CN106103741A - 将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶多核苷酸的方法 - Google Patents
将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶多核苷酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106103741A CN106103741A CN201580005650.8A CN201580005650A CN106103741A CN 106103741 A CN106103741 A CN 106103741A CN 201580005650 A CN201580005650 A CN 201580005650A CN 106103741 A CN106103741 A CN 106103741A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polynucleotide
- hole
- unwindase
- seq
- target polynucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y605/00—Ligases forming phosphoric ester bonds (6.5)
- C12Y605/01—Ligases forming phosphoric ester bonds (6.5) forming phosphoric ester bonds (6.5.1)
- C12Y605/01001—DNA ligase (ATP) (6.5.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
- C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
- C12Q2565/631—Detection means characterised by use of a special device being a biochannel or pore
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶多核苷酸的新方法。本发明还涉及表征靶多核苷酸的新方法。
Description
技术领域
本发明涉及将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶多核苷酸的新方法。本发明还涉及表征靶多核苷酸的新方法。
背景技术
目前需要一种具有广泛的应用范围的快速且廉价的多核苷酸(如DNA或RNA)测序和鉴定技术。现有的技术是缓慢的且昂贵的,这主要由于它们依赖于扩增技术来产生大量的多核苷酸,且需要大量特定的用于信号检测的荧光化学物质。
跨膜孔(纳米孔)作为用于聚合物和各种小分子的直接的、电生物传感器,具有很大的潜力。特别是,目前作为一种有潜力的DNA测序技术的纳米孔得到了许多关注。
当跨纳米孔施加电势时,在,当分析物如核苷酸在桶(barrel)中短暂停留一段时间时,会产生电流的变化。所述核苷酸的纳米孔检测能产生已知特征和持续时间的电流变化。在链测序方法中,单个多核苷酸链穿过所述孔并实现对核苷酸的鉴定。链测序可包括使用多核苷酸结合蛋白来控制所述多核苷酸穿过所述孔的移动。
发明内容
令人惊讶地,发明人已经证明可以预装载一个或多个多核苷酸结合蛋白到一个或多个装载部分,然后连接所述一个或多个装载部分到所述靶多核苷酸。令人惊讶的是,所述一个或多个多核苷酸结合蛋白对所述一个或多个装载部分到多核苷酸的连接没有空间位阻。还令人惊讶的是,连接过程不影响所述一个或多个多核苷酸结合蛋白,且所述一个或多个多核酸结合蛋白在连接到靶多核苷酸后仍保留其结合到所述一个或多个装载部分的给功能和能力。
因此,本发明提供了一种用于将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶多核苷酸的方法,包括:
(a)提供结合到一个或多个装载部分的一个或多个多核苷酸结合蛋白;和
(b)将所述一个或多个装载部分连接到所述靶多核苷酸。
本发明还提供了表征靶多核苷酸的方法,包括:
(a)实施本发明所述的方法;
(b)将在步骤(a)中提供的连接有一个或多个多核苷酸结合蛋白的靶多核苷酸与跨膜孔接触,以使得所述一个或多个多核苷酸结合蛋白控制所述多核苷酸相对于所述孔的移动;和
(c)随着所述多核苷酸相对于所述孔移动,获取一个或多个测量值,其中所述测量值代表所述多核苷酸的一个或多个特征,并由此表征所述靶多核苷酸。
本发明还提供了一种制备用于表征的靶多核苷酸的方法,包括:
(a)实施本发明的方法,其中所述一个或多个多核苷酸结合蛋白包含一个或多个聚合酶;和
(a)使用所述靶多核苷酸作为模板,使得在步骤(a)中提供的连接到所述靶多核苷酸的所述一个或多个聚合酶形成一个或多个多核苷酸,并由此制备用于表征的所述靶多核苷酸。
本发明还提供一种表征靶多核苷酸的方法,包括:
(a)实施本发明所述的基于聚合酶的方法;
(b)将在步骤(a)中产生的所述靶多核苷酸及所述一个或多个多核苷酸与跨膜孔接触,使得所述靶多核苷酸及所述一个或多个多核苷酸相对于所述孔移动;和
(c)随着所述靶多核苷酸和所述一个或多个多核苷酸相对于所述孔移动,获取一个或多个测量值,其中所述测量值代表所述多核苷酸的一个或多个特征,并由此表征所述靶多核苷酸。
本发明还提供:
-使用本发明所述的方法修饰的靶多核苷酸;
-具有一个或多个所结合的多核苷酸结合蛋白的装载部分;和
-用于将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶多核苷酸的试剂盒,包含(a)结合到一个或多个装载部分的所述一个或多个多核苷酸结合蛋白;和(b)连接酶。
附图说明
图1示出了使用8mL POROS HQ-10柱将预结合到DNA发夹衔体的TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C纯化后的示例性FPLC轨迹。
图2示出了使用5mL Histrap HP柱将预结合到DNA发夹衔体的TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C纯化后的示例性FPLC轨迹。
图3示出了TBE(天然的)PAGE凝胶分析(DNA校准带对应在凝胶的顶部示出的DNA浓度),柱1示出了在只有缓冲液中结合到DNA发夹衔体的TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C(显示为条带X),柱2示出了添加TRIS缓冲液后结合到DNA发夹衔体的TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C,柱3示出了添加双马来酰亚胺基乙烷后结合到DNA发夹衔体的TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C,柱4-6示出了经两次FPLC纯化后结合到DNA发夹衔体的不同稀释浓度的TrwCCba-L376C/Q594A/K762C。条带X对应结合到DNA的酶。条带Y对应没有酶结合的DNA。
图4示出了SDS PAGE凝胶分析(DNA校准带对应在凝胶的顶部示出的DNA浓度),柱1示出了在只有缓冲液中结合到DNA发夹衔体的TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C(显示为条带X),柱2示出了添加TRIS缓冲液后结合到DNA发夹衔体的TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C,柱3示出了添加双马来酰亚胺基乙烷后结合到DNA发夹衔体的TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C,柱4-6示出了经两次FPLC纯化后结合到DNA发夹衔体的不同稀释浓度的TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C。条带Y对应DNA上没有闭合的酶。条带X对应由双马来酰亚胺基乙烷连接体结合到DNA上的酶。
图5示出了TBE(天然的)PAGE凝胶分析(DNA校准带对应在凝胶的顶部显示的DNA浓度),柱1示出了在添加TMAD前结合到DNA发夹衔体的T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C。柱2示出了添加KCl和ATP之后结合到DNA发夹衔体的T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C,柱3示出了SPRI纯化后结合到DNA发夹衔体的T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C。条带2∶1示出了两个结合的酶,条带1∶1示出了一个结合的酶。DNA条带对应单独的DNA。
图6示出了当解旋酶T4 Dd-E94C/C109A/C136A/A360C和TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C控制DNA构建体(参见上文电流轨迹)移位穿过MspA纳米孔时的示例电流轨迹。x轴对应时间(秒)以及y轴对应电流(pA)。所述轨迹示出了在所述两种解旋酶控制下单个DNA链移动穿过纳米孔,标记的区域1和2对应DNA构建体的区域1和2的移位。所述轨迹示出了在解旋酶T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C和TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C二者控制下构建体Y移位穿过纳米孔时观察到的电流轨迹。箭头标记的3示出了当发夹衔体中的间隔器移位穿过纳米孔时电流的尖峰。所述发夹衔体和Y衔体间隔器在电流轨迹上方的DNA构建体的图片中以x示出。
图7示出了Agilent生物分析仪轨迹,表明酶预结合到MuA Y衔体。
图8示出了Agilent生物分析仪轨迹,表明当酶预结合到MuA Y衔体时,没有见到对靶DNA的副作用。
图9示出了当由解旋酶控制DNA移动穿过使用由MuA标签技术(tagmentation)产生的DNA制备的纳米孔时的示例电流轨迹。
图10示出了具有预结合的E1(A片段)及E2(END片段)的A片段(见分图A)和END片段(见分图B)的装载部分。这两个装载部分接合到实施例6中的基因组DNA。所述A片段具有标记为1的39个SpC3间隔器的区域。SEQ ID NO:32对应标记为2的区域,其为E1结合的区域。标记为3的区域对应4个iSp18间隔器。标记为4的区域对应SEQ ID NO:33。标记为5的区域对应SEQ ID NO:34。标记为6的区域对应一个iBNA-meC、两个iBNA-A和两个iBNA-meC。标记为7的区域对应SEQ ID NO:35。END片段中的标记为8的区域对应SEQ ID NO:36。标记为9的区域对应SEQ ID NO:37。标记为11区域对应SEQ ID NO:38。
图11示出了当解旋酶T4 Dda-(H82R/E94C/A360C)(具有突变H82R/E94C/A360C的SEQ ID NO:24,E1)和T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C(具有突变E94C/C109A/C136A/A360C的SEQ ID NO:24,E2)控制样本4中的DNA构建体图(图顶部示出)移位穿过MspA纳米孔时的示例性图。x轴对应移动指数,而y轴对应电流(pA)。对于移动穿过所述孔的每条DNA链,测量作为时间的函数的电流。移动的DNA导致测得的电流水平的逐步变化。将观察到的电流水平拟合以得到每一步的平均电流并为所述电流水平分配递增的移动指数点数。相对于移动指数的平均电流因此近似于原有的电流信号并且用于表征移位的DNA。该图示出了在所述两种酶的控制下单个DNA链移动穿过纳米孔,标记的区域1和2对应DNA构建体的区域1和2的移位。该轨迹示出了在解旋酶T4 Dda-(H82R/E94C/A360C)和T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C二者控制下当构建体移位穿过孔时所观察到的移动指数。箭头标记的3示出了在发夹衔体中的间隔器移位穿过纳米孔时的电流中的尖峰。所述的发夹衔体和Y衔体间隔器在所述轨迹上面的DNA构建体图片中以x示出。
图12示出了解旋酶前导复合体(见分图A)、聚合酶链复合体(见分图B)和具有预结合的聚合酶(标记为X1,Phi29-A411C/Q560C(具有突变A411C/Q560C的SEQ ID NO:9))和解旋酶(标记为Y1,T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C(具有突变E94C/C109A/C136A/A360C的SEQ ID NO:24))二者的解旋酶/聚合酶前导复合体的最终装载部分。在实施例7中,该最终装载部分被接合到3.6kb DNA链(SEQ ID NO:46)。标记为1的区域对应30个SpC3间隔器。SEQID NO:27对应标记为2的区域,其为T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C所结合的区域。标记为3的区域对应4个iSp18间隔器。标记为4的区域对应SEQ ID NO:28。标记为5的区域对应SEQ ID NO:43。标记为6的区域对应SEQ ID NO:44,其3’末端连接到4个iSpC3间隔器,所述间隔器在相对端连接到SEQ ID NO:45的5’末端。Phi29-A411C/Q560C结合到区域6。
图13示出了在实施例7中在连接步骤之后并且聚合步骤之前产生的DNA构建体。标记为1的区域对应30个SpC3间隔器。SEQ ID NO:27对应标记为2的区域,其为T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C所结合的区域。标记为3的区域对应4个iSp18间隔器。标记为4的区域对应SEQ ID NO:28。标记为5的区域对应SEQ ID NO:43。标记为6的区域对应SEQ ID NO:44,其3’末端连接到4个iSpC3间隔器,所述间隔器在相对端连接到SEQ ID NO:45的5’末端。Phi29-A411C/Q560C结合到区域6。标记为7的区域对应SEQ ID NO:46。标记为8的区域对应SEQ ID NO:47。标记为9的区域对应SEQ ID NO:31。
图14示出了当解旋酶T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C(标记为Y1)控制样本5中的DNA构建体(在该图顶部示出)移位穿过MspA纳米孔时的示例性图。x轴对应移动指数,而y轴对应电流(pA)。对于移动穿过所述孔的每条DNA链,测量作为时间函数的电流。移动的DNA导致测得的电流水平的逐步变化。将观察到的电流水平拟合以得到每一步的平均电流并为所述电流水平分配递增的移动指数点数。相对于移动指数的平均电流因此近似于原有电流信号并且用于表征转移的DNA。该图示出了在解旋酶的控制下DNA单链移动穿过纳米孔,标记区域1和2对应原始的3.6kb DNA构建体(SEQ ID NO:46)的区域1和2的移位。标记区域4和5对应使用Phi29-A411C/Q560C经聚合产生的区域1和2的互补链。轨迹示出了在T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C的控制下当构建体移位穿过孔时观察到的移动指数。箭头标记的3示出了在最终构建体的发夹中的间隔器(在图14的顶部构建体图表中示为x和标记为3)移位穿过纳米孔时的电流中的尖峰。所述的发夹衔体和Y衔体间隔器在该图上面的DNA构建体图片中以x示出。
图15示出了在200V运行60分钟然后使用SYBR染色的4-20%的TBE PAGE。在凝胶上运行的各个样品为400nM(5μL)。列1对应100bp梯子(条带对应的碱基对的数目沿凝胶的侧部示出)。列2对应在图12A中示出的没有结合解旋酶的解旋酶前导复合体。列3对应在图12A中示出的结合了解旋酶的解旋酶前导复合体。列4对应在图12B中示出的没有结合聚合酶的聚合酶链复合体。列5对应在图12B中示出的结合了聚合酶的聚合酶链复合体。条带A对应SEQ ID NO:43。条带B对应在3’端连接到SEQ ID NO:27的5’末端的DNA链X=30个iSpC3间隔器,SEQ ID NO:27在3’末端连接到4个iSp18间隔器,所述4个iSp18间隔器在相对端连接到SEQ ID NO:28的5’末端。条带C对应结合到DNA链X的解旋酶(T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C)。条带D对应没有结合酶的聚合酶链复合体(SEQ ID NO:44,其3’末端连接到4个iSpC3间隔器,所述iSpC3间隔器在相对端连接到SEQ ID NO:45的5’末端)。条带E对应结合到所述聚合酶链复合体的Phi29-A411C/Q560C。
图16的A)中示出了在连接前没有将聚合酶(标记为x)预结合到装载部分的双链靶多核苷酸的衔体连接方法和聚合方法的实例,B)中示出了用预结合的解旋酶(标记为y)和预结合的聚合酶(标记为x)两者连接装载部分,然后聚合所述双链靶多核苷酸的本发明方法的实例。步骤1A显示了将衔体连接到双链靶多核苷酸的任一端。步骤2A示出了聚合酶(标记为x)的结合。步骤3A示出了双链靶多核苷酸的聚合,使用所述靶作为模板形成的多核苷酸用虚线示出。步骤4A示出了新的双链构建体的末端修复、构建体的A尾以及用预结合的解旋酶与装载部分的连接(标记为y)。步骤1B示出了含有预结合的解旋酶(标记为y)和预结合的聚合酶(标记为x)二者的装载部分的连接。步骤2B示出了双链靶多核苷酸的聚合。B中不需要进一步的步骤,因此该方法包括比A中示出的方法明显更少的步骤。
图17示出了包含预结合的解旋酶(标记为y)和预结合的聚合酶(标记为x)的装载部分,该装载部分随后被连接(步骤1)到双链靶多核苷酸的两条链(一条链标记为T1用于模板,另一条标记为C1用于互补),该双链靶多核苷酸在一端由桥连部分衔体(标记为z)连接。在装载部分中,解旋酶从与聚合酶结合的链结合到相对的链。所述与聚合酶结合的链含有3’发夹环(标记为v)。在本实施方案中,聚合酶将产生双链构建体(步骤2),其中所述构建体的两条链在一端由桥连部分(标记为v)连接,而且所述构建体的每条链包含靶多核苷酸的一条链(示为实线,且标记为T1和C1)和由聚合酶形成的互补多核苷酸(示为虚线,且标记为T2和C2)。
图18示出了包含预结合的聚合酶(标记为x)和预结合的解旋酶(标记为y)的装载部分,其随后连接(步骤1)到双链靶多核苷酸的两条链的每一端,所述两条链的任一端没有由桥连部分连接。在装载部分中,解旋酶从与聚合酶结合的链结合到相对的链。所述与聚合酶结合的链含有3’发夹环(标记为v)。在本实施方案中,聚合酶将产生两个双链构建体(步骤2),其中每个构建体的两条链在一端由桥连部分连接(标记为v1或v2),并且每个构建体包含靶多核苷酸的一条链(示为实线)和由聚合酶形成的互补多核苷酸(示为虚线)。
图19示出了包含预结合的聚合酶(标记为x)和预结合的解旋酶(标记为y)的装载部分(标记为v的桥连部分衔体和标记为w的杂合前导体),其随后连接(步骤1)到双链靶多核苷酸的每一端,以使它们在两端由装载部分(前述的标记的w和v)连接以形成环形构建体。在本实施例中,所述桥连部分衔体包含预结合了解旋酶(标记为y)的多核苷酸前导体(标记为w),其杂合到所述桥连部分衔体(标记为v)。由该多核苷酸(标记为w)杂合到所述桥连部分衔体而形成的双链段形成了用于结合聚合酶的引物位点。当聚合酶扩展启动时(步骤2)(例如,通过添加核苷酸和辅因子),用为原始靶DNA的互补拷贝的DNA生成两个构建体,并且取决于聚合酶围绕该环形构建体进行的程度,所述两个构建体将含有T1和C1的多个拷贝段。
序列表的说明
SEQ ID NO:1示出了编码MS-B1突变体MspA单体的密码子优化的多核苷酸序列。该突突变缺少信号序列,并包括下列突变:D90N、D91N、D93N、D118R、D134R和E139K。
SEQ ID NO:2示出了MspA单体的MS-B1突变体的成熟形式的氨基酸序列。该突变体缺少信号序列,并包括下列突变:D90N、D91N、D93N、D118R、D134R和E139K。
SEQ ID NO:3示出了编码α-溶血素-E111N/K147N(α-HL-NN;Stoddart等人,PNAS,2009;106(19):7702-7707)的一个单体的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:4显示了α-HL-NN的一个单体的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:7显示了MspB,C和D的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8显示了编码Phi29 DNA聚合酶的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:9显示了Phi29 DNA聚合酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10显示了由大肠杆菌的sbcB基因衍生的密码子优化的多核苷酸序列。它编码来自大肠杆菌的核酸外切酶I(EcoExo I)。
SEQ ID NO:11显示了来自大肠杆菌的核酸外切酶I酶(EcoExo I)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12显示了从大肠杆菌的xthA基因衍生的密码子优化的多核苷酸序列。其编码来自大肠杆菌的核酸外切酶III。
SEQ ID NO:13显示了来自大肠杆菌的核酸外切酶III的氨基酸序列。这种酶在3′-5′的方向对双链DNA(dsDNA)的一条链的5′单磷酸核苷进行分配消化。链上酶的启动需要约4个核苷酸的5′突出。
SEQ ID NO:14显示了由嗜热栖热菌(T.thermophilus)的recJ基因衍生的密码子优化的多核苷酸序列。其编码来自嗜热栖热菌的RecJ酶(TthRecJ-cd)。
SEQ ID NO:15显示了来自嗜热栖热菌的RecJ酶(TthRecJ-cd)的氨基酸序列。该酶在5′-3′的方向对ssDNA的5′单磷酸核苷进行进行性(processive)消化。链上酶的启动需要至少4个核苷酸。
SEQ ID NO:16显示了由细菌噬菌体λ(redX)核酸外切酶基因衍生的密码子优化的多核苷酸序列。其编码细菌噬菌体λ核酸外切酶。
SEQ ID NO:17显示了细菌噬菌体λ核酸外切酶的氨基酸序列。该序列是装配成三聚体的三个相同的亚基之一。该酶在5′-3′方向上对dsDNA的一条链的核苷酸进行高度的进行性消化,(http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0262.asp)。链上酶的启动优选需要约4个具有5′磷酸的核苷酸的5′突出。
SEQ ID NO:18显示了Hel308 Mbu的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19显示了Hel308 Csy的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20显示了Hel308 Tga的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21显示了Hel308 Mhu的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22显示了Tral Eco的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23显示了XPD Mbu的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24显示了Dda 1993的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25显示了Trwc Cba的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26显示了在实施例1中使用的多核苷酸序列。此序列具有5′磷酸。
SEQ ID NO:27显示了在实施例2和7中使用的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:28显示了在实施例2和7中使用的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:29显示了在实施例1中使用的多核苷酸序列。此序列具有5′磷酸。
SEQ ID NO:30显示了在实施例1中使用的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:31显示了在实施例7中使用的多核苷酸序列。此序列具有5′胆固醇TEG。
SEQ ID NO:32显示了在实施例6中使用的多核苷酸序列。连接到SEQ ID NO:32的5’末端的是39个SpC3间隔器。连接到SEQ ID NO:32的3’末端的是在相对端连接到SEQ IDNO:33的5’末端的4个iSP18间隔器。
SEQ ID NO:33显示了在实施例6中使用的多核苷酸序列。连接到SEQ ID NO:33的5’末端的是在相对端连接到SEQ ID NO:32的3’末端的4个iSP18间隔器。
SEQ ID NO:34显示了在实施例6中使用的多核苷酸序列。连接到3’末端的是一个iBNA-meC、两个iBNA-A和两个iBNA-meC,所述两个iBNA-meC在相对端连接到3个iSp18间隔器,所述3个iSp18间隔器连接到SEQ ID NO:35的5’末端。
SEQ ID NO:35显示了在实施例6中使用的多核苷酸序列。连接到5’末端的是3个iSp18间隔器,所述间隔器在相对端连接两个iBNA-meC、两个iBNA-A和一个iBNA-meC,所述iBNA-meC在相对端连接到连接SEQ ID NO:34的3’末端。
SEQ ID NO:36显示了在实施例6中使用的多核苷酸序列。连接到SEQ ID NO:36的5’末端的是磷酸。连接到SEQ ID NO:36的3’末端的是四个在相对端连接到SEQ ID NO:37的5’末端的iSp18间隔器。
SEQ ID NO:37显示了在实施例6中使用的多核苷酸序列。连接到SEQ ID NO:37的5’末端的是在相对端连接到SEQ ID NO:36的3’末端的4个iSp18间隔器。
SEQ ID NO:38显示了在实施例6中使用的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:39显示了在实施例6中使用的多核苷酸序列。连接于SEQ ID NO:39的5’末端的是磷酸。连接到SEQ ID NO:39的3’末端的是在相对端连接到SEQ ID NO:40的5’末端的四个iSpC3间隔器。
SEQ ID NO:40显示了在实施例6中使用的多核苷酸序列。连接到SEQ ID NO:40的5’末端的是在相对端连接到SEQ ID NO:39的3’末端的四个iSpC3间隔器。
SEQ ID NO:41显示了在实施例6中使用的多核苷酸序列。SEQ ID NO:41是与SEQID NO:42互补的。
SEQ ID NO:42显示了在实施例6中使用的多核苷酸序列。SEQ ID NO:42是与SEQID NO:41互补的。
SEQ ID NO:43显示了在实施例7中使用的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:44显示了在实施例7中使用的多核苷酸序列。该序列具有5′磷酸。SEQID NO:44的3’末端连接到4个iSpC3间隔器,所述4个iSpC3间隔器在相对端连接到SEQ IDNO:45的5’末端。
SEQ ID NO:45显示了在实施例7中使用的多核苷酸序列。该序列在其5’末端连接到四个iSpC3间隔器,所述四个iSpC3间隔器在相对端连接到SEQ ID NO:44的3’末端。
SEQ ID NO:46显示了在实施例7中使用的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:47显示了在实施例7中使用的多核苷酸序列。该序列具有5′磷酸和在该序列的3’末端的基于胸腺嘧啶的硫代磷酸酯碱基。
具体实施方式
应该理解的是,所公开的产品和方法的不同应用可以适用于本领域中的特定需要。也应理解的是,这里使用的术语仅用于描述本发明的具体实施方案,并且不意在限制。
此外,除非内容另外明确指出,否则用于本说明书和所附权利要求书中的单数形式“一”,“一个”,和“所述”包括复数指代。因此,例如,涉及“多核苷酸”时包括两个或多个多核苷酸,涉及“酶”时包括两个或多个酶,涉及“解旋酶”时包括两个或多个解旋酶,涉及“分子制动器(molecular brake)”时指两个或多个分子制动器,涉及“跨膜孔”时包括两个或多个孔,等。
文本无论在上文还是下文中引用的所有出版物、专利和专利申请,以全文参考的方式引入本文。
本发明的方法
本发明提供一种将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶多核苷酸的方法。提供了结合到(或连接到)一个或多个装载部分的所述一个或多个多核苷酸结合蛋白。所述一个或多个装载部分被连接到所述的靶多核苷酸。这将所述一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到所述靶多核苷酸。一旦所述一个或多个多核苷酸结合蛋白以此种方式连接,它们可被用于控制所述靶多核苷酸穿过跨膜孔的移动或使用所述靶多核苷酸作为模板形成一个或多个多核苷酸(例如修饰所述靶多核苷酸)。这允许对待表征的靶多核苷酸在下文做更具体的讨述。
本发明具有多种优点。
i.将多核苷酸结合蛋白预装载到装载部分上加速了样品制备过程,并且意味着使用更少的试管。
ii.尽可能接近100%的所得靶多核苷酸的实例具有连接的多核苷酸结合蛋白。这可以改善后续的必需过程的产率。
iii.如果客户不将一个或多个多核苷酸结合蛋白装载到一个或多个装载部分上,客户错误减少。
iv.连接后无过量的多核苷酸结合蛋白(其可阻塞所述孔或具有一些其他不需要的活动)残留。
v.提高了所述一个或多个多核苷酸结合蛋白的稳定性。结合到多核苷酸的蛋白可能更稳定。
vi.过量的装载部分可作为正确地建立系统的对照(例如在缓冲液中的ATP等)。
vii.用户可控制一个或多个多核苷酸结合蛋白的顺序,以使它们以正确的序列装载在一个装载部分上。
viii.使用者可控制哪个多核苷酸结合蛋白连接到哪个装载部分,例如Y衔体对桥连部分。
ix.所述一个或多个多核苷酸结合蛋白可用于纯化所述一个或多个装载部分。
x.用户可以对连接到不同的装载部分的多核苷酸结合蛋白做出不同的修饰。
xi.不同的多核苷酸结合蛋白可以优选不同的结合条件,并因此它可有助于能够预装载它们到不同的装载部分上(而不是一起装载在靶多核苷酸上)。
xii.如果一个或多个多核苷酸结合蛋白被预装载,连接后应该没有任何游离的多核苷酸结合蛋白存在,并因此所述蛋白可用于纯化构建体。
xiii.本发明最小化的使用所述的一个或多个多核苷酸结合蛋白,因此存在较少浪费。
xiv.用户可以控制所述一个或多个多核苷酸结合蛋白相对于靶多核苷酸结合的位置或不相对于所述靶多核苷酸结合。通过预装载所述一个或多个多核苷酸结合蛋白到一个或多个装载部分上,所述一个或多个多核苷酸结合蛋白不直接结合到所述靶多核苷酸。
xv.本发明还提高了序列信息的产率,例如当聚合酶复制靶链时。产率可通过低效的蛋白结合限制,且还缺乏持续合成能力。预装载克服了装载低效性,且产生了克服持续合成问题的闭合复合体。
本发明还提供一种表征靶多核苷酸的方法。一旦所述一个或多个多核苷酸结合蛋白已经被装载到靶多核苷酸上,它们可与跨膜孔接触,以使得所述一个或多个多核苷酸结合蛋白控制多核苷酸相对于所述孔的移动,例如穿过所述孔。该方法还包括当所述多核苷酸相对于所述孔移动时,获取一个或多个测量值。所述测量值表示多核苷酸的一个或多个特征,如序列。
已经表明了可以使用跨膜孔有效地表征双链多核苷酸,如果所述双链多核苷酸被修饰为包括含有前导序列的Y衔体(双链茎干和两个非互补臂)和桥连部分衔体,如发夹环衔体(WO2013/014451)。优选为,含有前导序列的Y衔体连接到多核苷酸的一端,而桥连部分衔体连接到另一端。前导序列优选螺入纳米孔,且连接所述多核苷酸的两条链的桥连部分(如发夹环)使得待测试的作为多核苷酸的两条链解开且使得两条链(经桥连部分连接)相对于所述孔移动,如穿过所述孔。这是有利的,因为其使从单个双链多核苷酸获得的信息量加倍。另外,因为两条链中的序列是互补的,因此来自两条链中的信息可以进行信息合并。这种机制提供了提供更高的可信观察结果的正交校阅能力。根据本发明使用的一个或多个装载部分可以是Y衔体和/或桥连部分衔体。这在下文更详细地讨论。
本发明还提供了一种制备用于表征的靶多核苷酸的方法。该方法可用于改进用于表征的靶多核苷酸。该方法可以用于修饰或扩增靶多核苷酸。一旦一个或多个聚合酶已被装载到靶多核苷酸上,它们可以被允许使用所述靶多核苷酸作为模板以形成一个或多个多核苷酸。如果靶多核苷酸是单链的,则形成另一个互补的多核苷酸。如果所述靶多核苷酸是双链的,则优选通过所述一个或多个聚合酶将两条链用作模板。因为来自靶多核苷酸的链和由一个或多个聚合酶产生的新的多核苷酸是互补的,来自它们的信息可以如上所述进行信息合并。这种类型的方法也在WO2013/014451中公开。由聚合酶形成的多核苷酸可包含与靶多核苷酸相同种类的多核苷酸或不同种类的多核苷酸,如下详述。靶多核苷酸可以被修饰,如下文所详述。所述的一个或多个聚合酶可以使用Y型衔体和/或桥连部分衔体被装载到靶多核苷酸上,如下文所详述。
多核苷酸
所述靶多核苷酸可以是任何多核苷酸。多核苷酸如核酸是含有两个或更多个核苷酸的大分子。所述多核苷酸或核酸可包括任何核苷酸的任意组合。核苷酸可以是天然存在的或人工合成的。多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被氧化或甲基化。多核苷酸中的一个或多个核苷酸的可被损坏。例如,多核苷酸可包含嘧啶二聚体。此类二聚体通常与紫外线导致的损坏相关,且是皮肤黑素瘤的首要原因。多核苷酸中的一个或多个核苷酸可被修饰,例如用标记物或标签。合适的标记物如下所述。所述多核苷酸可包含一个或多个间隔器。
核苷酸通常含有核碱基、糖和至少一个磷酸基团。所述核碱基和糖形成核苷。核苷酸可以是天然核苷酸或非天然核苷酸。
核苷碱基通常为杂环的。核碱基包括但不限于:嘌呤和嘧啶,更具体地,腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)和胞嘧啶(C)。
糖通常为戊糖。核苷酸糖包括但不限于,核糖和脱氧核糖。所述糖优选为脱氧核糖。
所述多核苷酸中的核苷酸通常是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。所述多核苷酸可包含以下核苷:腺苷,尿苷,鸟苷和胞苷。核苷酸优选为脱氧核糖核苷酸。所述多核苷酸优选包含下列核苷:脱氧腺苷(dA)、脱氧尿苷(dU)和/或胸苷(dT)、脱氧鸟苷(dG)和脱氧胞苷(dC)。
所述核苷酸通常含有单磷酸、二磷酸或三磷酸。磷酸酶可以被连接在核苷酸的5′或3′侧。
合适的核苷酸包括但不限于,单磷酸腺苷(AMP)、单磷酸鸟苷(GMP)、单磷酸胸苷(TMP)、单磷酸尿苷(UMP)、单磷酸胞苷(CMP)、环单磷酸腺苷(cAMP)、环单磷酸鸟苷(cGMP)、单磷酸脱氧腺苷(dAMP)、单磷酸脱氧鸟苷(dGMP)、单磷酸脱氧胸苷(dTMP)、单磷酸脱氧尿苷(dUMP)和单磷酸脱氧胞苷(dCMP)。所述核苷酸优选选自AMP、TMP、GMP、CMP、UMP、dAMP、dTMP、dGMP、dCMP和dUMP。核苷酸最优选选自dAMP、dTMP、dGMP、dCMP和dUMP。多核苷酸优选包含下列核苷酸:dAMP、dUMP和/或dTMP、dGMP和dCMP。
多核苷酸中的核苷酸可以以任何方式彼此连接。如在核酸中一样,核苷酸通常通过它们的糖和磷酸基团连接。如嘧啶二聚体中一样,所述核苷酸可通过它们的核碱基连接。
所述多核苷酸可以是单链或双链的。至少所述多核苷酸的一部分优选为双链的。
所述多核苷酸可以是核酸。多核苷酸可以是本领域中已知的任何合成核酸,例如肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、锁核酸(LNA)、桥连核酸(BNA)或其它具有核苷酸侧链的合成聚合物。PNA骨架是由通过肽键连接的N-(2-氨基乙基)甘氨酸重复单元组成。GNA骨架是由通过磷酸二酯键连接的甘油重复单元组成。TNA骨架是由通过磷酸二酯键连接在一起的苏糖重复单元组成。LNA是由在核糖部分中具有连接2′氧和4′碳的额外的桥的如上所述的核糖核苷酸形成。桥连核酸(BNA)为经修饰的RNA核苷酸。它们也可以被称为被约束的或不可接近的RNA。BNA单体可含有具有“固定的”C3′-内糖起褶(C3’-endo sugarpuckering)的五元的、六元的或甚至七元的桥连结构。所述桥连是在核糖的2′,4′-位置通过合成而引入的,以产生2′,4′-BNA单体。
所述多核苷酸最优选为核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。
所述多核苷酸可以是任何长度。例如,多核苷酸可以是至少10、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少400或至少500个核苷酸的长度。所述多核苷酸可以是1000或更多个核苷酸、5000或更多个核苷酸,或100000或更多个核苷酸长度。
在本发明的方法中解旋酶可以沿整个多核苷酸或仅多核苷酸的一部分移动。可以使用本发明的方法来表征所述整个靶多核苷酸或仅靶多核苷酸的一部分。
所述多核苷酸可以是单链的。至少多核苷酸的一部分优选为双链的。解旋酶通常结合到单链多核苷酸。如果所述多核苷酸的至少一部分为双链的,所述多核苷酸优选包含单链区域或非杂合区域。所述一个或多个解旋酶能够结合到该单链区域或所述的非杂合区域的一条链。所述多核苷酸优选包含一个或多个单链区域或一个或多个非杂合区域。
所述一个或多个间隔器优选包括在多核苷酸的单链区域或非杂合区域中。所述多核苷酸可包含多于一个的单链区域或多于一个的非杂合区域。所述多核苷酸可在其序列内和/或在其一端或两端包含单链区域或非杂合区域。所述一个或多个间隔器可以被包括在多核苷酸的双链区域中。
如果在所述方法中使用的一个或多个解旋酶以5′至3′的方向移动,则多核苷酸优选地在其5′末端包含单链区域或非杂合区域。如果在所述方法中使用的一个或多个解旋酶以3′至5′的方向移动,则所述多核苷酸优选地在其3′末端包含单链区域或非杂合区域。如果所述一个或多个解旋酶在非激活模式下使用(即作为制动器),则其中单链区域或非杂合区域定位的位置是不重要的。
单链区域优选包含优选螺入所述孔的前导序列。这将在下文详述。
如果所述多核苷酸的至少一部分为双链,则所述双链部分的两条链优选使用桥连部分,如发夹或发夹环,进行连接。这有助于本发明的表征方法,并在下文详述。
所述多核苷酸存在于任何合适的样本中。本发明通常针对已知含有或怀疑含有所述多核苷酸的样品实施。可对样品实施本发明,以确认在样品中的存在是已知的或期望的一个或多个多核苷酸的同一性。
所述样品可以是生物样品。本发明可以针对从任何生物体或微生物中获得或提取的样品在体外实施。所述生物体或微生物通常是古细菌的(archaeal),原核的或真核的,并且通常属于以下五界中的一个:植物界,动物界,真菌,原核生物和原生生物。本发明针对从任何病毒中获得或提取的样品在体外实施。所述样品优选是液体样品。样品通常包括患者的体液。所述样品可以是尿液,淋巴液,唾液,粘液或羊水,但优选血液,血浆或血清。通常,所述样品来源于人,但替代地可以是来自其他哺乳动物,如自商业上养殖的动物如马,牛,绵羊,鱼,鸡或猪,或者替代地可以是宠物如猫或狗。或者,所述样品可以来源于植物,例如从商业作物获得的样品,如谷类,豆类,水果或蔬菜,例如小麦,大麦,燕麦,芸苔,玉米,大豆,水稻,大黄,香蕉,苹果,番茄,土豆,葡萄,烟草,菜豆,小扁豆,甘蔗,可可,棉花。
所述样品可以是非生物样品。所述非生物样品优选为流体样品。非生物样品的实例包括手术液,水如饮用水、海水或河水,以及用于实验室试验的试剂。
所述样品通常是在本发明中使用前处理,例如通过离心,或通过膜过滤掉不需要的分子或细胞,例如红细胞。所述样品可在采集后立即测量。样品也可通常在测定前被存储,优选低于-70℃存储。
多核苷酸结合蛋白
多核苷酸结合蛋白可以是能够结合到多核苷酸且控制其相对于孔移动例如穿过所述孔的任何蛋白质。现有技术中可直接确定蛋白质是否结合到多核苷酸。所述蛋白质通常与多核苷酸相互作用并修饰多核苷酸的至少一个特性。所述蛋白质可通过裂解多核苷酸以形成单个核苷酸或较短链的核苷酸,如二核苷酸或三核苷酸,来修饰所述多核苷酸。所述部分可以通过定向多核苷酸或移动多核苷酸到特定的位置例如控制其移动来修饰该多核苷酸。
任何数目的多核苷酸蛋白可以被连接到靶多核苷酸。例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个蛋白质可以被连接。
所述一个或多个多核苷酸结合蛋白可以是一个或多个单链结合蛋白(SSB)。所述一个或多个单链结合蛋白(SSB)可以包含不具有净负电荷的羧基末端(C-末端)的区域或(ii)在其C-末端区包含一个或多个修饰且可降低C-末端区域的净负电荷的被修饰的SSB。所述一个或多个多核苷酸结合蛋白可以是在国际申请No.PCT/GB2013/051924中(公开为WO2014/013259)公开的任何SSB。
所述一个或多个多核苷酸结合蛋白优选衍生自多核苷酸处理酶。所述多核苷酸处理酶是能够与多核苷酸相互作用并修饰多核苷酸的至少一个特性的多肽。所述酶可以通过裂解多核苷酸以形成单个核苷酸或较短链的核苷酸,如二核苷酸或三核苷酸,来修饰多核苷酸。所述酶可以通过定向多核苷酸或将多核苷酸移动到特定的位置而修饰该多核苷酸。只要多核苷酸处理酶能够结合多核苷酸并控制其相对于孔的移动,例如穿过所述孔,所述多核苷酸处理酶并不需要显示酶活性。例如,所述酶可被修饰以去除其酶活性或者可在防止其作为酶的条件下使用。这样的条件将在下文更详细的讨论。
所述一个或多个多核苷酸结合蛋白优选衍生自核酸溶解酶。所述酶更优选衍生自酶分类(EC)组3.1.11、3.1.13、3.1.14、3.1.15、3.1.16、3.1.21、3.1.22、3.1.25、3.1.26、3.1.27、3.1.30和3.1.31中的任何成员。所述酶可以是在国际申请No.PCT/GB10/000133(公开为WO2010/086603)中公开的任何酶。
优选的酶是聚合酶、核酸外切酶、解旋酶和拓扑异构酶如旋转酶和逆转录酶。合适的酶包括但不限于,来自大肠杆菌的核酸外切酶I(SEQ ID NO:11)、来自大肠杆菌的核酸外切酶III酶(SEQ ID NO:13)、来自嗜热栖热菌的RecJ(SEQ ID NO:15)和细菌噬菌体λ核酸外切酶(SEQ ID NO:17)、TatD核酸外切酶及其变体。包含SEQ ID NO:15中示出的序列的三个亚基或其变体相互作用以形成三聚体核酸外切酶。所述聚合酶可以是3173 DNA聚合酶(其可商购自公司)、SD聚合酶(可商购自)、来自NEB的Klenow或其变体。所述酶优选为Phi29 DNA聚合酶(SEQ ID NO:9)或其变体。Phi29的优选版本将在下文详述。可以在本发明中使用的Phi29聚合酶的经修饰版本将在下文论述且在美国专利No.5576204中公开。所述拓扑异构酶优选为部分分类(EC)组5.99.1.2和5.99.1.3中的任何成员。逆转录酶是能够催化从RNA模板形成cDNA的酶。它们可商购自例如New和
所述一个或多个多核苷酸结合蛋白优选衍生自解旋酶。所述解旋酶可以在至少两个激活操纵模式(当为解旋酶提供有助于移动的所有必要组分例如ATP和镁离子时)和一个未激活操纵模式(当未为解旋酶提供有助于移动的必要组分时,或解旋酶被修饰成能防止或阻碍移动时)下控制多核苷酸的移动。当向解旋酶提供了促进移动的所有必要组分时,解旋酶沿多核苷酸以5′到3′或3′至5′的方向移动(取决于解旋酶),但多核苷酸在孔中的取向(取决于多核苷酸的哪一端被孔捕获)意味着解旋酶可用于逆着施加电场将多核苷酸移出孔,或顺着施加电场将多核苷酸移入孔中。当解旋酶朝其移动的多核苷酸的一端被孔捕获时,所述解旋酶可以逆着施加电势产生的电场的方向工作,并将螺旋的多核苷酸拉出孔,并拉入顺室中。然而,当所述解旋酶远离其而移动的一端在孔中被捕获时,所述解旋酶可以顺着所施加电势而产生的电场的方向工作,并将螺旋的多核苷酸推入孔并进入反式室中。
当未为解旋酶提供有助于移动的必要组分时,在所述解旋酶通过施加的电势产生的场被拉入孔时,所述解旋酶可以结合到所述多核苷酸,且作为制动器减缓多核苷酸的移动。在非激活模式中,多核苷酸的哪一端被捕获并不重要,是施加的电场将多核苷酸朝着反式侧拉入孔中,所述解旋酶起制动器的作用。当在非激活模式中,解旋酶对多核苷酸的移动控制可以包括棘轮(ratcheting)、滑动和制动在内的多种方式进行描述。
在本发明的表征方法中,利用施加的电势所产生的电场,所述一个或多个解旋酶优选控制所述靶多核苷酸相对于所述孔的移动,如穿过所述孔。在一个优选的实施方案中,所述一个或多个解旋酶是以激活模式使用,且所述一个或多个解旋酶远离其而移动的一端被所述孔捕获,使得所述一个或多个解旋酶顺着所施加的电势所产生的电场工作,并且相对于孔推动多核苷酸,例如穿过所述孔。如果所述一个或多个解旋酶以5′到3′方向移动,所述多核苷酸的5’末端优选被孔捕获。在本实施方案中,所述一个或多个解旋酶以5′到3′方向沿多核苷酸移动。如果所述一个或多个解旋酶以3′到5′方向移动,所述的多核苷酸的3’末端优选被孔捕获。在这类实施方案中,所述一个或多个解旋酶以3′到5′方向沿多核苷酸移动。
在表征方法的另一个优选实施方案中,所述一个或多个解旋酶以非激活模式使用,使得所施加的场相对于孔牵拉多核苷酸,如穿过所述孔,并且所述一个或多个解旋酶充当制动器。在另一个优选的实施方案中,所述一个或多个解旋酶被修饰,使得它们保持它们的多核苷酸结合能力,但缺乏解旋酶活性(即主动地沿多核苷酸移动的能力),使得所施加的场相对于孔牵拉多核苷酸,如穿过所述孔,并且所述一个或多个解旋酶充当制动器。在本发明的方法中,优选所述一个或多个解旋酶利用由所施加的电势产生的场,减缓或制动多核苷酸相对于孔的移动,如穿过所述孔。在任一情况下,所述的一个或多个解旋酶通常太大而不能相对于孔移动,如穿过所述孔,并且在所施加的电势产生的场下当多核苷酸相对于孔移动,如穿过所述孔时,所述孔沿所述多核苷酸推动所述一个或多个解旋酶。
使用一个或多个解旋酶进行的表征方法的任何步骤通常在游离核苷酸或游离核苷酸类似物存在下,以及有助于一个或多个解旋酶的作用的酶辅因子的存在下进行。所述游离核苷酸可以是一个或多个上述的任意单个核苷酸。所述游离核苷酸包括但不限于,单磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、单磷酸鸟苷(GMP)、二磷酸鸟苷(GDP)、三磷酸鸟苷(GTP)、单磷酸胸苷(TMP)、二磷酸胸苷(TDP)、三磷酸胸苷(TTP)、单磷酸尿苷(UMP)、二磷酸尿苷(UDP)、三磷酸尿苷(UTP)、单磷酸胞苷(CMP)、二磷酸胞苷(CDP)、三磷酸胞苷(CTP)、环单磷酸腺苷(cAMP)、环单磷酸鸟苷(cGMP)、单磷酸脱氧腺苷(dAMP)、二磷酸脱氧腺苷(dADP)、三磷酸脱氧腺苷(dATP)、单磷酸脱氧鸟苷(dGMP)、二磷酸脱氧鸟苷(dGDP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、单磷酸脱氧胸苷(dTMP)、二磷酸脱氧胸苷(dTDP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)、单磷酸脱氧尿苷(dUMP)、二磷酸脱氧尿苷(dUDP)、三磷酸脱氧尿苷(dUTP)、单磷酸脱氧胞苷(dCMP)、二磷酸脱氧胞苷(dCDP)和三磷酸脱氧胞苷(dCTP)。所述游离核苷酸优选选自AMP、TMP、GMP、CMP、UMP、dAMP、dTMP、dGMP或dCMP。所述游离核苷酸优选为三磷酸腺苷(ATP)。所述酶辅因子是允许构建体起作用的因子。所述酶辅因子优选为二价金属阳离子。所述二价金属阳离子优选为Mg2+、Mn2+、Ca2+或Co2+。所述酶辅因子最优选Mg2+。
在本发明中可以使用任何解旋酶。解旋酶可以衍生自Hel308解旋酶、RecD解旋酶,如TraI解旋酶或TrwC解旋酶,XPD解旋酶或Dda解旋酶。所述的解旋酶可以是在国际申请No.PCT/GB2012/052579(公开为WO2013/057495)、PCT/GB2012/053274(公开为WO2013/098562)、PCT/GB2012/053273(公开号为WO2013098561)、PCT/GB2013/051925(公开为WO2014/013260)、PCT/GB2013/051924(公开为WO2014/013259)和PCT/GB2013/051928(公开为WO2014/013262)和在国际申请No.PCT/GB2014/052736中公开的任何的解旋酶、被修饰的解旋酶或解旋酶构建体。
所述一个或多个多核苷酸结合蛋白可衍生自解旋酶,例如Hel308 Mbu(SEQ IDNO:18)、Hel308 Csy(SEQ ID NO:19)、Hel308 Tga(SEQ ID NO:20)、Hel308 Mhu(SEQ IDNO:21)、TraI Eco(SEQ ID NO:22)、XPD Mbu(SEQ ID NO:23)或其变体。所述一个或多个多核苷酸结合蛋白优选包含在SEQ ID NO:25(Trwc Cba)中示出的序列或其变体、在SEQ IDNO:18(Hel308 Mbu)中示出的序列(Hel308 Mbu)或其变体,或在SEQ ID NO:24(Dda)中示出序列或其变体。对解旋酶或跨膜孔,变体可以下面所论述的任何方式不同于天然序列。
SEQ ID NO:24的优选的变体包含(或仅包含)(a)E94C/A360C,(b)E94C/A360C,然后(ΔM1)G1G2(即M1缺失,然后添加G1和G2),(c)E94C/A360C/C109A/C136A或(d)E94C/A360C/C109A/C136A,然后(ΔM1)G1G2(即M1缺失,然后添加G1和G2)。
SEQ ID NO:24的其它优选的变体包含W378A。SEQ ID NO:24的优选变体包含(或仅包括)(a)E94C/A360C/W378A,(b)E94C/A360C/W378A,然后(ΔM1)G1G2(即M1缺失,然后添加G1和G2),(c)E94C/A360C/C109A/C136A/W378A或(d)E94C/A360C/C109A/C136A/W378A,然后(ΔM1)G1G2(即M1缺失,然后添加G1和G2)。
SEQ ID NO:25的优选的变体包含(或仅包括)(a)Q594A,(b)L376C/Q594A/K762C,(c)L376C/Q594A/A779C,(d)Q346C/Q594A/A779C,(e)Q346C/Q594A/A783C,(f)D411/Q594A/A783C,(g)Q594A/R353C/E722C,(h)Q594A/Q357C/T720C,(i)Q594A/R358C/T720C,(j)Q594A/H354C/T720C,(k)Q594A/F374C/E722C或(1)Q594A/S350C/E722C。(a)至(1)中的任一项还可以进一步包含,然后(ΔM1)G1G2(即M1缺失,然后添加G1和G2)。其它优选的变体如上所述。
所述一个或多个解旋酶优选修饰为减少多核苷酸结合结构域的开口的大小,所述多核苷酸可以在至少一个构象状态下穿过所述开口从解旋酶上解绑。所述一个或多个解旋酶优选修饰为闭合该多核苷酸结合域的开口,所述多核苷酸可以在至少一个构象状态下穿过所述开口从解旋酶上解绑。这在WO2014/013260和PCT/GB2014/052736中被公开。可以在本发明中使用在WO2014/013260和PCT/GB2014/052736中所公开的任何修饰。
解旋酶结合到多核苷酸和从多核苷酸解绑的能力可以使用本领域中已知的任何方法来确定。合适的结合/解绑测定包括但不限于,天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),荧光各向异性、量热法和表面等离子共振(SPR,如BiacoreTM)。解旋酶从多核苷酸解绑的能力当然可以通过测量解旋酶可以控制多核苷酸移动的时间来确定。这也可使用本领域中已知的任何方法来确定。解旋酶控制多核苷酸移动的能力通常在纳米孔系统中测定,例如如下所述的那些。解旋酶控制多核苷酸移动的能力可以如实施例中所描述的来确定。
如PCT/GB2014/052736中公开的,本发明中使用的解旋酶可以是Dda解旋酶,所述Dda中至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然的氨基酸已经被引入到钩结构域和/或2A(RecA状电机)结构域,其中所述解旋酶保留其控制多核苷酸移动的能力。任何数量的半胱氨酸残基和/或非天然氨基酸可以被引入到每个结构域。例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个半胱氨酸残基可被引入,和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个非天然氨基酸可被引入。可以仅一个或多个半胱氨酸残基被引入。可以仅一个或多个非天然氨基酸被引入。一个或多个半胱氨酸残基和一个或多个非天然氨基酸的组合可被引入。优选通过取代引入至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸。这样做的方法是本领域已知的。这些Dda修饰不阻止解旋酶结合到多核苷酸。这些修饰降低了多核苷酸从解旋酶上解绑或分离的能力。换言之,所述一个或多个修饰通过防止Dda解旋酶从多核苷酸链的解离来增加Dda解旋酶的持续合成能力(processivity)。酶的热稳定性通常也通过一个或多个修饰给予酶在链测序中有利的提高的结构稳定性来增加。非天然氨基酸为不是在Dda解旋酶中天然发现的氨基酸。非天然氨基酸优选不是组氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、精氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丝氨酸或酪氨酸。非天然氨基酸更优选不是前句中二十种氨基酸中的任一种氨基酸或硒代半胱氨酸。
在本发明中使用的优选的非天然氨基酸包括但不限于,4-叠氮基-L-苯丙氨酸(Faz)、4-乙酰基-L-苯丙氨酸、3-乙酰基-L-苯丙氨酸、4-乙酰乙酰基L-苯丙氨酸、O-烯丙基-L-酪氨酸、3-(苯硒基)-L-丙氨酸、O-2-丙炔-1-基-L-酪氨酸、4-(二羟基硼基)-L-苯丙氨酸、4-[(乙基硫烷基)羰基]-L-苯丙氨酸、(2S)-2-氨基-3-{4-[(丙烷-2-基硫烷基)羰基]苯基}丙酸、(2S)-2-氨基-3-{4-[(2-氨基-3-硫烷基丙酰基)氨基]苯基}丙酸、O-甲基-L-酪氨酸、4-氨基-L-苯丙氨酸、4-氰基-L-苯丙氨酸、3-氰基-L-苯丙氨酸、4-氟-L-苯丙氨酸、4-碘-L-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、O-(三氟甲基)酪氨酸、4-硝基-L-苯丙氨酸、3-羟基-L-酪氨酸、3-氨基-L-酪氨酸、3-碘-L-酪氨酸、4-异丙基-L-苯丙氨酸、3-(2-萘基)-L-丙氨酸、4-苯基-L-苯丙氨酸、(2S)-2-氨基-3-(萘-2-基氨基)丙酸、6-(甲基硫烷基)正亮氨酸、6-氧代-L-赖氨酸、D-酪氨酸、(2R)-2-羟基-3-(4-羟基苯基)丙酸、(2R)-2-铵基辛酸酯3-(2,2′-双吡啶-5-基)-D-丙氨酸、2-氨基-3-(8-羟基-3-喹啉基)丙酸、4-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、S-(2-硝基苄基)半胱氨酸、(2R)-2-氨基-3-[(2-硝基苄基)硫烷基]丙酸、(2S)-2-氨基-3-[(2-硝基苄基)氧基]丙酸、O-(4,5-二甲氧基-2-硝基苄基)-L-丝氨酸、(2S)-2-氨基-6-({[(2-硝基苄基)氧基]羰基}氨基)己酸、O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸、2-硝基苯丙氨酸、4-[(E)-苯二氮烯基]-L-苯丙氨酸、4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]-D-苯丙氨酸(4-[3-(Trifluoromethyl)-3H-diaziren-3-yl]-D-phenylalanine)、2-氨基3-[[5-(二甲基氨基)-1-萘基]磺酰基氨基]丙酸、(2S)-2-氨基-4-(7-羟基-2-氧代-2H-色烯-4-基)丁酸、(2S)-3-[(6-乙酰萘-2-基)氨基]-2-氨基丙酸、4-(羧甲基)苯丙氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、O-磺基-L-酪氨酸、(2R)-6-乙酰胺基-2-铵基己酸酯、1-甲基组氨酸、2-氨基壬酸、2-氨基癸酸、L-高半胱氨酸、5-硫烷基正缬氨酸、6-硫烷基-L-正亮氨酸、5-(甲基硫烷基)-L-正缬氨酸、N6-{[(2R,3R)-3-甲基-3,4-二氢-2H-吡咯-2-基]羰基}-L-赖氨酸、N6-[(苄氧基)羰基]赖氨酸、(2S)-2-氨基-6-[(环戊基羰基)氨基]己酸、N6-[(环戊氧基)羰基]-L-赖氨酸、(2S)-2-氨基-6-{[(2R)-四氢呋喃-2-基羰基]氨基}己酸、(2S)-2-氨基-8-[(2R,3S)-3-乙炔基四氢呋喃-2-基]-8-氧代辛酸,N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸、(2S)-2-羟基-6-({[(2-甲基-2-丙基)氧基]羰基}氨基)己酸、N6-[(烯丙氧基)羰基]赖氨酸、(2S)-2-氨基-6-({[(2-叠氮基苄基)氧基]羰基}氨基)己酸、N6-L-脯氨酰-L-赖氨酸、(2S)-2-氨基-6-{[(丙-2-炔-1-基氧基)羰基]氨基}己酸和N6-[(2-叠氮基乙氧基)羰基]-L-赖氨酸。最优选的非天然氨基酸是4-叠氮基-L-苯丙氨酸(Faz)。
本发明中使用的解旋酶优选包含SEQ ID NO:24的变体,其中至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸已经被引入(i)塔域(残基D260-P274和N292-A389),和/或(ii)销域(残基K86-E102),和/或(iii)1A域(残基M1-L85和V103-K177)。至少一个半胱氨酸残基和/或至少一个非天然氨基酸优选被引入到塔域的残基N292-A389中。
如上所述,将至少两个半胱氨酸引入到SEQ ID NO:24和SEQ ID NO25中减小了解旋酶的多核苷酸结合域中的开口的大小或闭合了所述开口。
在本发明中使用的优选的解旋酶构建体在国际申请No.PCT/GB2013/051925(公开为WO2014/013260)、PCT/GB2013/051924(公开为WO2014/013259)和PCT/GB2013/051928(公开为WO2014/013262)和于2013年10月18日在英国提交的申请号1318464.3中描述。
SEQ ID NO:9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ IDNO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQ ID NO23、SEQ ID NO24或SEQ ID NO25的变体是具有从SEQ ID NO:9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQID NO23、SEQ ID NO24或SEQ ID NO25变化而来且保持多核苷酸结合能力的氨基酸序列的酶。这可以使用任何本领域中已知的方法来测定。例如,可使变体与多核苷酸接触并且测量其结合到多核苷酸并沿着多核苷酸移动的能力。所述变体可以包括有助于结合多核苷酸的修饰,和/或有助于其在高盐浓度和/或室温下活性的修饰。变体可被修饰,以使得其结合多核苷酸(即保留多核苷酸结合能力),但没有酶的功能。例如,解旋酶的变体可被修饰以使其结合多核苷酸(即保留多核苷酸结合能力),但没有解旋酶的功能(即当提供所有有助于移动的必要组分,例如ATP和Mg2+时,解旋酶不沿多核苷酸移动)。这样的修饰在本领域是已知的。例如,解旋酶中的Mg2+结合域的修饰通常导致不具有解旋酶功能的变体。这些类型的变体可以作为分子制动器。优选的分子制动器为TrwC CBA-Q594A(具有突变Q594A的SEQ IDNO:25)。其他的参考SEQ ID NO:25在上文进行了论述。该变体不具有解旋酶的功能(即当提供所有有助于移动的必要组分,例如ATP和Mg2+时,结合到多核苷酸,但是并不沿着多核苷酸移动)。一个或多个分子制动器解旋酶可以上文所述的任何方向和/或模式使用。
在SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸序列的整个长度上,基于氨基酸的同一性,变体将优选与所述序列为至少50%的同源性。更优选地,变体多肽可以与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的氨基酸序列在整个序列上基于氨基酸的同一性具有至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%,更优选至少95%,97%或99%的同源性。在200或更多,例如230、250、270、280、300、400、500、600、700、800、900或1000个或更多个连续氨基酸的长度上,可以具有至少80%,例如至少85%、90%或95%的氨基酸同一性(“严格同源性”)。同源性如上文所描述的确定。关于下文的SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4,所述的变体可以上文所述的任何方式不同于野生型序列。
如果两个或多个多核苷酸结合蛋白被使用,它们可以是相同的或不同的。可使用上述的蛋白质的任意组合。例如,两个或多个蛋白可以是相同蛋白例如解旋酶的不同变体。所述两个或多个多核苷酸结合蛋白优选包含一个或多个解旋酶和一个或多个聚合酶。
如果两个或多个多核苷酸结合蛋白被使用,它们可以彼此连接。所述两个或多个多核苷酸结合蛋白可以共价地彼此连接。多核苷酸结合蛋白可以以任何顺序和使用任何方法连接。本发明中使用的优选的解旋酶构建体在国际申请No.PCT/GB2013/051925(公开为WO2014/013260)、PCT/GB2013/051924(公开为WO2014/013259)和PCT/GB2013/051928(公开为WO2014/013262)和于2013年10月18日在英国提交的申请号1318464.3中描述。
如果使用了两个或多个多核苷酸结合蛋白,则除了经由多核苷酸外,它们优选不彼此连接。所述两个或多个多核苷酸结合蛋白更优选彼此不共价连接。
一个或多个解旋酶和一个或多个分子制动器
在某些情况下,本发明的表征方法可以涉及使用一个或多个解旋酶和一个或多个分子制动器。当靶多核苷酸与所述孔相接触时,所述一个或多个解旋酶和一个或多个分子制动器聚集在一起,并且这两者控制多核苷酸相对于所述孔的移动,如穿过所述孔。
所述一个或多个解旋酶可以是任何上述的那些解旋酶。所述一个或多个分子制动器可以是结合到多核苷酸并减缓多核苷酸相对于孔的移动如穿过所述孔的任何化合物或分子。所述一个或多个分子制动器优选包括结合到多核苷酸的一个或多个化合物。所述一个或多个化合物优选是一个或多个大环化合物。合适的大环化合物包括,但不限于,环糊精、杯芳烃、环肽、冠醚、瓜环、柱芳烃、其衍生物或其组合。环糊精或其衍生物可以是任何在Eliseev,A.V.,与Schneider,H-J.(1994)J.Am.Chem.Soc.116,6081-6088中公开的那些。所述的试剂更优选是七-6-氨基-β-环糊精(am7-βCD)、6-单脱氧-6-单氨基-β-环糊精(am1-βCD)或七-(6-脱氧-6-胍基)-环糊精(gu7-βCD)。
所述一个或多个分子制动器优选为一个或多个单链结合蛋白(SSB)。所述一个或多个分子制动器更优选为包含不具有净负电荷的羧基末端(C-末端)区域的单链结合蛋白(SSB),或为(ii)C-末端区域中包含能减少C-末端区域的净负电荷的一个或多个修饰的经修饰SSB。所述一个或多个分子制动器最优选为在国际申请No.PCT/GB2013/051924(公开为WO2014/013259)中公开的任何SSB。
所述一个或多个分子制动器优选为一个或多个多核苷酸结合蛋白。所述多核苷酸结合蛋白可以是能够结合到多核苷酸并控制其相对于孔的移动,如穿过所述孔的任何蛋白。现有技术中可直接确定蛋白质是否结合到多核苷酸。所述蛋白通常与多核苷酸相互作用并修饰所述多核苷酸的至少一个特性。所述蛋白可通过裂解以形成单个核苷酸或较短链的核苷酸,如二核苷酸或三核苷酸,来修饰多核苷酸。所述部分可以通过将多核苷酸定向或通过移动多核苷酸到特定的位置,即控制多核苷酸的移动,修饰多核苷酸。
所述多核苷酸结合蛋白优选衍生自多核苷酸处理酶。所述一个或多个分子制动器可以衍生自上述的任何多核苷酸处理酶。充当分子制动器的Phi29聚合酶的经修饰的版本(SEQ ID NO:9)在美国专利No.5576204中公开。充当分子制动器的Phi29聚合酶的经修饰的版本(SEQ ID NO:9)在下文中公开。所述一个或多个分子制动器优选衍生自解旋酶。
任何数量的衍生自解旋酶的分子制动器可以被使用。例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个解旋酶可被用作分子制动器。如果两个或更多个解旋酶被用作分子制动器,所述两个或更多个解旋酶通常是相同的解旋酶。所述两个或更多个解旋酶可以是不同的解旋酶。
所述两个或更多个解旋酶可以是上文提到的解旋酶的任意组合。所述两个或更多个解旋酶可以是两个或更多个Dda解旋酶。所述两个或更多个解旋酶可以是一个或多个Dda解旋酶和一个或多个TrwC解旋酶。所述两个或更多个解旋酶可以是相同解旋酶的不同变体。
所述两个或更多个解螺旋酶优选彼此连接。所述两个或更多个解旋酶更优选共价地彼此连接。所述解旋酶可以以任何顺序和使用任何方法连接。从解旋酶衍生的一个或多个分子制动器优选被修饰以减少多核苷酸结合域中开口的大小,所述多核苷酸可在至少一个构象状态下通过所述开口从解旋酶解绑。这在WO2014/013260中公开。
用于本发明的优选的解旋酶构建体在国际申请No.PCT/GB2013/051925(公开为WO2014/013260)、PCT/GB2013/051924(公开为WO2014/013259)、PCT/GB2013/051928(公开为WO2014/013262)和PCT/GB2014/052736中描述。
如果所述一个或多个解旋酶以激活模式使用(即当为一个或多个解旋酶提供有助于移动的所有必要组分,例如ATP和Mg2+时),所述一个或多个分子制动器优选(a)在非激活模式下使用(即在不存在有助于移动的必要组分或没有能力主动移动时),(b)在激活模式下使用,其中所述一个或多个分子制动器以与所述一个或多个解旋酶相反的方向移动,或(c)在激活模式下使用,其中所述一个或多个分子制动器以与所述一个或多个解旋酶相同的方向移动,且比所述一个或多个解旋酶移动得更慢。
如果在激活模式下使用所述一个或多个解旋酶(即当未为所述一个或多个解旋酶提供有助于移动的所有必要组分,例如ATP和Mg2+或不能主动移动时),所述一个或多个分子制动器优选(a)在非激活模式下使用(即在不存在有助于移动所需的组分时或不能主动移动时)或(b)在激活模式下使用,其中所述一个或多个分子制动器以与多核苷酸相对于孔的相同方向沿多核苷酸移动,如穿过所述孔。
所述一个或多个解旋酶和一个或多个分子制动器可以在任何位置被连接到多核苷酸,以使它们聚集在一起并且这两者控制多核苷酸相对于所述孔的移动,如穿过所述孔。所述一个或多个解旋酶和一个或多个分子制动器为至少一个核苷酸间隔,例如至少5个、至少10个、至少50个、至少100个、至少500个、至少1000、至少5000、至少10,000、至少50,000个核苷酸间隔或更多个核苷酸间隔。如果该方法涉及用在一端设置的Y衔体和在另一端设置的桥连部分衔体如发夹环衔体表征双链多核苷酸,则所述一个或多个解旋酶被优选地连接到Y衔体,而所述一个或多种分子制动器优选被连接到桥连部分衔体。在本实施方案中,所述一个或多个分子制动器优选是经修饰的一个或多个解旋酶,使得它们结合多核苷酸但不具有解旋酶的功能。连接到Y衔体的一个或多个解旋酶如下文中详述的优选被停滞在间隔器处。连接到桥连部分衔体的一个或多个分子制动器优选不停滞在间隔器处。当所述一个或多个解旋酶到达桥连部分时,所述一个或多个解旋酶和一个或多个分子制动器优选聚集在一起。所述一个或多个解旋酶可以在Y衔体被连接到多核苷酸之前或Y衔体被连接到多核苷酸之后,连接到Y衔体。一个或多个分子制动器可以在所述桥连部分衔体被连接到多核苷酸之前或桥连部分衔体被连接到多核苷酸之后,连接到桥连部分衔体。
所述一个或多个解旋酶和一个或多个分子制动器优选不彼此连接。所述一个或多个解旋酶和一个或多个分子制动器更优选不共价地彼此连接。所述一个或多个解旋酶和一个或多个分子制动器优选不连接,如在国际申请No.PCT/GB2013/051925(公开为WO2014/013260)、PCT/GB2013/051924(公开为WO2014/013259)和PCT/GB2013/051928(公开为WO2014/013262),以及于2013年10月18日在英国提交的申请号为1318464.3中所描述的。
一个或多个聚合酶
本发明的方法优选涉及将一个或多个聚合酶连接到靶多核苷酸。可以使用上文或下文所述的任何聚合酶。例如,聚合酶可包含上文所述的SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:31中所示的序列或其变体。
SEQ ID NO:9的优选的变体包括,但不限于,包含以下取代物的变体:(a)G410C和P562C、(b)A411C和Q560C、(c)K402C和I94C、(d)A406C和E75C、以及(e)L412C和Q560C。将这些半胱氨酸引入到SEQ ID NO:9中减小了上文针对解旋酶所述的聚合酶的多核苷酸结合域中的开口的大小,或闭合了该开口。(a)至(e)中的变体可以被用作如上所述的分子制动器。
一旦一个或多个聚合酶被装载到靶多核苷酸上,它/它们可以使用靶多核苷酸作为模板形成一个或多个多核苷酸。这通常包括在聚合酶使用靶多核苷酸作为模板形成一个或多个多核苷酸的条件下,将靶多核苷酸与一个或多个具有一组游离核苷酸的聚合酶接触。合适的条件将在下文论述。任何数量的多核苷酸可以由一个或多个聚合酶形成。优选形成一个或两个多核苷酸。
所述一组游离核苷酸可以包含上文和下文所述的任何核苷酸。由所述一个或多个聚合酶形成的一个或多个多核苷酸的性质将取决于该组中的游离核苷酸。所述一个或多个聚合酶可以形成与靶多核苷酸相同类型的一个或多个多核苷酸。例如,如果靶多核苷酸为DNA,本发明可使用一组游离的DNA核苷酸(即包括脱氧腺苷、脱氧鸟苷、胸苷、脱氧胞苷和脱氧甲基胞苷的核苷酸),使得所述一个或多个聚合酶使用靶多核苷酸作为模板形成一个或多个DNA多核苷酸。所述一个或多个聚合酶可以形成与靶多核苷酸不同类型的一个或多个多核苷酸。例如,如果靶多核苷酸是RNA,本发明可使用一组游离的DNA核苷酸,使得所述一个或多个聚合酶使用靶多核苷酸作为模板形成一个或多个DNA多核苷酸。所述一个或多个聚合酶可以如下文详述来修饰靶多核苷酸。
引物或3′发夹通常用作用于聚合酶扩展的成核点。所述一个或多个聚合酶可以本文所述的任何方式连接到靶多核苷酸。所述一个或多个聚合酶通常被提供结合到一个或多个装载部分,如一个或多个Y衔体和/或一个或多个桥连部分衔体(如一个或多个发夹环衔体)。
本发明的方法优选包括根据本发明将一个或多个聚合酶连接到单链靶多核苷酸,并使一个或多个聚合酶使用所述靶多核苷酸作为模板形成多核苷酸,并由此产生双链多核苷酸。所述双链多核苷酸包含靶多核苷酸(模板)和由所述一个或多个聚合酶形成的互补多核苷酸。以这种方式形成的双链多核苷酸的两条链可以与桥连部分衔体如发夹环衔体相连,且该双链多核苷酸的两条链可如下文所述被表征。
本发明提供了制备用于表征的靶多核苷酸的方法。该方法包括使用本发明将一个或多个聚合酶连接到靶多核苷酸,然后使用所述靶多核苷酸作为模板,用所述一个或多个聚合酶产生一个或多个额外的多核苷酸。产生与靶多核苷酸互补的多核苷酸有助于其表征,如上所述。
所述方法优选包括根据本发明将一个或多个聚合酶连接到双链靶多核苷酸,并使所述一个或多个聚合酶使用靶多核苷酸的每条链作为模板形成一个或多个多核苷酸。
在一个优选的实施方案中,双链靶多核苷酸的两条链在一端与桥连部分衔体(如发夹环衔体)连接,且使用包含另一桥连部分的装载部分将一个或多个聚合酶连接到所述双链靶多核苷酸的另一端。所述装载部分可以是Y衔体。所述另一桥连部分通常在一个或更多个聚合酶结合的Y衔体的链的末端由发夹环形成。所述装载部分可以包括一个或多个解旋酶,优选结合到一个或多个聚合酶结合的链的相对链。在本实施方案中,一个或多个聚合酶将产生双链构建体,其中所述构建体的两条链在一端与桥连部分连接,而且所述构建体的每条链包含靶多核苷酸的一条链和由一个或多个聚合酶形成的互补的多核苷酸。这在图17中示出。双链构建体的两条链可以如下文所述被表征。在本实施方案中,原始靶多核苷酸的每条链被表征两次。所述一个或多个聚合酶可以用于控制双链构建体相对于孔的移动,如穿过所述孔。所述一个或多个聚合酶可以是分子制动器。如果装载部分还包括一个或多个解旋酶,所述一个或多个解旋酶可以用于控制双链构建体相对于所述孔的移动,如穿过所述孔。在一些实施方案中,一个或多个聚合酶和一个或多个解旋酶可以都被用于控制双链构建体相对于所述孔的移动,如穿过所述孔。
在另一个实施方案中,双链靶多核苷酸的两条链的任一端不与桥连部分衔体(如发夹环衔体)连接。一个或多个聚合酶使用包含桥连部分的装载部分在每一端被连接到双链靶多核苷酸。在每一端的装载部分可以是相同的或不同的。每个装载部分可以是Y衔体。桥连部分通常在一个或多个聚合酶结合的Y衔体的链的末端由发夹环形成。所述装载部分可包含一个或多个解旋酶,优选结合到与一个或多个聚合酶结合的链的相对链。在本实施方案中,一个或多个聚合酶将产生两个双链构建体,其中每个构建体的两条链一端与桥连部分连接,且每个构建体包含靶多核苷酸的一条链和由所述一个或多个聚合酶形成的互补的多核苷酸。这在图18中示出。所述两个构建体可以如下文论述被表征。在本实施方案中,原始靶多核苷酸的每条链表征两次,每个构建体表征一次。所述一个或多个聚合酶可以控制每个双链构建体相对于所述孔的移动,如穿过所述孔。所述一个或多个聚合酶可以是分子制动器。如果每个装载部分还包括一个或多个解旋酶,则所述一个或多个解旋酶可被用于控制每个双链构建体相对于所述孔的移动,如穿过所述孔。在一些实施方案中,所述一个或多个聚合酶和一个或多个解旋酶可都被用于控制每个双链构建体相对于孔的移动,如穿过所述孔。
在另一个实施方案中,双链靶多核苷酸的两条链的两端与桥连部分衔体(如发夹环衔体)连接,以形成环形构建体,并且一个或多个聚合酶被连接到每个桥连部分衔体。所述的一个或所述的两个桥连部分衔体可以包含一个或多个解旋酶,优选结合到杂合到桥连部分衔体的多核苷酸。通过杂合该多核苷酸到桥接衔体部分形成的双链多核苷酸可由所述一个或多个聚合酶来成核,用于聚合酶延伸。在本实施方案中,在环形构建体的每一端的一个或多个聚合酶将使用该环形构建体作为模板,产生包含所述靶多核苷酸的每条链的多个拷贝的构建体。由于有两组一个或多个聚合酶,两个构建体将从每个靶多核苷酸产生。这在图19中示出。每个构建体可以如下所述被表征。每个构建体将通常包含靶多核苷酸的每条链的多个拷贝。构建体中的拷贝可以杂合在一起形成双链区域。在本实施方案中,原始靶多核苷酸的每条链将进行与一个或多个聚合酶复制它们时一样多次数的表征。所述一个或多个聚合酶可控制构建体相对于所述孔的移动,如穿过所述孔。所述一个或多个聚合酶可以是分子制动器。如果每个桥连部分还包括一个或多个解旋酶,所述一个或多个解旋酶可以被用于控制构建体相对于所述孔的移动,如穿过所述孔。在一些实施方案中,所述一个或多个聚合酶和一个或多个解旋酶可以都被用于控制构建体相对于所述孔的移动,如穿过所述孔。
使用一个或多个聚合酶产生一个或多个多核苷酸之后,该方法优选包括将靶多核苷酸和一个或多个多核苷酸与跨膜孔接触,使得靶多核苷酸和所述一个或多个多核苷酸相对于孔的移动,如穿过所述孔。该方法优选包括将所述靶多核苷酸和一个或多个多核苷酸与跨膜孔接触,使得所述一个或多个聚合酶控制靶多核苷酸和一个或多个多核苷酸相对于孔的移动,如穿过所述孔。一个或多个解旋酶也可以用于控制靶多核苷酸和一个或多个多核苷酸相对于孔的移动,如穿过所述孔。所述一个或多个解旋酶可以连接到所述靶多核苷酸和所述一个或多个多核苷酸,如上所述。
该方法还包含当所述靶多核苷酸和一个或多个多核苷酸相对于所述孔移动时,获取一个或多个测量值,其中测量值代表多核苷酸的一个或多个特征,并由此表征所述靶多核苷酸。下文所述的任何实施方案适用于本方法。
装载部分
一个或多个多核苷酸结合蛋白被提供结合到(或连接到)一个或多个装载部分。在一个优选的实施方案中,该方法还包括结合(或连接)所述一个或多个多核苷酸结合蛋白到所述一个或多个装载部分。
每个装载部分可以是能够被连接到靶多核苷酸的任何部分。只要多核苷酸结合蛋白可结合且其能被连接到靶多核苷酸,每个装载部分可以是任何长度。
所述一个或多个装载部分优选是合成的或人工的。所述一个或多个装载部分优选是非天然的。
合适的装载部分包括,但不限于,聚合连接体、化学连接体、多核苷酸或多肽。所述一个或多个装载部分优选包含多核苷酸或装载多核苷酸。在此类实施方案中,一个或多个多核苷酸结合蛋白优选结合到(或连接到)多核苷酸。也可以使用以上所述的任何多核苷酸。优选地,所述一个或多个装载部分包含DNA、RNA、经修饰的DNA(如脱碱基的DNA)、RNA、PNA、LNA、BNA或PEG。所述一个或多个装载部分更优选包含单链或双链DNA或RNA。
所述一个或多个装载部分优选包括所述一个或多个多核苷酸结合蛋白结合的(或连接的)的单链多核苷酸。
至少一个所述一个或多个装载部分优选为Y衔体。Y衔体在关于双偶联的章节中定义,并且可以包括前导序列。
至少一个所述一个或多个装载部分优选为桥连部分。所述桥连部分最优选为发夹环或发夹环衔体。合适的发夹环衔体可以使用本领域中已知的方法来设计。发夹环可以是任何长度。如果发夹环用作装载部分,其通常为400个或更少个核苷酸,如350个或更少个核苷酸、300个或更少个核苷酸、250个或更少个核苷酸、200个或更少个核苷酸、150个或更少个核苷酸、100个或更少个核苷酸、90或更少个核苷酸、80个或更少个核苷酸、70个或更少个核苷酸、60个或更少个核苷酸、50个或更少个核苷酸、40个或更少个核苷酸、30个或更少个核苷酸、20个或更少个核苷酸、或10个或更少个核苷酸的长度。发夹环优选为从约1个至400个、2个至300个、5个至200、6个至100个核苷酸的长度。当多核苷酸的两个互补部分杂合以形成双链序列(称为茎干)时,形成发夹环。如果用作装载部分,发夹环的茎干优选200个或更少个核苷酸对、例如150个或更少个核苷酸对、100个或更少个核苷酸对、90个或更少个核苷酸对、80个或更少个核苷酸对、70个或更少核苷酸对、60个或更少个核苷酸对、50个或更少个核苷酸对、40个或更少个核苷酸对、30个或更少核苷酸对、20个或更少核苷酸对或10个或更少核苷酸对的长度。所述一个或多个多核苷酸结合蛋白通常结合到发夹的环,即不是茎干。
如果靶多核苷酸是双链的,所述一个或多个装载部分优选包含Y衔体和可选地桥连部分,如发夹环衔体。如果至少一个或多个所述装载部分是Y衔体,它可与不具有任何多核苷酸结合蛋白结合或连接的桥接衔体组合使用。
如果所述一个或多个多核苷酸结合蛋白衍生自解旋酶,它们可停滞在所述一个或更多个装载部分上的一个或多个间隔器处。下文进行更详细的讨论。
可以使用任何数量的一个或多个装载部分。本方法可以包括连接两个或多个装载部分,其中每个装载部分具有与其结合(连接)的一个或多个多核苷酸结合蛋白。例如,装载部分可连接到靶多核苷酸的每一端。在此类实施方案中,一个装载部分优选为Y衔体,且另一装载部分可以是桥连部分,如发夹环衔体。这些将在下文更详细地讨论。
所述一个或多个装载部分可以以任何方式连接到靶多核苷酸。所述一个或多个装载部分优选共价地连接到靶多核苷酸。
所述一个或多个装载部分最优选接合到靶多核苷酸。所述一个或多个装载部分可以接合到多核苷酸的任一端,即5′或3′末端。装载部分可被接合到靶多核苷酸的两端。所述一个或多个装载部分可使用本领域中已知的任何方法接合到多核苷酸。所述一个或多个装载部分可在没有ATP存在下或使用γ-S-ATP(ATPγS)代替ATP接合到多核苷酸。
所述一个或多个装载部分可使用连接酶接合,如T4 DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、Taq DNA连接酶、Tma DNA连接酶和9°N DNA连接酶。连接酶优选在实施例3中设定的条件下使用。
该方法优选进一步包括从本方法的条件中去除连接酶。
一旦装载部分已经连接到靶多核苷酸,所述一个或多个多核苷酸结合蛋白优选保持结合(连接)到所述装载部分。根据本发明所述一个或多个多核苷酸结合蛋白被连接后,可以将它们从所述一个或多个装载部分解绑。
膜
根据本发明可使用任何膜。合适的膜是本领域公知的。所述膜优选为两亲层。两亲层是由具有亲水性和亲脂性的两亲分子形成的层,如磷脂。所述两亲分子可以是合成的或天然存在的。非天然存在的两亲物和形成单层的两亲物在本领域中是已知的,且包括,例如,嵌段共聚物(Gonzalez-Perez等人,Langmuir,2009,25,10447-10450)。嵌段共聚物是其中两个或多个单体亚基一起聚合以生成单个聚合物链的聚合物材料。嵌段共聚物通常具有由每个单体亚基贡献的特性。然而,嵌段共聚物可具有由各个亚基形成的聚合物不具有的独特的特性。嵌段共聚物可以被加工,使得单体亚基中的一个是疏水性的(即亲脂的),而其他亚基在含水介质中是亲水性的。在这种情况下,该嵌段共聚物可具有两亲特性,并且可以形成模仿生物膜的结构。嵌段共聚物可以是二嵌段(由两个单体亚基组成),但也可以由多于两个的单体亚基构成以形成充当两亲物的更复杂的排列。所述共聚物可以是三嵌段、四嵌段或五嵌段共聚物。膜优选为三嵌段共聚物膜。
古细菌双极四醚脂质是天然存在的脂质,其被构造为使得所述脂质形成单层膜。这些脂质通常在恶劣的生物环境、嗜热菌、嗜盐菌和嗜酸菌中生存的嗜极菌(extremophiles)中被发现。它们的稳定性被认为是从最终双层的融合性质中衍生的。比较简单的是,通过生成具有亲水性-疏水性-亲水性一般基序的三嵌段聚合物构造模仿这些生物实体的嵌段共聚物材料。所述材料可以形成行为类似于脂质双层且包含从囊泡到层状膜的一系列相行为的单体膜。由这些三嵌段共聚物形成的膜与生物脂质膜相比持有一些优点。因为三嵌段共聚物是合成的,因此可以仔细控制其确切构造以提供用于形成膜和与孔及其它蛋白相互作用所需的正确链长度和特性。
嵌段共聚物也可以从不被分类为脂质子材料的亚基构建;例如疏水性聚合物可从硅氧烷或其它非基于烃的单体制成。嵌段共聚物的亲水性子段也可具有低的蛋白质结合特性,这使得当暴露于未处理的生物样品时,其可生成高抗性的膜。该头部基团单元也可以从非经典的脂质头部基团衍生。
三嵌段共聚物膜与生物脂质膜相比,还具有增强的机械稳定性和环境稳定性,例如高得多的操作温度或pH范围。嵌段共聚物的合成性质为定制用于广泛应用范围的基于聚合物的膜提供了平台(platform)。
所述膜最优选为在国际申请No.PCT/GB2013/052766或PCT/GB2013/052767中公开的膜之一。
所述两亲分子可以是经化学修饰的或官能化的以有助于多核苷酸的耦合。
该两亲层可以是单层或双层。两亲层通常是平面的。两亲层可以是弯曲的。两亲层可以被支撑。
两亲膜通常天然是移动的,本质上充当具有约10-8cm s-1的脂质扩散速率的二维流体。这意味着检测器和耦合的多核苷酸通常在两亲膜内移动。
膜可以是脂质双层。脂质双层是细胞膜的模型,并充当用于一系列实验研究的优秀的平台。例如,脂质双层可通过单通道记录用于膜蛋白的体外研究。或者,脂质双层可用作生物传感器以检测一系列物质的存在。脂质双层可以是任何脂质双层。合适的脂质双层包括,但不限于,平面脂双层、支撑双层或脂质体。脂质双层优选平面脂质双层。合适的脂质双层在国际申请No.PCT/GB08/000563(公开为WO 2008/102121)、国际申请No.PCT/GB08/004127(公开为WO2009/077734)和国际申请No.PCT/GB2006/001057(公开为WO 2006/100484)中公开。
用于形成脂质双层的方法在本领域中是已知的。合适的方法在实施例中公开。脂质双层通常由Montal和Mueller的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,1972;69:3561-3566)共同来形成,其中脂质单层是在水溶液/空气界面上进行的,所述水溶液/空气界面穿过垂直于该界面的孔的任一侧。脂质通常通过首先将其在有机溶剂中溶解,然后使得一滴所述溶剂在孔的任一侧上的水溶液的表面上蒸发,而添加到电解质水溶液的表面。一旦有机溶剂蒸发了,在孔的任一侧上的溶液/空气界面物理地上下移动穿过所述孔,直到双层形成。平面脂质双层可跨越膜中的孔或跨越开口而形成凹部。
Montal和Mueller的方法是流行的,因为该方法是形成适于蛋白孔插入的良好品质脂质双层的成本合算和相对简单的方法。双层形成的其它常用方法包括脂质体双层的尖部浸渍,喷涂双层和膜片钳。
尖部浸渍形成双层必需使孔表面(例如,移液管尖部)接触到承载脂质单层的测试溶液的表面。另外,首先通过将一滴溶解在有机溶剂中的脂质在溶液表面蒸发而在溶液/空气界面处产生脂质单层。然后由Langmuir-Schaefer工艺形成所述双层,并且所述双层需要机械自动化以相对于溶液表面移动所述孔。
对于喷涂双层,将溶解在有机溶剂中的脂质的液滴直接施加到所述孔,该孔浸没在水性测试溶液中。使用画笔或等效物将脂质溶液薄薄地涂在孔上。溶剂的稀释(thinning)导致脂质双层的形成。然而,从双层完全去除溶剂是困难的,并因此由该方法形成的双层是较不稳定的且在电化学测量过程中更容易有噪声。
膜片钳通常在生物细胞膜的研究中使用。细胞膜通过抽吸被夹到移液管的端部,且膜的小块贴附到孔上。该方法已被改为用于通过夹住脂质体,然后脂质体爆裂而离开移液管的孔上的脂质双层密封,而产生脂质双层。该方法需要稳定的、巨大的和单层的脂质体,以及需要在具有玻璃表面的材料中制造小孔。
脂质体可通过超声、挤出或Mozafari法(Colas等人(2007)Micron 38:841-847)来形成。
在优选的实施方案中,脂质双层如在国际申请No.PCT/GB08/004127(公开为WO2009/077734)中描述的来形成。本方法中有利的是,脂质双层是由干燥的脂质形成的。在最优选的实施方案中,脂质双层跨越开口而形成,如在WO2009/077734(PCT/GB08/004127)中描述的。
脂质双层是由脂质的两个相对的层形成的。脂质的两层被排列为使得它们的疏水性尾部基团面向彼此以形成疏水性内部。脂质的亲水性头部基团面向外朝向该双层的每一侧的含水环境。该双层可存在于许多脂质相中,所述脂质相包括但不限于,液态无序相(流体层状)、液态有序相、固态有序相(层状凝胶相、相互交叉的凝胶相)和平面双层晶体(层状子凝胶相、层状结晶相)。
可使用形成脂质双层的任何脂质组合物。脂质组合物被选择为,使得形成的脂双层具有所需的特性,例如表面电荷、支撑膜蛋白的能力、填充密度或机械特性。脂质组合物可包含一个或多个不同的脂质。例如,脂质组合物可含有多达100个脂质。脂质组合物优选含有1至10个脂质。脂质组合物可以包括天然存在的脂质和/或人工脂质。
脂质通常包括头部基团、界面部分和可以相同或不同的两个疏水尾基。合适的头部基团包括,但不限于,中性头部基团,如二酰基甘油酯(DG)和神经酰胺(CM);两性离子头部基团,如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和鞘磷脂(SM);带负电荷的头部基团,如磷脂酰甘油(PG);磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷酸(PA)和心磷脂(CA);和带正电荷的头部基团,如三甲基铵-丙烷(TAP)。合适的界面部分包括,但不限于,天然存在的界面部分,例如基于甘油或基于神经酰胺的部分。合适的疏水性尾部基团包括,但不限于,饱和烃链,如月桂酸(正十二烷酸)、肉豆蔻酸(正十四烷酸)、棕榈酸(正十六烷酸)、硬脂酸(正十八烷酸)和花生酸(正二十烷酸);不饱和烃链,如油酸(顺-9-十八烷酸);和支链烃链,如植烷酰(phytanoyl)。链的长度和不饱和烃链中双键的位置和数量可以改变。链的长度和在支链烃链中的支链如甲基基团的位置和数目可以改变。疏水性尾部基团可以被连接到作为醚或酯的界面部分。脂质可以是霉菌酸。
脂质也可以是被化学修饰的。脂质的头部基团或尾部基团可以是化学修饰的。头部基团已被化学修饰的合适的脂质包括,但不限于,PEG修饰的脂质,例如1,2-二酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000];官能化的PEG脂质,如1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[生物素基(聚乙二醇)2000];为共轭而修饰的脂质,如1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(琥珀酰基)和1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素基)。尾部基团已被化学修饰的合适的脂质包括,但不限于,可聚合的脂质,如1,2-双(10,12-二十三二炔酰)-sn甘油基-3-磷酸胆碱;氟化脂质,例如1-棕榈酰基-2-(16-氟代棕榈酰基)-sn甘油基-3-磷酸胆碱;氘化脂质,如1,2-二棕榈酰基-D62--sn-甘油基-3-磷酸胆碱;和醚连接的脂质,如1,2-二-O-植烷基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱。脂质可以是化学修饰的或官能化的,以有助于多核苷酸的耦合。
两亲层例如,脂质组合物,通常包含将影响该层的性能的一个或多个添加剂。合适的添加剂包括,但不限于,脂肪酸,如棕榈酸、肉豆蔻酸和油酸;脂肪醇,如棕榈醇、肉豆蔻醇和油醇;甾醇,如胆固醇、麦角固醇、羊毛甾醇,谷甾醇和豆甾醇;溶血磷脂,如1-酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱;和神经酰胺。
在另一个优选的实施方案中,所述膜为固态层。固态层可以由有机和无机材料形成,该有机和无机材料包括但不限于,微电子材料、绝缘材料,如Si3N4、Al2O3和SiO,有机和无机聚合物,例如聚酰胺、塑料如或弹性体如双组分加成固化硅橡胶,和玻璃。固态层可以由石墨烯形成。合适的石墨烯层在国际申请No.PCT/US2008/010637(公开为WO2009/035647)中公开。
该方法通常使用(i)包含孔的人工两亲层,(ii)分离的、包含孔的天然存在的脂质双层,或(iii)具有嵌入其中的孔的细胞进行。该方法通常使用人工两亲层进行,如人工三嵌段共聚物层。除了孔以外,所述层可包含其它跨膜和/或膜内蛋白以及其他分子。合适的设备和条件在下面讨论。本发明的方法通常在体外实施。
耦合
所述一个或多个装载部分优选包含一个或多个能够耦合到膜的锚。根据本发明,一旦被连接,所述一个或多个锚能够将靶多核苷酸耦合到膜。
在本发明的表征方法中,靶多核苷酸优选通过使用一个或多个锚耦合到膜。靶多核苷酸可以使用任何已知的方法耦合到膜。
每个锚包含耦合(或结合)到所述一个或多个装载部分的基团和耦合(或结合)到膜上的基团。每个锚可以共价耦合(或结合)到所述部分和/或所述膜。
每个部分可包含任何数量的锚,如2、3、4个或更多个锚。例如,一个靶多核苷酸可以使用两个锚耦合到所述膜,所述两个锚各自经部分和膜单独耦合(或结合)到两个多核苷酸。
如果膜是两亲层,如共聚物膜或脂质双层,则所述一个或多个锚优选地包括在所述膜中存在的多肽锚和/或在所述膜中存在的疏水锚。所述疏水锚优选是脂质、脂肪酸、甾醇、碳纳米管、多肽、蛋白质或氨基酸,例如胆固醇、棕榈酸酯或生育酚。在优选的实施方案中,所述一个或多个锚不是检测器。
膜的组分,如两亲分子、共聚物或脂质,可以是化学修饰的或官能化的,以形成一个或多个锚。合适的化学修饰和合适的官能化膜的组分的方式的实例在下面更详细地讨论。任何比例的膜组分可以被官能化,例如至少0.01%、至少0.1%、至少1%、至少10%、至少25%、至少50%或100%。
用于耦合多核苷酸到膜的一个或多个锚优选包含连接体。所述一个或多个锚可包含一个或多个连接体,例如2、3、4或更多个。一个连接体可用于耦合多于1个,例如2、3、4或更多个多核苷酸到膜上。
优选的连接体包括,但不限于,聚合物,如多核苷酸、聚乙二醇(PEG)、多糖和多肽。这些连接体可以是直链的、支链的或环状的。例如,所述连接体可以是环形的多核苷酸。所述多核苷酸可杂合到环状多核苷酸连接体上的互补序列。
所述一个或多个锚或一个或多个连接体可包含可切割或可分解的组分,如限制性位点或光不稳定基团。
官能化的连接体以及它们耦合分子的方式在本领域中是已知的。例如,用马来酰亚胺基团官能化的连接体将与蛋白质中的半胱氨酸残基反应并连接到其上。在本发明的上下文中,该蛋白质可以存在于该膜中,或者可以用来耦合(或结合)到所述一个或多个装载部分。这在下面更详细地讨论。
可使用“锁和钥匙”排列避免多核苷酸的交联。各连接体仅一端可一起反应以形成更长的连接体,且连接体的其他端各自分别与装载部分或膜反应。此类连接体在国际申请No.PCT/GB10/000132(公开为WO 2010/086602)中描述。
连接体优选用在下文讨论的测序实施方案中。如果多核苷酸被永久地直接耦合到所述膜,意义在于当多核苷酸与检测器相互作用时,多核苷酸不解耦(即在步骤(b)或(e)中不解耦),则由于所述膜和检测器之间的距离,当测序运行不能继续至多核苷酸的末端时,一些序列数据将丢失。如果使用连接体,则多核苷酸可以进行到完成为止。
所述耦合可以是永久的或稳定的。换言之,耦合可以是,使得当多核苷酸与所述孔相互作用时,多核苷酸保持耦合到膜上。
该耦合可以是短暂的。换言之,耦合可以是,使得当多核苷酸与所述孔相互作用时,多核苷酸可以去耦。
对于某些应用,如适体(aptamer)检测,耦合的短暂性质是优选的。如果永久的或稳定的连接体直接连接到多核苷酸的5′或3′末端,并且连接体比膜和跨膜孔的通道之间的距离更短,则当测序运行不能继续至多核苷酸的末端,一些序列数据将丢失。如果耦合是短暂的,那么当耦合的末端随机地变得没有膜时,该多核苷酸可以被加工至完成为止。形成永久的/稳定的或短暂的链接的化学基团在下面更详细地讨论。所述多核苷酸可使用胆固醇或脂肪酰链短暂地耦合到两亲层或三嵌段共聚物膜。可以使用具有6至30个碳原子的长度的任何脂肪酰基链,例如十六烷酸。
在优选的实施方案中,一个或多个锚能够被耦合到两亲层,如三嵌段共聚物膜或脂质双层。将核酸耦合到合成脂双层已经先前用多种不同的拴系策略实施。这些总结于下表1中。
表1
合成的多核苷酸和/或连接体可使用在合成反应中经修饰的亚磷酰胺官能化,所述经修饰的亚磷酰胺与用于直接加成合适的锚固基团,如胆固醇、生育酚、棕榈酸、硫醇、脂质和生物素基团是容易兼容的。这些不同的连接化学物给出了用于连接装载部分的一套选择。每个不同的修饰基团以略微不同的方式耦合装载部分,并且耦合并不总是永久的,所以给予了连接到膜的多核苷酸以不同的停留时间(dwell time)。短暂的耦合的优点如上所述。
将多核苷酸耦合到连接体,或将多核苷酸耦合到官能化的膜还可以通过许多其他手段实现,条件是互补的反应性基团或锚固基团被加成到所述多核苷酸装载部分。将反应性基团加成到多核苷酸的任一端在以前已经有报道。硫醇基团可以使用T4多核苷酸激酶和ATPγS加成到ssDNA或dsDNA的5’末端(Grant,G.P.and P.Z.Qin(2007).″在核酸的5′末端连接硝基氧自旋标记的简便方法″,Nucleic Acids Res 35(10):e77)。叠氮基可以用T4多核苷酸激酶和γ-[2-叠氮基乙基]-ATP或-γ-〔6-叠氮己基]-ATP加成到ssDNA或dsDNA的5′-磷酸酯。使用硫醇或点击化学(Click chemistry),将含有硫醇、碘乙酰胺OPSS或马来酰亚胺基团(对硫醇具有反应性)或DIBO(二苯并环辛炔(dibenzocyclooxtyne))或炔基(对叠氮化物具有反应性)的系链共价连接到多核苷酸装载部分。更多样化选择的化学基团,如生物素、硫醇和荧光团,可以使用末端转移酶进行加成,以结合修饰的寡核苷酸到ssDNA的3′末端(Kumar,A.,P.Tchen,et al.(1988).“以末端脱氧核苷酸转移酶非放射性标记合成的寡核苷酸探针”Anal Biochem 169(2):376-82)。链霉亲和素/生物素和/或链霉亲和素/脱硫生物素耦合可用于任何其它的多核苷酸装载部分。也可以将锚使用具有经合适修饰的核苷酸(例如,胆固醇或棕榈酸酯)的末端转移酶直接加成到多核苷酸装载部分。
所述一个或多个锚优选能够将装载部分/多核苷酸经杂合偶联到膜。一个或多个锚中的杂合可使以如上所述的短暂方式耦合。杂合可以存在于一个或多个锚的任何部分中,例如一个或多个锚与装载部分之间、所述一个或多个锚内或在一个或多个锚和膜之间。例如,连接体可以包含杂合在一起的两个或更多个多核苷酸,如3、4或5个多核苷酸。所述一个或多个锚可以杂合到多核苷酸装载部分。所述一个或多个锚可以直接地杂合到多核苷酸装载部分,如直接杂合到Y衔体和/或前导序列,或直接杂合到桥连部分衔体,如发夹环衔体(如下面讨论的)。或者,一个或多个锚可以杂合到一个或多个,例如2或3个中间多核苷酸(或“夹板体(splint)”),所述中间多核苷酸杂合到多核苷酸装载部分,或杂合到Y衔体和/或前导序列,或杂合到连接到多核苷酸的桥连部分衔体(如下面讨论)。
所述一个或多个锚可包括单链多核苷酸或双链多核苷酸。锚的一部分可以接合到单链或双链多核苷酸装载部分。使用T4 RNA连接酶I接合ssDNA的短片段已经被报道(Troutt,A.B.,M.G.McHeyzer-Williams等人(1992).″接合-锚定PCR技术:具有单侧特异性的简单扩增技术.″Proc Natl Acad Sci U S A 89(20):9823-5)。或者,单链或双链多核苷酸可以接合到双链多核苷酸,然后通过热变性或化学变性分离两条链。对于双链靶多核苷酸,可以将单链多核苷酸的小段添加到该双链体的一端或两端,或将一双链多核苷酸添加到其一端或两端。对于将单链多核苷酸添加到双链多核苷酸,可以使用用于连接到单链多核苷酸的其他区域的T4 RNA连接酶I来实现。对于将双链多核苷酸添加到双链多核苷酸随后接合可以用分别在多核苷酸和添加的多核苷酸上的互补的3′dA/dT尾部(如同常规地对许多样品制备应用所做的,以防止多联体或者二聚体形成)或使用由多核苷酸的限制消化和相容衔体的接合而产生的“粘性末端”,进行“钝化终止(blunt-ended)”。然后,当双链体熔化时,每条单链将具有或5′或3′修饰,如果使用单链多核苷酸进行连接或修饰,则在5’末端或3′末端进行修饰,或如果使用双链多核苷酸进行接合,则在这两端进行修饰。
如果装载部分是合成的,所述一个或多个锚可以在其化学合成过程中并入。例如,多核苷酸装载部分可以使用具有连接到它的反应性基团的引物来合成。
腺苷酰化的多核苷酸是接合反应中的中间体,其中单磷酸腺苷连接到多核苷酸的5′-磷酸。多种试剂盒可用于产生该中间体,如来自NEB的5′-DNA腺苷酸化试剂盒。通过在反应中用ATP替代修饰的核苷酸三磷酸,可以将反应性基团(例如硫醇、胺、生物素、叠氮化物等)加成到多核苷酸的5′。也可以使用具有适当被修饰的核苷酸(例如,胆固醇或棕榈酸酯)的5′DNA腺苷酰化试剂盒将锚直接加成到多核苷酸装载部分。
用于基因组DNA的片段的扩增的常用技术是使用聚合酶链反应(PCR)。本文中,使用两个合成寡核苷酸引物可以生成许多DNA的相同片段的拷贝,其中对于每个拷贝,双链体中每条链的5′将是合成的多核苷酸。单个或多个核苷酸可以通过使用聚合酶被添加到单链或双链的DNA的3′末端。可使用的聚合酶的实例包括,但不限于,末端转移酶、Klenow和大肠杆菌多(A)聚合酶。通过在反应中用ATP替代被修饰的核苷酸三磷酸,则可将锚,例如胆固醇、硫醇、胺、叠氮化物、生物素或脂质,结合至双链多核苷酸装载部分中。因此,扩增的多核苷酸装载部分的每个拷贝将包含锚。
理想化的,装载部分/多核苷酸耦合到膜,而无需必须将所述装载部分/多核苷酸官能化。这可以通过耦合一个或多个锚,如多核苷酸结合蛋白质或化学基团到膜,并使得所述一个或多个锚与装载部分/多核苷酸相互作用或通过官能化所述膜来实现。所述一个或多个锚可以通过本文所述的任何方法被耦合到膜上。特别地,所述一个或多个锚可以包含一个或多个连接体,如马来酰亚胺官能化的连接体。
所述一个或多个锚可包含耦合到、结合到下述物质或与之相互作用:单链或双链多核苷酸、装载部分内特定的核苷酸序列、或装载部分内经修饰核苷酸的模式,或在装载部分上存在的任何其它配体。
在锚中使用的合适的结合蛋白包括但不限于,大肠杆菌单链结合蛋白、P5单链结合蛋白、T4 gp32单链结合蛋白、TOPO V dsDNA结合区、人类组蛋白、大肠杆菌HU DNA结合蛋白和其他古细菌、原核或真核的单链或双链多核苷酸(或核酸)结合蛋白,包括下文列出的那些。
装载部分中的特定的核苷酸序列可以是由转录因子、核糖体、核酸内切酶、拓扑异构酶或复制起始因子识别的序列。修饰的核苷酸的模式可以是甲基化模式或损伤模式。
所述一个或多个锚可包含耦合到、结合到、嵌入多核苷酸装载部分或与多核苷酸装载部分相互反应的任何基团。该基团可以通过静电结合、氢键结合或范德华相互作用而嵌入或与多核苷酸相互作用。这类基团包括赖氨酸单体,聚赖氨酸(其将与ssDNA或dsDNA相互作用),溴化乙锭(其将嵌入dsDNA),通用碱基或通用核苷酸(可以与任何多核苷酸杂合)和锇络合物(可以对甲基化碱基反应)。因此多核苷酸装载部分可使用连接到膜的一个或多个通用核苷酸耦合到膜。每个通用核苷酸可以使用一个或多个连接体耦合到膜。通用核苷酸优选包括以下的核碱基中的一个:次黄嘌呤、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚、6-硝基吲哚、甲酰基吲哚、3-硝基吡咯、硝基咪唑、4-硝基吡唑、4-硝基苯并咪唑、5-硝基吲唑、4-氨基苯并咪唑或苯基(C 6-芳族环)。通用核苷酸更优选包括下列核苷中的一个:2′-脱氧肌苷,肌苷、7-脱氮杂-2′-脱氧肌苷、7-脱氮杂-肌苷、2-氮杂-脱氧肌苷、2-氮杂-肌苷、2-O′-甲基肌苷、4-硝基吲哚2′-脱氧核糖核苷、4-硝基吲哚核糖核苷、5-硝基吲哚-2′-脱氧核糖核苷、5-硝基吲哚核糖核苷、6-硝基吲哚-2′-脱氧核糖核苷、6-硝基吲哚核糖核苷、3-硝基吡咯2′-脱氧核糖核苷、3-硝基吡咯核糖核苷、次黄嘌呤的无环糖类似物、硝基咪唑2′-脱氧核糖核苷、硝基咪唑核糖核苷、4-硝基吡唑2′-脱氧核糖核苷、4-硝基吡唑核糖核苷、4-硝基苯并咪唑2′-脱氧核糖核苷、4-硝基苯并咪唑核糖核苷、5-硝基吲唑2′-脱氧核糖核苷、5-硝基吲唑核糖核苷、4-氨基苯并咪唑2′-脱氧核糖核苷、4-氨基苯并咪唑核糖核苷、苯基C-核糖核苷、苯基C-2′-脱氧核糖基核苷、2′-脱氧水粉蕈素、2′-脱氧异鸟苷、K-2′-脱氧核糖、P-2′脱氧核糖和吡咯烷。通用核苷酸更优选包含2′-脱氧肌苷。通用核苷酸更优选为IMP或dIMP。通用核苷酸最优选dPMP(2′-脱氧-P-核苷单磷酸)或dKMP(N6-甲氧基-2,6-二氨基嘌呤单磷酸)。
所述一个或多个锚可以通过Hoogsteen氢键(其中两个核碱基通过氢键保持在一起)或反向Hoogsteen氢键(其中一个核碱基相对于另一个核碱基旋转180°)耦合到(或结合到)多核苷酸装载部分。例如,一个或多个锚可以包含一个或多个核苷酸、一个或多个寡核苷酸,或与多核苷酸装载部分形成Hoogsteen氢键或反向Hoogsteen氢键的一个或多个多核苷酸。这种类型的氢键允许第三个多核苷酸链绕双链螺旋卷绕并形成三链体。所述一个或多个锚可以通过用双链二链体形成三链体而耦合到(或结合到)双链多核苷酸装载部分。
在本实施方案中,至少1%、至少10%、至少25%、至少50%或100%的膜组分可以被官能化。
如果所述一个或多个锚包含蛋白,它们无需进一步官能化,能够直接锚固到膜中,例如,如果所述蛋白已经具有一个与膜相容的外部疏水区时。这类蛋白的实例包括,但不限于,跨膜蛋白、膜内蛋白和膜蛋白。或者,所述蛋白可以用与膜相容的遗传融合的疏水区来表达。这种疏水蛋白区在本领域中是公知的。
所述一个或多个锚优选在与膜接触之前,与一个或多个装载部分混合,但是所述一个或多个锚也可以与膜接触,然后与一个或多个装载部分接触。
在另一个方面,装载部分可使用上述方法官能化,以使其可以被特定的结合基团识别。具体地,所述装载部分也可以用配体如生物素(用于结合到链霉亲和素)、直链淀粉(用于结合到麦芽糖结合蛋白或融合蛋白)、Ni-NTA(用于结合到聚组氨酸或聚组氨酸标记的蛋白)或肽(如抗原)官能化。
根据优选的实施方案,当多核苷酸连接到包含优先螺入孔中的前导序列的装载部分上时,所述一个或多个锚可用于将多核苷酸耦合到膜上。前导序列是在下面更详细地讨论。优选地,该多核苷酸被连接到(例如接合到)优先螺入孔中的前导序列。这种前导序列可以包含均聚多核苷酸或脱碱基区。前导序列通常设计为,被直接杂合到或由一个或多个间体多核苷酸(或夹板体)杂合到所述一个或多个锚。在这种情况下,所述一个或多个锚通常包含与前导序列中的序列或一个或多个中间体多核苷酸(或夹板体)中的序列互补的多核苷酸序列。在这种情况下,所述一个或多个夹板体通常包含与前导序列中的序列互补的多核苷酸序列。
在化学连接中使用的分子的实例是EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)。反应性基团也可以使用商购的试剂盒(Thermo Pierce,货号No.22980)被加成到多核苷酸的5’末端。合适的方法包括,但不限于,使用组氨酸残基和Ni-NTA进行的短暂亲和连接,以及由反应性半胱氨酸、赖氨酸或非天然氨基酸进行的更牢固的共价连接。
跨膜孔
本发明的表征方法包括当靶多核苷酸相对于孔移动时,获取一个或多个测量值。可使用孔得到多种不同类型的测量值。这包括但不限于:电测量和光学测量。可能的电测量包括:电流测量、阻抗测量、风洞测量(Ivanov AP et al.,Nano Lett.2011 Jan 12;11(1):279-85)以及FET测量(国际申请号WO 2005/124888)。光学测量可以与电测量组合(Soni GVet al.,Rev Sci Instrum.2010 Jan;81(1):014301)。所述测量值可以是跨膜电流测量值,如流经孔的离子电流的测量值。
电测量值可以使用在Stoddart D et al.,Proc Natl Acad Sci,12;106(19):7702-7,Lieberman KR et al,J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72,和国际申请WO2000/28312中所描述的标准的单通道记录设备获得。或者,电测量可以使用多通道系统进行,例如国际申请WO 2009/077734和国际申请号WO 2011/067559中描述的。
本方法优选用跨膜施加发电势实施。所施加的电势可以是电压电势。或者,所施加的电势可以是化学势。这方面的实例是跨膜,如两亲层,使用盐梯度。盐梯度在Holden etal.,J Am Chem Soc.2007 Jul 11;129(27):8650-5中公开。在一些情况下,当多核苷酸相对于孔移动时,使用流经检测器(或孔)的电流来评估或确定多核苷酸的序列。这就是链测序。
该方法包括将靶多核苷酸与跨膜孔接触。跨膜孔是在一定程度上穿过所述膜的结构。其允许由施加的电势驱动的水合离子流过膜或在膜内流动。跨膜孔通常穿过整个膜,使得水合离子可从膜的一侧流到膜的另一侧。然而,跨膜孔不是必须穿过膜。它可以是一端闭合的。例如,所述孔可以是位于水合离子沿其流动或流入其中的膜中的孔道、间隙、通道、沟槽或狭缝。
任何跨膜孔可以在本发明中使用。所述孔可以是生物的或人工的。合适的孔包括但不限于,蛋白孔、多核苷酸孔和固态孔。所述孔可以是DNA折纸(origami)孔(Langeckeret al.,Science,2012;338:932-936)。
跨膜孔优选为跨膜蛋白孔。跨膜蛋白孔是允许水合离子如分析物从膜的一侧流向膜的另一侧的多肽或多肽的集合。在本发明中,跨膜蛋白孔能够形成孔,所述孔允许由施加的电势驱动的水合离子从膜的一侧流到膜的另一侧。跨膜蛋白质孔优选允许分析物如核苷酸从膜如三嵌段共聚物膜的一侧流动到另一侧。跨膜蛋白孔允许多核苷酸如DNA或RNA,相对于孔移动,如穿过所述孔。
跨膜蛋白质孔可以是单体或低聚物。孔优选由几个重复的亚基,例如至少6个、至少7、至少8或至少9个亚基组成。孔优选是六聚体的、七聚体的、八聚体的或九聚体的孔。所述孔可以是同源低聚物或异源低聚物。
跨膜蛋白质孔通常包含该离子可流动通过的桶状体或通道。孔的亚基通常围绕中心轴并且将链贡献到跨膜β桶状体或通道或跨膜α螺旋束或通道。
跨膜蛋白孔的桶状体或通道通常包含有助于与分析物如核苷酸、多核苷酸或核酸相互作用的氨基酸。这些氨基酸优选定位于靠近桶状体或通道的缢痕(constriction)。跨膜蛋白孔通常包括一个或多个带正电荷的氨基酸,例如精氨酸、赖氨酸或组氨酸,或芳族氨基酸,例如酪氨酸或色氨酸。这些氨基酸通常有助于孔和核苷酸、多核苷酸或核酸之间的相互作用。
本发明使用的跨膜蛋白孔可衍生自β-桶状体孔或α-螺旋束孔。β-桶状体孔包含由β-链形成的桶状体或通道。合适的β-桶状体孔包括,但不限于,β-毒素、如α-溶血素、炭疽毒素和杀白细胞素,和细菌的外膜蛋白/孔蛋白,如耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)孔蛋白(Msp),例如MspA、MspB、MspC或MspD、外膜孔蛋白F(OmpF)、外膜孔蛋白G(OmpG)、外膜磷脂酶A和奈瑟球菌属(Neisseria)自转运脂蛋白(NalP)以及其他孔,如胞溶素(lysenin)。α-螺旋束孔包含由α-螺旋形成的桶状体或通道。合适的α-螺旋束孔包括但不限于内膜蛋白和α-外膜蛋白,如WZA和ClyA毒素。跨膜孔可以从lysenin衍生。从胞溶素衍生的合适的孔在国际申请No.PCT/GB2013/050667(公开为WWO 2013/153359)中公开。跨膜孔可以衍生自Msp或α-溶血素(α-HL)。
跨膜蛋白孔优选衍生自Msp,优选MspA。该孔为低聚的且通常包含衍生自Msp的7个,8个,9个或10个单体。所述孔可以是衍生自含相同单体的MsP的同源寡聚孔。或者,所述孔可以是从含至少一个与其他单体不同的单体的Msp衍生的异源寡聚孔。优选地,所述孔衍生自MspA或其同源物或并系同源物(paralog)。
衍生自Msp的单体通常包含SEQ ID NO:2所示的序列或其变体。SEQ ID NO:2为MspA单体的MS-(B1)8突变体。其包括以下突变:D90N,D91N,D93N,D118R,D134R和E139K。SEQID NO:2的变体是多肽,所述多肽具有从SEQ ID NO:2的氨基酸序列变化而来且保留了其形成孔的能力的氨基酸序列。可以使用本领域已知的任何方法测定变体形成孔的能力。例如,变体可以连同其他合适的亚基被插入到两亲层中,且可以确定其寡聚形成孔的能力。将亚基插入膜例如两亲膜中的方法是本领域已知的。例如,亚基可以以纯化的形式悬浮在含有三嵌段共聚体膜的溶液中,从而使其扩散到膜并通过结合而插入膜中,并组装成功能状态。或者,可以使用如M.A.Holden,H.Bayley.J.Am.Chem.Soc.2005,127,6502-6503和国际申请No.PCT/GB2006/001057(公开为WO 2006/100484)中所描述的“拾取和放置”方法将亚基直接插入膜中。
对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列的整个长度,基于氨基酸同一性,变体优选与该序列具有至少50%的同源性。更优选地,基于氨基酸同一性,变体可与SEQ ID NO:2的氨基酸序列的整个序列具有至少55%,至少60%,至少65%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,更优选至少95%,97%或99%的同源性。在100或更多,例如125,150,175或200或更多的连续氨基酸长度上,以具有至少为80%,例如至少85%,90%或95%的氨基酸同一性(严格同源性)。
可使用本领域的标准方法确定同源性。例如,UWGCG软件包提供BESTFIT程序,该程序可以用来计算同源性,例如用于其默认设置(Devereux et al(1984)Nucleic AcidsResearch 12,p387-395)。PILEUP和BLAST算法可以用来计算同源性或比对序列(例如鉴定当量残基或相应的序列(通常在它们的默认设置下)),如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol36:290-300;Altschul,S.F et al(1990)J Mol Biol 215:403-10中所描述的。公众可通过国家生物技术信息中心获得用于进行BLAST分析的软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
SEQ ID NO:2是MspA单体的MS-(B1)8突变体。该变体与MspA比较,可包含MspB,MspC或MspD单体中的任何突变。MspB,MspC和MspD的成熟形式在SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:7中示出。特别地,所述变体可以包含存在于MspB中的下列取代:A138P。所述变体可以包含存在于MspC中的下列取代中的一个或多个:A96G,N102E和A138P。所述变体可包含存在于MspD中的下列突变中的一个或多个:G1缺失,L2V,E5Q,L8V,D13G,W21A,D22E,K47T,I49H,I68V,D91G,A96Q,N102D,S103T,V104I,S136K和G141A。所述变体可以包含来自Msp B,Msp C和Msp D的突变体和取代中的一个或多个的组合。所述变体优选包含突变L88N。SEQ ID NO:2的变体除了具有MS-B1的所有突变外还具有突变L88N,并被称为MS-(B2)8。在本发明中使用的孔优选为MS-(B2)8。SEQ ID NO:2的变体除了具有MS-B1的所有突变外,还具有突变G75S/G77S/L88N/Q126R,并被称为MS-B2C。在本发明使用的孔优选MS-(B2)8或MS-(B2C)8。
除了以上讨论的那些,还可对SEQ ID NO:2的氨基酸序列进行氨基酸取代,例如高达1,2,3,4,5,10,20或30个取代。保守取代用相似化学结构,相似化学性质或相似侧链体积的其他氨基酸替代氨基酸。引入的氨基酸可以与它们要替代的氨基酸具有相似的极性,亲水性,疏水性,碱性,酸性,中性或带电性。或者,所述保守取代可在预先存在的芳香族或脂肪族氨基酸的位置引入其他芳香族或脂肪族氨基酸。保守氨基酸的改变是本领域公知的,并且可以根据下表2中所定义的20种主要氨基酸的特性进行选择。如果氨基酸具有相似极性,这也可以通过参考表3中的氨基酸侧链的亲水性大小而确定。
表2-氨基酸的化学性质
Ala | 脂肪族,疏水,中性 | Met | 疏水,中性 |
Cys | 极性,疏水,中性 | Asn | 极性,亲水,中性 |
Asp | 极性,亲水,带电荷(-) | Pro | 疏水,中性 |
Glu | 极性,亲水,带电荷(-) | Gln | 极性,亲水,中性 |
Phe | 芳香族,疏水,中性 | Arg | 极性,亲水,带电荷(+) |
Gly | 脂肪族,中性 | Ser | 极性,亲水性,中性 |
His | 芳香族,极性,亲水性,带电荷(+) | Thr | 极性,亲水性,中性 |
Ile | 脂肪族,疏水,中性 | Val | 脂肪族,疏水,中性 |
Lys | 极性,亲水,带电荷(+) | Trp | 芳香族,疏水,中性 |
Leu | 脂肪族,疏水,中性 | Tyr | 芳香族,极性,疏水 |
表3-亲水性大小
SEQ ID NO:2的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基可另外从上述多肽中缺失。可缺失高达1,2,3,4,5,10,20或30个或更多个氨基酸残基。
变体可包括SEQ ID NO:2的片段。这些片段保持孔形成活性。片段可以至少为50,100,150或200个氨基酸长度。这类片段可用于产生孔。片段优选包含SEQ ID NO:2的孔形成域。片段必须包含SEQ ID NO:2的残基88、90、91、105、118和134之一。通常,片段包括SEQ IDNO:2的所有残基88、90、91、105、118和134。
一个或多个氨基酸可以替代地或另外地添加到上述多肽。可在SEQ ID NO:2或多肽变体或其片段的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端提供延伸。所述延伸可以很短,例如,1到10个氨基酸长度。或者,延伸可以更长,例如长达50或100个氨基酸。载体蛋白可以根据本发明被融合到氨基酸序列。其他融合蛋白在下文中更详细地讨论。
如上所讨论的,变体为多肽,所述多肽具有从SEQ ID NO:2的氨基酸序列变化而来的氨基酸序列且保留其形成孔能力。变体通常包含负责孔形成的SEQ ID NO:2的区域。包含β-桶状体的Msp的孔形成能力由每个亚基中的β-片体(β-sheet)提供。SEQ ID NO:2的变体通常包含SEQ ID NO:2中形成β-片体的区域。可对SEQ ID NO:2中形成β-片体的区域进行一个或多个修饰,只要得到的变体保留了其形成孔的能力即可。SEQ ID NO:2的变体优选地包括在α-螺旋和/或环状区域内的一个或多个修饰,如取代,添加或缺失。
衍生自Msp的单体可以被修饰以辅助它们的鉴定或纯化,例如通过添加组氨酸残基(hist标签),天冬氨酸残基(asp标签),链霉亲和素标签或Flag标签,或通过添加信号序列以促进它们从细胞中分泌,该细胞中的多肽不天然地含有该信号序列。引入遗传标签的一种替代方式是通过化学反应将标签连到孔上天然或工程位点。其例子是将凝胶迁移试剂与工程连接在孔外的半胱氨酸进行反应。这已被证明是用于分离溶血素异源寡聚物的方法(Chem Biol.1997 Jul;4(7):497-505)。
衍生自Msp的单体可以用可显示标记物(revealing label)进行标记。所述显示标记物可为任何使孔可被检测的合适的标记物。合适的标记物如下所述。
衍生自Msp的单体也可以使用D-氨基酸生产。例如,衍生自Msp的单体可包含L-氨基酸和D-氨基酸的混合物。这是本领域中用于生产这类蛋白质或肽常规的。
衍生自Msp的单体含有一个或多个特异性修饰以促进对核苷酸的鉴别。衍生自Msp的单体也可以含有其它非特异性修饰,只要它们不干扰孔的形成即可。许多非特异性侧链修饰是本领域已知的,并可以针对衍生自Msp的单体的侧链进行。这种修饰包括,例如,通过与醛反应然后用NaBH4还原进行氨基酸的还原性烷基化,用甲基乙酰亚胺酯(methylacetimidate)进行脒基化,或用乙酸酐进行酰化。
衍生自Msp的单体可以使用本领域中已知的标准方法来制备。衍生自Msp的单体可以通过合成或重组方式制成。例如,所述孔可通过体外翻译和转录(IVTT)合成。制造孔的合适的方法在国际申请No.PCT/GB09/001690(公开为WO 2010/004273),PCT/GB09/001679(公开为WO 2010/004265)或PCT/GB10/000133(公开为WO 2010/086603)中描述。论述了将孔插入膜的方法。
跨膜蛋白质孔还优选衍生自α-溶血素(α-HL)。野生型α-HL孔由七个相同的单体或亚基形成(即,其为七聚体)。α-溶血素-NN的一个单体或亚基的序列在SEQ ID NO:4中示出。
在一些实施例中,跨膜蛋白孔是经化学修饰的。所述孔可以任何方式在任何位点进行化学修饰。所述跨膜蛋白孔优选通过下述进行化学修饰:将分子连接到一个或多个半胱氨酸(半胱氨酸连接),将分子连接到一个或多个赖氨酸,将分子连接到一个或多个非天然氨基酸,表位的酶修饰或末端的修饰。适用于进行这些修饰的方法是本领域已知的。跨膜蛋白孔可通过连接任何分子被化学修饰。例如,所述孔可以通过连接染料或荧光团被化学修饰。
可对孔中任何数量的单体进行化学修饰。一个或多个,例如2,3,4,5,6,7,8,9或10个单体优选如上所述进行化学修饰。
半胱氨酸残基的反应性可以通过相邻残基的修饰而增强。例如,侧翼精氨酸、组氨酸或赖氨酸残基的碱基将使半胱氨酸硫醇基团的pKa变为更大反应性的S-基团的pKa。半胱氨酸残基的反应性可通过硫醇保护基如dTNB进行保护。所述保护基可在连接体连接之前与孔的一个或多个半胱氨酸残基反应。
所述分子(使用其对孔进行化学修饰)可以直接地连接到孔或通过连接体连接到孔,如国际申请No.PCT/GB09/001690(公开为WO 2010/004273),PCT/GB09/001679(公布为WO 2010/004265)或PCT/GB10/000133(公开为WO 2010/086603)所公开的。
本文所描述的任何蛋白质,例如跨膜蛋白孔,可以被修饰以有助于它们的鉴定或纯化,所述修饰为例如通过添加组氨酸残基(his标签),天冬氨酸残基(asp标签),链霉亲和素标签,Flag标签,SUMO标签,GST标签或MBP标签,或通过添加信号序列以促进它们从细胞中分泌,该细胞中的多肽不天然地含有该信号序列。引入遗传标签的另一方式是通过化学反应将标签连到孔或构建体上的天然或工程位点。其例子是将凝胶迁移试剂与工程连接在所述孔外的半胱氨酸反应。这已被证明是用于分离溶血素异源寡聚物的方法(ChemBiol.1997 Jul;4(7):497-505)。
所述孔可以用显示标记物标记。所述显示标记物可以是使得所述孔被检测的任何合适的标记物。合适的标记物包括,但不限于,荧光分子,放射性同位素,例如125I,35S,酶,抗体,抗原,多核苷酸和配体例如生物素。
本文所描述的任何蛋白质,例如跨膜蛋白孔可以通过人工合成或重组手段制备。例如,所述孔可通过体外翻译和转录(IVTT)合成。该孔的氨基酸序列可以被修饰为包括非天然存在的氨基酸或被修饰为用以提高蛋白质的稳定性。当通过合成手段制备蛋白质时,可以在制备过程中引入这种氨基酸。所述孔也可在合成或重组生产后被改变。
所述孔还可以使用D-氨基酸生产。例如,所述孔或构建体可包含L-氨基酸和D-氨基酸的混合物。这是本领域中用于生产这类蛋白质或肽常规的。
所述孔还可以包含其他非特异性修饰,只要它们不干扰孔形成或构建体功能即可。许多非特异性侧链修饰是本领域中已知的,并且可以针对蛋白质的侧链进行。这样的修饰包括,例如,通过与醛反应然后用NaBH4还原进行氨基酸的还原性烷基化,用甲基乙酰亚胺酯进行的脒基化,或用乙酸酐进行的酰化。
本文所描述的任何蛋白质例如跨膜蛋白孔可以使用本领域已知的标准方法制备。可以使用本领域的标准方法衍生和复制编码孔或构建体的多核苷酸序列。可以使用本领域的标准技术在细菌宿主细胞中表达编码孔或构建体的多核苷酸序列。所述孔可在细胞中由重组表达载体原位表达多肽而产生。所述表达载体可选地携带诱导型启动子以控制所述多肽的表达。这些方法在Sambrook,J.和Russell,D.(2001).分子克隆:实验手册,第3版.冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rdEdition.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)中描述。
所述孔可以从制备生物体的蛋白质通过任何蛋白质液相色谱系统进行纯化后,或在重组表达后,而大规模制备。通常的蛋白质液相色谱系统包括FPLC、AKTA系统、Bio-Cad系统、Bio-Rad BioLogic系统和Gilson HPLC的系统。
间隔器
如果所述一个或多个多核苷酸结合蛋白是解旋酶,且所述一个或多个装载部分包含多核苷酸,则所述一个或多个解旋酶可以停滞在一个或多个间隔器处,如在国际申请No.PCT/GB2014/050175(公开为WO 2014/135838)中描述。在该国际申请中公开的一个或多个解旋酶和一个或多个间隔器的任何构造均可以在本发明中使用。
当部分靶多核苷酸进入所述孔,并相对于所述孔沿着由所施加的电势而产生的场移动如穿过所述孔时,随着多核苷酸相对于所述孔移动,如穿过所述孔,所述一个或多个解旋酶被所述孔移动穿过间隔器。这是因为,多核苷酸(包括所述一个或多个间隔器)相对于所述孔移动,如穿过所述孔,并且所述一个或多个解旋酶保留在所述孔的顶部。
所述一个或多个间隔器优选为装载部分多核苷酸的一部分,例如它/它们中断多核苷酸序列。所述一个或多个间隔器优选不是杂合到多核苷酸的一个或多个阻断分子如减速障(speed bump)的一部分。
装载部分多核苷酸中可以有任何数量的间隔器,如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个间隔器。多核苷酸中优选有2个、4个或6个间隔器。不同的装载部分多核苷酸中可以有间隔器,如在前导序列中的间隔器,和在桥连部分或发夹环中的间隔器。
所述一个或多个间隔器其各自提供使一个或多个解旋酶即使在激活模式下也无法克服的能量屏障。所述一个或多个间隔器可通过减弱解旋酶的牵引(例如通过从多核苷酸中的核苷酸去除碱基)或物理地阻断所述一个或多个解旋酶的移动(例如使用庞大的化学基团)而使所述一个或多个解旋酶停滞(stall)。
所述一个或多个间隔器可包含使一个或多个解旋酶停滞的任何分子或分子组合。所述一个或多个间隔器可包含防止所述一个或多个解旋酶沿着多核苷酸移动的任何分子或分子组合。这可以在不存在跨膜孔和施加的电势的情况下,直接确定所述一个或多个解旋酶是否被停滞在一个或多个间隔器处。例如,其可如实施例中所示被检测,例如可以用PAGE测定解旋酶移动经过间隔器且置换DNA的互补链的能力。
所述一个或多个间隔器通常包含线性分子,如聚合物。所述一个或多个间隔器通常具有与多核苷酸不同的结构。例如,如果该多核苷酸是DNA时,则所述一个或多个间隔器通常不是DNA。特别是,如果所述多核苷酸是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA),则所述一个或多个间隔器优选包含肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、锁核酸(LNA)、桥连核酸(BNA)或具有核苷酸侧链的合成聚合物。所述一个或多个间隔器可以沿与所述多核苷酸相反的方向包含一个或多个核苷酸。例如,当多核苷酸在5′到3′的方向时,所述一个或多个间隔器可在3′至5′方向包含一个或多个核苷酸。核苷酸可以是上文论述的任何核苷酸。
所述一个或多个间隔器优选包含一个或多个硝基吲哚,例如一个或多个5-硝基吲哚、一个或多个肌苷、一个或多个吖啶、一个或多个2-氨基嘌呤、一个或多个2-6-二氨基嘌呤、一个或多个5-溴-脱氧尿苷、一个或多个倒立胸苷(倒立dT)、一个或多个倒立二脱氧胸苷(ddT)、一个或多个二脱氧胞苷(ddC)、一个或多个5-甲基胞苷、一个或多个5-羟甲基胞苷、一个或多个2′-O-甲基RNA碱基、一个或多个异脱氧胞苷(Iso-dC)、一个或多个异脱氧鸟苷(Iso-dG)、一个或多个iSpC3基团(即缺乏糖和碱基的核苷酸)、一个或多个光可切割(PC)基团、一个或多个己二醇基团、一个或多个间隔器9(iSp9)基团、一个或多个间隔器18(iSp18)基团、聚合物或一个或多个硫醇的连接。所述一个或多个间隔器可包含这些基团的任意组合。这些基团中的许多都是商购自(Integrated DNA)。
所述一个或多个间隔器可包含任何数量的这些基团。例如,对于2-氨基嘌呤、2-6-二氨基嘌呤、5-溴-脱氧尿苷、倒立dT、ddT、ddC、5-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、2′-O-甲基RNA碱基、异-dC、异-dG、iSpC3基团、PC基团、己二醇基团和硫醇的连接,所述一个或多个间隔器优选包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个。所述一个或多个间隔器优选包含2、3、4、5、6、7、8个或更多个iSp9基团。所述一个或多个间隔器优选包含2、3、4、5或6个或更多个iSp18基团。最优选的间隔器为四个iSp18基团。
所述聚合物优选为多肽或聚乙二醇(PEG)。所述多肽优选地包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个氨基酸。所述PEG优选包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个单体单元。
所述一个或多个间隔器优选包含一个或多个脱碱基核苷酸(即缺乏核碱基的核苷酸),如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个脱碱基核苷酸。所述核碱基可以被脱碱基核苷酸中的-H(idSP)或-OH替代。脱碱基间隔器可以通过从一个或多个相邻的核苷酸中去除核碱基而被嵌入到多核苷酸中。例如,多核苷酸可以被修饰为包括3-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、1,N 6-亚乙烯基腺嘌呤肌苷或次黄嘌呤,并且所述核碱基可使用人类烷基腺嘌呤DNA转葡糖基酶(hAAG)从这些核苷酸中去除。或者,多核苷酸可以被修饰为包括尿嘧啶和用尿嘧啶-DNA转葡糖基酶(UDG)去除的核碱基。在一个实施方案中,所述一个或多个间隔器不包含任何脱碱基核苷酸。
所述一个或多个解旋酶可通过每个线性分子间隔器停滞(即停滞在其前面)或在每个线性分子间隔器上停滞。如果使用线性分子间隔器,则优选所述装载部分多核苷酸优选提供有与一个或多个解旋酶待移动穿过的每个间隔器的末端相邻近的多核苷酸的双链区。所述双链区通常有助于将一个或多个解旋酶停滞到相邻的间隔器上。如果该方法是在约100mM或更低的盐浓度下进行的,则存在双链区是特别优选的。每个双链区通常为至少10个,如至少12个核苷酸的长度。如果本发明中使用的装载部分多核苷酸是单链的,则双链区可以通过将较短的多核苷酸杂合到与间隔器邻近的区域而形成。所述较短的多核苷酸通常由与装载部分多核苷酸相同的核苷酸形成,但也可以由不同的核苷酸形成。例如,所述较短的多核苷酸可由LNA或BNA形成。
如果使用线性分子间隔器,所述装载部分多核苷酸优选提供有阻断分子,该阻断分子在每个间隔器的与所述一个或多个解旋酶待移动穿过的末端相对的末端。这有助于确保所述一个或多个解旋酶保持停滞在每个间隔器上。在它/它们在溶液中扩散的情况下,也有助于在多核苷酸上保持一个或多个解旋酶。阻断分子可以是下文所述的能物理地引起一个或多个解旋酶停滞的任何化学基团。阻断分子可以是多核苷酸的双链区。
所述一个或多个间隔器优选包含物理地引起一个或多个解旋酶停滞的一个或多个化学基团。所述一个或多个化学基团优选为一个或多个侧挂的化学基团。所述一个或多个化学基团可以被连接到所述多核苷酸中的一个或多个核碱基。所述一个或多个化学基团可以被连接到多核苷酸骨架。可以存在任意数量的这些化学基团,如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个。合适的基团包括,但不限于,荧光团、链霉亲和素和/或生物素、胆固醇、亚甲蓝、二硝基苯酚(DNP)、地高辛配基和/或抗地高辛配基和二苯甲基环辛炔基团。
装载部分多核苷酸中的不同间隔器可以包含不同的停滞分子。例如,一个间隔器可以包含上述的线性分子中的一个,而另一个间隔器可以包含物理地引起一个或多个解旋酶停滞的一个或多个化学基团。间隔器可以包含任何上述的线性分子和一个或多个物理地引起一个或多个解旋酶停滞的化学基团,如一个或多个脱碱基体和荧光团。
合适的间隔器可以根据装载部分多核苷酸的类型和本发明的方法实施的条件进行设计。大多数的解旋酶结合DNA并沿DNA移动,且由此可以使用不为DNA的任何物质使其停滞。合适的分子如上所述。
本发明的表征方法优选在游离核苷酸存在下和/或在解旋酶辅因子存在下进行。这在下文更详细地讨论。在跨膜孔和施加电势不存在时,所述一个或多个间隔器优选能够在游离核苷酸存在下和/或在解旋酶辅因子存在下停滞所述一个或多个解旋酶。
如果本发明的表征方法如下文所述在游离核苷酸和解旋酶辅因子存在下进行(使得一个或更多的解旋酶是在激活模式下),则通常使用一个或多个较长间隔器来确保所述一个或多个解旋酶是在它们与跨膜孔接触前且电势施加前被停滞在多核苷酸上。在不存在游离核苷酸和解旋酶辅因子情况下(使得所述一个或多个解旋酶是在非激活模式下),可以使用一个或多个较短间隔器。
所述盐浓度也影响所述一个或多个间隔器停滞一个或多个解旋酶的能力。在跨膜孔和施加的电势不存在时,所述一个或多个间隔器优选能够在约100mM或更低的盐浓度下停滞所述一个或多个解旋酶。本发明的方法中使用的盐浓度越高,通常使用的所述一个或多个间隔器越短,反之亦然。
特征的优选组合在下表4中示出。
所述方法可以涉及,移动两个或更多个解旋酶穿过间隔器。在这种情况下,间隔器的长度通常是增加的以防止在不存在孔和施加的电势下尾部解旋酶推动前导解旋酶穿过间隔器。如果该方法涉及移动两个或更多个解螺酶穿过一个或多个间隔器,则上文所述的间隔器的长度可以增加至少1.5倍,例如2倍、2.5倍或3倍。例如,如果该方法涉及移动两个或更多个解螺酶穿过一个或多个间隔器,则在上表4的第三列中的间隔器的长度可以增加1.5倍、2倍、2.5倍或3倍。
所述两个或更多个解旋酶也可以被分开,使得每个解旋酶具有其自身的一个或多个间隔器。这在下面更详细地讨论。
双链多核苷酸
靶多核苷酸可以是双链的。如果多核苷酸是双链的,本发明优选包括在多核苷酸的一端连接桥连部分衔体,如发夹环衔体,以及分离所述多核苷酸的两条链,以形成单链多核苷酸构建体。根据本发明,单链多核苷酸构建体可以随后相对于所述孔移动,如穿过所述孔。以这种方式连接或内接合(interrogating)双链构建体的两条链提高了表征的效率和准确性。
所述桥连部分能够连接多核苷酸的两条链。桥连部分通常共价连接多核苷酸的两条链。只要桥连部分不干扰所述多核苷酸穿过跨膜孔的移动,桥连部分可以是能够连接多核苷酸的两条链的任何物质。
桥连部分可通过本领域中已知的任何合适的手段被连接到多核苷酸。桥连部分可以被分别合成并化学连接或通过酶接合到多核苷酸。或者,桥连部分可以在多核苷酸的加工过程中生成。
桥连部分在多核苷酸的一端或接近多核苷酸的一端被连接到多核苷酸。桥连部分优选连接到所述多核苷酸末端的10个核苷酸中的多核苷酸。
尽管桥连部分是优选的装载部分,但是所述桥连部分不是必须具有一个或多个结合的(或连接的)多核苷酸结合蛋白,只要所述装载部分如Y衔体具有连接到靶多核苷酸的另一端的一个或多个结合的(或连接的)多核苷酸结合蛋白即可。在一些实施方案中,所述装载部分可以被连接到本发明的多核苷酸的两端,优选其中一个是Y衔体,而另一个是桥连部分,如发夹环衔体。合适的桥连部分在上文论述,参考装载部分。如果发夹环不被用作装载部分,发夹环通常是110个或更少个核苷酸,例如100个或更少个核苷酸、90个或更少个核苷酸、80个或更少个核苷酸、70个或更少个核苷酸、60个或更少个核苷酸、50个或更少个核苷酸、40个或更少个核苷酸、30个或更少个核苷酸、20个或更少个核苷酸,或10个或更少个核苷酸的长度。发夹环优选为约1至110、2到100、5至80、或6到50个核苷酸的长度。如果发夹环被包含在衔体的差分可选的结合(differential selectable binding)中,优选所述发夹环具有较长的长度,如50到110个核苷酸。类似地,如果发夹环如下文所述不包含在差分可选的结合中,优选所述发夹环具有较短的长度,如1至5个核苷酸。
所述桥连部分衔体或发夹环衔体可以被连接到或接合到靶多核苷酸,如上文所述。
多核苷酸的两条链可以使用本领域中已知的任何方法分离。例如,它们可以由一个或多个多核苷酸结合蛋白或使用有利于去杂合化的条件进行分离(有利于去杂合化的条件的实例包括,但不限于高温、高pH值以及添加可以破坏氢键或碱基配对的试剂,如甲酰胺和脲)。如果使用一个或多个多核苷酸结合蛋白来分离链,则所述一个或多个多核苷酸结合蛋白通常在桥连部分的另一端被连接到靶多核苷酸,例如使用Y衔体进行连接。
所述一个或多个装载部分,优选Y衔体和/或桥连部分衔体(如发夹环衔体),优选包含可选结合部分。这使得多核苷酸被纯化或分离。可选结合部分是在其结合特性的基础上选择出的部分。因此,可选结合部分优选为特异性结合到表面的部分。如果可选结合部分,与本发明中使用的任何其他部分相比,以大得多的程度结合到表面,则可选结合部分特异性结合到该表面。在优选的实施方案中,所述部分结合到未结合有本发明使用的其他部分的表面。
合适的可选结合部分是本领域已知的。优选的可选结合部分包括,但不限于,生物素、多核苷酸序列、抗体、抗体片段,如Fab和ScSv,抗原、多核苷酸结合蛋白、聚组氨酸尾部和GST标签。最优选的可选结合部分是生物素和可选的多核苷酸序列。生物素特异性结合到涂覆有抗生物素蛋白的表面。可选的多核苷酸序列特异性结合(即杂合)到涂覆有同源序列的表面。或者,可选的多核苷酸序列特异性结合到涂覆有多聚核苷酸结合蛋白的表面。
所述一个或多个装载部分,优选Y衔体和/或桥连部分衔体(如发夹环衔体)和/或可选的结合部分,可包含可以被切割的、带缺口的、裂缝的或水解的区域。这种区域可以被设计为允许第一和/或第二多核苷酸从其所结合的表面移除,随后纯化或分离。合适的区域在本领域中是公知的。合适的区域包括,但不限于,RNA区域、包含脱硫生物素和链霉亲和素的区域、二硫键以及可光解的区域。
前导序列
所述一个或多个装载部分可提供有优先螺入孔中的前导序列。前导序列有助于本发明的方法。前导序列被设计为优先螺入跨膜孔中,并由此有助于靶多核苷酸相对于所述孔的移动,如穿过所述孔。前导序列还可以用于将多核苷酸连接到一个或多个锚,如上文所述。
前导序列通常包含聚合物。所述聚合物优选带负电荷。聚合物优选为多核苷酸,如DNA或RNA,修饰的核苷酸(如脱碱基的DNA)、PNA、LNA、BNA、聚乙二醇(PEG)或多肽。所述前导序列优选包含多核苷酸,并且更优选包含单链多核苷酸。前导序列可以包含上述的任何多核苷酸。单链前导序列最优选包含DNA的单链,如聚dT段。前导序列优选地包含所述一个或多个间隔器。
前导序列可以是任意长度,但通常为10至150个核苷酸长度,例如20至150个核苷酸长度。前导序列的长度通常取决于在本方法中使用的跨膜孔。
双耦合
在优选的实施方案中,本发明包括将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶双链多核苷酸的方法,包括:
(a)提供结合(或连接)有一个或多个多核苷酸结合蛋白并且具有用于将多核苷酸耦合到膜的一个或多个第一锚的Y衔体,且提供具有一个或多个第二锚的桥连部分衔体,如发夹环衔体,其中所述桥连部分衔体耦合到膜的强度比Y衔体耦合到膜的强度更大;以及
(b)将所述Y衔体连接到所述靶多核苷酸的一端,并且将所述桥连部分连接到所述靶多核苷酸的另一端。桥连部分优选具有与其连接的一个或多个多核苷酸结合蛋白,优选一个或多个分子制动器。
本发明还提供表征靶双链多核苷酸的方法,包括
(c)将在上面步骤(b)中提供的多核苷酸与跨膜孔接触,使得所述一个或多个多核苷酸结合蛋白控制靶多核苷酸相对于所述孔的移动,如穿过所述孔;和
(d)随着所述多核苷酸相对于所述孔移动,获取一个或多个测量值,其中测量值代表多核苷酸的一个或多个特征,并由此表征所述靶多核苷酸。
这种类型的方法在英国申请No.1406147.7中被详细讨论。
Y衔体和/或桥连部分衔体通常为多核苷酸衔体。它们可以由上文所述的任何多核苷酸形成。
Y衔体通常包含(a)双链区域和(b)单链区域或另一端不互补的区域。如果Y衔体包括一个单链区域,则Y衔体可被描述为具有悬突(overhang)。与双链部分不同的是,由于两条链通常不彼此杂合,因此Y衔体中非互补区域的存在给予该衔体Y形。Y衔体包括一个或多个第一锚。锚在上文更详细地论述。
Y衔体优选包括优先螺入孔中的前导序列。这是上文进行了论述。
所述桥连部分衔体优选包含如上所述的可选结合部分。所述桥连部分衔体和/或可选结合部分可包含如上所述的可切割的、带缺口的、裂缝的或水解的区域。
Y衔体和/或桥连部分衔体可以使用本领域中已知的任何方法接合到多核苷酸。所述的一个或两个衔体可使用连接酶,如T4 DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶、Taq DNA连接酶、Tma DNA连接酶和9°N DNA连接酶进行接合。
桥连部分衔体耦合(或结合)到膜的强度比Y衔体耦合(或结合)到膜的强度更大。这可以用任何方式来测定。用于测定耦合(或结合)的强度的合适的方法在英国申请No.1406147.7的实施例中公开。
桥连部分衔体耦合(或结合)的强度优选至少是Y衔体耦合(或结合)的强度的1.5倍,如是Y衔体耦合(或结合)的强度的至少二倍,至少三倍,至少四倍,至少五倍或至少十倍。用于膜的桥连部分衔体的亲和常数(Kd)优选为Y衔体的亲和常数的至少1.5倍,如至少二倍,至少三倍,至少四倍,至少五倍或至少十倍。
使桥连部分衔体比Y衔体更牢固地耦合(或结合)到膜的方式有多种。例如,所述桥连部分衔体可以包含比Y衔体更多的锚。例如,桥连部分衔体可包含2、3或更多个第二锚,而Y衔体可包含一个第一锚。
一个或多个第二锚耦合(或结合)到膜的强度可以比一个或多个第一锚耦合(或结合)到膜的强度更大。将一个或多个第二锚耦合(或结合)到桥连部分衔体的强度可以比将一个或多个第一锚耦合(或结合)到Y衔体的强度更大。所述一个或多个第一锚和所述一个或多个第二锚定可通过杂合被连接到其各自的衔体,且在一个或多个第二锚中杂合的强度比在一个或多个第一锚中更大。这些实施方案的任意组合也可以用于本发明中。耦合(或结合)的强度可以使用本领域的已知技术来测定。
所述一个或多个第二锚优选包含耦合(或结合)到膜的一个或多个基团,所述一个或多个基团在一个或多个第一锚中耦合(或结合)到膜的一个或多个基团具有更高的强度。在优选的实施方案中,使用胆固醇将桥连部分衔体/一个或多个第二锚耦合(或结合)到膜,且使用棕榈酸酯将Y衔体/一个或多个第一锚耦合(或结合)到膜。胆固醇比棕榈酸酯更牢固地结合到三嵌段共聚物膜和脂质膜。在可替代的实施方案中,使用单酰基物种,如棕榈酸膜,将桥连部分衔体/一个或多个第二锚耦合(或结合)到膜,并且使用二酰基物种如二棕榈酰磷脂酰胆碱将Y衔体/一个或多个第一锚耦合(或结合)到膜。
添加发夹环及前导序列
根据本发明,双链多核苷酸可以与MuA转座酶和一组双链MuA底物接触,其中所述组中的底物的一部分是结合到一个或多个多核苷酸结合蛋白且包含前导序列的Y衔体,且其中所述组中的底物的一部分是桥连部分衔体,例如结合到一个或多个多核苷酸结合蛋白的发夹环衔体。所述Y衔体和/或桥连部分衔体有所述装载部分的功能。转座酶分裂双链多核苷酸并且将MuA底物接合到分裂碎片的一端或两端。这产生多个经修饰的双链多核苷酸,所述经修饰的双链多核苷酸一端含有具有一个或多个多核苷酸结合蛋白和前导序列的Y衔体,且在另一端含有具有一个或多个多核苷酸结合蛋白的桥连部分(或发夹环)。所述经修饰的双链多核苷酸随后可以使用本发明的方法进行表征。
所述组中的每个底物优选包含至少一个通用核苷酸的悬突,使得转座酶将模板多核苷酸分裂且将底物接合到双链分裂碎片的一端或两端,并由此产生多个碎片/底物构建体,并且其中所述方法进一步包括将悬突接合到构建体中的碎片,并由此产生多个经修饰的双链多核苷酸。合适的通用核苷酸如上所述。悬突优选为5个核苷酸的长度。
或者,所述组中的每个底物优选包含(i)至少一个悬突,以及(ii)在与至少一个悬突相同的链中的至少一个核苷酸,所述悬突包含在模板多核苷酸中不存在的核苷,使得转座酶分裂所述模板多核苷酸,且将底物接合到双链碎片的一端或两端,并由此产生多个碎片/底物构建体,且其中所述方法进一步包括(a)通过选择性地去除所述至少一个核苷酸而从所述构建体去除所述悬突,且由此产生多个含有单链间隙的双链构建体,以及(b)修复所述构建体中的单链间隙,并由此产生多个经修饰的双链多核苷酸。多核苷酸分析物通常包含核苷脱氧腺苷(dA)、脱氧尿苷(dU)和/或脱氧胸苷(dT)、脱氧鸟苷(dG)和脱氧胞苷(dC)。不存在于多核苷酸中的核苷优选是脱碱基的腺苷(A)、尿苷(U)、5-甲基尿苷(m5U)、胞苷(C)或鸟苷(G)或包含脲、5,6-二羟基胸腺嘧啶、胸腺嘧啶二醇、5-羟基-5-甲基乙内酰脲(5-hydroxy-5 methylhydanton)、尿嘧啶二醇、6-羟基-5,6-二氢硫胺、甲基丙醇二酰脲(tartronylurea)、7,8-二氢-8-氧鸟嘌呤(8-氧鸟嘌呤)、8-氧代腺嘌呤、fapy-鸟嘌呤、甲基-fapy-鸟嘌呤、fapy-腺嘌呤、黄曲霉毒素B1-fapy-鸟嘌呤、5-羟基胞嘧啶、5-羟基尿嘧啶、3-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、1,N 6-亚乙烯基腺嘌呤、次黄嘌呤、5-羟基尿嘧啶、5-羟基甲基尿嘧啶、5-甲酰基尿嘧啶或顺式-环丁烷嘧啶二聚体。所述至少一个核苷酸优选为来自悬突的10个或更少的核苷酸。所述至少一个核苷酸优选为悬突中的第一个核苷酸。悬突中的所有核苷酸优选包含在模板多核苷酸中不存在的核苷。
这些基于MuA的方法在英国申请No.1314695.6中公开。它们还在英国申请No.1406147.7中有详细论述。
一个或多个解旋酶可在与双链多核苷酸和MuA转座酶接触之前,连接到MuA底物Y衔体(即装载部分)。或者,一个或多个解旋酶可在与双链多核苷酸和MuA转座酶接触之后,连接到MuA底物Y衔体(即装载部分)。
一个或多个分子制动器可在与双链多核苷酸和MuA转座接触之前,连接到MuA底物桥连部分(或发夹环)衔体。或者,一个或多个分子制动器可在与双链多核苷酸和MuA转座酶接触后,连接到MuA底物桥连部分(或发夹环)衔体。
多核苷酸表征
本发明提供了表征靶多核苷酸的方法。靶多核苷酸也可称为模板多核苷酸或感兴趣的多核苷酸。
本发明的方法涉及测量所述多核苷酸的一个或多个特征。特别地,上述用于控制多核苷酸移动穿过跨膜孔的方法中之一按步骤(a)实施,然后在步骤(b)中,当所述多核苷酸相对于所述孔移动时,获取一个或多个测量值,其中测量值代表多核苷酸的一个或多个特征。合适的测量值如上文所述。
可以测查任意数量的靶多核苷酸。例如,本发明的方法可以涉及表征2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50、100个或更多个靶多核苷酸。所述靶多核苷酸可以是天然存在的或人工的。例如,该方法可以被用于检验所制造的寡核苷酸的序列。该方法一般在体外进行。
该方法可以涉及测量一个,两个,三个,四个或五个或更多个靶多核苷酸的特征。所述一个或多个特征优选选自(i)所述多核苷酸的长度,(ii)所述多核苷酸的同一性,(iii)所述多核苷酸的序列,(iv)所述多核苷酸的二级结构,和(v)所述多核苷酸是否被修饰。(i)至(v)的任意组合可以根据本发明进行测量,如{i},{ii},{iii},{iv},{v},{i,ii},{i,iii},{i,iv},{i,v},{ii,iii},{ii,iv},{ii,v},{iii,iv},{iii,v},{iv,v},{i,ii,iii},{i,ii,iv},{i,ii,v},{i,iii,iv},{i,iii,v},{i,iv,v},{ii,iii,iv},{ii,iii,v},{ii,iv,v},{iii,iv,v},{i,ii,iii,iv},{i,ii,iii,v},{i,ii,iv,v},{i,iii,iv,v},{ii,iii,iv,v}或{i,ii,iii,iv,v}。
对于(i),多核苷酸的长度例如可以通过确定所述多核苷酸和所述孔之间的相互作用次数,或所述多核苷酸与所述孔之间相互作用的持续时间来测定。
对于(ii),所述多核苷酸的同一性可以通过多种方式测定。所述多核苷酸的同一性可以联合所述多核苷酸的序列的测定来测定,或不联合多核苷酸的序列的测定进行测定。前者是直接进行的;对所述多核苷酸进行测序,并由此进行鉴定。后者可以以几种方式来完成。例如,可以测定多核苷酸中特定模序的存在(而无需测定该多核苷酸的其余序列)。或者,所述方法中测定的特定的电和/或光信号可鉴定来自特定来源的多核苷酸。
对于(iii),多核苷酸的序列可以如以前所述确定。合适的测序方法,特别是那些使用电测量的方法,描述于Stoddart D et al.,Proc Natl Acad Sci,12;106(19):7702-7,Lieberman KR et al,J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72,和国际申请WO 2000/28312中。
对于(iv),所述二级结构可以以多种方式测量。例如,如果该方法包含电测量,二级结构可以利用相对于孔流动例如穿过孔时的停留时间的改变或电流变化进行测量。这使得单链和双链多核苷酸的区域能够得到识别。
对于(v),可以测定任何修饰的存在或不存在。该方法优选包括确定所述多核苷酸是否通过甲基化、氧化、损伤、用一个或多个蛋白质或一个或多个标记物、标签或间隔器进行了修饰。特异性修饰将导致与孔的特异性相互作用,这可以使用下面描述的方法来测定。例如,甲基胞嘧啶可以基于其与每个核苷酸的相互作用过程中相对于孔流动例如穿过孔时的电流,与胞嘧啶区别开。
所述方法可以使用任何适于研究膜/孔系统(其中孔存在于膜中)的设备进行实施,该方法可以使用任何适合于感测跨膜孔的设备实施。例如,所述设备包括一个室,所述室包括水溶液和将该室分割为两部分的屏障(barrier)。所述屏障通常具有开口,其中在开口中形成包括所述孔的膜。或者该屏障形成其中存在所述孔的膜。
该方法可以使用在国际申请No.PCT/GB08/000562(WO 2008/102120)中描述的设备实施。
该方法可以包括随着多核苷酸相对于所述孔移动,测量经过所述孔的电流。因此该装置也可以包括能够跨所述膜和孔而施加电势并测量电信号的电路。该方法可以使用膜片钳或电压钳实施。所述方法优选包含使用电压钳。
本发明的方法包括测量当所述多核苷酸相对于所述孔移动时经过所述孔的电流。用于测量通过跨膜蛋白孔的离子电流的合适的条件是本领域已知的,并且在实施例中公开。该方法通常用跨所述膜和孔施加的电压进行实施。使用的电压通常为+5V到-5V,例如+4V到-4V,+3V到-3V或+2V到-2V。使用的电压通常为-600mV到+600mV或-400mV到+400mV。所使用的电压优选在具有以下下限和上限的范围内:所述下限选自-400mV,-300mV,-200mV,-150mV,-100mV,-50mV,-20mV和0mV的范围内,所述上限独立地选自+10mV,+20mV,+50mV,+100mV,+150mV,+200mV,+300mV,和+400mV。所用的电压更优选在100mV到240mV的范围内并最优选在120mV到220mV的范围内。可通过施加提高的电势通过孔来提高对不同核苷酸的鉴别力。
该方法通常在任何载荷子,如金属盐,如碱金属盐,卤盐,如盐酸盐,如碱金属盐酸盐的存在下实施。载荷子可包括离子型液体或有机盐,例如四甲基氯化铵,三甲基苯基氯化铵,苯基三甲基氯化铵,或1-乙基-3-甲基咪唑鎓氯化物。在上面论述的示例性设备中,所述盐存在于所述室中的水溶液中。通常使用氯化钾(KCl),氯化钠(氯化钠)、氯化铯(CsCl)或亚铁氰化钾和铁氰化钾的混合物。优选KCl、NaCl,和亚铁氰化钾与铁氰化钾的混合物。所述载荷子可以不对称的跨所述膜。例如在膜的每侧,所述载荷子的种类和/或浓度可以是不同的
盐浓度可为饱和的。盐浓度可以是3M或更低,通常为0.1M至2.5M,0.3M至1.9M,0.5M至1.8M,0.7M至1.7M,0.9M至1.6M或1M至1.4M。优选盐浓度为150mM到1M。所述方法优选使用至少为0.3M,例如至少为0.4M,至少为0.5M,至少为0.6M,至少为0.8M,至少为1.0M,至少为1.5M,至少为2.0M,至少为2.5M,或者至少为3.0M的盐浓度进行实施。高盐浓度提供了高信噪比,并使得在正常电流波动的背景下,代表核苷酸存在的电流能被识别。
该方法通常在缓冲剂存在下实施。在上面讨论的示例性设备中,缓冲剂存在于所述室的水溶液中。本发明的方法可使用任何缓冲剂。通常地,缓冲剂是磷酸缓冲液。另一个合适的缓冲剂是HEPES和Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-HCl)缓冲剂。该方法通常在pH值为4.0至12.0,4.5至10.0,5.0至9.0,5.5至8.8,6.0至8.7,7.0至8.8,或7.5至8.5下实施。所使用的pH优选约为7.5。
该方法可以通常在0℃到100℃,15℃到95℃,16℃至90℃,17℃至85℃,18℃至80℃,19℃至70℃,或者从20℃至60℃实施。该方法通常在室温下进行。该方法可选地在支持酶功能的温度下如约37℃实施。
桥连部分测序
在优选的实施方案中,靶双链多核苷酸在一端设置有桥连部分(或发夹环)衔体,并且该方法包括将多核苷酸与跨膜孔接触,使得该多核苷酸的两条链相对于孔移动,如穿过所述孔,并且随着多核苷酸的两条链相对于所述孔移动,获取一个或多个测量值,其中所述测量值代表多核苷酸的链的一个或多个特征,并由此表征所述靶双链多核苷酸。上述的任何实施方案同样适用于本实施例。
经修饰的多核苷酸
在使用本发明的方法之前,在聚合酶使用多核苷酸作为模板形成经修饰的多核苷酸的条件下,通过将所述多核苷酸与聚合酶和一组游离核苷酸接触,来修饰所述多核苷酸,其中当形成经修饰的多核苷酸时,所述聚合酶用不同的核苷酸物种来代替所述多核苷酸中的一个或多个核苷酸物种。所述经修饰的多核苷酸随后可以在本发明的方法中使用。这种类型的修饰在英国申请No.1403096.9中描述。可以使用任何上述的聚合酶。所述聚合酶优选Klenow or 9°North。
在聚合酶使用该多核苷酸作为模板形成经修饰的多核苷酸的条件下,使所述多核苷酸与聚合酶接触。这种条件在本领域中是已知的。例如,通常在商购的聚合酶缓冲液中如来自New England的缓冲液中,使所述多核苷酸与聚合酶接触。对于Klenow,温度优选20到37℃,或对于9°North,温度优选60到75℃。通常使用引物或3′发夹作为聚合酶扩展的成核点。根据本发明聚合酶可以与靶多核苷酸接触,即通过下述进行接触:(a)提供结合到一个或多个装载部分的一个或多个聚合酶,及(b)将所述一个或多个装载部分连接到所述靶多核苷酸。
使用跨膜孔对多核苷酸的表征,如测序,通常包括,分析由k个核苷酸组成的聚合物单元(即‘k聚体’),其中k是正整数。这在国际申请No.PCT/GB2012/052343(公开为WO2013/041878)中有论述。虽然理想的是在不同k-聚体的电流测量值之间能清楚的分离开,但是通常这些测量中的一些存在重叠。特别是k-聚体中具有大量的聚合物单元时,即具有非常高的k值时,难以分辨由不同的k-聚体产生的测量值,不利于导出关于多核苷酸的信息,例如估计多核苷酸的基础序列。
通过用所述经修饰的多核苷酸中的不同的核苷酸物种代替所述多核苷酸中的一个或多个核苷酸物种,所述经修饰的多核苷酸含有的k-聚体不同于所述多核苷酸中的k-聚体。所述经修饰的多核苷酸中的不同k-聚体能够产生与来自所述多核苷酸中的k聚体不同的电流测量值,所以所述经修饰的多核苷酸提供了与所述多核苷酸不同的信息。来自所述经修饰的多核苷酸的额外信息使得可以更容易表征所述多核苷酸。在一些情况下,所述经修饰的多核苷酸其自身可以更容易表征。例如,所述经修饰的多核苷酸可以被设计为,包括在它们的电流测量值之间具有增强的分离或清楚的分离的k-聚体或具有降低的噪声的k-聚体。
所述聚合酶优选用在形成经修饰的多核苷酸时的不同核苷酸物种代替所述多核苷酸中的两个或多个核苷酸物种。所述聚合酶可以用有区别的核苷酸物种代替所述多核苷酸中的两个或多个核苷酸物种中的每一个。所述聚合酶可以用相同的核苷酸物种代替所述多核苷酸中的两个或多个核苷酸物种中的每一个。
如果所述多核苷酸为DNA,则所述经修饰的多核苷酸中的不同的核苷酸物种通常包含与腺嘌呤,鸟嘌呤,胸腺嘧啶,胞嘧啶或甲基胞嘧啶不同的核碱基和/或包含与脱氧腺苷,脱氧鸟苷,胸苷,脱氧胞苷或脱氧甲基胞苷不同的核苷。如果所述多核苷酸是RNA,则所述经修饰的多核苷酸中不同的核苷酸物种通常包含与腺嘌呤,鸟嘌呤,尿嘧啶,胞嘧啶或甲基胞嘧啶不同的核碱基,和/或包含与腺苷,鸟苷,尿苷,胞苷或甲基胞苷不同的核苷。所述不同的核苷酸物种可以是上述的任何通用核苷酸。
所述聚合酶可以用含有在一个或多个核苷酸物种中不存在的化学基团或原子的不同核苷酸物种代替一个或多个核苷酸物种。所述化学基团可以是丙炔基,硫代基,氧代基,甲基,羟甲基,甲酰基,羧基,羰基,苄基,炔丙基或炔丙胺基。
所述聚合酶可以用缺少存在于一个或多个核苷酸物种中的化学基团或原子的不同核苷酸种类来代替一个或多个核苷酸物种。聚合酶可以用具有改变的电负性的不同核苷酸物种来代替一个或多个核苷酸物种。具有改变的电负性的不同核苷酸物种优选包含卤素原子。
该方法优选进一步包括选择性地从所述经修饰的多核苷酸中的一个或多个不同核苷酸物种中去除核碱基。
产物
本发明还提供使用本发明修饰的靶多核苷酸。本发明还提供具有一个或多个多核苷酸结合蛋白结合其上的装载部分。上文针对本发明方法所论述的任何实施方案均适用于本发明的多核苷酸和部分。
试剂盒
本发明还提供了一种用于将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶多核苷酸的试剂盒,包括:(a)结合到一个或多个装载部分的一个或多个多核苷酸结合蛋白和(b)连接酶。上文所述的任何实施方案均适用于试剂盒。
所述试剂盒优选用于通过跨膜孔的双链多核苷酸,且该试剂盒优选地包括具有一个或多个解旋酶附连的Y衔体和具有一个或多个分子制动器附连的桥连部分(或发夹环)衔体。所述Y衔体优选包含一个或多个用于耦合所述多核苷酸到膜的第一锚,所述桥连部分(或发夹环)衔体优选包含一个或多个用于耦合所述多核苷酸到膜的第二锚,并且将桥连部分(或发夹环)衔体耦合到所述膜的强度优选比将所述Y衔体耦合到所述膜的强度更大。
所述试剂盒优选还包含跨膜孔。任何以上所述的膜和孔均可以在试剂盒中。
上文针对本发明方法所述的任何实施方案同样适用于所述试剂盒。所述试剂盒还可以包括膜的组分,如两亲层或三嵌段共聚物膜的组分。
本发明的试剂盒可以额外包括一个或多个能使上述任何实施方案实施的其它试剂或仪器。这类试剂或仪器包括以下中的一个或多个:合适的缓冲液(水性溶液),从受试者获得样品的工具(例如包含针的容器或仪器),扩增和/或表达多核苷酸的工具,或上文定义的膜,或电压或膜片钳装置。试剂可以干燥状态存在于试剂盒中,使得流体样品能重悬所述试剂。所述试剂盒还可以任选包括能使试剂盒用于本发明方法的介绍,或关于本发明方法可用于哪种生物的详情。
下列实施例阐明了本发明。
实施例1
本实施例描述了用于将多核苷酸结合蛋白结合到装载部分的样品制备过程。
材料与方法
TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C(6.5μM,具有突变L376C/Q594A/K762C的SEQ IDNO:25)和DNA发夹衔体(4μM,SEQ ID NO:29在3′末端连接到四个iSpC3间隔器,所述四个iSpC3间隔器在相对端连接到SEQ ID NO:30的5′末端)在缓冲液(100mM KCl,100mM CAPS(pH为10)和1mM EDTA)中混合,并培养30分钟。将TRIS(0.1体积的1M TRIS pH 7.0)添加到该DNA/酶混合物中,并将该混合物充分混合。最后,添加0.025体积的DMF中的1.29mM双马来酰亚胺基乙烷,且将混合物进一步培养15分钟。各成分的最终浓度如下:TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C(5.8μM),DNA发夹衔体(3.56μM),缓冲液(89mM KCl,89mM CAPS,pH 10,0.89mMEDTA,89mM Tris(pH 7))和双马来酰亚胺基乙烷(28.7μM),该混合物被称为样品1。
然后使用8mL POROS HQ-10柱(FPLC)和随后的洗脱缓冲液(缓冲液A——50mM乙醇胺,300mM NaCl,0.1%β-OTG,1mM TCEP,pH 10.0,缓冲液B——50mM乙醇胺,700mM NaCl,0.1%β-OTG,1mM TCEP,p 10.0)使用所述的步骤将预结合到DNA发夹衔体的TrwC CBA-L376C/Q594A/K762C纯化。将样品1装载到柱上,用5柱体积的缓冲液A将没有TrwC CBA-L376C/Q594A/K762C结合的任何DNA或没有结合到DNA的酶洗掉。用11.8柱体积的0-100%缓冲液B对预结合到DNA发夹衔体的TrwC CBA-L376C/Q594A/K762C进行洗脱,该样品被称为样品2。示例性FPLC轨迹在图1中示出,标有P1的峰对应预结合到DNA发夹衔体的TrwC CBA-L376C/Q594A/K762C。
然后将样品2使用5mL的Histrap HP柱(FPLC),使用下列洗脱缓冲液(缓冲液C——20mM的Na-CAPS,100mM的NaCl,0.1%β-OTG,1mM TCEP,pH 10.0,缓冲液D——20mM的Na-CAPS,2M NaCl,10%(w/v)甘油,0.1%β-OTG,1mM的TCEP,pH 10.0,和缓冲剂E——20mM的Na-CAPS,100mM的NaCl,300mM咪唑,0.1%β-OTG,1mM的TCEP,pH 10.0)进一步纯化。将样品2装载到所述柱上,用缓冲液C将没有TrwC CBA-L376C/Q594A/K762C结合的任何DNA或没有结合到DNA的酶从柱上洗脱掉。然后用缓冲液D洗涤该柱,然后用缓冲液C再次洗涤。最后用10柱体积的0-100%缓冲液E将预结合到DNA发夹衔体的TrwC CBA-L376C/Q594A/K762C进行洗脱。然后汇集(pool)主洗脱峰(实例在图2中示出,用P2标记主峰),测量其浓度,并使用TBE(天然的)PAGE和SDS PAGE凝胶分析DNA样品。TBE(天然的)PAGE为4-20%TBE凝胶,在150V下运行25分钟,然后使用SYBR金染料染色。这种染料使得样品中的任何DNA(有或没有酶结合)均是可见的。图3显示了这种凝胶。4-6列表明纯化后,DNA仍结合到酶。SDS PAGE为10%Bis-Tris凝胶,XT MOPS,在200V下运行60分钟,然后使用SYPRO红宝石染料染色。这种染料使得样品中的任何酶(结合到或未结合到DNA)均是可见的。图4的4-6列中显示了纯化后,使用双马来酰亚胺基乙烷连接体将酶闭合到DNA上。
实施例2
本实施例描述了用于将多核苷酸结合蛋白结合到装载部分的样品制备过程。
材料与方法
将T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C(3μM,具有突变E94C/C109A/C136A/A360C的SEQ ID NO:24)和DNA Y衔体(500nM,SEQ ID NO:26杂合到DNA链X=30个iSpC3间隔器,所述间隔器在其3′末端连接到SEQ ID NO:27的5′末端,SEQ ID NO:27在其3′末端连接到4个iSp18间隔器,所述4个iSp18间隔器在相对端连接到SEQ ID NO:28的5′末端)在缓冲液(50mM HEPES,100mM KOAc(pH 8))中混合,并添加EDTA(1mM)和TMAD(100μM),并在室温下培养60分钟。然后将混合物在KCl/ATP溶液中(500mM KCl,1mM ATP最终浓度)以1∶1稀释,并在环境温度下培育25分钟,该混合物被称为样品3。
然后使用SPRI珠粒纯化该样品。使用下面的过程制备SPRI珠粒——
1.使用血清移液管将洗涤缓冲液(30mL,50mMTris pH7.5,2.5M NaCl)转移到50mLFalcon试管中。
2.将速度珠粒羧酸酯修饰的磁性颗粒(Thermo)的存储罐(stock pot)涡旋以重悬所述珠粒。
3.将珠粒悬浮液(600μL)转移到30mL的洗涤缓冲液中(步骤1)并涡旋以重悬所述珠粒。
4.然后将Falcon试管放入DynaMag-50磁道中,使得珠粒在所述试管的邻近该磁体的一侧上积聚,并且使用血清移液管去除上清液。
5.将另外的30mL的洗涤缓冲液添加到所述试管中并将所述试管充分涡旋以重悬所述珠粒。
6.然后将Falcon试管放回DynaMag-50磁道中,使得所述珠粒在所述试管的邻近该磁体的一侧上积聚。
7.一旦溶液已经澄清,将上清液从所述试管中去除。
8.依次重复步骤5、6和7三次。
9.将结合缓冲液(30mL,50mM Tris pH7.5,2.5M NaCl,20%PEG8000)添加到来自步骤8的Falcon试管中,然后将该试管涡旋以重悬所述珠粒。
然后使用前将所述珠粒在4℃下储存,但是所述珠粒在纯化过程中在室温条件下使用。
使用如下所述的方法纯化样品3——
1.将来自上述步骤9的试管涡旋以悬浮珠粒,并将18.5mL(样品3)转移到干净的50mL的Falcon试管中。
2.然后将Falcon试管放入DynaMag-50磁道中,使得所述珠粒在该试管的邻近该磁体的一侧上积聚。注意,由于珠粒悬浮于结合缓冲液(50mM的Tris pH7.5,2.5M NaCl,20%PEG8000)中,所述积聚进行超过10分钟。
3.一旦溶液已经澄清,将上清液去除,添加18.5mL的结合缓冲液并将样品彻底涡旋以重悬所述珠粒。
4.然后将Falcon试管放入DynaMag-50磁道中,使得珠粒在所述试管的邻近该磁体的一侧上积聚。注意,由于珠粒悬浮于结合缓冲液(50mM Tris pH7.5,2.5M NaCl,20%PEG8000),珠粒积聚进行超过10分钟。
5.然后重复步骤3。
从该时间点起,不对样品进行移液器混合或进行涡旋。
6.将Falcon试管放回DynaMag-50磁道中,使得珠粒在所述试管的邻近该磁体的一侧上积聚。注意,由于所述缓冲液含有PEG8000,珠粒积聚进行超过10分钟。
7.使用血清吸液管去除上清液,并用足够的结合缓冲液替换所述上清液以覆盖珠粒(~25mL)。
8.将Falcon试管留在DynaMag-50磁道中,并将所述试管沿其轴线顺时针旋转90°,使得积聚的珠粒围绕试管的侧部移动直到它们在邻近该磁体的新位置处沉降。
9.将步骤8重复三次,直至所述的Falcon试管返回到其原始的位置。
10.使用血清移液管去除上清液,然后除去尽可能多的残留上清液。
11.将Falcon试管从DynaMag-50磁道移除,并添加洗脱缓冲液(2.5mL,20mMNaCl,50mMTris,pH7.5)。
12.通过轻弹将试管轻轻搅动以重悬所述珠粒,然后将样品在环境条件下培育5分钟。
13.然后将所述的Falcon试管放回至DynaMag-50磁道,使得珠粒在该试管的邻近该磁体的一侧上积聚,将上清液转移到5mL的蛋白质LoBind微量离心管。
14.通过添加洗脱缓冲液将来自步骤13的洗脱物质稀释两倍。
15.在将所述材料分装到试管中之前,将所述材料在4℃储存。
然后,如前文在实施例1中所述,使用TBE PAGE凝胶来分析所得结合到DNA的酶,不同在于将凝胶运行45分钟。凝胶在图5中示出,列3示出了SPRI纯化法纯化结合到DNA Y衔体的单个酶。
实施例3
本实施例描述了用于将预结合到Y衔体的酶和结合到发夹衔体的酶接合到基因组双链DNA的随机链的样品的制备过程。
材料与方法
使用NEBNext dA-尾部模块(NEB)将随机基因组的双链DNA序列进行dA结尾。无需进一步纯化。将dA结尾的基因组DNA(30μL)与具有T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C预结合的Y衔体DNA(10μL 200nM)和具有TrwC CBA-L376C/Q594A/K762C预结合的发夹衔体(10μL,1μM)以及Blunt/TA连接酶主要混合物(master mix)(50μL)混合,将样品倒置10次以混合。然后短暂地将样品在微量离心机中向下旋转。然后,将样品在室温下培育10分钟。按照制造商的实验手册,使用0.4倍体积的Agencourt AMPure XP珠粒纯化改造的DNA,但使用下列洗涤缓冲液(750mM NaCl,10%PEG8000,50mM Tris.HCl pH 8)和洗脱缓冲液(40mM CAPS pH10,40mM KCl和适当的DNA系链),如下详述。
在按照制造商的实验手册之后,将丸状珠粒在150μL的洗涤缓冲液中浸浴30秒。然后小心地吸出洗涤缓冲液,当心不要干扰到丸粒。然后将所述样品在微量离心机中短暂地旋转,以充分地从珠粒排干多余的洗涤缓冲液。然后将试管重置于磁体上将珠粒制成丸状,然后放置约1-2分钟。最后,将剩余的洗涤缓冲液吸出,并将丸状珠粒重悬浮于25μl的洗脱缓冲液中,并充分混合。然后在丸状化以及除去洗脱液之前将样品放置10分钟。最后,将在一端具有胆固醇连接的DNA链杂合到样品。这即是随后在实施例4中测试的样品DNA。
实施例4
本实施例说明了上述样品制备过程之后,制备的DNA构建体具有功能预结合酶(T4Dda-E94C/C109A/C136A/A360C and TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C),该酶能够控制DNA移动穿过MspA纳米孔。
材料与方法
将在实施例3中制备的具有两种预结合酶(见图6数据)的DNA构建体(添加到纳米孔系统中的终浓度为0.1nM)添加到缓冲液中(添加到纳米孔系统中的终浓度是500mM KCl,25mM的磷酸钾pH 8.0),ATP(添加到纳米孔系统中的终浓度是2mM)和MgCl2(添加到纳米孔系统的终浓度是2mM)中。这是预混合物,然后将其添加到纳米孔系统中(总体积150μL)。
电测量是在缓冲液中从嵌入到嵌段共聚物的单个MspA纳米孔获得的(25mM磷酸钾,150mM的亚铁氰化钾(II),150mM铁氰化钾(III),pH 8.0)。在实现单个孔嵌入到嵌段共聚物后,则将缓冲液(2mL,25mM磷酸钾,150mM的亚铁氰化钾(II),150mM铁氰化钾(III),pH8.0)流经该系统以去除任何过量的MspA纳米孔。然后将预先结合到构建体Y(有T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C和TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C两种预结合酶)的酶和燃料(MgCl2和ATP)的预混合物(总量150μL)流入所述的单个纳米孔实验系统中,并使实验在-120mV保持电位下运行6小时(电势翻转至+60mV达2秒)并监测解旋酶控制的DNA移动。
结果
对于使用串联的T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C和TrwC Cba-L376C/Q594A/K762C的DNA构建体Y,观察解旋酶控制的DNA移动(参照图6)。该图显示了图中标记的区域1和2的控制移位,所述区域1和2对应随机基因组双链DNA。当在发夹衔体中存在的间隔器移位穿过纳米孔时,可观察到增加的电流,见标记3。因此该样品解旋酶控制的DNA移动表明,样品的制备过程是成功的,区域1和2在酶的控制下移位穿过纳米孔,并且可使用所述增加的电流的尖峰清楚地识别所述区域之间的过渡。
实施例5:MuA预装载的酶衔体
在本实施例中,我们发现酶可以预结合到MuA衔体,并且这不影响MuA的功能,即MuA仍可将衔体连接到DNA。
将T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C(具有突变4C/C109A/C136A/A360C的SEQ IDNO:24)预结合到MuA Y衔体:如图7所示,衔体峰偏移(左边是非预结合的,右边是预结合的)。
标签技术使用转座酶产生片段,并连接衔体到基因组DNA。标签技术的条件如下:用酶预装载衔体。使用以下来实施标签技术:100nM具有400nM T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C(具有4C/C109A/C136A/A360C突变的SEQ ID NO:24)预结合衔体的MuA四聚体。25ngul-1靶λDNA。25mM Tris-HCl pH 8.0,20℃,10mM MgCl2,110mMNaCl,0.05%的Triton X-100,10%甘油,30℃下1小时。
为了在Agilent生物分析仪上可视,将T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C(具有突变4C/C109A/C136A/A360C的SEQ ID NO:24)和MuA在75℃热灭活10分钟。如图8所示,没有看到有关靶DNA的标签技术的不利效应。这可通过靶DNA涂迹(smear)这一事实看到(左边是非预结合的,右边是预结合的)。结果显示出,酶连接与否并不重要,碎片化的基因组DNA具有相同的碎片尺寸分布。
使用与实施例4中所述仅使用T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C作为解旋酶类似的过程,测试之前描述的使用标签技术方案制备的DNA样品。如图9中所示,所得到的样品库可直接添加到芯片(chip)上,并观察解旋酶控制的DNA移动。
实施例6
实施例描述了将两个不同的酶装载到两个DNA组分上,然后将所述两个DNA组分接合到一起并连接到基因组DNA。下文的实施例描述了两个不同的酶的装载,然而,该过程同样适用于连接两个相同的酶。
材料与方法
进行与实施例2中所述相同的过程,且将两个酶(E1=T4 Dda-(H82R/E94C/A360C)(具有突变H82R/E94C/A360C的SEQ ID NO:24)和E2=T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C(具有突变E94C/C109A/C136A/A360C的SEQ ID NO:24),图10中)分别装载到两个DNA构建体(图10中的A片段和END片段)上,随后按实施例2中所述纯化。A片段包含两个杂合在一起的DNA寡核苷酸(参见图10的图解,完整说明了该寡核苷酸)。END片段包含三个杂合在一起的DNA寡核苷酸(参见图10的图解,完整说明了该寡核苷酸)。
然后将纯化的酶装载的A片段和END片段DNA衔体使用下文描述的过程与发夹衔体3(具有5′磷酸的SEQ ID NO:39,其在3’末端连接到四个iSpC3间隔器,所述iSpC3间隔器在相对端连接到SEQ ID NO:40的5’末端)一起接合到基因组λdsDNA的3.6kb区段(模板和互补的SEQID)。
将3.6kb基因组DNA(0.34μL,5nM的终浓度,SEQ ID NO:41杂合到SEQ ID NO:42)与A片段E1 DNA(6.25uL,50nM的终浓度)、END片段E2-DNA(3.125uL,25nM的终浓度)、发夹3(1.25uL,25nM的终浓度)用接合缓冲液(5uL,2mMATPγS,4mM MgCl2,10mm的Hepes pH8.0,6%PEG 8000,10mM NaCl终浓度)、快速T4 DNA连接酶NEB(2.5uL,200U/μL的终浓度)和无水核酸酶(8uL)混合。将所述样品在室温下培育10分钟。最后,将在一端连接胆固醇的DNA链杂合到所述样品。样品4可不用进一步纯化而如实施例4中所述在纳米孔电生理学中使用。
结果
对于样品4中使用串联的T4 Dda-(H82R/E94C/A360C)和T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C(参见图11)的DNA构建体(参见图11中示出的DNA构建体),观察解旋酶控制的DNA移动。该图显示了在该图中标记的区域1和2的可控移位,所述区域1和2对应基因组双链DNA。当存在于发夹衔体中的间隔器移位穿过纳米孔时,可观察到增加的电流,见箭标3。因此该样品解旋酶控制的DNA移动表明,该样品制备过程是成功的,区域1和2在酶的控制下移位穿过纳米孔,并且可使用所述增加的电流的尖峰来清楚地识别所述区域之间的过渡。
实施例7
本实施例描述了将解旋酶和聚合酶预装载到装载部分上,然后将所述装载部分接合到DNA的到3.6kB链。然后聚合酶被用于制造DNA的3.6kB链的模板链和互补链二者的拷贝。接合和聚合步骤的卡通示意图在图17中示出。
材料与方法
如实施例2中所述制备解旋酶前导复合物(在图12的A部分中示出的图),不同在于,用SEQ ID NO:43代替SEQ ID NO:26。图15泳道3显示了样品在TBE PAGE上的运行,表明酶已经结合到DNA(标记为C的条带)。
通过将Phi29-A411C/Q560C(具有突变A411C/Q560C的SEQ ID NO:9,标记为X1)预结合到DNA发夹链(SEQ ID NO:44在其3’末端连接到四个iSpC3间隔器,所述iSpC3间隔器在相对端连接到SEQ ID NO:45的5’末端)来制备聚合酶链复合物(图12的B部分中示出的图)。Phi29-A411C/Q560C是按照实验手册(https://www.piercenet.com/instructions/2161515.pdf)使用Zeba 0.5mL脱盐柱(89882,Piercenet)交换成下列缓冲液(50mM的TrispH8,20mM(NH4)2SO4,10mM的MgCl2,4%甘油)并稀释到400nM的缓冲液。将DNA发夹链(SEQ IDNO:44在其3’末端连接到4个iSpC3间隔器,所述4个iSpC3间隔器在其相对端连接到SEQ IDNO:45的5’末端)添加到phi29-A411C/Q560C,制得phi29-A411C/Q560C∶DNA发夹链比例为1∶1的样品(400nM)(本样品对应图15中的条带E)。将其在室温下培育15分钟。然后添加TMAD(125uM),并将样品在室温下进一步培育15分钟。然后,如之前所描述的,将样品再次进行缓冲液交换,不同在于,使用的缓冲液为(10mM HEPES pH8,10mM MgCl2)。然后将样品与解旋酶-前导复合体(该解旋酶-前导复合体对应图15的条带C)以1∶1混合,以产生图12的C部分中所示的解旋酶/聚合酶前导复合体。
用2∶1过量的发夹(SEQ ID NO:47),以2∶1过量,将解旋酶/聚合酶前导复合体接合到3.6kb DNA链(SEQ ID NO:46)。所述接合在10%的T4快速连接酶存在下,在5x ATP接合缓冲液(5x:150mM Tris pH8,50mM MgCl2,5mM ATP,30%PEG 8000)中实施。将样品在室温下培育15分钟。接合步骤之后产生的构建体在图13中示出。对于聚合酶填充步骤,添加dNTP(0.5mM)。然后在30℃将样品培育1小时。最后,SEQ ID NO:31以5倍过量添加到样品中,并将样品在室温下培育最少15分钟。
最终样品5可不用进一步纯化而如实施例4中所述在纳米孔电生理学中使用。
结果
对于样品5中使用T4 Dda-E94C/C109A/C136A/A360C(参见图14)的DNA构建体(参见图13中示出的DNA构建体),观察解旋酶控制的DNA移动。该图显示了该图中标记的区域1、2、4和5的可控移位,所述区域对应原始的3.6kB DNA链(区段1和2)和通过聚合酶制备的互补链(区段4和5)。当最终构建体(表示为x,在图14的顶部构件体图中标记为3)的发夹中存在的间隔器移位穿过纳米孔时,可观察到增加的电流,见箭头标记3。因此该样品由解旋酶控制的DNA移动表明,样品的接合和聚合制备过程是成功的,区域1,2和聚合区域4和5在酶的控制下移位穿过纳米孔,并且可使用所述增加的电流的尖峰清楚地识别原始链区和聚合链区之间的过渡。
Claims (38)
1.一种用于将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶多核苷酸的方法,包括:
(a)提供结合到一个或多个装载部分的所述一个或多个多核苷酸结合蛋白;以及
(b)将所述一个或多个装载部分连接到所述靶多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述方法包括在步骤(a)之前将所述多核苷酸结合蛋白结合到所述一个或多个装载部分。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述一个或多个多核苷酸结合蛋白衍生自一个或多个多核苷酸处理酶。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述一个或多个多核苷酸处理酶是一个或多个聚合酶、核酸外切酶、解旋酶、拓扑异构酶,或其组合。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述一个或多个解旋酶为a)Hel308解旋酶、RecD解旋酶、XPD解旋酶或Dda解旋酶;(b)衍生自(a)中所述任何解旋酶的解旋酶;或(c)(a)和/或(b)中所述解旋酶的任意组合。
6.根据权利要求5所述的方法,其中对所述一个或多个解旋酶进行修饰,以减小所述多核苷酸结合域中开口的大小,所述多核苷酸在至少一个构象下穿过所述开口从解旋酶上解绑。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法涉及连接两个或更多个多核苷酸结合蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述两个或更多个多核苷酸结合蛋白除非由所述一个或多个装载部分连接,否则彼此不连接。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述两个或更多个多核苷酸结合蛋白彼此不同。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述一个或多个多核苷酸结合蛋白在步骤(b)结束时保持结合到所述一个或多个装载部分。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述一个或多个装载部分是合成的。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述一个或多个装载部分包含装载多核苷酸。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述一个或多个装载部分包含所述一个或多个多核苷酸结合蛋白结合的单链多核苷酸。
14.根据权利要求12或13所述的方法,其中所述一个或多个多核苷酸结合蛋白衍生自解旋酶,所述解旋酶停滞在所述一个或多个装载多核苷酸上的一个或多个间隔器处。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述靶多核苷酸是双链多核苷酸。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述一个或多个装载部分中的至少一个是Y衔体。
17.根据权利要求16所述的方法,其中所述Y衔体包含优先螺入所述孔中的前导序列。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法,其中所述一个或多个装载部分中的至少一个是桥连部分。
19.根据权利要求18所述的方法,其中所述桥连部分是发夹环。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述发夹环的茎干为少于200个核苷酸对的长度。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述一个或多个装载部分包含一个或多个能够耦合到膜的锚。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述一个或多个装载部分包含装载多核苷酸,且步骤(b)包含使用连接酶将所述一个或多个装载部分连接到所述靶多核苷酸。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述方法进一步包括(c)从方法条件中去除所述连接酶。
24.根据权利要求22或23所述的方法,其中步骤(b)是在ATP不存在或使用γ-S-ATP(ATPγS)代替ATP的情况下进行的。
25.一种表征靶多核苷酸的方法,包括:
(a)实施前述权利要求中任一项所述的方法;
(b)将在步骤(a)中提供的具有所述一个或多个多核苷酸结合蛋白连接的所述靶多核苷酸与跨膜孔接触,使得所述一个或多个多核苷酸结合蛋白控制所述多核苷酸相对于所述孔的移动;以及
(c)随着所述多核苷酸相对于所述孔移动,获取一个或多个测量值,其中所述测量值代表所述多核苷酸的一个或多个特征,且由此表征所述靶多核苷酸。
26.一种制备用于表征的靶多核苷酸的方法,包括:
(a)实施权利要求1至24中任一项所述的方法,其中所述一个或多个多核苷酸结合蛋白包含一个或多个聚合酶;以及
(b)使用所述靶多核苷酸作为模板,使在步骤(a)中提供的连接到所述靶多核苷酸的所述一个或多个聚合酶形成一个或多个多核苷酸,且由此制备用于表征的靶多核苷酸。
27.一种表征靶多核苷酸的方法,包括:
(a)实施权利要求26中所述的方法;
(b)将在步骤(a)中产生的所述靶多核苷酸和/或所述一个或多个多核苷酸与跨膜孔接触,使得在步骤(a)中产生的所述靶多核苷酸和/或所述一个或多个多核苷酸相对于所述孔移动;
以及
(c)在步骤(a)中产生的所述靶多核苷酸和/或所述一个或多个多核苷酸相对于所述孔移动时,获取一个或多个测量值,其中所述测量值代表在步骤(a)中产生的所述靶多核苷酸和/或所述一个或多个多核苷酸的一个或多个特征,并由此表征所述靶多核苷酸。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述孔是跨膜蛋白孔或固态孔。
29.根据权利要求28所述的方法,其中所述跨膜蛋白孔衍生自溶血素、杀白细胞素、耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)、MspB、MspC、MspD、胞溶素、外膜孔蛋白F(OmpF)、外膜孔蛋白G(OmpG)、外膜磷脂酶A、奈瑟球菌属自转运脂蛋白(NalP)和WZA。
30.根据权利要求29中所述的方法,其中所述跨膜蛋白孔为:
(a)由8个如SEQ ID NO:2中所示的相同亚基形成的MspA,或(b)MspA的变体,其中基于氨基酸同一性,所述8个亚基中的一个或多个与SEQ ID NO:2在整个序列上具有至少50%同源性且保留了孔活性;或
(b)由7个如SEQ ID NO:4中所示的相同亚基形成的α-溶血素,或(d)α-溶血素的变体,其中基于氨基酸同一性,所述7个亚基中的一个或多个与SEQ ID NO:4在整个序列上具有至少50%同源性且保留了孔活性。
31.根据权利要求30所述的方法,其中所述一个或多个特征选自(i)所述靶多核苷酸的长度,(ii)所述靶多核苷酸的同一性,(iii)所述靶多核苷酸的序列,(iv)所述靶多核苷酸的二级结构,以及(v)所述靶多核苷酸是否被修饰。
32.根据权利要求31所述的方法,其中所述靶多核苷酸通过甲基化、氧化、损伤、用一个或多个蛋白或用一个或多个标记物、标签或间隔器进行修饰。
33.根据权利要求25至32中任一项所述的方法,其中所述靶多核苷酸的一个或多个特征通过电测量和/或光学测量来测量。
34.根据权利要求33所述的方法,其中所述电测量是电流测量、阻抗测量、风洞测量或场效应晶体管(FET)测量。
35.一种靶多核苷酸,使用根据权利要求1至24和26中任一项所述的方法进行修饰。
36.一种装载部分,具有一个或多个结合的多核苷酸结合蛋白。
37.一种用于将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶多核苷酸的试剂盒,包含(a)结合到一个或多个装载部分的所述一个或多个多核苷酸结合蛋白,和(b)连接酶。
38.根据权利要求36所述的装载部分或根据权利要求37所述的试剂盒,其中所述部分或一个或多个装载部分如权利要求11至21中任一项所限定,和/或所述一个或多个多核苷酸结合蛋白如权利要求2至6中任一项所限定。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010095234.4A CN111534504B (zh) | 2014-01-22 | 2015-01-22 | 将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶多核苷酸的方法 |
Applications Claiming Priority (9)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBPCT/GB2014/050175 | 2014-01-22 | ||
PCT/GB2014/050175 WO2014135838A1 (en) | 2013-03-08 | 2014-01-22 | Enzyme stalling method |
GB1406155.0 | 2014-04-04 | ||
GB1406151.9 | 2014-04-04 | ||
GBGB1406155.0A GB201406155D0 (en) | 2014-04-04 | 2014-04-04 | Method |
GBGB1406151.9A GB201406151D0 (en) | 2014-04-04 | 2014-04-04 | Method |
GB201416197A GB201416197D0 (en) | 2014-09-12 | 2014-09-12 | Method |
GB1416197.0 | 2014-09-12 | ||
PCT/GB2015/050140 WO2015110813A1 (en) | 2014-01-22 | 2015-01-22 | Method for attaching one or more polynucleotide binding proteins to a target polynucleotide |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010095234.4A Division CN111534504B (zh) | 2014-01-22 | 2015-01-22 | 将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶多核苷酸的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106103741A true CN106103741A (zh) | 2016-11-09 |
CN106103741B CN106103741B (zh) | 2020-03-13 |
Family
ID=53680879
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201580005650.8A Active CN106103741B (zh) | 2014-01-22 | 2015-01-22 | 将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶多核苷酸的方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US10385389B2 (zh) |
EP (1) | EP3097210B2 (zh) |
JP (1) | JP6749243B2 (zh) |
CN (1) | CN106103741B (zh) |
AU (1) | AU2015208919B9 (zh) |
CA (1) | CA2937411C (zh) |
WO (1) | WO2015110813A1 (zh) |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110267974A (zh) * | 2017-02-10 | 2019-09-20 | 牛津纳米孔技术公司 | 修饰的纳米孔、包含其的组合物及其用途 |
CN110603446A (zh) * | 2017-05-04 | 2019-12-20 | 牛津纳米孔技术公司 | 包括使用多核苷酸报道分子和跨膜孔的确定靶分析物的存在或不存在的方法 |
WO2021056598A1 (zh) | 2019-09-29 | 2021-04-01 | 北京齐碳科技有限公司 | 一种Mmup单体变体及其应用 |
WO2021056599A1 (zh) * | 2019-09-29 | 2021-04-01 | 北京齐碳科技有限公司 | 一种Mnep单体变体及其应用 |
CN112851771A (zh) * | 2021-02-09 | 2021-05-28 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 连接核酸与蛋白或肽的方法 |
CN112851765A (zh) * | 2021-02-09 | 2021-05-28 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 蛋白或肽与核酸共价连接的方法 |
CN113862264A (zh) * | 2021-12-03 | 2021-12-31 | 北京齐碳科技有限公司 | 用于靶多核苷酸测序的衔接子、构建体、方法和应用 |
WO2023093688A1 (zh) * | 2021-11-23 | 2023-06-01 | 成都齐碳科技有限公司 | 衔接体、复合物、单链分子、试剂盒、方法和应用 |
WO2023109538A1 (zh) * | 2021-12-15 | 2023-06-22 | 成都齐碳科技有限公司 | 用于表征多核苷酸的衔接体及其用途 |
Families Citing this family (54)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102369298B (zh) | 2009-01-30 | 2017-03-22 | 牛津纳米孔技术有限公司 | 跨膜测序中用于核酸构建体的衔接体 |
GB0905140D0 (en) | 2009-03-25 | 2009-05-06 | Isis Innovation | Method |
IN2014DN00221A (zh) | 2011-07-25 | 2015-06-05 | Oxford Nanopore Tech Ltd | |
CA2852812A1 (en) | 2011-10-21 | 2013-04-25 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Enzyme method |
BR112014025157B1 (pt) | 2012-04-10 | 2022-02-08 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Monômero de lisenina mutante, construto, poro, método para caracterizar um analito alvo, uso de um poro, e, kit |
CA2879261C (en) | 2012-07-19 | 2022-12-06 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Modified helicases |
WO2014013259A1 (en) | 2012-07-19 | 2014-01-23 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Ssb method |
WO2014135838A1 (en) | 2013-03-08 | 2014-09-12 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Enzyme stalling method |
GB201314695D0 (en) | 2013-08-16 | 2013-10-02 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
GB201313477D0 (en) | 2013-07-29 | 2013-09-11 | Univ Leuven Kath | Nanopore biosensors for detection of proteins and nucleic acids |
CN117947149A (zh) | 2013-10-18 | 2024-04-30 | 牛津纳米孔科技公开有限公司 | 经修饰的酶 |
AU2015208919B9 (en) | 2014-01-22 | 2021-04-01 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Method for attaching one or more polynucleotide binding proteins to a target polynucleotide |
GB201403096D0 (en) | 2014-02-21 | 2014-04-09 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Sample preparation method |
GB201417712D0 (en) | 2014-10-07 | 2014-11-19 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
WO2015166275A1 (en) | 2014-05-02 | 2015-11-05 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Mutant pores |
CN114605507A (zh) | 2014-09-01 | 2022-06-10 | 弗拉芒区生物技术研究所 | 突变csgg孔 |
US10266885B2 (en) | 2014-10-07 | 2019-04-23 | Oxford Nanopore Technologies Ltd. | Mutant pores |
GB201418159D0 (en) | 2014-10-14 | 2014-11-26 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
GB201502810D0 (en) | 2015-02-19 | 2015-04-08 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
GB201502809D0 (en) | 2015-02-19 | 2015-04-08 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Mutant pore |
WO2016166232A1 (en) | 2015-04-14 | 2016-10-20 | Katholieke Universiteit Leuven | Nanopores with internal protein adaptors |
EP3387432B1 (en) | 2015-12-08 | 2022-09-28 | Katholieke Universiteit Leuven KU Leuven Research & Development | Modified nanopores, compositions comprising the same, and uses thereof |
EP4019543A1 (en) | 2016-03-02 | 2022-06-29 | Oxford Nanopore Technologies plc | Mutant pore |
US11104709B2 (en) | 2016-04-06 | 2021-08-31 | Oxford Nanopore Technologies Ltd. | Mutant pore |
GB201609220D0 (en) | 2016-05-25 | 2016-07-06 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
GB201609221D0 (en) | 2016-05-25 | 2016-07-06 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
GB201620450D0 (en) | 2016-12-01 | 2017-01-18 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
GB2559117B (en) | 2017-01-19 | 2019-11-27 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Double stranded polynucleotide synthesis method, kit and system |
CA3066715A1 (en) | 2017-06-30 | 2019-01-03 | Vib Vzw | Novel protein pores |
GB2569977A (en) * | 2018-01-05 | 2019-07-10 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
GB201801768D0 (en) * | 2018-02-02 | 2018-03-21 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Synthesis method |
GB201807793D0 (en) | 2018-05-14 | 2018-06-27 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
GB201809323D0 (en) | 2018-06-06 | 2018-07-25 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
JP2020031557A (ja) * | 2018-08-28 | 2020-03-05 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 生体分子分析装置 |
JP6545888B1 (ja) * | 2018-11-09 | 2019-07-17 | 国立大学法人東北大学 | 情報処理システム、公開鍵の変更方法、およびプログラム |
GB201907244D0 (en) | 2019-05-22 | 2019-07-03 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
US11926819B2 (en) | 2019-05-28 | 2024-03-12 | The Regents Of The University Of California | Methods of adding polymers to ribonucleic acids |
US20220396829A1 (en) * | 2019-09-18 | 2022-12-15 | Hitachi High-Tech Corporation | Adapter Molecule, Biomolecule-Adapter Molecule Complex in Which Said Adapter Molecule and Biomolecule Are Bound, Biomolecule Analysis Apparatus, and Biomolecule Analysis Method |
WO2021053745A1 (ja) * | 2019-09-18 | 2021-03-25 | 株式会社日立ハイテク | アダプター分子、当該アダプター分子と生体分子とが結合した生体分子-アダプター分子複合体、生体分子分析装置及び生体分子分析方法 |
GB202009349D0 (en) | 2020-06-18 | 2020-08-05 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
CN115698331A (zh) * | 2020-06-18 | 2023-02-03 | 牛津纳米孔科技公开有限公司 | 使用检测器选择性地表征多核苷酸的方法 |
WO2021255476A2 (en) | 2020-06-18 | 2021-12-23 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Method |
EP4193363A1 (en) | 2020-08-07 | 2023-06-14 | Oxford Nanopore Technologies plc | Methods of identifying nucleic acid barcodes |
GB202015993D0 (en) | 2020-10-08 | 2020-11-25 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
CN117337333A (zh) | 2021-05-19 | 2024-01-02 | 牛津纳米孔科技公开有限公司 | 用于补体链测序的方法 |
GB202118906D0 (en) | 2021-12-23 | 2022-02-09 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
GB202118908D0 (en) | 2021-12-23 | 2022-02-09 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
GB202204919D0 (en) | 2022-04-04 | 2022-05-18 | Oxford Nanopore Tech Plc | Method |
GB202205617D0 (en) | 2022-04-14 | 2022-06-01 | Oxford Nanopore Tech Plc | Novel modified protein pores and enzymes |
WO2023222657A1 (en) | 2022-05-17 | 2023-11-23 | Oxford Nanopore Technologies Plc | Method and adaptors |
WO2023223033A1 (en) | 2022-05-18 | 2023-11-23 | Oxford Nanopore Technologies Plc | Compositions and methods for nucleic acid extraction and purification |
GB202207267D0 (en) | 2022-05-18 | 2022-06-29 | Oxford Nanopore Tech Plc | Calibration and profiling of a nanopore array device |
CN116478983B (zh) * | 2022-11-21 | 2023-10-24 | 北京普译生物科技有限公司 | 一种rna-dna嵌合接头及其应用 |
GB202307486D0 (en) | 2023-05-18 | 2023-07-05 | Oxford Nanopore Tech Plc | Method |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020197614A1 (en) * | 1997-05-16 | 2002-12-26 | Mosaic Technologies, Inc. | Electrophoretic analysis of target molecules using adapter molecules |
WO2013014451A1 (en) * | 2011-07-25 | 2013-01-31 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Hairpin loop method for double strand polynucleotide sequencing using transmembrane pores |
WO2013057495A2 (en) * | 2011-10-21 | 2013-04-25 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Enzyme method |
WO2013098561A1 (en) * | 2011-12-29 | 2013-07-04 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Method for characterising a polynucelotide by using a xpd helicase |
Family Cites Families (109)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5198543A (en) | 1989-03-24 | 1993-03-30 | Consejo Superior Investigaciones Cientificas | PHI29 DNA polymerase |
US6362002B1 (en) | 1995-03-17 | 2002-03-26 | President And Fellows Of Harvard College | Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions |
US5795782A (en) | 1995-03-17 | 1998-08-18 | President & Fellows Of Harvard College | Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions |
JP3891620B2 (ja) * | 1996-11-14 | 2007-03-14 | 株式会社アイシン・コスモス研究所 | ヘアピン型構造の核酸プローブ分子、及び該核酸プローブ分子を利用した核酸検出方法 |
WO1999005167A1 (en) | 1997-07-25 | 1999-02-04 | University Of Massachusetts | Designed protein pores as components for biosensors |
US6743605B1 (en) | 1998-06-24 | 2004-06-01 | Enzo Life Sciences, Inc. | Linear amplification of specific nucleic acid sequences |
US6150112A (en) * | 1998-09-18 | 2000-11-21 | Yale University | Methods for identifying DNA sequences for use in comparison of DNA samples by their lack of polymorphism using Y shape adaptors |
US6267872B1 (en) | 1998-11-06 | 2001-07-31 | The Regents Of The University Of California | Miniature support for thin films containing single channels or nanopores and methods for using same |
US6426231B1 (en) | 1998-11-18 | 2002-07-30 | The Texas A&M University System | Analyte sensing mediated by adapter/carrier molecules |
NO986133D0 (no) | 1998-12-23 | 1998-12-23 | Preben Lexow | FremgangsmÕte for DNA-sekvensering |
AU5631200A (en) | 1999-06-22 | 2001-01-09 | President And Fellows Of Harvard College | Control of solid state dimensional features |
AU7901300A (en) | 1999-08-31 | 2001-03-26 | Stefan Bossmann | Method for producing a channel-forming protein |
EP1255772A2 (en) | 2000-02-11 | 2002-11-13 | The Texas A & M University System | Biosensor compositions and methods of use |
AU2001243232A1 (en) * | 2000-02-25 | 2001-09-03 | University Of South Carolina Research Foundation | Topoisomerase linker-mediated amplification methods |
US7001792B2 (en) | 2000-04-24 | 2006-02-21 | Eagle Research & Development, Llc | Ultra-fast nucleic acid sequencing device and a method for making and using the same |
US6936433B2 (en) | 2000-11-27 | 2005-08-30 | The Regents Of The University Of California | Methods and devices for characterizing duplex nucleic acid molecules |
US6863833B1 (en) | 2001-06-29 | 2005-03-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Microfabricated apertures for supporting bilayer lipid membranes |
AU2003245272A1 (en) | 2002-05-10 | 2003-11-11 | The Texas A And M University System | Stochastic sensing through covalent interactions |
WO2004081183A2 (en) * | 2003-03-07 | 2004-09-23 | Rubicon Genomics, Inc. | In vitro dna immortalization and whole genome amplification using libraries generated from randomly fragmented dna |
DE602004025801D1 (de) * | 2003-03-25 | 2010-04-15 | Stratagene California | Dna-polymerasefusionen und deren verwendungen |
US7163658B2 (en) | 2003-04-23 | 2007-01-16 | Rouvain Bension | Rapid sequencing of polymers |
AU2003904237A0 (en) | 2003-08-08 | 2003-08-21 | Garvan Institute Of Medical Research | Novel translocation assay |
EP1721283B1 (en) | 2004-02-06 | 2022-11-30 | Council of Scientific and Industrial Research | Computational method for identifying adhesin and adhesin-like proteins of therapeutic potential |
JP2005253427A (ja) * | 2004-03-15 | 2005-09-22 | Aisin Seiki Co Ltd | 核酸検出方法及び核酸単離方法 |
WO2006028508A2 (en) | 2004-03-23 | 2006-03-16 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and apparatus for characterizing polynucleotides |
WO2005124888A1 (en) | 2004-06-08 | 2005-12-29 | President And Fellows Of Harvard College | Suspended carbon nanotube field effect transistor |
US20060105461A1 (en) | 2004-10-22 | 2006-05-18 | May Tom-Moy | Nanopore analysis system |
EP1842061A4 (en) | 2004-12-21 | 2009-05-13 | Texas A & M Univ Sys | HIGH-TEMPERATURE ION CHANNELS AND ION PORES |
GB0505971D0 (en) | 2005-03-23 | 2005-04-27 | Isis Innovation | Delivery of molecules to a lipid bilayer |
KR100730350B1 (ko) | 2005-10-17 | 2007-06-19 | 삼성전자주식회사 | 표면처리된 나노포어를 이용한 dna 검출방법 및검출장치 |
GB0523282D0 (en) | 2005-11-15 | 2005-12-21 | Isis Innovation | Methods using pores |
EP1963530B1 (en) | 2005-12-22 | 2011-07-27 | Pacific Biosciences of California, Inc. | Active surface coupled polymerases |
US7849581B2 (en) | 2006-05-05 | 2010-12-14 | University Of Utah Research Foundation | Nanopore electrode, nanopore membrane, methods of preparation and surface modification, and use thereof |
US7638034B2 (en) | 2006-09-21 | 2009-12-29 | Los Alamos National Security, Llc | Electrochemical detection of single molecules using abiotic nanopores having electrically tunable dimensions |
US20110121840A1 (en) | 2007-02-20 | 2011-05-26 | Gurdial Singh Sanghera | Lipid Bilayer Sensor System |
KR101521990B1 (ko) | 2007-04-04 | 2015-05-20 | 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 나노포어 사용을 위한 조성물, 장치, 시스템 및 방법 |
US9121843B2 (en) | 2007-05-08 | 2015-09-01 | Trustees Of Boston University | Chemical functionalization of solid-state nanopores and nanopore arrays and applications thereof |
GB0716264D0 (en) | 2007-08-21 | 2007-09-26 | Isis Innovation | Bilayers |
WO2009035647A1 (en) | 2007-09-12 | 2009-03-19 | President And Fellows Of Harvard College | High-resolution molecular graphene sensor comprising an aperture in the graphene layer |
GB2453377A (en) | 2007-10-05 | 2009-04-08 | Isis Innovation | Transmembrane protein pores and molecular adapters therefore. |
WO2009052214A2 (en) † | 2007-10-15 | 2009-04-23 | Complete Genomics, Inc. | Sequence analysis using decorated nucleic acids |
GB0724736D0 (en) | 2007-12-19 | 2008-01-30 | Oxford Nanolabs Ltd | Formation of layers of amphiphilic molecules |
US8231969B2 (en) | 2008-03-26 | 2012-07-31 | University Of Utah Research Foundation | Asymmetrically functionalized nanoparticles |
EP3425060B1 (en) | 2008-03-28 | 2021-10-27 | Pacific Biosciences of California, Inc. | Compositions and methods for nucleic acid sequencing |
WO2009132124A2 (en) | 2008-04-24 | 2009-10-29 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Geometric patterns and lipid bilayers for dna molecule organization and uses thereof |
EP2293921A4 (en) | 2008-05-22 | 2013-05-22 | Univ California | MEMBRANE PROBLEMS AND MEMBRANES MADE FROM THESE |
US8652771B2 (en) | 2008-05-28 | 2014-02-18 | University of Souther California | Measurement of succinate in urine samples as a biomarker of kidney damage in diabetic subjects |
EP2310534B1 (en) | 2008-07-07 | 2018-09-05 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Base-detecting pore |
US20110229877A1 (en) | 2008-07-07 | 2011-09-22 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Enzyme-pore constructs |
US20100092960A1 (en) | 2008-07-25 | 2010-04-15 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Helicase-assisted sequencing with molecular beacons |
WO2010034018A2 (en) | 2008-09-22 | 2010-03-25 | University Of Washington | Msp nanopores and related methods |
US8383369B2 (en) | 2008-09-24 | 2013-02-26 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Intermittent detection during analytical reactions |
US9080211B2 (en) * | 2008-10-24 | 2015-07-14 | Epicentre Technologies Corporation | Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids |
GB0820927D0 (en) | 2008-11-14 | 2008-12-24 | Isis Innovation | Method |
WO2010086603A1 (en) | 2009-01-30 | 2010-08-05 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Enzyme mutant |
CN102369298B (zh) | 2009-01-30 | 2017-03-22 | 牛津纳米孔技术有限公司 | 跨膜测序中用于核酸构建体的衔接体 |
GB0905140D0 (en) | 2009-03-25 | 2009-05-06 | Isis Innovation | Method |
WO2010122293A1 (en) | 2009-04-20 | 2010-10-28 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Lipid bilayer sensor array |
EP2507387B1 (en) | 2009-12-01 | 2017-01-25 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Biochemical analysis instrument and method |
CA3116307C (en) | 2010-02-23 | 2023-10-17 | University Of Washington | Artificial mycolic acid membranes |
WO2011125015A2 (en) | 2010-04-05 | 2011-10-13 | Bar-Ilan University | Protease-activatable pore-forming polypeptides |
EP2580588B1 (en) | 2010-06-08 | 2014-09-24 | President and Fellows of Harvard College | Nanopore device with graphene supported artificial lipid membrane |
US9593370B2 (en) | 2010-10-01 | 2017-03-14 | Oxford Nanopore Technologies Ltd. | Biochemical analysis apparatus and rotary valve |
CN102116783B (zh) | 2010-12-31 | 2013-05-29 | 北京普源精电科技有限公司 | 一种波形显示方法 |
CN102174554A (zh) | 2011-01-24 | 2011-09-07 | 内蒙古民族大学 | 双控双调节原核表达载体系统及其构建方法和用途 |
US20120196279A1 (en) | 2011-02-02 | 2012-08-02 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid sample preparation |
EP2673638B1 (en) | 2011-02-11 | 2019-10-30 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Mutant pores |
CN103733063B (zh) | 2011-05-27 | 2016-04-20 | 牛津纳米孔技术有限公司 | 偶联方法 |
US9580480B2 (en) | 2011-05-31 | 2017-02-28 | Massachusetts Institute Of Technology | Cell-directed synthesis of multifunctional nanopatterns and nanomaterials |
JP6457811B2 (ja) | 2011-09-23 | 2019-01-23 | オックスフォード ナノポール テクノロジーズ リミテッド | ポリマー単位を含むポリマーの解析 |
GB201120910D0 (en) | 2011-12-06 | 2012-01-18 | Cambridge Entpr Ltd | Nanopore functionality control |
CA2861808C (en) | 2011-12-29 | 2021-02-23 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Enzyme method |
EP3415901A1 (en) * | 2012-01-20 | 2018-12-19 | Genia Technologies, Inc. | Nanopore based molecular detection and sequencing |
BR112014025157B1 (pt) | 2012-04-10 | 2022-02-08 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Monômero de lisenina mutante, construto, poro, método para caracterizar um analito alvo, uso de um poro, e, kit |
TWI655213B (zh) | 2012-07-13 | 2019-04-01 | 目立康股份有限公司 | 自我組織化肽衍生物的製造方法 |
BR112015001052B8 (pt) * | 2012-07-19 | 2022-12-27 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Métodos para distinguir um polinucleotídeo alvo,sensor para distinguir um polinucleotídeo alvo, e, uso de um construto |
CA2879261C (en) * | 2012-07-19 | 2022-12-06 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Modified helicases |
WO2014013259A1 (en) | 2012-07-19 | 2014-01-23 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Ssb method |
GB201313121D0 (en) | 2013-07-23 | 2013-09-04 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Array of volumes of polar medium |
JP6375301B2 (ja) | 2012-10-26 | 2018-08-15 | オックスフォード ナノポール テクノロジーズ リミテッド | 液滴界面 |
US9683230B2 (en) † | 2013-01-09 | 2017-06-20 | Illumina Cambridge Limited | Sample preparation on a solid support |
WO2014122654A2 (en) | 2013-02-07 | 2014-08-14 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Hybrid nanopores and uses thereof for detection of analytes |
WO2014135838A1 (en) | 2013-03-08 | 2014-09-12 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Enzyme stalling method |
GB201314695D0 (en) | 2013-08-16 | 2013-10-02 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
WO2014142850A1 (en) † | 2013-03-13 | 2014-09-18 | Illumina, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid sequencing |
US10613076B2 (en) | 2013-03-14 | 2020-04-07 | The Trustees Of Boston University | Optoelectronic control of solid-state nanopores |
GB201313477D0 (en) | 2013-07-29 | 2013-09-11 | Univ Leuven Kath | Nanopore biosensors for detection of proteins and nucleic acids |
DK3351645T3 (da) | 2013-05-24 | 2020-09-21 | Illumina Cambridge Ltd | Pyrofosforolytisk sekventering ved anvendelse af nanoporer |
WO2015051378A1 (en) | 2013-10-04 | 2015-04-09 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Systems and methods for nanopore-based analysis of nucleic acids |
CN117947149A (zh) | 2013-10-18 | 2024-04-30 | 牛津纳米孔科技公开有限公司 | 经修饰的酶 |
GB201406151D0 (en) | 2014-04-04 | 2014-05-21 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
CN113528632A (zh) | 2013-11-26 | 2021-10-22 | 伊鲁米那股份有限公司 | 用于多核苷酸测序的组合物和方法 |
AU2015208919B9 (en) | 2014-01-22 | 2021-04-01 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Method for attaching one or more polynucleotide binding proteins to a target polynucleotide |
GB201406155D0 (en) | 2014-04-04 | 2014-05-21 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
GB201403096D0 (en) | 2014-02-21 | 2014-04-09 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Sample preparation method |
US10337060B2 (en) | 2014-04-04 | 2019-07-02 | Oxford Nanopore Technologies Ltd. | Method for characterising a double stranded nucleic acid using a nano-pore and anchor molecules at both ends of said nucleic acid |
GB201417712D0 (en) | 2014-10-07 | 2014-11-19 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
WO2015166275A1 (en) | 2014-05-02 | 2015-11-05 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Mutant pores |
FR3023394B1 (fr) | 2014-07-02 | 2017-12-29 | Adn Access Data Networks | Dispositif permettant de faciliter l'enseignement de la langue amharique et d'en normaliser l'ecriture |
CN114605507A (zh) | 2014-09-01 | 2022-06-10 | 弗拉芒区生物技术研究所 | 突变csgg孔 |
US10266885B2 (en) | 2014-10-07 | 2019-04-23 | Oxford Nanopore Technologies Ltd. | Mutant pores |
GB201502809D0 (en) | 2015-02-19 | 2015-04-08 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Mutant pore |
GB201502810D0 (en) | 2015-02-19 | 2015-04-08 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Method |
WO2016166232A1 (en) | 2015-04-14 | 2016-10-20 | Katholieke Universiteit Leuven | Nanopores with internal protein adaptors |
EP3387432B1 (en) | 2015-12-08 | 2022-09-28 | Katholieke Universiteit Leuven KU Leuven Research & Development | Modified nanopores, compositions comprising the same, and uses thereof |
EP4019543A1 (en) | 2016-03-02 | 2022-06-29 | Oxford Nanopore Technologies plc | Mutant pore |
US11104709B2 (en) | 2016-04-06 | 2021-08-31 | Oxford Nanopore Technologies Ltd. | Mutant pore |
GB201707122D0 (en) | 2017-05-04 | 2017-06-21 | Oxford Nanopore Tech Ltd | Pore |
CA3066715A1 (en) | 2017-06-30 | 2019-01-03 | Vib Vzw | Novel protein pores |
-
2015
- 2015-01-22 AU AU2015208919A patent/AU2015208919B9/en active Active
- 2015-01-22 CA CA2937411A patent/CA2937411C/en active Active
- 2015-01-22 US US15/113,207 patent/US10385389B2/en active Active
- 2015-01-22 CN CN201580005650.8A patent/CN106103741B/zh active Active
- 2015-01-22 EP EP15704360.5A patent/EP3097210B2/en active Active
- 2015-01-22 WO PCT/GB2015/050140 patent/WO2015110813A1/en active Application Filing
- 2015-01-22 JP JP2016547868A patent/JP6749243B2/ja active Active
-
2019
- 2019-08-14 US US16/540,425 patent/US11725235B2/en active Active
-
2023
- 2023-06-23 US US18/340,823 patent/US20240026441A1/en active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020197614A1 (en) * | 1997-05-16 | 2002-12-26 | Mosaic Technologies, Inc. | Electrophoretic analysis of target molecules using adapter molecules |
WO2013014451A1 (en) * | 2011-07-25 | 2013-01-31 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Hairpin loop method for double strand polynucleotide sequencing using transmembrane pores |
WO2013057495A2 (en) * | 2011-10-21 | 2013-04-25 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Enzyme method |
WO2013098561A1 (en) * | 2011-12-29 | 2013-07-04 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Method for characterising a polynucelotide by using a xpd helicase |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ANNA-HELENA SAARIAHO等: ""Characteristics of MuA transposase-catalyzed processing of model transposon end DNA hairpin substrates"", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 * |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110267974A (zh) * | 2017-02-10 | 2019-09-20 | 牛津纳米孔技术公司 | 修饰的纳米孔、包含其的组合物及其用途 |
CN110603446A (zh) * | 2017-05-04 | 2019-12-20 | 牛津纳米孔技术公司 | 包括使用多核苷酸报道分子和跨膜孔的确定靶分析物的存在或不存在的方法 |
WO2021056598A1 (zh) | 2019-09-29 | 2021-04-01 | 北京齐碳科技有限公司 | 一种Mmup单体变体及其应用 |
WO2021056599A1 (zh) * | 2019-09-29 | 2021-04-01 | 北京齐碳科技有限公司 | 一种Mnep单体变体及其应用 |
CN112851771A (zh) * | 2021-02-09 | 2021-05-28 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 连接核酸与蛋白或肽的方法 |
CN112851765A (zh) * | 2021-02-09 | 2021-05-28 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 蛋白或肽与核酸共价连接的方法 |
CN112851765B (zh) * | 2021-02-09 | 2023-02-28 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 蛋白或肽与核酸共价连接的方法 |
WO2023093688A1 (zh) * | 2021-11-23 | 2023-06-01 | 成都齐碳科技有限公司 | 衔接体、复合物、单链分子、试剂盒、方法和应用 |
CN113862264A (zh) * | 2021-12-03 | 2021-12-31 | 北京齐碳科技有限公司 | 用于靶多核苷酸测序的衔接子、构建体、方法和应用 |
WO2023109538A1 (zh) * | 2021-12-15 | 2023-06-22 | 成都齐碳科技有限公司 | 用于表征多核苷酸的衔接体及其用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111534504A (zh) | 2020-08-14 |
EP3097210B1 (en) | 2018-11-14 |
CA2937411A1 (en) | 2015-07-30 |
CA2937411C (en) | 2023-09-26 |
EP3097210A1 (en) | 2016-11-30 |
AU2015208919A1 (en) | 2016-07-21 |
AU2015208919B9 (en) | 2021-04-01 |
JP6749243B2 (ja) | 2020-09-02 |
JP2017503517A (ja) | 2017-02-02 |
WO2015110813A1 (en) | 2015-07-30 |
US20170107569A1 (en) | 2017-04-20 |
CN106103741B (zh) | 2020-03-13 |
US11725235B2 (en) | 2023-08-15 |
US20240026441A1 (en) | 2024-01-25 |
US20200087724A1 (en) | 2020-03-19 |
US10385389B2 (en) | 2019-08-20 |
EP3097210B2 (en) | 2022-04-20 |
AU2015208919B2 (en) | 2021-03-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106103741A (zh) | 将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶多核苷酸的方法 | |
EP3619224B1 (en) | Transmembrane pore consisting of two csgg pores | |
EP3097204B1 (en) | Method for controlling the movement of a polynucleotide through a transmembrane pore | |
EP3126515B1 (en) | Method for characterising a double stranded nucleic acid using a nano-pore and anchor molecules at both ends of said nucleic acid | |
EP3126516B1 (en) | Method of target molecule characterisation using a molecular pore | |
CN108779170A (zh) | 突变孔 | |
CN106459159A (zh) | 突变孔 | |
CN109312401A (zh) | 连接的核酸的纳米孔测序方法 | |
CN106232834A (zh) | 样品制备方法 | |
CN105899678A (zh) | 经修饰的酶 | |
CN111534504B (zh) | 将一个或多个多核苷酸结合蛋白连接到靶多核苷酸的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant |