CN103134709A - 检测原料奶中孕酮含量的前处理方法及检测方法 - Google Patents

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刘志楠
喻东威
李梅
李海礁
刘晓川
薛志清
杜丽
解鑫
刘卫星
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Abstract

本发明提供了一种检测原料奶中孕酮含量的前处理方法，包括：取待测的原料奶，先于沸水浴中加热30-90秒，再于2000g-4000g的离心条件下离心5-15分钟，去除上层漂浮的脂肪层后，取上清液作为待测液。本发明的前处理方法能有效去除原料奶中的干扰物质。本发明还提供了一种利用上述前处理方法的检测原料奶中孕酮含量的方法，包括如下步骤：根据上述前处理方法对待测的原料奶进行处理，得到待测液；利用孕酮酶联免疫检测试剂盒对待测液中的孕酮含量进行检测，得到待测液的孕酮含量。本发明检测方法的准确性较高，方法的加标回收率为80%-110%，检测结果的相对标准偏差为3.8%-9.0%。

Description

检测原料奶中孕酮含量的前处理方法及检测方法
技术领域
本发明涉及一种检测孕酮含量的前处理方法，尤其适用于原料奶中孕酮含量的检测，本发明还提供了一种采用该前处理方法的检测方法。
背景技术
食品中性激素残留污染问题已引起全世界的广泛关注。乳及乳制品营养丰富，但在动物饲养过程中存在滥用性激素（如孕酮）的现象，导致乳类食品中性激素残留污染问题。对原料奶中孕酮含量进行检测，可有效控制原料奶的质量，提高后续产品的安全性。
目前，已可以通过酶联免疫吸附法快速检测原料奶中孕酮含量，其中前处理方法为：对待测的原料奶进行离心处理，去除上层脂肪层后其余部分用于检测。采用这种前处理方法无法有效去除样本中的干扰物质，处理后的样本用孕酮酶联免疫检测试剂盒检测时，其检测的准确性不理想。
现有的孕酮酶联免疫检测试剂盒常用于快速检测血液或尿液中的孕酮，但是如果直接使用这种试剂盒检测原料奶中的孕酮，准确度不高，难以实现快速检测的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测原料奶中孕酮含量的前处理方法，能有效去除原料奶中的干扰物质。
本发明的另一个目的是提供一种原料奶中孕酮含量的检测方法，通过特定的前处理方法去除原料奶中的干扰物质，再用于酶联免疫检测试剂盒检测，提高检测的准确性。
本发明提供了一种检测原料奶中孕酮含量的前处理方法，包括：取待测的原料奶，先于沸水浴中加热30-90秒，再于2000g-4000g的离心条件下离心5-15分钟，去除上层漂浮的脂肪层后，取上清液作为待测液。其中，离心的温度可以为2-8℃。
本发明还提供了一种检测原料奶中孕酮含量的方法，包括如下步骤：根据上述前处理方法对待测的原料奶进行处理，得到待测液；利用孕酮酶联免疫检测试剂盒对待测液中的孕酮含量进行检测，得到待测液的孕酮含量。
本发明的一种检测原料奶中孕酮含量的前处理方法，通过沸水浴加热和离心处理去除了原料奶中的干扰物质，尤其可以一定程度上去除原料奶中对检测结果有干扰的细菌。使用这种方法前处理后的原料奶特别适用于使用试剂盒快速检测其中的孕酮。
本发明的一种原料奶中孕酮含量的检测方法，通过上述方法对原料奶进行前处理后，再用酶联免疫检测试剂盒对其中的孕酮含量进行检测，得到原料奶中孕酮的含量。该检测方法将成本较低的酶联免疫检测试剂盒运用于检测原料乳，快速简便，准确性高，测得的加标回收率为80%-110%，检测结果的相对标准偏差为3.8%-9.0%。
具体实施方式
为了对发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现结合各实施例说明本发明的具体实施方式。
第一实施例：一种原料奶的前处理方法。
取待测的原料奶于离心管中，先于沸水浴中加热30秒，再于4℃的温度下、2000g的离心条件下离心8分钟，去除上层漂浮的脂肪层后，取上清液作为待测液。
第二实施例：一种原料奶的前处理方法。
取待测的原料奶于离心管中，先于沸水浴中加热90秒，再于2℃的温度下、3000g的离心条件下离心5分钟，去除上层漂浮的脂肪层后，取上清液作为待测液。
第三实施例：一种原料奶的前处理方法。
取待测的原料奶于离心管中，先于沸水浴中加热60秒，再于8℃的温度下、4000g的离心条件下离心15分钟，去除上层漂浮的脂肪层后，取上清液作为待测液。
第四实施例：一种原料奶中孕酮含量的检测方法。
1、试剂盒及酶标仪。
孕酮酶联免疫检测试剂盒：选用Biostest公司的Progesterone Elisa试剂盒，货号为DS314301。
酶标仪：选用BioTek公司的Elx808酶标仪。
2、检测步骤：
1）按照第一实施例所述前处理方法对待测的原料奶进行前处理，得到待测液。
2）取出微孔板，分别取25μL标准品（孕酮含量分别为0 ng/mL、0.3 ng/mL、1.25 ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL和15 ng/mL）和25μL待测液到各自的微孔中，将微孔板于20℃孵育5分钟。
3）每孔加入200μL酶标记物，用手轻轻摇动混匀60秒，封板，再将微孔板于20℃避光孵育1小时。
4）将微孔内液体甩干，每孔加入300μL洗液，摇板10秒，弃掉洗液并将微孔板在吸水纸上拍干。
5）重复步骤4）3次。
6）每孔加入200μL发色剂，用手轻轻摇动混匀，再将微孔板于20℃避光孵育15分钟。
7）每孔加入100μL反应终止液，用手轻轻摇动混匀。设定酶标仪于450nm处，测定每孔的吸光度值。
8）以标准品对应孔的吸光度值为纵坐标、标准品浓度为横坐标构建标准曲线，拟合方式为四参数逻辑拟合。将待测液对应孔的吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出所对应的浓度，即为待测液的孕酮含量，即为原料奶中孕酮含量。
3、检测方法的准确性验证。
取待测的原料奶，按下表所示孕酮添加水平向其中加入不同量的孕酮标准品（市购），得到加标原料奶，用本实施例的检测方法对加标原料奶进行三次平行检测，根据检测结果计算不同添加水平下的平均回收率和检测结果的相对标准偏差，计算结果如下表所示。
 
样本编号 孕酮添加水平 平均回收率 检测结果的相对标准偏差
加标原料奶1-1 0.5ng/mL 100% 8.1%
加标原料奶1-2 1.0ng/mL 80% 4.7%
加标原料奶1-3 1.5ng/mL 87% 5.3%
4、对比实验。
操作步骤：取上述加标原料奶，于4℃的温度下、2000g的离心条件下离心8分钟，去除上层漂浮的脂肪层后，取上清液作为对比待测液，按照本实施例检测步骤的步骤2）至8）中对待测液的检测方法对对比待测液进行检测，得到对比待测液的孕酮含量。按上述方法平行检测三次，根据检测结果计算不同添加水平下的平均回收率和检测结果的相对标准偏差，计算结果如下表所示。
 
样本编号 孕酮添加水平 平均回收率 检测结果的相对标准偏差
加标原料奶1-1 0.5ng/mL 37% 11.3%
加标原料奶1-2 1.0ng/mL 51% 9.4%
加标原料奶1-3 1.5ng/mL 46% 8.5%
第五实施例：一种原料奶中孕酮含量的检测方法。
1、试剂盒及酶标仪。
与第四实施例所述相同。
2、检测步骤：
按照第二实施例所述前处理方法对待测的原料奶进行前处理，得到待测液。其余步骤与第四实施例检测步骤的步骤2）至步骤8）所述相同。
3、检测方法的准确性验证。
取待测的原料奶，按下表所示孕酮添加水平向其中加入不同量的孕酮标准品（市购），得到加标原料奶，用本实施例的检测方法对加标原料奶进行三次平行检测，根据检测结果计算不同添加水平下的平均回收率和检测结果的相对标准偏差，计算结果如下表所示。
 
样本编号 孕酮添加水平 平均回收率 检测结果的相对标准偏差
加标原料奶2-1 0.5ng/mL 100% 9.0%
加标原料奶2-2 1.0ng/mL 110% 5.7%
加标原料奶2-3 1.5ng/mL 107% 6.8%
第六实施例：一种原料奶中孕酮含量的检测方法。
1、试剂盒及酶标仪。
与第四实施例所述相同。
2、检测步骤：
按照第三实施例所述前处理方法对待测的原料奶进行前处理，得到待测液。其余步骤与第四实施例检测步骤的步骤2）至步骤8）所述相同。
3、检测方法的准确性验证。
取待测的原料奶，按下表所示孕酮添加水平向其中加入不同量的孕酮标准品（市购），得到加标原料奶，用本实施例的检测方法对加标原料奶进行三次平行检测，根据检测结果计算不同添加水平下的平均回收率和检测结果的相对标准偏差，计算结果如下表所示。
 
样本编号 孕酮添加水平 平均回收率 检测结果的相对标准偏差
加标原料奶3-1 0.5ng/mL 90% 3.8%
加标原料奶3-2 1.0ng/mL 100% 5.1%
加标原料奶3-3 1.5ng/mL 93% 4.6%
根据上述实施例的实验结果可知，本发明检测方法的加标回收率为80%-110%，检测结果的相对标准偏差为3.8%-9.0%，回收率较高，相对标准偏差较低。参照上述实施例的对比实验，还可以发现本发明的加热步骤大大提高了检测结果的准确性，降低了检测结果的相对标准偏差。
应当理解，虽然本说明书是按照各个实施例描述的，但并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (3)

1.一种检测原料奶中孕酮含量的前处理方法，其特征在于，包括：取待测的原料奶，先于沸水浴中加热30-90秒，再于2000g-4000g的离心条件下离心5-15分钟，去除上层漂浮的脂肪层后，取上清液作为待测液。
2.如权利要求1所述的前处理方法，其中，所述离心的温度为2-8℃。
3.一种检测原料奶中孕酮含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
　　根据权利要求1或2所述的前处理方法对待测的原料奶进行处理，得到所述待测液；
　　利用孕酮酶联免疫检测试剂盒对所述待测液中的孕酮含量进行检测，得到所述待测液的孕酮含量。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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