CN106170470A

CN106170470A - 制造15‑羟基脂肪酸衍生物的方法

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Publication number: CN106170470A
Application number: CN201480071389.7A
Authority: CN
Inventors: M·曼库; D·科兰; B·道恩斯
Original assignee: Honorable Science Co Ltd
Current assignee: AF Immunology Co.,Ltd.
Priority date: 2013-10-29
Filing date: 2014-10-29
Publication date: 2016-11-30
Anticipated expiration: 2034-10-29
Also published as: US20150119593A1; US9670126B2; ES2670776T3; WO2015063617A2; CN106170470B; JP2016537411A; JP6659557B2; EP3063118A2; WO2015063617A3; EP3063118B1

Abstract

本公开提供从相应的脂肪酸(例如，分别是二高‑γ‑亚麻酸(DGLA)或二十碳五烯酸(EPA))制造15‑羟基脂肪酸衍生物、例如15‑(S)‑羟基二十碳三烯酸(HETrE或15‑(S)‑HETrE)或15(S)‑羟基二十碳五烯酸(HEPE或15(S)‑HEPE)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在单个反应容器中使所述脂肪酸与氧化剂(例如，脂氧合酶和氧气)在还原剂(例如，半胱氨酸)存在下接触以形成15‑羟基脂肪酸衍生物。

Description

制造15-羟基脂肪酸衍生物的方法

优先权要求

本申请要求2013年10月29日提交的美国临时专利申请序列号61/896,901的优先权，所述临时专利申请的整个内容并入本文中并作为依据。

发明内容

本公开提供从相应的脂肪酸(例如，分别是二高-γ-亚麻酸(DGLA)或二十碳五烯酸(EPA))起始制备15-羟基脂肪酸衍生物、例如15-(S)-羟基二十碳三烯酸(HETrE或15-(S)-HETrE)或15(S)-羟基二十碳五烯酸(HEPE或15(S)-HEPE)的两步方法。第一步骤包括将所述脂肪酸酶促氧化成15(S)-过氧氢脂肪酸中间体(例如，使用液体酶制剂)，接着还原成15(S)-羟基脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，所述酶促氧化步骤包括使所述脂肪酸与任选地获自大豆粉的脂氧合酶接触。在一些实施方案中，还原15(S)-过氧氢脂肪酸中间体的步骤包括用半胱氨酸原位还原。在一些实施方案中，所述方法的至少一部分是在排除(例如，部分排除)空气的情况下进行的。在一些实施方案中，所述方法还包括分离和/或纯化所述15(S)-羟基脂肪酸衍生物以形成粗制活性药物成分(API)级产品。在一些实施方案中，所述分离和/或纯化步骤包括色谱纯化和/或结晶。在一些实施方案中，所述方法被按比例放大以制备多千克量的任选地符合cGMP的API。

在一些实施方案中，所述脂肪酸是DGLA，所述15(S)-过氧氢脂肪酸中间体是15(S)-HPETrE，并且所述15(S)-羟基脂肪酸衍生物是15(S)-HETrE。

在其他实施方案中，所述脂肪酸是EPA，所述15(S)-过氧氢脂肪酸中间体是15(S)-HPEPE，并且所述15(S)-羟基脂肪酸衍生物是15(S)-HEPE。

附图说明

图1示出根据本公开的一个实施方案的亚甲基蓝溶液(680nm)的吸光度随时间随着脂氧合酶浓度递增而降低。

图2示出根据本公开的一个实施方案由于酶载量降低和更廉价的酶源而导致的酶成本贡献降低。

图3示出商业冷冻干燥的酶与大豆粉提取物的材料成本比较。

图4示出根据本公开的一个实施方案使用大豆粉提取物(0.1M乙酸钠，pH 4.5)相比于商业酶(2.06mg/mL，0.2兆单位/毫升)漂白亚甲基蓝溶液所花费的时间。

图5是1891-029的¹H NMR光谱的叠图(黄色：在O₂下1小时后；紫色：在O₂下2小时后；绿色：在O₂+另外0.5当量半胱氨酸下3小时后；红色：在大气条件下搅拌过周末，具有另外0.5当量半胱氨酸；蓝色：分离的粗HETrE)。

图6是1822-155-4D1的HPLC迹线和峰值表。

图7是1891-051-7A的HPLC迹线和峰值表。

图8是批料1822-155-4D1(红色，原始方法)和批料1891-051-7A(蓝色，根据本公开的方法)的¹H NMR光谱的叠图。

图9示出根据本公开的一个实施方案的HETrE反应的加热速率(heat rate)数据。

图10是根据本公开的一个实施方案的HETrE反应的压力对温度的曲线。

图11示出根据本公开的一个实施方案的HPETrE反应的加热速率数据。

图12是根据本公开的一个实施方案的HPETrE反应的压力对温度的曲线。

图13示出在本公开的一个实施方案中制备的过氧化材料1822-063-3的LC-MS分析。

图14是比较根据本公开的一个实施方案的反应中的过氧化样品(1822-163-3，蓝色；1822193-3，红色)与在O₂/空气存在下进行延长时期的过氧化样品(1891-003-3，绿色；1891-029-4，紫色；和按比例放大批料1891-05，黄色)的¹H NMR光谱的叠图。

图15示出在40％MtBE:环己烷混合物(75℃外部温度)中回流超过4.5天的HETrE的UPLC纯度数据。

图16是示出根据¹H NMR的DGLA与HETrE质子信号之间的重叠的代表性光谱。

图17是根据本公开的一个实施方案来自15-(S)-HETrE的纯化的前馏分(1891-051-6D)的带注释UV色谱图。

图18是根据本公开的一个实施方案制备的纯化15-(S)-HETrE(1891-051-7A)的带注释UV色谱图。

图19是根据本公开的一个实施方案来自15(S)-HETrE的纯化的尾馏分(1891-051-6E)的带注释UV色谱图。

图20示出DGLA和主要杂质的化学结构和其他特征数据。

图21示出来自纯化HETrE72中的二聚体杂质的片段化分析的质谱数据。

图22提出用于制备通过MS观测到的酯片段的一种可能途径。

具体实施方式

本公开提供从二高-γ-亚麻酸(DGLA)制造15-(S)-羟基二十碳三烯酸(15-(S)-HETrE)的方法。在一个步骤中，DGLA在ω6位置被生物氧化，接着使用还原剂(例如，硼氢化钠和/或半胱氨酸)还原所得氢过氧化物。代表性方法示于方案1中。在一些实施方案中，所述15(S)-HETrE是在单个步骤中形成的(例如，无需分离或纯化15(S)-HPETrE中间体)。

方案1

需要用于递送千克和更大量的GMP 15-(S)-HETrE和15(S)-HEPE的具有成本效益的酶促过程(例如，用于临床研究方案中)。在一个实施方案中，进行100、250和500kg批量的GMP 15(S)-HETrE的制备。这项工作方案的结果是通过用大豆脂氧合酶P1酶进行生物氧化而从DGLA制备15(S)-HETrE，得到15(S)-HPETrE，接着用1.1当量的硼氢化钠还原。在酸化和提取处理后，通过硅胶柱色谱法纯化分离的粗15-(S)-HETrE，得到50％的产率，根据HPLC面积百分比(235nm)的纯度>95％。

已表明，也可使用大豆粉作为更廉价的酶源来进行生物氧化反应；然而，下游加工不方便。

在另一个实施方案中，制备500+g示范批量的非GMP 15(S)-HETrE(例如，用于毒理学研究)。在这个实施方案中，从DGLA制备500+g的15(S)-HETrE(根据HPLC面积％(235nm)的纯度>95％)。所分离杂质的LC-MS和MS-MS分析表明，在最终产物中存在的约5％杂质中存在二氧化和三氧化化合物。

在一些实施方案中，所述方法包括用氧化剂氧化DGLA以形成15(S)-HPETrE。在一些实施方案中，所述氧化剂是酶促氧化剂，例如脂氧合酶。在一些实施方案中，所述氧化剂是大豆脂氧合酶(例如，脂氧合酶P1酶)。在一些实施方案中，所述大豆脂氧合酶是纯化的。在其他实施方案中，所述大豆脂氧合酶被用作混合物(例如，大豆粉)的组分。

所述氧化步骤可在水性介质中并且在适于实现酶活性的pH下进行。例如，当氧化剂是大豆脂氧合酶时，氧化步骤可在缓冲水性溶剂中在碱性pH(例如，约9或约9.6的pH)下进行。所述氧化剂和/或酶可相比于DGLA的量以化学计量过量存在。例如，所述氧化剂和/或酶可以约1当量、约1.1当量、约1.2当量、约1.3当量、约1.4当量、约1.5当量、约1.6当量、约1.7当量、约1.8当量、约1.9当量、约2当量、约2.1当量、约2.2当量、约2.3当量、约2.4当量、约2.5当量、约2.6当量、约2.7当量、约2.8当量、约2.9当量、约3当量、约3.1当量、约3.2当量、约3.3当量、约3.4当量、约3.5当量、约3.6当量、约3.7当量、约3.8当量、约3.9当量、约4当量或大于约4当量存在。

在一些实施方案中，氧化步骤需要添加氧源，例如当氧化步骤包括使DGLA与酶接触时。在这些实施方案中，氧化步骤可在氧源、例如大气氧或纯化(例如，至少部分纯化)气态氧存在下进行。在一些实施方案中，氧化步骤在加压氧气气氛下、例如在约1.1巴、约1.2巴、约1.3巴、约1.4巴、约1.5巴、约1.6巴、约1.7巴、约1.8巴、约1.9巴、约2巴、约2.1巴、约2.2巴、约2.3巴、约2.4巴、约2.5巴、约2.6巴、约2.7巴、约2.8巴、约2.9巴、约3巴、约3.1巴、约3.2巴、约3.3巴、约3.4巴、约3.5巴、约3.6巴、约3.7巴、约3.8巴、约3.9巴、约4巴或大于约4巴下进行。

氧化步骤的温度可被控制以避免过量热量产生。在一些实施方案中，例如，氧化步骤可在约0-5℃下进行。

在一些实施方案中，氧化步骤包括在0-5℃下在约2.5巴的氧气气氛下在pH约9.6的水性缓冲液(例如，0.1M硼酸钠缓冲液)下使DGLA与约2当量的大豆脂氧合酶P1酶接触。

在另一个实施方案中，氧化步骤包括在0-5℃下在加压氧气气氛中在pH约9.6的水性缓冲液(例如，0.1M硼酸钠缓冲液)存在下使DGLA与约2当量的作为粗大豆粉提取物的大豆脂氧合酶接触。

在一些实施方案中，还原15(S)-HPETrE中间体以形成15(S)-HETrE的步骤包括使所述15(S)-HPETrE中间体与还原剂接触以形成所述15(S)-HETrE。在一些实施方案中，所述还原剂是硼氢化钠。在其他实施方案中，所述还原剂是半胱氨酸。作为较温和还原剂的半胱氨酸相比于硼氢化物型还原剂提供额外的优点。例如，半胱氨酸不形成氢气作为副产物，因此能够实现更安全的扩大规模的机会。另外，半胱氨酸是一种稳定的试剂并且不需要硼氢化物型试剂所需的特殊处理或储存技术。另外，氧化形式的半胱氨酸(胱氨酸)是仅在水中部分可溶的稳定二肽，其提供优于一些其他还原剂的适宜纯化机会。

在一些实施方案中，氧化DGLA的步骤和还原15(S)-HPETrE中间体以形成15(S)-HETrE的步骤发生在单个反应容器中，而不存在分离或纯化所述15(S)-HPETrE中间体的步骤。在这些实施方案中，所述方法包括在还原剂存在下使DGLA与如上所述的氧化剂和/或酶接触。所述还原剂可相比于DGLA的量以化学计量过量(例如，约2当量)存在。在一些实施方案中，所述还原剂是半胱氨酸。

在一些实施方案中，所述方法包括在还原剂存在下使DGLA与如上所述的氧化剂和/或酶接触。所述还原剂最初可相比于DGLA的量以化学计量过量(例如，约2当量)存在。所述方法还可包括在一段时期后向反应容器添加额外量的还原剂，例如约另外1当量。在一些实施方案中，所述还原剂是半胱氨酸。

在一些实施方案中，所述方法包括用氧化剂氧化EPA以形成15(S)-HPEPE。在一些实施方案中，所述氧化剂是酶氧化剂，例如脂氧合酶。在一些实施方案中，所述氧化剂是大豆脂氧合酶(例如，脂氧合酶P1酶)。在一些实施方案中，所述大豆脂氧合酶是纯化的。在其他实施方案中，所述大豆脂氧合酶被用作混合物(例如，大豆粉)的组分。

在一些实施方案中，氧化EPA的步骤和还原15(S)-HPEPE中间体以形成15(S)-HEPE的步骤发生在单个反应容器中，而不存在分离或纯化所述15(S)-HPEPE中间体的步骤。在这些实施方案中，所述方法包括在还原剂存在下使EPA与如上所述的氧化剂和/或酶接触。所述还原剂可相比于EPA的量以化学计量过量(例如，约2当量)存在。在一些实施方案中，所述还原剂是半胱氨酸。

在一些实施方案中，还原15(S)-HPEPE中间体以形成15(S)-HEPE的步骤包括使所述15(S)-HPEPE中间体与还原剂接触以形成所述15(S)-HEPE。在一些实施方案中，所述还原剂是硼氢化钠。在其他实施方案中，所述还原剂是半胱氨酸。作为较温和还原剂的半胱氨酸相比于硼氢化物型还原剂提供额外的优点。例如，半胱氨酸不形成氢气作为副产物，因此能够实现更安全的扩大规模的机会。另外，半胱氨酸是一种稳定的试剂并且不需要硼氢化物型试剂所需的特殊处理或储存技术。另外，氧化形式的半胱氨酸(胱氨酸)是仅在水中部分可溶的稳定二肽，其提供优于一些其他还原剂的适宜纯化机会。

在一些实施方案中，所述方法包括在还原剂存在下使EPA与如上所述的氧化剂和/或酶接触。所述还原剂最初可相比于EPA的量以化学计量过量(例如，约2当量)存在。所述方法还可包括在一段时期后向反应容器添加额外量的还原剂，例如约另外1当量。在一些实施方案中，所述还原剂是半胱氨酸。

在一些实施方案中，通过在无水丙酮中用烷基溴化物(例如，乙基溴化物)和碳酸钾处理15(S)-HEPE而将所述15(S)-HEPE转化成酯(例如，乙酯)。在这些实施方案中形成的粗酯可通过用木炭和硅胶处理而方便地纯化以形成高纯度15(S)-HEPE。

在一些实施方案中，所述方法提供包含15-羟基脂肪酸衍生物和一种或多种杂质的组合物。在一些实施方案中，所述一种或多种杂质由以下组成，基本上由以下组成，或包含以下：15(S)-羟基脂肪酸衍生物的过氧化产物、过还原产物、二聚体和/或位置异构体。在一些实施方案中，所述过氧化产物是二羟基化化合物、具有一个或多个额外C＝C双键的化合物，或其组合。在一些实施方案中，所述过还原产物是相比于所述15(S)-羟基脂肪酸衍生物具有一个或多个更少C＝C双键的化合物。在一些实施方案中，所述二聚体是在第一分子的羧酸部分与第二分子的羟基部分之间形成的酯二聚体。

在一些实施方案中，本公开提供包含15(S)-羟基脂肪酸衍生物的组合物。在一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种杂质。在一些这样的实施方案中，所述15(S)-羟基脂肪酸衍生物是以组合物中存在的所有脂肪酸的重量计至少约90％、例如以组合物中存在的所有脂肪酸的重量计至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的量存在。在一些实施方案中，所述15(S)-羟基脂肪酸衍生物呈酯、例如乙酯形式。在一些实施方案中，所述组合物还包含杂质，其中所述杂质是以存在的所有脂肪酸的重量计不大于约10％、例如组合物中存在的所有脂肪酸的不大于约10％、不大于约9％、不大于约8％、不大于约7％、不大于约6％、不大于约5％、不大于约4％、不大于约3％、不大于约2％、不大于约1％的量存在。

在一些实施方案中，本公开提供包含15(S)-HETrE的组合物。在一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种杂质。在一些这样的实施方案中，所述15(S)-HETrE是以组合物中存在的所有脂肪酸的重量计至少约90％、例如以组合物中存在的所有脂肪酸的重量计至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的量存在。在一些实施方案中，所述15(S)-HETrE呈酯、例如乙酯形式。在一些实施方案中，所述组合物还包含杂质，其中所述杂质是以存在的所有脂肪酸的重量计不大于约10％、例如组合物中存在的所有脂肪酸的不大于约10％、不大于约9％、不大于约8％、不大于约7％、不大于约6％、不大于约5％、不大于约4％、不大于约3％、不大于约2％、不大于约1％的量存在。

在一些实施方案中，本公开提供包含15(S)-HEPE的组合物。在一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种杂质。在一些这样的实施方案中，所述15(S)-HEPE是以组合物中存在的所有脂肪酸的重量计至少约90％、例如组合物中存在的所有脂肪酸的重量计至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的量存在。在一些实施方案中，所述15(S)-HEPE呈酯、例如乙酯形式。在一些实施方案中，所述组合物还包含杂质，其中所述杂质是以存在的所有脂肪酸的重量计不大于约10％、例如组合物中存在的所有脂肪酸的不大于约10％、不大于约9％、不大于约8％、不大于约7％、不大于约6％、不大于约5％、不大于约4％、不大于约3％、不大于约2％、不大于约1％的量存在。

实施例

实施例1：用于评估粗植物匀浆的脂氧合酶活性的比色测定法

亚油酸氢过氧化物、3-甲基-2-苯并噻唑啉(MBTH)和3-(二甲基氨基)苯甲酸(DMAB)已知在血红蛋白存在下反应，得到在590nm下吸收的紫色吲达胺染料。这个波长下的吸光度与至多35μM的亚油酸氢过氧化物浓度成线性关系。

在4℃或环境温度下，在至多24小时的时期内将1g大豆粉提取到10mL的经适当pH调节的缓冲液或水(1:10w/v)中。在试管中在磁性搅拌(约500rpm)下进行反应。对于1小时和2小时时间点，使提取溶液静置约10分钟，然后抽取10μL酶溶液并添加至4mL比色管中的测定溶液A(含有亚油酸和DMAB)(1mL)中。在室温下温育约5分钟后，添加测定溶液B(MBTH和血红蛋白)(1mL)并且进一步温育约5分钟，然后记录吸光度读数(表1)。在所有样品中观测到蓝色形成，但硼酸钠、pH 10.4提取样品和空白(所有试剂，除了酶)除外。在这种情况下在约0.2的吸光度下观测到浅灰色。利用除亚油酸之外的所有试剂和酶进行空白试验，得到0.2的吸光度。经测定，酶溶液干扰吸光度读数。

表1.大豆粉提取物在各种条件下在590nm下的吸光度读数

不同地分析其余时间点(5小时和24小时)。使提取溶液静置约10分钟，然后抽取10μL酶溶液并添加至2mL eppendorf管中的测定溶液A(含有亚油酸和DMAB)(0.5mL)中。在室温下温育约5分钟后，添加测定溶液B(MBTH和血红蛋白)(0.5mL)并进一步温育约5分钟。添加月桂基硫酸钠溶液(1％w/v)(0.5mL)以淬灭反应并且将溶液在9.8rcf、4℃下离心5分钟。然后将溶液倾析到4mL比色管中并如前分析。结果没有显示出任何特定趋势。

实施例2：替代性比色测定条件

为了测试测定灵敏度，在原始载量值(0.42兆单位(4.11mg)/mL，基于供应商分析证书)下使用冷冻干燥的酶并稀释一半直至不再能够观测到比色检测来设置稀释系列。这也利用亚甲基蓝漂白法(Suda等,《农业化学及食品化学杂志(J.Agric.Food Chem.)》43,3,1995,第742页,EP号2118126A1)来分析，由此分析当在亚油酸存在下与酶溶液一起温育时100μM亚甲基蓝溶液随时间在680nm下的吸光度的降低。使用2.1mL的0.2M Tris-HCl缓冲液pH 9.0、0.3mL 100μM亚甲基蓝溶液、0.3mL 10mM亚油酸钠底物和0.3mL大豆粉提取物(总体积3mL)进行亚甲基蓝漂白测定法。

表2.纯化酶稀释系列在680nm下的吸光度读数(亚甲基蓝漂白法)

对于DMAB-MBTH测定法，抽吸10μL酶溶液并添加至2mL eppendorf中的测定溶液A(含有亚油酸和DMAB)(0.5mL)中。在室温下温育约5分钟后，添加测定溶液B(MBTH和血红蛋白)(0.5mL)并进一步温育约5分钟。添加月桂基硫酸钠溶液(1％w/v)(0.5mL)以淬灭反应并且将溶液在16.1rcf、4℃下离心10分钟。然后将溶液倾析到4mL比色管中并如前分析。这是一式两份地进行的。

表3.纯化酶稀释系列在590nm下的吸光度读数(DMAB-MBTH测定法)

根据表3中的结果，看来使用这种方法获得的吸光度读数并非以线性方式符合溶液中的酶溶液。原始方法用于在pH 6下的粗植物脂氧合酶的测定法。据报道，血红蛋白在8.5的最佳pH和0.5mM亚油酸浓度下展现准脂氧合酶活性。由于测定法在pH 9下进行，因此这可能对所得结果具有一些意义。然而已指出，在含有除酶外的所有试剂的空白中未观测到颜色形成。然而，基于所得结果，决定用亚甲基蓝漂白法进行。所述方法是简单和快速的，但没有特别灵敏并且难以定量。通过颜色消失(即在680nm下的吸光度达到0)所花费的时间来确定活性水平。为了区分较高的酶载量，使用较低浓度的酶溶液重复纯化酶的稀释系列。将仅30μL酶溶液添加至亚甲基蓝漂白溶液并且利用270μL蒸馏水将体积补足至3mL。所得结果记录于表4中。

表4.使用较低酶浓度的纯化酶稀释系列在680nm下的吸光度读数(亚甲基蓝漂白法)

稀释系列的图形表示示于图1中。对于具有较低酶浓度的样品观测吸光度开始降低的诱导时间(0.5-2分钟)。

已确定，使用这种方法可相对于商业酶溶液比色测定大豆粉提取物的活性，从而给出足以进行所需氧化反应的活性的指示。

实施例3：作为还原剂的半胱氨酸

采购另一种供应的冷冻干燥酶。初始试验显示，酶载量可降低至多一半。与替代还原剂(半胱氨酸)组合，酶载量从初始的13.7兆单位/克DGLA底物(液体酶制剂)降至1.8兆单位/克(冷冻干燥酶)。实现了脂氧合酶的成本从/克DGLA降至/克DGLA(约15倍降低，图2)。这是由于以下两种因素：降低的酶载量和更廉价的供应(/兆单位冷冻干燥酶相对于/兆单位液体酶制剂)。

此外观测到，所供应的冷冻干燥酶具有良好稳定性。虽然建议在-20℃下储存，并且在使用后干燥，但将批料储存在环境大气条件下持续两周，然后利用于使用最佳酶载量(1.8兆单位/克DGLA)的反应中。未观测到性能劣化。在缓冲溶液中进行反应以维持pH并溶解反应组分。

使用半胱氨酸(一种温和还原剂)来代替硼氢化钠。使用半胱氨酸能够在一个步骤中进行氧化/还原反应。另外，在反应/淬灭期间未产生可燃性氢气。此外，产生较少的过氧化产物，这可能是由于半胱氨酸的抗氧化特性。此外据认为，在过程开始时添加还原剂有助于通过高浓度的氢过氧化物来减轻不可逆的酶失活，因此导致较低的酶需求(例如，成本节约)和较低的过氧化电位。

实施例4：酶载量

使用液体酶制剂利用约13.7兆单位活性/克DGLA底物的酶载量(1单位定义为当在25℃下在总体积为1.0mL的0.1M硼酸盐缓冲液pH 9.0中与0.02％亚油酸酯一起温育时酶造成在234nm下每分钟增加0.001 AU)来进行先前的生物氧化反应。此外测试了呈冷冻干燥粉末形式的另一种供应的脂氧合酶。使用约13.7兆单位活性/克DGLA底物利用冷冻干燥酶重复生物氧化反应并且获得根据¹H NMR光谱分析得到的类似反应完成度概况。将这种反应再重复3次，每次使酶载量降低一半。结果总结于表5中。

表5.使用冷冻干燥纯酶的初始酶载量研究结果

这些试验的结果表明，可将酶载量降低至少一半，而仍在1小时内获得反应完成。虽然对于较低载量样品获得的¹H NMR光谱是没有定论的，但通过NMR仍然可见DLGA，并且通过TLC证实了其存在。

实施例5：酶源

使用脂氧合酶的液体制剂进行先前的反应，在13.7兆单位/克DGLA的载量下得到反应完成。获得另一种供应的冷冻干燥纯酶并且使用仅6.87兆单位/克DGLA的酶载量达到反应完成。

实施例6：反应介质

使用纯水代替缓冲液来进行实验。向水中添加DGLA，得到两个不混溶层。利用2M氢氧化钠将pH调节至9.8并搅拌得到乳液。添加冷冻干燥酶(6.87兆单位/克DGLA)并且如前进行反应。1小时后，反应混合物仍是混浊乳液，指示不完全转化。¹H NMR光谱分析显示约45％未反应的DLGA和一些过氧化杂质。这表明需要缓冲液来维持所需的pH(约9)并帮助溶解底物。据认为，15-(S)-HPETrE也有助于溶解DGLA底物。

实施例7：还原剂

在一锅顺序中，先前使用1.1当量硼氢化钠将中间体氢过氧化物完全还原。然而，这导致氢气产生，尤其是在处理期间并且需要大体积的10％柠檬酸溶液用于pH调节。在扩大规模时，由于氢气问题、装料模式和对整厂设备预计的长淬灭时间(约17小时)，硼氢化钠是不受欢迎的。

使用半胱氨酸代替硼氢化钠作为还原剂来进行实验。使用不同酶载量进行多个反应。各种排列详述于表6中。在Parr反应器中在氧气压力(2.5巴)下进行反应。

最初似乎需要两当量的半胱氨酸。添加3当量造成反应迟延，或至少非常缓慢地进行，这可能是由于酶活化的氢过氧化物的快速去除。然而，如果最初使用两当量的半胱氨酸，则在一小时反应时间后需要添加另一当量的半胱氨酸来还原剩余的氢过氧化物。这可能是由于反应混合物中的半胱氨酸被氧气而非氢过氧化物氧化。此外发现，在这些条件下可实现酶载量降低到低至1.8兆单位活性/克DGLA，在几小时内得到DGLA的几乎完全消耗和减少的杂质(例如，过氧化产物)形成。

表6.使用半胱氨酸还原剂和改变的酶载量(冷冻干燥酶)的反应的结果

实施例8：双批次进料发酵罐反应

在3L发酵罐中进行1L最终体积反应，其中分别在恒定速率(1.6mL/min和2mL/min)下添加底物(40g)和酶(1.8兆单位/克DGLA)至pH 9.5 0.1M硼酸钠缓冲液(850mL)。使氧气鼓泡通过在500rpm下搅拌的缓冲溶液。酶以于pH 4.5 0.1M乙酸钠溶液(150mL)中的溶液形式添加并且通过添加3MNaOH(水溶液)将反应的pH维持在约9.5。在添加DGLA后，出现显著起泡并且从容器中排出一些物质(约10％)。添加聚丙二醇2000(20mL，与硼酸盐缓冲液为1:1v/v)作为消泡剂，但作用很小。另外20mL并没有显著减少起泡。将氧气流量降至最低可能设置最终减少了起泡。在1.5小时后通过¹H NMR分析等分试样，其显示残余DGLA(6.25重量％)。反应再持续5小时。然后将悬浮液通过Celite过滤以除去胱氨酸并且用固体柠檬酸将透明滤液酸化至pH 3。将所得悬浮液储存在4℃下过周末。沉淀的产物和其他胱氨酸残余物已经从水溶液中沉降。通过过滤收集这些物质，得到白色膏状物。TLC显示在水性滤液中不存在产物。使收集的‘膏状物’在MTBE中浆化并过滤以留下颗粒状白色固体。在旋转蒸发仪上浓缩滤液，留下44g黄色油状物。¹H NMR分析显示，无HPETrE和小于1重量％残余DGLA。然而，产物还含有PPG2000。使油状物在20％MTBE:己烷(100mL)中浆化并施加至二氧化硅垫(400g)。将所述垫用己烷(1.2L)、20％MTBE:己烷(2L)和40％MTBE:己烷(4L)洗脱。通过TLC鉴别含有产物的级分。根据TLC，含有初始产物的级分含有微量的DGLA；将这些合并并分别浓缩，得到13g呈透明浅黄色油状的产物。¹H NMR(CDCl₃)约0.5％DGLA、HETrE。将含有剩余产物的级分合并，得到14g产物。¹H NMR(CDCl₃)–HETrE。HPLC面积％纯度(252nm)–96.92％。柱色谱法后的产物总回收率为62％。然而，由于反应器中的起泡问题，发生显著损失。这表明如果通过搅拌将足够的氧气转移至混合物中，则反应无需在压力下进行，并且延长的反应时间不会导致副产物增加。不希望受理论束缚，据认为这是由于以下多种原因：较低的酶载量、较低的氧气利用度，和反应混合物中降低量的不稳定氢过氧化物。然而，在轻微氧气压力下的反应将有助于控制反应起泡问题。

实施例9：作为酶源的大豆粉

开发了用于从10g大豆粉提取足够的脂氧合酶活性以将3g DGLA完全转化成HETrE所需的条件(1:10w/v 0.1M乙酸钠缓冲液pH 4.5，3小时，180rpm)。

基于冷冻干燥酶和大豆粉的目前价格的成本比较显示，材料成本节约7倍(图3)，但是在工厂规模上需要额外的装置操作(提取、过滤)，因此在低体积下的潜在节约可忽略不计。

在氧气压力下进行的使用大豆粉作为酶源的生物氧化反应得到DGLA至HPETrE的合理转化率(约95％)。可通过直接添加大豆粉来进行反应；然而，这产生粘稠的反应混合物。所述反应混合物的酸化造成蛋白质沉淀，其当提取时产生难以过滤的浓稠乳液。已发现，利用离心可实现层的完全分离，但由于所涉及的体积，这在大规模上将是不可行的。还将存在反应器清洁问题，因为粉残余物相当难以去除。

在室温下将活性酶从粉中提取到缓冲溶液中。在离心后，使用所得混浊溶液来进行生物氧化。这从反应混合物除去不溶性碳水化合物，但由于存在显著量的蛋白质，在处理程序期间形成乳液。

试图从大豆粉分离半纯化酶，但发现这是非活性的。

用于从脱脂大豆粉提取酶活性的最佳条件的系统确定(缓冲介质、pH、时间、温度)。

从大豆粉提取酶的研究考虑在如下pH和提取缓冲液(1:10w/v大豆粉载量)(表7)下并与比色测定研究平行进行。

表7.初始脂氧合酶提取条件(缓冲液、pH、温度)

分析这些提取溶液的pH并且发现pH 4.5的硼酸钠缓冲液在添加大豆粉时具有6.1的pH。乙酸钠缓冲液pH 10在添加大豆粉时具有6.8的pH并且纯水提取物的pH也是6.8。这符合硼酸盐(8-10)和乙酸盐(3.6-5.6)缓冲液的pH缓冲范围。在添加大豆粉时乙酸钠缓冲液pH 4.5变成pH 5.2。

蛋白质可能通过摩擦、如由磁力搅拌器造成的摩擦而破坏。在50mL离心管中在温度控制轨道摇床中进行下一组提取。在不同pH和温度下设置多个反应，并且在3个时间点(1、2和14小时)和3种温度(5、25和40℃)下分析。测定结果(通过在少差别条件(300μL酶溶液)下的亚甲基蓝漂白测定)示于表8中。

表8. 1小时后大豆粉提取物在680nm下的吸光度读数

表9. 2小时后大豆粉提取物在680nm下的吸光度读数

表10. 14小时后大豆粉提取物在680nm下的吸光度读数

通过比较这些结果与纯化酶的稀释系列的结果(表2)，确定在所研究的pH范围内从大豆粉提取≥0.105兆单位的酶活性/mL。这是用于合成500g总氧化剂(tox)批料的酶活性(0.41兆单位/毫升反应混合物)的约1/4。看来在pH 9.0下，在25和40℃下提取降低了酶活性，这在2小时提取时间后变得显著。在4.5和6.5的较低pH值下，在这些条件下在高温下提取不具有可确定作用。

14小时提取样品在适当条件下搅拌过周末并如前分析(表11)。

表11.经过周末的大豆粉提取物在680nm下的吸光度读数

唯一显著差异是pH 9.0硼酸盐提取物在5℃下的活性降低。此外观测到，如通过亚甲基蓝漂白法所判定，在室温下静置过周末的过滤提取物(pH 4.5)不显示显著活性下降。

在pH 4.5和6.5下(载量为1:5w/v大豆粉)和在30℃的温度下进行进一步提取(表12)。使用更敏感条件(30μL酶溶液)测定提取溶液(参见表4)。

观测到，pH 4.5提取溶液的上清液不如在pH 6.5和9.0下获得的那些混浊。

表12. 1小时和2小时大豆粉提取(1:5w/v)(30℃)在680nm下的吸光度读数

在静置1天后过滤已经在25℃下静置过周末的提取溶液(1:10w/v)。pH4.5下的样品具有透明黄色上清液，将其倾析并通过Celite垫过滤。此外过滤残余粉以得到固态饼状物。从33mL的初始缓冲液体积回收20mL提取物。如上述处理具有混浊上清液的pH 6.5和9.0下的样品。当倾析pH 6.5提取物时，上清液变得与粉残余物混合。将悬浮液过滤，得到14mL轻微混浊黄色滤液。pH 9.0提取物得到20mL橙色混浊滤液。

此外过滤在30℃下的pH 4.5提取物(1:5w/v)，从13.5mL的初始缓冲液体积仅得到4mL滤液。

基于漂白亚甲基蓝溶液所花费的时间，在pH 4.5和6.5下提取得到0.21至0.42兆单位/毫升的酶活性。然而，在pH 4.5下可以获得更透明的提取物。在pH 9.0下，提取物活性似乎随时间而降低，并且此外所得提取物是混浊的。在1:5w/v的粉载量下，仅可以回收少量的提取物并且相比于1:10w/v提取物的活性增加不太显著。因此，可以在室温下提取在pH4.5的0.1M乙酸钠缓冲液中1:10w/v载量的大豆粉，得到有效活性。

实施例10：作为酶源的大豆粉提取物

在32℃、180rpm下用100mL 0.1M乙酸钠缓冲液pH 4.5提取10g 7B大豆粉持续3小时，然后通过Celite过滤，得到85mL的透明黄色滤液(pH 5.2)。通过亚甲基蓝漂白测试分析30μL部分并且活性与约2mg/mL(0.2兆单位/毫升)的纯化冷冻干燥酶类似(图4)。

商业酶载量为约0.055兆单位/毫升的反应溶液(1.8兆单位/克DGLA)足以完成反应。

将2当量半胱氨酸与35mL的0.1M硼酸钠缓冲液一起装入Parr反应器中并在冰浴中冷却至0-5℃。用2M氢氧化钠溶液调节pH，接着添加DGLA并且进一步调节pH至9.6。添加大豆粉提取物(53mL)，得到100mL的体积和9.3的pH。酶活性载量为0.11兆单位/毫升的反应溶液。在O₂压力(35psi，2.5巴)下进行反应1小时。¹H NMR光谱分析显示很少残余DGLA以及HPETrE和HETrE的混合物(图5)。再以2份添加1当量的半胱氨酸，使剩余HPETrE减少，如通过¹H NMR光谱分析所判定。将反应溶液在4℃下储存过周末。如前处理反应物(图5)。

实施例11：15(S)-HETrE的分离和纯化

使用半胱氨酸还原剂使得反应的酶活性载量降低7.6倍(13.7兆单位/克至1.8兆单位/克DGLA)，仍得到可接受的杂质分布。在几小时内可获得反应完成。并非用10％柠檬酸溶液酸化，而是用固体柠檬酸酸化反应物，因此使总体积降低约30％。从反应混合物中沉淀出HETrE产物，以及胱氨酸残余物，其可通过过滤收集。使所收集的沉淀物与MtBE一起浆化并过滤，接着除去溶剂，使得分离出>100重量％粗HETrE。相比之下，先前的处理涉及用相当昂贵的50/50己烷/MtBE混合物(×3)提取以减少乳液形成。此外收集碎片层(rag layer)，其需要通过celite过滤以打破乳液并通过用MtBE洗涤来回收产物。从约72L溶剂回收粗HETrE(430g)。然而，利用这种方法，从仅9L MtBE回收320g粗HETrE。

通过柱色谱法(约55g输出)使用1:10w/w粗HETrE:硅胶比率并用(1)4L的10％MTBE:环己烷、(2)3L的20％MTBE:环己烷和(3)4L的50％MTBE:环己烷(总洗脱剂体积：11L)洗脱进行纯化证实是合适的。先前，使用Biotage KP Sil柱使用1:10w/w粗HETrE:硅胶比率来纯化约45g的15(S)-HETrE并用(1)2L的己烷、(2)2L的10％MTBE:己烷、(3)2L的20％MTBE:己烷、(4)2L的30％MTBE:己烷、(5)4L的40％MTBE:己烷、(6)50％MTBE:己烷和(7)4L的MTBE(总洗脱剂体积：19L)洗脱。改进的色谱条件代表溶剂体积降低40％，加工时间(例如，用于去除溶剂)减少和产物降解风险降低。

通过使用半胱氨酸作为还原剂，观测到随着反应进行从其中沉淀出固体，这可能是氧化形式胱氨酸。最初，通过经Celite过滤来收集在反应结束时可见的沉淀物，得到透明滤液，然后使用固体柠檬酸调节pH至3。在这个阶段沉淀出另外的胱氨酸/半胱氨酸沉淀物以及产物。可通过经烧结漏斗过滤来收集面团状沉淀物并在漏斗上风干。然后将‘面团’在MTBE(1×100mL、3×50mL)中浆化以除去产物，通过过滤收集并经Na₂SO₄干燥。

当使用纯化酶时，水层的提取得到乳液，其快速沉降。然而，使用粉提取物提取反应得到凝胶状乳液，其需要通过Celite过滤以打破。这可能导致产物损失或通过过滤器洗涤的溶剂使用量增加。已发现，沉淀产物/胱氨酸的直接过滤和与MTBE一起浆化避免了这个问题。在进行这个程序后，用100mL MTBE提取从粉提取物反应(1891-029)得到的水性滤液(pH 3)，得到凝胶状乳液，其通过Celite过滤。有机层的TLC分析仅显示非常模糊的UV活性点并且分离产物(62mg)的¹H NMR显示不存在HETrE，因此指示沉淀物过滤是适于回收HETrE产物的方法。

这个反应得到2.5g(94％)的粗HETrE，根据UPLC面积％(252nm)的纯度为92.73％。

实施例12：10L规模放大反应

进行10L规模放大反应(各300g的DGLA)，得到组合总计469g(74％)的15(S)-HETrE，根据UPLC的纯度为97.2％，在柱色谱纯化后，去除溶剂并高真空干燥。发现所述物质具有12.5mEq/kg的过氧化值，相比于比较性总氧化剂批料的约90mEq/kg。

进行另外10L规模放大反应以得到另外239g(76％)的15(S)-HETrE，在柱色谱纯化后，去除溶剂并高真空干燥。

实施例13：稳定性研究

进行两个10L规模放大反应以加工600g DGLA用于稳定性研究。使用方案2中所示的条件进行这些。

方案2.

将10L的0.1M硼酸钠缓冲液(pH 13.4)装入氢化容器，接着装入2当量的半胱氨酸。将DGLA装入缓冲溶液并冷却至0-5℃。向冷反应容器中添加LPX1酶粉末并且用最少2巴纯氧加压并搅拌1小时。1小时后的¹H NMR分析显示约6％HPETrE和8％残余DGLA。反应样品的CAD分析显示，存在12.6％w/w的残余DGLA。在氧气压力下在另外60分钟后，分析显示约5％HPETrE(根据¹H NMR)和4％DGLA。CAD分析显示存在5.0％w/w的残余DGLA。在利用氮气净化反应混合物后，添加另外1当量的半胱氨酸并且将反应搅拌1小时。等分试样的分析显示无HPETrE(根据¹H NMR)和3.5％DGLA。CAD分析显示存在3.8％w/w的残余DGLA。

将反应混合物在1.3℃下在氮气毯覆下搅拌过夜。等分试样的分析显示无HPETrE(根据¹H NMR)和3.5％DGLA。CAD分析显示存在5.3％w/w的残余DGLA，这被认为是反常结果。在氮气气氛下处理等分试样并且立即分析过氧化值。其测得为2mEq/kg。在氮气气氛下将本体溶液排放到25L转鼓并转移至10L玻璃容器。添加含有0.02％BHT的MtBE并且通过逐份添加固体柠檬酸来调节水溶液的pH。使所得三相混合物(有机、水性和固体沉淀物)沉降。然后在氮气流下通过4L烧结漏斗过滤混合物。在花费1.5-2小时的过滤期间，约三分之二的外加MtBE蒸发。使滤液层返回容器并使其静置，然后分离。再次提取水层(×2)。分别在旋转蒸发仪上浓缩三个提取层。分离出总共274g粗油状物(通过¹H NMR测定法相对于四氯硝基苯标准物测得为约231g(73％))。在MtBE(2×1L)中对分离的滤饼浆化后获得另外53g粗油状物(43g+10g)，得到327g(根据¹H NMR测定法为278g(88％))的总粗回收率。对于第一提取物和浆化物质分别获得8.6mEq/kg和14.9mEq/kg的过氧化值。

以相同方式制备第二批料，但反应溶液的初始温度较低(1.4℃对4.2℃)。1小时后的¹H NMR分析显示约3％HPETrE和11％残余DGLA。反应样品的CAD分析显示存在15.5％w/w的残余DGLA。在氧气压力下另外120分钟后，分析显示约6％HPETrE(根据¹H NMR)和4％DGLA。在用氮气净化反应混合物后，再添加1当量的半胱氨酸并且在氮气毯覆下搅拌反应过夜。等分试样的分析显示无HPETrE(根据¹H NMR)和约3％DGLA。CAD分析显示存在4.0％w/w的残余DGLA。

在氮气气氛下处理等分试样并且立即分析过氧化值，其测定为5mEq/kg。在氮气气氛下将本体溶液排放到25L转鼓并转移至15L玻璃容器。在用固体柠檬酸酸化至pH 3.2后，在氮气流下通过孔隙率1的4L烧结漏斗过滤来收集所得固体沉淀物。然后使滤饼返回容器并且每次用MtBE(3×3L)浆化并过滤。分别在旋转蒸发仪上浓缩三个滤液层。分离出总共325g粗油状物(通过¹H NMR测定法相对于四氯硝基苯标准物测得为约284g(90％))。对于第一提取物级分获得10mEq/kg的过氧化值。

将粗物质合并并通过柱色谱法在众多75L Biotage KP-Sil柱上纯化。基于TLC分析将纯化级分合并并在旋转蒸发仪上在40℃下(避光)浓缩，然后用氮气排气并储存在-80℃下。将分离的纯HETrE级分溶解在MtBE中，通过洁净的烧结漏斗过滤并合并，然后在旋转蒸发仪上在40℃下(避光)浓缩。使纯化物质避光并在室温下在高真空泵上干燥三天，然后用氮气排气并储存在-80℃下。获得总共469g的浅黄色油状物，根据UPLC(252nm)为97.4％面积纯度并且使用原始HPLC方法(235nm)为97.3％面积纯度。¹H NMR光谱符合结构。通过GC顶空对所述物质分析残余溶剂，对于MtBE和环己烷分别得到434和9.2ppm的值(限度为5000和3880ppm)。对于批料计算出过氧化值为12.5mEq/kg(相对于先前总氧化剂批料的约90mEq/kg)。

将通过这种方法制备的物质与使用原始OPRD方法通过HPLC得到的总氧化剂批料进行比较。HPLC迹线示于图6和图7中。

所述批料具有类似的概况和纯度。两个光谱之间的主要差异注明在约35-36分钟，但这可能是由于宽泛的界定模糊的峰的积分。在48.1分钟下的杂质以0.92％存在于测试批料中，相对于总氧化剂批料中的0.55％，这可能是由于修改的反应条件，或者更可能是由于DGLA原料的组成(使用生育酚稳定化批料来制备测试批料)。在63至66分钟之间的杂质符合面积％的变化。根据迹线的比较，显而易见没有高于0.1％的新杂质。

¹H NMR光谱的叠图显示几乎一致的特征曲线(图8)。

表13给出用于制备总氧化剂批料的先前利用条件与用于制备测试批料的条件的简要比较。

表13.合成方法比较

参数	总氧化剂批料	测试批料
			DGLA输入	1100g	600g
酶载量	13.7兆单位/克	1.8兆单位/克
			纯化HETrE输出	603.5(53％)	469(74％)
纯度，UV面积％	96-97.5％(235nm)	>97％(252nm)
			纯化溶剂用量	19L/柱	11L/柱

在规模放大测试批料进行期间观测到，在O₂压力下在2.5-3小时后约4-5％残余DGLA留在反应混合物中。在试验反应期间，添加最后当量的半胱氨酸还原剂并在大气条件下搅拌，使得残余DGLA进一步转化。然而，在规模放大反应中，在已经用氮气净化反应混合物后添加最后当量的半胱氨酸，因此DGLA水平可能无进一步降低。基本原理是降低反应混合物中存在的氧气并且因此最小化其他过氧化物形成和半胱氨酸氧化的可能性。进行其他试验，其中添加另外20-50％的酶活性。如通过¹H NMR所判定，发现添加20％酶活性以及最后当量的半胱氨酸得到<1％残余DGLA。

根据本文详述的方法描述进行剩余10L操作。如前利用¹H NMR特征曲线获得总共239g的浅黄色油状物。

实施例14：工艺描述

基于在这项研究主体中进行的反应结果生成工艺描述(PD)。在2×300g的DGLA的加工中遵循草案工艺描述以提供足以用于稳定性研究项目的HETrE。所述PD包括以下示例性步骤：

1.通过将硼酸(61.8g，1mol)和NaOH(120.0g；3mol)装入10L水中并搅拌直至溶解来制备0.1M硼酸钠缓冲液。

2.将10.0L的0.1M硼酸钠缓冲液装入氢化容器。

3.装入半胱氨酸(237.2g；1.958mol；2.0eq)并搅拌直至溶解。

4.将DGLA(300.0g；9.79mol；1.0当量/重量/体积)装入缓冲溶液并冷却至0-5℃。

5.使用校准的pH探针检查pH为约9.3-9.6。

6.如果需要的话用4M NaOH溶液调节pH。

7.将LPX1酶粉末(5.30g，17.7mg/g DGLA；1.8兆单位/克DGLA，1.77重量％)装入冷反应溶液。

8.用最少2巴纯氧气对反应容器加压。

9.在2巴氧气压力下、在0-5℃下搅拌反应1小时。

10.缓慢释放氧气压力以避免起泡。

11.化学工作者检查：移出等分试样；使用固体柠檬酸将提取物酸化至pH 3并用MTBE提取。经Na₂SO₄干燥，过滤并在旋转蒸发仪上去除溶剂并通过¹H NMR分析残余物以确定DGLA至HPETrE/HETrE的转化率。

12.添加另外的LPX1酶粉末(1.06g，3.5mg/g DGLA，0.36兆单位/克DGLA，0.35重量％)和1当量的半胱氨酸(119.0g；0.979mol)并在氧气下再搅拌1.5小时。

13.分析氧化完成度-移出反应混合物的等分试样，用相等体积的MeOH淬灭，并通过CAD检测分析以显示原料的消耗。如果残余DGLA<10g/kg(通过HPLC/CAD)，则通过。如果IPC失败，则在氧气压力下再持续搅拌一小时并重复分析。

14.分析还原完成度-移出等分试样；使用固体柠檬酸将提取物酸化至pH 3并用MTBE提取。经Na₂SO₄干燥，过滤并在旋转蒸发仪上去除溶剂并通过¹H NMR和/或UPLC/UV分析残余物以确定无残余HPETrE。在试验期内，避免样品接触氧气并无延迟地进行过氧化物测试。如果利用NMR和/或UPLC/UV可检测到无15-HPETrE，则通过。过氧化值为FIO。如果IPC失败，则添加半胱氨酸(59.5g，0.489mol，0.5eq)并且在氮气毯覆下再持续搅拌4至8小时并重复分析。

15.用氮气(×3)净化反应混合物。

16.在氮气流下将反应器内含物转移至25L转鼓。

17.将反应混合物装入氮气毯覆的约15L容器。

18.以多份将固体柠檬酸(按需要，装料表(表16，附录1)仅作为指导)装入搅拌的氮气毯覆的反应混合物，用校准的pH计检查pH。调节至pH≤3.5。等待pH稳定，然后添加每个下一部分。记录添加时间、pH趋势和观测结果。

19.停止搅拌并在烧结漏斗上过滤沉淀的固体。在过滤期间施加外部氮气毯覆。

20.将水性滤液层转移至10L转鼓。

21.将湿滤饼再转移回提取容器。将MtBE(3L)装入提取容器。

22.搅拌10分钟并使其静置。

23.停止搅拌并在烧结漏斗上过滤沉淀的固体。在过滤期间施加外部氮气毯覆。

24.将有机滤液转移至洁净的10L转鼓。

25.再重复步骤21至24两次。

26.蒸发粗产物溶液直至在250毫巴/40℃浴下的蒸馏物收集变得缓慢。用氮气排空旋转蒸发仪。在蒸发结束之前，将溶液转移至配衡的1L烧瓶。尽可能好地避免接触空气。

27.测定粗重量，并获取NMR样品用于15-HETrE:MtBE摩尔比率(FIO)。趁新鲜获取FIO样品用于过氧化物测试并无延迟地分析。获取FIO样品用于通过UPLC/UV分析粗纯度。

28.在氮气下在-80℃下储存粗产物。

29.将粗HETrE以80g的部分溶解在1体积环己烷中并施加至用环己烷预洗脱的Biotage 75L二氧化硅滤筒。用10％MtBE:环己烷起始直至50％MtBE:环己烷从柱洗脱产物。

30.基于TLC预合并产物级分。

31.分析柱级分纯度-移出预合并产物级分的等分试样并通过UPLC分析。如果面积％纯度>95％，则通过。如果IPC失败，则将级分置于一旁以用于再次纯化。

32.合并含有适当纯产物的级分。

33.在40℃下在旋转蒸发仪上去除溶剂。用氮气排气。

34.在搅拌下在高真空下将物质干燥至恒定重量。

35.在氮气下释放真空。

36.分析残余溶剂-移出干燥产物的等分试样并通过GC-顶空分析。如果残余溶剂低于ICH限度(<5000ppm MtBE，3880ppm环己烷)，则通过。如果IPC失败，则使散装物质返回高真空泵并持续干燥24小时并重复分析。

37.在氮气毯覆下转移至配衡的琥珀色瓶并储存在80℃下。

实施例15：反应器清洁

DGLA和HETrE残余物易溶于醇如乙醇和甲醇、或丙酮中。半胱氨酸可溶于水(280g/L，在25℃下)和乙醇(1.5g/100g乙醇，在19℃下)中并且胱氨酸可溶于加热的1M HCl(50g/L)和碱性溶液中。

将从反应处理收集的550mg固体在加热下在12mL的1M HCl中浆化。大部分物质在50℃下加热下溶解。可见少量的不溶性物质。添加另外的1M HCl(12mL)不允许粘性固体溶解。通过过滤收集残余物质(14mg，湿，2.5％)。

将550mg所收集固体在10mL的4M NaOH中在(加热枪)加热下浆化。大部分物质溶解，但仍可见少量的不溶性物质。添加另外的NaOH(10mL)并未使固体溶解。

在进行10L反应后，用水和甲醇清洁氢化容器以去除沉淀的半胱氨酸/胱氨酸等。在15L玻璃容器中处理反应混合物后，将反应器用苛性溶液(约0.5M)清洁，加热至80℃并搅拌过夜，接着用丙酮冲洗以几乎完全离开容器。

实施例16：热危害评估

高级反应系统筛选工具(Advanced Reactive System Screening Tool，ARSST)是可以快速和安全地鉴别过程工业中的潜在化学危害的有效量热仪。

合成反应(方案2)涉及在硼酸钠缓冲液中使用脂氧合酶将DGLA过氧化。然后在半胱氨酸存在下将所得过氧化物(15-(S)-HPETrE)原位还原成最终产物15-(S)-HETrE。所述反应预期以1锅程序在0-5℃下进行。主要关注的是，高温可产生不利的热事件，特别是随着在反应过程期间形成过氧化物。

将所有试剂以已经在实验室中制备的水溶液形式装入ARSST单元中。溶液浓度为起始试剂的约5％w/w。将约10g的溶液以一批转移至ARSST容器，应用压力垫并且操作开始。所述操作在250℃下终止以避免水沸腾出。

在添加前容器中的温度是21℃。自加热速率是约0.9℃/min。在反应过程期间未观测到显著的放热(图9)。使用高级反应系统筛选工具(ARSST)或直接扫描量热法(DSC)观测到没有热危害。

在测试范围(至多140℃)内未观测到进一步放热。在操作过程中未观测到气体逸出。在100℃下自加热速率下降是由于可能从产物分解形成挥发性化合物，未观测到永久气体形成(图10)。

使用反应溶液(约10g)进行另一个操作，其中已省略半胱氨酸还原剂并且因此主要含有中间体过氧化物，因为在这种情况下最有可能观测到任何潜在的热危害(图11)。

检测到具有40℃的起始温度且ATR为13℃的放热线。背景加热速率为0.9℃/min。在约116℃下，由于形成挥发物，自加热速率开始下降，这可能是产物的分解。如前，在这个反应中不存在任何气体逸出的证据(图12)。

在这个反应中观测到起始温度为40℃并且ATR为13℃的放热线。因为反应在0-5℃下操作，所以它不太可能成为问题。因为在反应期间的过氧化物水平较低，所以在标准反应条件下不可能观测到明显的放热。在这个反应中未观测到明显气体逸出。反应在0-5℃的所提出温度范围下操作是安全的。

通过DSC分析纯HETrE的样品，在20至300℃的范围内，加热速率为2、5、10和20℃/min。未观测到显著放热，但在约40℃下观测到轻微吸热，这可能是由于从样品蒸发的残余溶剂(MtBE)。

实施例17：稳健性研究

使用修改方法，在O₂下的延长反应时间(达4小时)不显示对产物质量的任何不利影响。

在75℃的外部温度下在40％MtBE:环己烷中回流延长时间(4.5天)不造成HETrE的显著降解。先前，在真空下在50℃下加热的纯HETrE(1822-129-4E)显示降解(观测到1种主要杂质，其已被鉴别为自身形成的酯)。

实施例18：15(S)-HPETrE/HETrE对反应时间延长的稳定性的研究

多个反应已给出关于在反应各个阶段下的稳健性的有用信息。这些总结于表14中。

表14.显示反应稳健性的实验的细节

先前，使用原始加工条件(产生氢过氧化物，接着使用硼氢化钠还原成HETrE)，观测到在氧气压力下的延长时间(4小时)导致形成过氧化杂质(实验1822-063)，如通过¹HNMR(图14)和LC-MS(图13)所判定。在RT约7.8下的峰具有m/z 337，符合二-HETrE并且吸光度在267nm下最大，其符合化合物的三烯性质。

进行初始反应(1822-193)，其中使用如前相同的酶载量(13.7兆单位/克DGLA)形成氢过氧化物中间体，然后添加2当量的半胱氨酸还原剂并在O₂/空气下再搅拌3.5小时。¹HNMR特征曲线(图14)与关于1822-163所得类似。由于高酶载量或氢过氧化物对氧气的反应性质，氢过氧化物中间体似乎发生过氧化。

在下一实验(1822-195)中，在反应开始时添加2当量的半胱氨酸还原剂，其在O₂压力下搅拌30分钟。在¹H NMR光谱中可见一些残余DGLA，加上HETrE和HPETrE和少量的过氧化杂质的混合物。在大气条件下储存过夜后，杂质分布似乎略微更差，HPETrE没有进一步减少，这表明半胱氨酸都已经被氢过氧化物或氧气氧化。

在实验1822-197中，在反应开始时添加3当量的半胱氨酸似乎降低了过氧化，但它也减缓了DGLA向HETrE的转化。据推测，过量半胱氨酸加速酶活化HPETrE的还原并且这可能造成过氧化的缺乏以及惰性的反应。

然后进行实验1891-001至1891-005，其中酶载量分别降至3.6、1.8和0.9兆单位酶活性/克DGLA底物。在反应开始时添加2当量的半胱氨酸，将其放置在O₂压力下1小时，然后通过¹H NMR分析并且然后再添加1当量的半胱氨酸并在空气或O₂压力下再搅拌1小时。通过¹H NMR观测到无过氧化杂质(图14)，但通过UPLC在252nm下可见低水平。

根据¹H NMR，其中使氧气连续鼓泡通过反应混合物持续6.5小时的发酵罐反应1891-009显示无过氧化产物。在这种情况下，溶液中的活性酶浓度总是处在低水平。

反应1891-029在氧气下搅拌3小时并在空气下储存过周末。根据¹H NMR可见可忽略量的过氧化杂质(图14)。

规模放大批料1891-051(1.8兆单位/克DGLA)在O₂压力下维持2.5-3.75小时，如通过¹H NMR分析所判定，对纯度无严重影响。

实施例19：在溶剂去除条件下的稳定性

进行热稳定性试验，其中将HETrE(约9.1g)于500mL 40％MtBE:环己烷中的溶液在400毫巴真空(冷凝器冷却剂温度-0℃)下在75℃(外部油浴温度)下加热。这形成温和回流。使溶液避光。在氮气气氛下在多个时间点抽取样品，并通过UPLC(252nm)分析(图15)。

所述条件被设计成模拟在工厂规模上从汇集柱级分去除溶剂时可能遇到的条件。在6小时后，未检测到纯度显著降低。再持续回流112小时。未观测到纯度显著降低，在RT12.2分钟下也不存在二聚体杂质形成的快速增加，但从0.44％增加至0.64％。

实施例20：对于反应完成度IPC的非NMR方法的研究

使用相对于w/w DGLA标准物的化学喷雾式检测(CAD)方法来测定反应混合物中的残余DGLA。基于从反应混合物移出等分试样来评估先前反应的反应完成度并微型处理，接着¹H NMR分析。然而，这种方法是不理想的，因为残余DGLA与HETrE产物信号之间存在一些重叠(图16)。

替代方法是优选的。因为DGLA在高于210nm时不吸收，所以UV分析减低。发现电雾式检测(charged aerosol detection，CAD)是合适的方法，其中将比较IPC样品与0.1％w/wDGLA标准物。所述IPC样品将从反应中抽取并用50％甲醇淬灭以使酶变性，然后进行分析。这种方法将允许更精确测定反应样品中的残余DGLA水平。

实施例21：杂质的LC-MS研究

通过LC-MS和MS-MS分析在PRD发展过程期间制备的纯化15(S)-HETrE和富集杂质的前馏分和尾馏分。基于所提供的DGLA说明书和所获得的数据，对所观测杂质提出初步结构。基于DGLA原料的说明书，所存在的三种主要杂质(图20)是20:2ω6(二十碳二烯酸(EDA)，C₂₀H₃₆O₂，RMM 308.48)、20:3ω3(二十碳三烯酸(ETE)C₂₀H₃₄O₂，RMM 306.48)和20:4ω3(二十碳四烯酸(ETA)，C₂₀H₃₂O₂，RMM 304.48)，根据GC分析分别具有1.1％、1.6％和0.4％的FAME面积％。根据FAME GC分析，此外存在另外2种未鉴别的杂质，各自为0.2％面积(FAME)面积，得到总共3.5面积％的杂质。

表15中包括从纯化产物(1891-051-7A)鉴别的物质的初步结构。在m/z323(RT7.68分钟)和319(RT 6.3分钟)下在纯化物质中鉴别的主要杂质符合EDA和ETA的羟基化产物(分别是HEDA和HETE)。在纯化物质中未检测到与ETE的羟基化有关的立即可鉴别杂质(预计m/z 321)，但在尾馏分中，在主要HETrE产物峰上观测到具有m/z 321(RT 7.19分钟)的峰。第三主要杂质具有m/z 583(RT 11.41)，其可能与在12.22分钟下可见的二聚体产物有关，其中m/z为625。最初，这被假定为由于Diels Alder机制或自酯化而形成。对已经储存在+25℃下的样品(来自稳定性研究1773A0030E的样品229)进行LC MS-MS(图21)，其中这种二聚体杂质已增加。

表15.基于LC-MS和MS-MS分析的纯化15-(S)-HETrE中存在的杂质的初步结构

杂质分子式是C₄₀H₆₆O₅。片段化模式支持杂质的酯-二聚体性质。通过MS/MS算法鉴别得到子离子，其具有与HETrE相同的分布，这是来自酯裂解的预期模式(图22)。

实施例22：从EPA制备15(S)-HEPE

通过将硼砂(194g，0.508mol)完全溶解在去离子水(5L)中来进行反应。添加L-半胱氨酸(40g，0.33mol)并在25至30℃下搅拌30分钟。添加PPG-2000(消泡剂，2mL)并且使用4M NaOH将反应物质pH调节至9.55-9.65。添加EPA(50g，0.165mol)并在25至30℃下搅拌30分钟。将反应物质冷却至0至5℃并添加LPX1酶(1.25g，2.49％)。用氧气(商业级，99.5％)(1Kg×2)净化反应混合物并且用氧气(2.2Kg)对反应容器加压。将反应混合物在0-5℃下在氧气压力(2.2Kg)下搅拌1小时。在EPA完全转化后，将物质用氮气(I级，1Kg×2)脱气。添加L-半胱氨酸(20g，0.165mol)并且用氮气(I级，2.2Kg)对反应容器加压。将物质在0至5℃下搅拌1小时。在过氧中间体完全转化后，释放氮气压力；使物质从反应器卸载并用DM水(150mL×2)冲洗。使用40％w/w柠檬酸溶液将粗物质的pH调节至3.0-4.0，接着添加MTBE(1L)。将双相层搅拌30分钟并过滤。将主要滤液进行层分离并且用MTBE(500mL×2)洗涤残余物。将洗涤残余物的MTBE用于提取分离的水层。将有机层合并，经无水硫酸钠(15g)干燥并过滤。将滤液在真空下在30至35℃下浓缩，得到呈浅黄色液体状的I段物(48g)，HPLC纯度为95.00％。

通过将I段物(30g，0.094mol)溶解在无水丙酮(300mL)中来进行15(S)-HEPE的酯化。添加碳酸钾(68.36g，0.495mol)和溴乙烷(30.8g，0.283mol)并且将物质在25-30℃下搅拌48小时。在I段物完成后，在10至20℃下向反应物质中添加冷冻DM水(120mL)和盐水溶液(30mL)。使反应物质达到25至30℃并且然后搅拌60分钟。分离双相层并且在25-30℃下在真空下浓缩顶部有机层以蒸馏出溶剂。向粗物质中添加己烷(225mL)并且将物质在25-30℃下搅拌30分钟。分离出双相层并且用盐水溶液(15％，90mL)洗涤顶部有机层。所述有机层经无水硫酸钠(4.5g)干燥并过滤。向滤液添加norit活性炭(SX plus，3g)并搅拌1小时。在通过celite垫过滤黑色溶液后，向滤液添加硅胶(100-200目，20％)并且然后搅拌1小时。在过滤浆液物质后，在25至30℃下在真空下浓缩滤液以蒸馏出溶剂。用MTBE(90mL×2)跟踪浓缩物质并且得到呈浅黄色液体状的II段物(21.73g)，HPLC纯度为97.13％。

结论和建议

DGLA的新型一锅生物氧化/还原得到类似纯度的15(S)-HETrE材料，产率显著增加(76％，相对于两步法的53％)，同时仅使用较小分数的酶载量和更少的提取和色谱溶剂。

以依序一锅模式使用的先前的还原剂硼氢化钠已经被用作原位还原剂的半胱氨酸取代。这避免了在反应和处理期间的氢气产生，否则在更大规模上将成问题，涉及对于质量和产率具潜在危险的长淬灭时间。使用半胱氨酸的额外优点是可以在反应开始时、即在生物氧化步骤之前添加还原剂。因此所产生的氢过氧化物中间体随着其形成而原位还原，从而避免了由高水平的氢过氧化物造成的酶失活，以及避免了由于过氧化和氢过氧化物中间体降解而导致的杂质形成。这已导致所需脂氧合酶载量降低7.6倍。与另一种较廉价供应的冷冻干燥酶组合，这导致酶成本贡献总降低15倍。

与努力降低酶载量需求一起的酶源研究已经揭示出，从大豆粉提取的脂氧合酶现在是用于15-(S)-HETrE工艺的有效酶源。其被视为大规模制造的长期选择，其中尚未开发合适的大豆粉去除技术。在短期内和对于较小的多千克制造，建议使用冷冻干燥的分离酶，因为其较高成本被额外大豆粉加工操作的非必要性抵消。

处理程序已经从使用昂贵的己烷和MtBE溶剂混合物形成乳液的提取简化成反应沉淀物与MtBE的简单浆液以分离出粗产物。使用固体柠檬酸而非10％溶液将反应混合物酸化有助于降低反应体积。

由于较清洁的反应概况，已经修改柱纯化条件以降低所消耗的溶剂量，同时也用更良性的环己烷置换毒性己烷。这具有降低溶剂蒸发期间的加工时间的额外优点并且因此降低产物降解的相关风险。15(S)-HETrE于溶液中和对于暴露于热表面的热稳定性的研究已经显示，在工厂典型的溶剂蒸发条件下，在<2天的时间表上不应出现显著降解。最终，仍需要从柱色谱移出以通过盐、共晶体或其他衍生物的结晶纯化，以期大规模>100kg的制造成本降低。

新加工方法包括在所有合适的阶段在惰性气氛下处理材料，以试图降低氧气暴露和因此过氧化物和后续降解产物的产生。所得过氧化值现在在10-15的范围中，相比于先前获得的90+的值。来自稳定性试验的结果表明，材料的初始质量对所观测的稳定性(酯形成减低)具有正面影响。

通过LC-MS试图鉴别纯化物质中的主要杂质(>0.10％面积)表明它们主要源自起始DGLA。此外可观测到自酯化产物，其量在较高温度(>-20℃)下随时间增加。杂质鉴别状态足以用于早期临床测试和相关制造。

如目前所设计的方法未展现任何限制热危害，当反应混合物达到40℃时观测到轻微温度上升，但随着温度将维持在0-5℃，这将不会成为安全工艺规模放大的障碍。

总之，由这种工作方案产生的所开发方法现在适合安全目的和符合cGMP的稳固的早期多千克规模放大制造。

优点

Claims

1.一种制备脂肪酸的15-羟基衍生物的方法，其中使用半胱氨酸作为还原剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在反应中使用小于400兆单位/克的所述脂肪酸。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中产率为至少约50％。

4.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述15-羟基衍生物是15(S)-HETrE。

5.根据任何前述权利要求所述的方法，其包括氧化所述脂肪酸以形成15-过氧氢脂肪酸中间体并还原所述中间体以形成所述15-羟基衍生物。

6.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述15-羟基衍生物是15(S)-羟基二十碳五烯酸。