CN106153921B - 生物标志物检测试剂在制备检测垂体腺瘤侵袭性的试剂盒中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了生物标志物检测试剂在制备检测垂体腺瘤侵袭性的试剂盒中的用途，以及用于检测垂体腺瘤侵袭性的试剂盒和生物标志物组合，可以应用于通过检测生物标志物的表达水平检测出患者垂体腺瘤的侵袭性，从而为了解垂体腺瘤的恶性程度，了解垂体腺瘤患者的预后及指导临床诊疗提供有效依据。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及生物标志物检测试剂在制备检测垂体腺瘤侵袭性的试剂盒中的用途。
背景技术
垂体腺瘤占原发性颅内肿瘤的10％-15％，是最常见的神经系统肿瘤之一。虽然垂体腺瘤整体上是良性肿瘤，但一部分肿瘤介于良、恶性之间，肿瘤呈侵袭性生长。Jefferson在1940年首次提出侵袭性垂体腺瘤的概念。1965年Martins将其定义为：“垂体腺瘤生长突破包膜或侵犯临近结构”。一般认为，侵袭性垂体腺瘤是介于良性腺瘤与垂体腺癌之间的病理类型，其组织学形态属良性但生物学特性却近似恶性肿瘤。可向蝶窦、两侧海绵窦、鞍上及鞍旁等周围结构浸润生长，手术中很难达到全切除。多项研究指出，垂体腺瘤侵袭和浸润周围组织是影响手术效果的关键因素，并与患者预后高度相关。
因此，有必要开发与垂体腺瘤侵袭性相关的蛋白标志物和检测手段，从而为更加简便、准确的了解垂体腺瘤的侵袭性、指导临床治疗提供有效途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种准确简便的检测垂体腺瘤侵袭性的方案。
为了实现上述目的，本公开提供了生物标志物检测试剂在制备检测垂体腺瘤侵袭性的试剂盒中的用途，其中，所述生物标志物选自EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc中的至少一种。
优选地，所述生物标志物为EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc。
另一方面，本公开提供一种检测垂体腺瘤侵袭性的试剂盒，其中，所述试剂盒包括生物标志物检测试剂，所述生物标志物选自EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc中的至少一种。
本公开还提供了垂体腺瘤侵袭性生物标志物组合，其中，包括EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc中的至少两种。
优选的，所述垂体腺瘤侵袭性生物标志物组合包括EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc。
本发明所提供的用途、试剂盒以及生物标志物组合可以应用于通过检测生物标志物的表达水平检测出患者垂体腺瘤的侵袭性，从而为了解垂体腺瘤的恶性程度和了解垂体腺瘤患者的预后及指导临床诊疗提供了有效依据。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本公开首先提供了生物标志物检测试剂在制备检测垂体腺瘤侵袭性的试剂盒中的用途，其中，所述生物标志物选自EGFL7(NCBI Gene ID:51162)、Notch3(NCBI Gene ID:4854)、EGFR(NCBI Gene ID:1956)、β-catenin(NCBI Gene ID:1499)和c-Myc(NCBI GeneID:4609)中的至少一种。
其中，EGFL7，又名VE-statin，即类表皮生长因子域-7，是V.Mattot在2006年发现的一个内皮特异性基因。
其中，Notch3属于由Notch基因编码的一类跨细胞膜受体，该类受体在人类中分为4类：Notch1、2、3、4。
其中，EGFR是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一，是NOTCH通路下游信号分子。
其中，EGFL7、Notch3、EGFR、c-Myc、β-catenin的表达水平均与垂体腺瘤的侵袭性正相关。
其中，本公开中所述的垂体腺瘤侵袭性，是指垂体腺瘤向蝶窦、两侧海绵窦、鞍上及鞍旁等周围结构浸润生长的程度。
在本公开的一种特别优选的实施方式中，所述生物标志物为EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc。所述生物标志物检测试剂为检测EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc表达水平的试剂。
在本公开中，生物标志物的表达水平为垂体腺瘤组织和/或患者血清中生物标志物的表达水平。
进一步地，检测生物标志物表达水平可以是通过以下步骤进行的：
1)获得待测样本；以及
2)确定样本中生物标志物的表达水平。
其中，步骤2)的方法可以选自PCR、Western印迹、North-Western印迹、免疫吸附测定、抗体微阵列、组织微阵列、免疫沉淀、原位杂交和其他免疫组织化学技术、放射免疫测定法和免疫酶测定法中的至少一种。
在本公开的一种实施方式中，所述方法为免疫组织化学技术检测方法或者为Western印迹检测方法。
另一方面，本公开提供一种检测垂体腺瘤侵袭性的试剂盒，其中，所述试剂盒包括生物标志物检测试剂，所述生物标志物选自EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc中的至少一种。
在本公开的一种特别优选的实施方式中，在所述试剂盒中包括检测EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc的表达水平的试剂。
进一步地，所述试剂为PCR、Western印迹、North-Western印迹、免疫吸附、抗体微阵列、组织微阵列、免疫沉淀、原位杂交和其他免疫组织化学技术、放射免疫测定和免疫酶测定试剂中的至少一种。
在使用本公开所述的试剂盒时，将待测样品中生物标志物表达水平与作为对照样品的确诊的不具有侵袭性的样品中生物标志物的表达水平进行比较，判断待测样品与对照样品相比的表达量差异。
当EGFL7表达量上调时，指征垂体腺瘤具有侵袭性。
当Notch3表达量上调时，指征垂体腺瘤具有侵袭性。
当EGFR表达量上调时，指征垂体腺瘤具有侵袭性。
当c-Myc表达量上调时，指征垂体腺瘤具有侵袭性。
当β-catenin表达量上调时，指征垂体腺瘤具有侵袭性。
本公开的一个方面还涉及垂体腺瘤侵袭性生物标志物组合，包括EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc中的至少两种。
优选的情况下，所述垂体腺瘤侵袭性生物标志物组合由EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc组成。当EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc的表达均上调时，指征垂体腺瘤具有侵袭性。
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1
收集312例垂体腺瘤的临床资料，按照Knosp分级分为侵袭组135例和非侵袭组177例。构建组织芯片，通过Leica-BOND III系统进行全自动免疫组织化学方法检测垂体腺瘤标本中EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc蛋白的表达水平，分析上述蛋白与垂体腺瘤侵袭等临床病理特征的相关性。
利用徕卡自动扫描仪进行扫描，扫描后进行分析，给出高低表达判读。当EGFL7、Notch3、EGFR、c-Myc、β-catenin表达颜色2分和3分的细胞占比分别达到51％-100％时，确定为高表达，低表达就是表达颜色1分的细胞占比1-100％或者2分和3分的细胞占比低于50％。
结果如表1所示，表1为垂体腺瘤侵袭组和非侵袭组中EGFL7、Notch3、EGFR、c-Myc和β-catenin的表达情况。
表1
由表1的结果可以得知，存在侵袭性的垂体腺瘤标本中EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin、c-Myc存在表达上调。
实施例2
采用实施例1的方法对实施例1中的312例垂体腺瘤标本(其中侵袭标本135例，非侵袭标177例)进行生物标记物的表达水平检测，区别仅在于，每例标本进行6次平行检测，每次检测的生物标志物的种类如表2所示。
表2
在第1组中，将EGFL7、Notch3、EGFR、和c-My均高表达的标本认定为侵袭组，共检测出侵袭标本74例。
在第2组中，将EGFL7、Notch3、EGFR和β-catenin均高表达的标本认定为侵袭标本，共检测出侵袭标本99例。
在第3组中，将EGFL7、Notch3、c-My和β-catenin均高表达的标本认定为侵袭标本，共检测出侵袭标本77例。
在第4组中，将EGFL7、EGFR、c-My和β-catenin均高表达的标本认定为侵袭标本，共检测出侵袭标本72例。
在第5组中，将Notch3、EGFR、c-My和β-catenin均高表达的标本认定为侵袭标本，共检测出侵袭标本62例。
在第6组中，将EGFL7、Notch3、EGFR、c-My和β-catenin均高表达的标本认定为侵袭标本，共检测出侵袭标本111例。
将各组检测出的侵袭标本数据与实际的侵袭标本数据进行比较，结果显示，第1组的准确率为55％，第2组的准确率为73％，第3组的准确率为57％，第4组的准确率为53％，第5组的准确率为46％，第6组的准确率为82％。
实施例3
本实施例通过Transwell实验鉴定垂体腺瘤细胞侵袭能力。
1、融化BD Matrigel为液态备用。
2、用无血清培养基，按1:8(Matrigel:无血清培养基)的体积比稀释Matrigel。
3、在Transwell小室上室中加入80μL已稀释的Matrigel工作液，在培养箱中，37℃孵育6小时，聚合Matrigel凝胶。
4、待垂体腺瘤细胞(GH3，购自ATCC)生长至汇合率为85％，状态良好时，消化细胞，用无血清培养基重悬细胞，计数调整密度至2×105个/ml获得细胞悬液。
5、包括五个处理组，其中处理组1-3：在Transwell小室(24孔板，8板)上室加入以上细胞悬液约200μl，再分为3个不同处理组分别添加Notch3抑制剂DAPT至终浓度为10μmol/L、EGFR抑制剂AG1478至终浓度为50nmol/L和c-Myc抑制剂10058-F4至终浓度为1μmol/L。在第4处理组中加入过表达EGFL7的GH3细胞株悬液(细胞密度2×105个/ml)。在第5处理组中加入过表达β-catenin的GH3细胞株悬液(细胞密度2×105个/ml)。同时在各处理组下室加入600μL含15％FBS的DMEM培养基，在37℃，5％的CO2条件下培养24小时，每个处理组重复3个样本。
6、用棉擦去除上室底部基质并用PBS漂洗移除未侵袭细胞。用4％PFA固定30分钟，PBS洗5次，3分钟/次。亚甲蓝溶液染色25分钟，自来水冲洗，PBS清洗3次，5分钟/次；取下聚碳酸脂膜，置于载玻片上，并覆盖盖玻片。
7、计数及统计学分析：随机选择10个40倍倒置显微镜统计视野中的总细胞数，以侵袭细胞的相对数目标示肿瘤细胞的侵袭能力。取平均值。采用Student-t检验，分析各组之间的差异是否具有统计学意义。结果如表3所示。
表3
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
Claims (2)
1.生物标志物蛋白表达水平检测试剂在制备区分侵袭性垂体腺瘤和非侵袭性垂体腺瘤的试剂盒中的用途，其中，所述生物标志物蛋白表达水平为所述生物标志物在垂体腺瘤组织中的蛋白表达水平，所述生物标志物由EGFL7、Notch3、EGFR、β-catenin和c-Myc组成。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述生物标志物蛋白表达水平检测试剂为抗所述生物标志物的抗体。
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