CN106134998A - 一种金线莲组培培养基及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金线莲组培培养基及其制备方法和应用，该培养基，每升MS培养基中添加琼脂5g、旱莲草提取液20‑28g、仙茅提取液15‑23g、珍珠母12‑20g、高岭土3‑10g。将旱莲草粉碎，加入柠檬酸水溶液浸提2次，浓缩得旱莲草提取液；将仙茅粉碎，加入去离子水、煎煮，加入无水乙醇浸泡、文火煎煮、过滤、浓缩得仙茅提取液；将珍珠母粉碎，加入食醋水溶液浸泡、烘干即得珍珠母粉；将琼脂、旱莲草提取液、仙茅提取液、高岭土、珍珠母粉添加进MS培养基中进行超声处理即得。本发明培养基配方合理，起到防褐化的作用，提高金线莲组培苗的成活率和质量，灭菌效果好，没有环境污染，成本降低，制备方法操作简单，重复性好，适合大规模的推广应用。

Description

一种金线莲组培培养基及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体是一种金线莲组培培养基及其制备方法和应用。

背景技术

金线莲(Anoectochilus roxburghii)又名金丝草，为兰科开唇兰属多年生草本植物，是我国传统名贵中药，具有清热凉血、除湿解毒等功效，用于治疗糖尿病、肾炎、膀胱炎等症，在民间享有“药王”的美称。浙南、闽台及两广一带长期用金线莲煮水、泡茶、煲汤，用于强身健体、滋补调养。现代研究表明金线莲中含有多糖、黄酮类、强心苷类等多种成分，可增强人体免疫力，提高机体抵抗力、防止疾病的侵袭，增强并改善体质等功效。

现有金线莲组培培养基大都采用MS培养基或B5培养基为母液，添加蛋白胨，琼脂等。在组培过程中因受环境、培养基及人工技术等多方面因素影响，导致苗瓶污染率较高，从而提高组培成本。污染问题一直是当前制约金线莲种苗繁育的主要障碍。污染初期会导致增殖效率的降低，培养材料生长延缓；污染后期会导致组培苗移栽困难和死亡，甚至有的会引起培养材料的遗传变异。目前解决的手段是在培养基中加入杀菌剂，如青霉素或氯霉素、四环素等抗生素，甚至添加多菌灵咪酰胺等农药，虽起到一定的杀菌效果，但很难控制农残，再者抗生素及农药杀菌剂的添加也影响金线莲的生长。

另外，外植体褐变是植物组织培养中遇到的重要问题。早前有研究表明活性炭是能够起到防褐化的作用的，而活性炭本身吸附作用是有限的，小量的活性炭的吸附作用是比较小的，一旦吸附的有害成分达到饱和，基本上就没有功效了，而且频繁更换培养基不利于培养基中的营养成分产生作用，且在转接过程中存在着污染的风险，活性炭防褐化的作用有严重的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种防止褐化、促进生长、灭菌效果好、没有环境污染、成本低的金线莲组培培养基及其制备方法和应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种金线莲组培培养基，每升MS培养基中添加琼脂5g、旱莲草提取液20-28g、仙茅提取液15-23g、珍珠母12-20g、高岭土3-10g。

作为本发明进一步的方案：所述金线莲组培培养基，每升MS培养基中添加琼脂5g、旱莲草提取液22-26g、仙茅提取液17-21g、珍珠母14-18g、高岭土5-8g。

作为本发明进一步的方案：所述金线莲组培培养基，每升MS培养基中添加琼脂5g、旱莲草提取液24g、仙茅提取液19g、珍珠母16g、高岭土7g。

本发明另一目的是提供一种金线莲组培培养基的制备方法，包括以下步骤：

1)将旱莲草粉碎、过80目筛，加入其质量5-6倍的柠檬酸水溶液浸提2次，浸提时间为3.8-4h，浸提温度为72-75℃，柠檬酸水溶液在柠檬酸的质量含量为3-4％，合并浸提液，浓缩至原体积的15-18％，即得旱莲草提取液；

2)将仙茅粉碎、过100目筛，加入其质量11倍的去离子水，武火煎煮1h，停止加热，并加入仙茅质量0.5-0.8倍的无水乙醇，浸泡1.5-2h，然后文火煎煮1-1.5h，过滤取滤液，浓缩至原体积的15-20％即得仙茅提取液；

3)将珍珠母粉碎、过200目筛，再加入其质量3倍的食醋水溶液并在48-50℃下浸泡2h，食醋水溶液中食醋质量含量为18-20％，然后再在88-90℃下烘干即得珍珠母粉；

4)按照各成分的质量将琼脂、旱莲草提取液、仙茅提取液、高岭土、珍珠母粉添加进MS培养基中，然后进行超声处理75-80min，超声功率为800W，即得培养基。

本发明又一目的是提供所述培养基在培养金线莲中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明采用旱莲草提取液、仙茅提取液、珍珠母、高岭土等作为添加剂加入培养基中，起到防褐化的作用，采用的原料绿色环保，利用其自身所含有益物质起到防褐化的作用。在初代和增殖过程都能起到防止褐化的作用，从各个阶段解决防褐化的问题，因而提高金线莲组培苗的成活率和质量。还具有较好抑菌、杀菌作用，在有效降低农残的同时，又能促进金线莲的健康生长，能有效提供金线莲养分需求，同时提高金线莲各种有效成分含量，确保药效，长势旺盛。本发明不仅灭菌效果好(金线莲组培污染率降至3％以下)，而且没有环境污染，成本也显著降低。所提供的培养基配方合理，效果明显；制备方法操作简单，易于掌握，重复性好，适合大规模的推广应用。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本发明实施例中，一种金线莲组培培养基，每升MS培养基中添加琼脂5g、旱莲草提取液20g、仙茅提取液15g、珍珠母12g、高岭土3g。

将旱莲草粉碎、过80目筛，加入其质量5倍的柠檬酸水溶液浸提2次，浸提时间为3.8h，浸提温度为72℃，柠檬酸水溶液在柠檬酸的质量含量为3％，合并浸提液，浓缩至原体积的15％，即得旱莲草提取液。将仙茅粉碎、过100目筛，加入其质量11倍的去离子水，武火煎煮1h，停止加热，并加入仙茅质量0.5倍的无水乙醇，浸泡1.5h，然后文火煎煮1h，过滤取滤液，浓缩至原体积的15％即得仙茅提取液。将珍珠母粉碎、过200目筛，再加入其质量3倍的食醋水溶液并在48℃下浸泡2h，食醋水溶液中食醋质量含量为18％，然后再在88-90℃下烘干即得珍珠母粉。按照各成分的质量将琼脂、旱莲草提取液、仙茅提取液、高岭土、珍珠母粉添加进MS培养基中，然后进行超声处理75min，超声功率为800W，即得培养基。

实施例2

本发明实施例中，一种金线莲组培培养基，每升MS培养基中添加琼脂5g、旱莲草提取液28g、仙茅提取液23g、珍珠母20g、高岭土10g。

将旱莲草粉碎、过80目筛，加入其质量6倍的柠檬酸水溶液浸提2次，浸提时间为4h，浸提温度为75℃，柠檬酸水溶液在柠檬酸的质量含量为4％，合并浸提液，浓缩至原体积的18％，即得旱莲草提取液。将仙茅粉碎、过100目筛，加入其质量11倍的去离子水，武火煎煮1h，停止加热，并加入仙茅质量0.8倍的无水乙醇，浸泡2h，然后文火煎煮1.5h，过滤取滤液，浓缩至原体积的20％即得仙茅提取液。将珍珠母粉碎、过200目筛，再加入其质量3倍的食醋水溶液并在50℃下浸泡2h，食醋水溶液中食醋质量含量为20％，然后再在90℃下烘干即得珍珠母粉。按照各成分的质量将琼脂、旱莲草提取液、仙茅提取液、高岭土、珍珠母粉添加进MS培养基中，然后进行超声处理80min，超声功率为800W，即得培养基。

实施例3

本发明实施例中，一种金线莲组培培养基，每升MS培养基中添加琼脂5g、旱莲草提取液22g、仙茅提取液17g、珍珠母14g、高岭土5g。

将旱莲草粉碎、过80目筛，加入其质量5.5倍的柠檬酸水溶液浸提2次，浸提时间为3.9h，浸提温度为73℃，柠檬酸水溶液在柠檬酸的质量含量为3.5％，合并浸提液，浓缩至原体积的16％，即得旱莲草提取液。将仙茅粉碎、过100目筛，加入其质量11倍的去离子水，武火煎煮1h，停止加热，并加入仙茅质量0.6倍的无水乙醇，浸泡1.8h，然后文火煎煮1.2h，过滤取滤液，浓缩至原体积的18％即得仙茅提取液。将珍珠母粉碎、过200目筛，再加入其质量3倍的食醋水溶液并在49℃下浸泡2h，食醋水溶液中食醋质量含量为19％，然后再在89℃下烘干即得珍珠母粉。按照各成分的质量将琼脂、旱莲草提取液、仙茅提取液、高岭土、珍珠母粉添加进MS培养基中，然后进行超声处理78min，超声功率为800W，即得培养基。

实施例4

本发明实施例中，一种金线莲组培培养基，每升MS培养基中添加琼脂5g、旱莲草提取液26g、仙茅提取液21g、珍珠母18g、高岭土8g。

将旱莲草粉碎、过80目筛，加入其质量5.5倍的柠檬酸水溶液浸提2次，浸提时间为3.9h，浸提温度为73℃，柠檬酸水溶液在柠檬酸的质量含量为3.5％，合并浸提液，浓缩至原体积的16％，即得旱莲草提取液。将仙茅粉碎、过100目筛，加入其质量11倍的去离子水，武火煎煮1h，停止加热，并加入仙茅质量0.6倍的无水乙醇，浸泡1.8h，然后文火煎煮1.2h，过滤取滤液，浓缩至原体积的18％即得仙茅提取液。将珍珠母粉碎、过200目筛，再加入其质量3倍的食醋水溶液并在49℃下浸泡2h，食醋水溶液中食醋质量含量为19％，然后再在89℃下烘干即得珍珠母粉。按照各成分的质量将琼脂、旱莲草提取液、仙茅提取液、高岭土、珍珠母粉添加进MS培养基中，然后进行超声处理78min，超声功率为800W，即得培养基。

实施例5

本发明实施例中，一种金线莲组培培养基，每升MS培养基中添加琼脂5g、旱莲草提取液24g、仙茅提取液19g、珍珠母16g、高岭土7g。

将旱莲草粉碎、过80目筛，加入其质量5.5倍的柠檬酸水溶液浸提2次，浸提时间为3.9h，浸提温度为73℃，柠檬酸水溶液在柠檬酸的质量含量为3.5％，合并浸提液，浓缩至原体积的16％，即得旱莲草提取液。将仙茅粉碎、过100目筛，加入其质量11倍的去离子水，武火煎煮1h，停止加热，并加入仙茅质量0.6倍的无水乙醇，浸泡1.8h，然后文火煎煮1.2h，过滤取滤液，浓缩至原体积的18％即得仙茅提取液。将珍珠母粉碎、过200目筛，再加入其质量3倍的食醋水溶液并在49℃下浸泡2h，食醋水溶液中食醋质量含量为19％，然后再在89℃下烘干即得珍珠母粉。按照各成分的质量将琼脂、旱莲草提取液、仙茅提取液、高岭土、珍珠母粉添加进MS培养基中，然后进行超声处理78min，超声功率为800W，即得培养基。

对比例1

每升MS培养基中仅添加琼脂5g、珍珠母16g、高岭土7g，制备过程与实施例5一致。

对比例2

每升MS培养基中仅添加旱莲草提取液24g、仙茅提取液19g，制备过程与实施例5一致。

实施例6

分别采用本发明实施例5与对比例1-2的培养基并采用常规的培养方式培养金线莲，培养4个月后，结果如表1所示。

表1

	实施例5	对比例1	对比例2
				株高(cm)	8.1	7.3	6.8
最大也宽幅(cm)	2.3	1.9	1.7
				新叶数(片)	5.5	4.6	4.2
发根数(条)	5.3	4.1	3.2
				单株鲜重(g)	2.35	1.95	1.76
生长状况	植株生长健壮，根系粗壮	植株生长一般	植株生长一般
				苗污染率(％)	2.8	17.5	4.3
褐化率(％)(6周)	1.4	13.5	7.2

从表1中可以看出，本发明中各成分的协同作用下，使金线莲降低褐化率，降低污染率，其植株生长健壮，根系粗壮，叶片较大生长旺盛且为墨绿色，有光泽，最大的叶片宽幅可达2.3cm，促进根部生长，单株平均鲜生高达2.35g，从株高、新叶数、发根率、鲜质量等生物量指标来看，都明显优于对比例1-2。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (5)

1.一种金线莲组培培养基，其特征在于，每升MS培养基中添加琼脂5g、旱莲草提取液20-28g、仙茅提取液15-23g、珍珠母12-20g、高岭土3-10g。

2.根据权利要求1所述的金线莲组培培养基，其特征在于，每升MS培养基中添加琼脂5g、旱莲草提取液22-26g、仙茅提取液17-21g、珍珠母14-18g、高岭土5-8g。

3.根据权利要求1所述的金线莲组培培养基，其特征在于，每升MS培养基中添加琼脂5g、旱莲草提取液24g、仙茅提取液19g、珍珠母16g、高岭土7g。

4.一种如权利要求1-3任一所述的金线莲组培培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将旱莲草粉碎、过80目筛，加入其质量5-6倍的柠檬酸水溶液浸提2次，浸提时间为3.8-4h，浸提温度为72-75℃，柠檬酸水溶液在柠檬酸的质量含量为3-4％，合并浸提液，浓缩至原体积的15-18％，即得旱莲草提取液；

2)将仙茅粉碎、过100目筛，加入其质量11倍的去离子水，武火煎煮1h，停止加热，并加入仙茅质量0.5-0.8倍的无水乙醇，浸泡1.5-2h，然后文火煎煮1-1.5h，过滤取滤液，浓缩至原体积的15-20％即得仙茅提取液；

3)将珍珠母粉碎、过200目筛，再加入其质量3倍的食醋水溶液并在48-50℃下浸泡2h，食醋水溶液中食醋质量含量为18-20％，然后再在88-90℃下烘干即得珍珠母粉；

4)按照各成分的质量将琼脂、旱莲草提取液、仙茅提取液、高岭土、珍珠母粉添加进MS培养基中，然后进行超声处理75-80min，超声功率为800W，即得培养基。

5.如权利要求1-3任一所述的培养基在培养金线莲中的应用。