CN106153952A - 牛奶中β‑受体激动剂含量的定性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛奶中β‑受体激动剂含量的定性检测方法，包括：(1)通过酶联免疫法分别对本底物、阳性质控品及待测牛奶进行检测，得到本底物的OD值、阳性质控品的OD值及待测牛奶的OD值，其中，所述阳性质控品为含有已知含量β‑受体激动剂的复原乳；所述本底物为不含β‑受体激动剂的复原乳，所述复原乳是通过将购自新西兰全脂乳粉溶解于水中所得到的；(2)基于检测结果，对所述待测牛奶进行定性判定。本发明的方法操作简便、准确性强。
Description
技术领域
本发明涉及食品领域。具体地，本发明涉及牛奶中β-受体激动剂含量的定性检测方法。
背景技术
β-受体激动剂多由苯乙醇胺与叔丁基或异丙基连接而成，根据母核结构中苯环上取代基的不同分为苯胺型、苯酚型和间苯二酚型3类，代表化合物有克仑特罗、沙丁胺醇等。β-受体激动剂在动物体内能促进脂肪分解，增加蛋白质的合成，提高酮体的瘦肉率，但是大剂量的使用容易在可食性动物组织中残留。人类食用了有药物残留的组织后会引发呼吸加剧、头痛、恶心和肌肉震颤等中毒症状，可诱发和加重心脑血管系统患者的病情，甚至导致死亡。因而，我国已经明确将这类药物列入饲养食品动物禁用药品目录。
然而，目前对β-受体激动剂含量的检测方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种牛奶中β-受体激动剂含量的定性检测方法，该方法操作简便、准确性强。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
动物源性食品中β-受体激动剂多采用气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)进行检测。但是，利用色谱法检测处理步骤较多，耗时长，消耗大量的有机溶剂，而且两相分离时容易造成被测物的损失，不适用于大批量样品检测。
进而，发明人发现，利用酶联免疫法检测β-受体激动剂具有操作简便、反应快速、无需大量待测液即可完成检测的优点，可以快速且准确地对大批量的牛奶进行检测。但是，由于牛奶本身成分差异大，对试剂干扰较大，存在假阳性发生率较高的缺陷。
有鉴于此，发明人意外地发现，将购自新西兰全脂乳粉溶解于水中制成复原乳，以含有已知含量β-受体激动剂的复原乳作为阳性质控品，以不含β-受体激动剂的复原乳作为本底物，利用酶联免疫法分别测定待测牛奶OD值、阳性质控品OD值及本底物OD值，从而能够基于检测结果对待测牛奶的β-受体激动剂含量进行定性判断。该方法操作简便、准确性强。
为此，本发明提出了一种牛奶中β-受体激动剂含量的定性检测方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)通过酶联免疫法分别对本底物、阳性质控品及待测牛奶进行检测，得到本底物的OD值、阳性质控品的OD值及待测牛奶的OD值，其中，所述阳性质控品为含有已知含量β-受体激动剂的复原乳；所述本底物为不含β-受体激动剂的复原乳，所述复原乳是通过将购自新西兰全脂乳粉溶解于水中所得到的；(2)基于下列标准，对所述待测牛奶进行定性判定：(a)所述待测牛奶的OD值小于所述阳性质控品的OD值，是所述待测牛奶中β-受体激动剂含量大于所述阳性质控品中β-受体激动剂含量的指示；(b)所述待测牛奶的OD值大于或等于所述阳性质控品的OD值，是所述待测牛奶中β-受体激动剂含量小于或等于所述阳性质控品中β-受体激动剂含量的指示；或(c)所述本底物的OD值小于所述阳性质控品的OD值，是检测结果无效的指示。
发明人发现，在检测牛奶中β-受体激动剂含量过程中，为提高检测效率、节约成本，可以先采用酶联免疫法对待测牛奶进行定性检测，以初步确定β-受体激动剂含量的范围，再对无法确定含量范围或需要进一步确定准确含量的待测牛奶进行色谱检测。定性检测主要是将检测试剂分别与待测牛奶、阳性质控品、本底物进行反应，并测定反应产物的OD值，通过OD值的比较以确定含量。
发明人意外地发现，利用不同物质作为阳性质控品所得到的检测结果不同。经过深入研究发现，对于不同厂家或不同产地的牛奶而言，因本身成分并不相同，作为阳性质控品进行检测时，会对反应体系造成不同影响，某些产品对反应体系的干扰较大，导致检测结果不准确。发明人惊奇地发现，将购自新西兰全脂乳粉溶解于水中所得到的复原乳对反应体系的干扰较小，通过向上述复原乳中加入已知含量β-受体激动剂，制成阳性质控品，能够有效地避免假阳性或假阴性现象出现，从而保证检测结果的准确性。具体地，新西兰全脂乳粉可以购自恒天然公司。
进一步地，发明人发现，仅比较阳性质控品与待测牛奶的OD值，并不能完全准确地保证结果的准确性，还需比较本底物(与阳性质控品的区别仅在于不含已知含量β-受体激动剂)与阳性质控品的OD值。若本底物的OD值低于阳性质控品的OD值，则说明检测试剂、操作过程等出现问题，检测结果无效。
由此，根据本发明实施例的牛奶中β-受体激动剂含量的定性检测方法能够准确、快速地对牛奶中β-受体激动剂含量进行定性检测，且操作简便。
需要说明的是，本领域技术人员可以根据实际需要确定阳性质控品中β-受体激动剂的含量。根据本发明的实施例，所述阳性质控品含有0.15ng/mL的β-受体激动剂。在此条件下，待测样品本底(除β-受体激动剂)的OD值显著低于阳性质控品的OD值，从而避免了样品本底对检测结果的影响，防止出现假阳性现象。若阳性质控品中β-受体激动剂浓度太高，容易造成阳性样品的漏检，存在风险；而浓度过低，测定待测样品OD值时，样品本底的OD值与阳性质控品的OD值接近，导致出现假阳性现象。
根据本发明的实施例，在进行步骤(1)之前，分别将所述本底物、阳性质控品及待测牛奶进行离心处理，并将收集的上清液进行所述酶联免疫法检测。根据本发明的另一个实施例，所述离心处理是在2～8℃的温度、3000g的转速下进行10min。发明人发现，通过酶联免疫法进行检测之前，分别将本底物、阳性质控品及待测牛奶进行离心处理，能够有效地除去杂质，从而避免其对反应体系造成干扰，影响检测结果。发明人经过大量实验得到上述最优离心处理条件，在此条件下能够有效地除去杂质，从而保证检测结果的准确性。
根据本发明的实施例，所述OD值是在450nm波长下进行测定的。发明人发现，在此波长下，β-受体激动剂具有最大的光吸收，进而能够基于OD值结果对牛奶中β-受体激动剂含量进行定性检测。
根据本发明的实施例，所述复原乳中新西兰全脂乳粉与水的质量比为1:7。发明人经过大量实验发现，将新西兰全脂乳粉按照1:7的质量比溶解于水中所得到的复原乳的干扰较小，从而保证检测结果的准确性。
在本发明的第二方面，本发明提出了另一种牛奶中β-受体激动剂含量的定性检测方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：1)分别将本底物、阳性质控品及待测牛奶在2～8℃的温度、3000g的转速下离心10min，并收集上清液，分别将所述上清液加入微孔管中，每孔50μL，其中，所述阳性质控品为含有已知含量β-受体激动剂的复原乳；所述本底物为不含β-受体激动剂的复原乳，所述复原乳是通过将购自新西兰全脂乳粉按照1:7的质量比溶解于水中所得到的；2)分别向含有所述本底物、阳性质控品和待测牛奶的微孔管中加入25μL酶结合物；3)分别向含有所述酶结合物的微孔管中加入25μL抗体溶液；4)用胶条封板，并摇板1min，于2℃-8℃下在暗处孵育1小时；5)除去所述微孔管中的液体，并向所述微孔管中注入250μL清洗液，混匀并倒掉微孔管中液体，重复操作3遍；6)分别向所述微孔管中加入100μL底物溶液，置于20-25℃下暗处温育30min；7)分别向含有所述底物溶液的微孔管中加入100μL终止液，并读取450nm波长下的吸光值；8)基于下列标准，对所述待测牛奶进行定性判定：(a)所述待测牛奶的OD值小于所述阳性质控品的OD值，是所述待测牛奶中β-受体激动剂含量大于所述阳性质控品中β-受体激动剂含量的指示；(b)所述待测牛奶的OD值大于或等于所述阳性质控品的OD值，是所述待测牛奶中β-受体激动剂含量小于或等于所述阳性质控品中β-受体激动剂含量的指示；或(c)所述本底物的OD值小于所述阳性质控品的OD值，是检测结果无效的指示。由此，根据本发明实施例的牛奶中β-受体激动剂含量的定性检测方法能够准确、快速地对牛奶中β-受体激动剂含量进行定性检测，且操作简便。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
1、试剂及溶液。
β-受体激动剂检测试剂盒，购自荷兰EP公司。
本底物：复原乳，通过将购自新西兰恒天然公司的全脂乳粉按照1:7的质量比溶解于水中所得到的。
阳性质控品：含有已知含量β-受体激动剂的复原乳。
2、设备仪器。
BioTek公司的ELx808酶标仪，检测波长为：450nm。
Waters premier超高效液相色谱串联质谱联用仪。
3、操作步骤。
(1)将所需数量的微孔管取出并插入微孔板，记录微孔位置；
(2)分别将本底物、阳性质控品及待测牛奶在2～8℃的温度、3000g的转速下离心10min，并收集上清液，分别将所述上清液加入微孔管中，每孔50μL；
(3)分别向含有本底物、阳性质控品和待测牛奶的微孔管中加入25μL酶结合物；
(4)分别向含有酶结合物的微孔管中加入25μL抗体溶液；
(5)用胶条封板，并摇板1min，于2℃-8℃下在暗处孵育1小时；
(6)将微孔板上端朝下倒空各孔后，再平稳快速向下垂直甩动，并将微孔板倒置在吸水纸上拍打以除去管中的液体，用清洗液(250μL/孔)注入微孔管，混匀并再次倒掉微孔管中液体，重复上述操作3遍；
(7)分别向含有抗体溶液的微孔管中加入100μL底物溶液，置于室温(20-25℃)下暗处温育30min；
(8)分别向含有底物溶液的微孔管中加入100μL终止液，并立即读取450nm波长下的吸光值；
(9)基于下列标准，对待测牛奶进行定性判定：
(a)待测牛奶的OD值小于阳性质控品的OD值，则待测牛奶中β-受体激动剂含量大于阳性质控品中β-受体激动剂含量；
(b)待测牛奶的OD值大于或等于阳性质控品的OD值，则待测牛奶中β-受体激动剂含量小于或等于阳性质控品中β-受体激动剂含量；或
(c)本底物的OD值小于阳性质控品的OD值，则检测结果无效。
实施例2
准确性检测
取不含β-受体激动剂的4种牛奶样品中，按照下表所示的浓度向其中分别加入不同浓度β-受体激动剂标准品(市售)，得到加标牛奶，分别利用实施例1的方法及GB/T22965-2008《牛奶和奶粉中12种β-兴奋剂残留量的测定液相色谱-串联质谱法》(以下简称色谱法)对不同加标牛奶进行2次平行检测，其中本底物为不添加β-受体激动剂的复原乳，阳性质控品为添加0.15ng/mLβ-受体激动剂的复原乳。
结果如表1所示。在四种牛奶样品中分别添加β-受体激动剂标准品，添加浓度低于0.15ng/mL时，吸光值均高于阳性质控品(平均OD值为0.916)，均可定性判定为阴性；而添加浓度≥0.15ng/mL时，吸光值均低于阳性质控品，均可定性判定为阳性。添加标准品的样品经色谱法检测，确认了加标的浓度，证明本次实验的准确性。
表1准确性检测
注：阳性是指样品中β-受体激动剂含量大于等于0.15ng/mL，阴性是指样品中不含或者β-受体激动剂含量小于0.15ng/mL。
实施例3
假阳性率检测
取不含β-受体激动剂的4种牛奶样品中，按照下表所示的浓度向其中分别加入不同浓度β-受体激动剂标准品(市售)，得到加标牛奶，分别利用实施例1的方法、酶联免疫定量试剂盒及色谱法对不同加标牛奶进行2次平行检测，其中本底物为不添加β-受体激动剂的复原乳，阳性质控品为添加0.15ng/mLβ-受体激动剂的复原乳。
酶联免疫定量试剂盒检测过程如下：
(一)按照实施例1的步骤(1)～(8)测定待测样品的OD值，其中步骤(1)中无需设置本底物和阳性质控品；
(二)按照实施例1的步骤(1)～(8)测定不同浓度β-受体激动剂标准品的OD值(其中步骤(1)中无需设置本底物和阳性质控品)，绘制β-受体激动剂浓度-OD值标准曲线；
(三)将步骤(一)所测定的OD值代入标准曲线中，以便获得待测样品中β-受体激动剂含量。
结果如表2所示，其中，实施例1方法检测的OD450值的两栏数据中，左栏数据为样品中添加0ng/mL的β-受体激动剂的检测结果，右栏数据为样品中添加0.15ng/mLβ-受体激动剂的检测结果。实施例1方法的判定、试剂盒检测结果及色谱法检测结果的两栏数据的含义与上述描述相同，在此不再赘述。
可以看出，20个不同批次的牛奶样品，用酶联免疫定量试剂盒法检测时，7个结果高于0.15ng/mL，而用色谱法检测均为<0.1ng/mL，为假阳性结果，假阳性率为35％。主要原因可能是待测样品的本身成分较复杂，对试剂干扰较大，从而出现较高的假阳性现象。而用实施例1的方法检测本底检测结果均为阴性，假阳性率为0％，进而证明了本方法在保证检测结果准确的前提下，可以有效降低成品牛奶中β-激动剂检测的假阳性率，达到节约检测成本的效果。
表2假阳性率检测
注：阳性是指样品中β-受体激动剂含量大于等于0.15ng/mL，阴性是指样品中不含或者β-受体激动剂含量小于0.15ng/mL。
对比例1
分别选取新西兰脱脂乳粉复原乳、新西兰全脂乳粉复原乳、纯牛奶、麦香早餐奶作为阳性质控的本底物，对样品进行检测，以确定最适合的阳性质控物质，其中，“脱脂乳粉复原乳”是将购自新西兰恒天然公司的脱脂乳粉按照1:7的质量比溶解于水所得到的；“全脂乳粉复原乳”是将购自新西兰恒天然公司的全脂乳粉溶解于水所得到的；“纯牛奶”购自蒙牛公司；“麦香早餐奶”购自蒙牛公司。检测结果如表3～6所示，其中，实施例1方法检测的OD450值的两栏数据中，左栏数据为样品中添加0ng/mL的β-受体激动剂的检测结果，右栏数据为样品中添加0.15ng/mLβ-受体激动剂的检测结果。实施例1方法的判定、试剂盒检测结果及色谱法检测结果的两栏数据的含义与上述描述相同，在此不再赘述。
可以看出，以新西兰全脂乳粉复原乳为本底物及阳性质控品时，各样品本底检测结果均为阴性；以含有0.15ng/mLβ-受体激动剂的上述本底物作为阳性质控品，检测结果均为阳性，满足检测要求。
以纯牛奶为本底及阳性质控时，各样品本底检测结果均为阴性，满足检测要求；但添加β-受体激动剂，浓度为0.15ng/mL后，20个检测结果其中11个为阴性，假阴性率可达55％，存在较高的漏检风险。
以麦香早餐奶为本底及阳性质控时，各样品本底检测结果均为阴性，满足检测要求；但添加β-受体激动剂，浓度为0.15ng/mL后，20个检测结果其中18个为阴性，假阴性率可达90％，存在极高的漏检风险。
以新西兰脱脂乳粉复原乳为本底及阳性质控时，各样品共20个本底检测结果，其中3个为阳性，假阳性率为15％，存在需要复检，效率降低，造成浪费的可能；添加β-受体激动剂，浓度为0.15ng/mL后，检测结果均为阳性，满足检测要求。
综上，选取新西兰脱脂乳粉复原乳作为本底及阳性质控时，存在假阳性的概率，复检会造成效率降低，成本升高；而选择纯牛奶或者麦香早餐奶作为本底及阳性质控时，又存在漏检的可能性，存在较大安全隐患；新西兰全脂乳粉复原乳有效规避了上述缺点，因此选择新西兰全脂乳粉复原乳作为本底及阳性质控。
表3以新西兰全脂乳粉复原乳为阳性质控检测结果
注：阳性是指样品中β-受体激动剂含量大于等于0.15ng/mL，阴性是指样品中不含或者β-受体激动剂含量小于0.15ng/mL。
表4以纯牛奶为阳性质控检测结果
注：阳性是指样品中β-受体激动剂含量大于等于0.15ng/mL，阴性是指样品中不含或者β-受体激动剂含量小于0.15ng/mL。
表5以麦香早餐奶为阳性质控检测结果
注：阳性是指样品中β-受体激动剂含量大于等于0.15ng/mL，阴性是指样品中不含或者β-受体激动剂含量小于0.15ng/mL。
表6以新西兰脱脂乳粉复原乳为阳性质控检测结果
注：阳性是指样品中β-受体激动剂含量大于等于0.15ng/mL，阴性是指样品中不含或者β-受体激动剂含量小于0.15ng/mL。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (7)
1.一种牛奶中β-受体激动剂含量的定性检测方法，其特征在于，包括：
1)分别将本底物、阳性质控品及待测牛奶在2～8℃的温度、3000g的转速下离心10min，并收集上清液，分别将所述上清液加入微孔管中，每孔50μL，
其中，
所述阳性质控品为含有已知含量β-受体激动剂的复原乳；
所述本底物为不含β-受体激动剂的复原乳，
所述复原乳是通过将购自新西兰全脂乳粉按照1:7的质量比溶解于水中所得到的；
2)分别向含有所述本底物、阳性质控品和待测牛奶的微孔管中加入25μL酶结合物；
3)分别向含有所述酶结合物的微孔管中加入25μL抗体溶液；
4)用胶条封板，并摇板1min，于2℃-8℃下在暗处孵育1小时；
5)除去所述微孔管中的液体，并向所述微孔管中注入250μL清洗液，混匀并倒掉微孔管中液体，重复操作3遍；
6)分别向所述微孔管中加入100μL底物溶液，置于20-25℃下暗处温育30min；
7)分别向含有所述底物溶液的微孔管中加入100μL终止液，并读取450nm波长下的吸光值；
8)基于下列标准，对所述待测牛奶进行定性判定：
(a)所述待测牛奶的OD值小于所述阳性质控品的OD值，是所述待测牛奶中β-受体激动剂含量大于所述阳性质控品中β-受体激动剂含量的指示；
(b)所述待测牛奶的OD值大于或等于所述阳性质控品的OD值，是所述待测牛奶中β-受体激动剂含量小于或等于所述阳性质控品中β-受体激动剂含量的指示；或
(c)所述本底物的OD值小于所述阳性质控品的OD值，是检测结果无效的指示。
2.一种牛奶中β-受体激动剂含量的定性检测方法，其特征在于，包括：
(1)通过酶联免疫法分别对本底物、阳性质控品及待测牛奶进行检测，得到本底物的OD值、阳性质控品的OD值及待测牛奶的OD值，
其中，
所述阳性质控品为含有已知含量β-受体激动剂的复原乳；
所述本底物为不含β-受体激动剂的复原乳，
所述复原乳是通过将购自新西兰全脂乳粉溶解于水中所得到的；
(2)基于下列标准，对所述待测牛奶进行定性判定：
(a)所述待测牛奶的OD值小于所述阳性质控品的OD值，是所述待测牛奶中β-受体激动剂含量大于所述阳性质控品中β-受体激动剂含量的指示；
(b)所述待测牛奶的OD值大于或等于所述阳性质控品的OD值，是所述待测牛奶中β-受体激动剂含量小于或等于所述阳性质控品中β-受体激动剂含量的指示；或
(c)所述本底物的OD值小于所述阳性质控品的OD值，是检测结果无效的指示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述阳性质控品含有0.15ng/mL的β-受体激动剂。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在进行步骤(1)之前，分别将所述本底物、阳性质控品及待测牛奶进行离心处理，并将收集的上清液进行所述酶联免疫法检测。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述离心处理是在2～8℃的温度、3000g的转速下进行10min。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述OD值是在450nm波长下进行测定的。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述复原乳中新西兰全脂乳粉与水的质量比为1:7。
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