CN106092707A - 一种用于对同一组织切片进行多次免疫染色的装置和方法 - Google Patents
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Abstract
为了实现对同一组织切片进行多次免疫染色，以节约组织标本并满足诊断需要，本发明公开一种用于对同一组织切片进行多次免疫染色的装置和方法，包括组织切片承载装置及其使用方法。通过使用改进的组织切片承载装置对同一组织切片进行依次循环的染色、拍照、清洗、再染色、再拍照、再清洗的多次染色，可获得更好的染色效果，将多次染色后拍摄的照片进行比对分析，可获得组织切片上每一个细胞的抗原表达谱。
Description
技术领域
本发明涉及医学生物实验的设备及其使用方法，尤其涉及一种用于对同一组织切片进行多次免疫染色的装置和方法。
背景技术
免疫染色是利用抗原与抗体特异性结合的原理，检测特定蛋白（抗原）的表达情况，是发现机体在生理或病理状态下功能变化最常用的检测方法之一，最常用的免疫染色包括免疫组织化学染色和免疫荧光染色。常规方法是对一张组织切片进行一种抗原标记的染色，要研究多种抗原的表达情况则需要多张组织切片，每一张组织切片各进行一种抗原标记的染色。如果对极少量的组织标本（如细针穿刺标本）进行多种抗原表达情况的研究，常规免疫染色方法由于受标本量的限制而难以实现。因此，有必要开发一种能对同一组织切片进行多次免疫染色的装置和方法，以节约组织标本，满足诊断需要。专利（2016204811024；2016103501400）提供了一种用于对同一组织切片进行多次免疫染色的装置和方法，但在实施过程中，本发明人发现，该装置和方法存在两个不足，即需要较长的时间才能使染色液充分作用组织切片和染色过程中第一抗体脱离组织不够充分，这两个不足均影响对同一组织切片进行多次免疫染色的效率和质量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术存在需要较长的时间才能使染色液充分作用组织切片和染色过程中第一抗体脱离组织不够充分的不足，提供一种用于对同一组织切片进行多次免疫染色的装置和方法。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：提供一种对同一组织切片进行多次免疫染色的组织切片承载装置和使用所述组织切片承载装置进行多次免疫染色的方法。
所述组织切片承载装置，包括带凹槽载玻片和盖玻片和楔子这三部分。所述带凹槽载玻片由高透明性的无色玻璃制成，中央有至少一个凹槽，凹槽的横切面可为圆形、椭圆形、长方形等几何形状，也可为不规则形，优选于长方形，凹槽底光滑平整，凹槽的侧壁有一个缺口。所述盖玻片的大小和形状与所述凹槽相匹配，优选于刚好能放入凹槽，所述盖玻片厚度为0.13-0.17mm，用高透明玻璃制成。所述盖玻片的一条边的边缘处与所述带凹槽载玻片的凹槽底不完全贴合，该边紧邻凹槽侧壁的缺口。所述缺口的宽度刚好能容纳一个所述楔子伸入或退出凹槽，所述楔子的尖端能从缺口处伸入凹槽，插入盖玻片与凹槽底之间，使盖玻片上抬而增大盖玻片与凹槽底之间的间隙，使较多的染色液充分浸泡组织切片而进行染色。所述染色液指免疫染色过程中使用的一系列液体试剂。所述楔子能从缺口处后撤，可使盖玻片恢复到楔子插入前的状态，紧贴组织切片，便于通过显微镜观察组织切片和拍照。为了实现所述盖玻片的一条边的边缘处与所述带凹槽载玻片的凹槽底不完全贴合这个目的，可采用在靠近缺口处且不影响组织切片贴附处的凹槽底制作一条沟，或者使盖玻片靠近凹槽侧壁缺口处的边向上弯曲，优选于使盖玻片靠近凹槽侧壁缺口处的边向上弯曲，而保持覆盖组织切片的部分平整如常规盖玻片。
所述带凹槽载玻片的凹槽底需要采用目前常规的方法，如涂抹多聚赖氨酸等，增加组织切片与载玻片凹槽底的粘附性，以避免组织切片脱离载玻片。组织切片置于带凹槽载玻片的凹槽内底部中央，盖玻片置于组织切片上方。
执行所述多次染色之前，先进行常规的染色前准备，包括石蜡包埋组织的切片（厚度为4~6μm）、漂片，将组织切片置于带凹槽载玻片的凹槽底部中央，烤片、脱蜡、水化、抗原修复等一系列常规步骤（冰冻切片则切片后即可进行染色），将盖玻片置于组织切片上方，向上弯曲的一条边邻近缺口。然后对组织切片进行依次循环的染色、拍照、清洗、再染色、再拍照、再清洗的多次染色。除所述拍照阶段外，即在染色和清洗阶段，将所述楔子从缺口插入盖玻片与凹槽底之间，使盖玻片的一端上抬，染色液滴加在盖玻片与凹槽侧壁的缝隙处，由于表面张力的作用，染色液将到达组织切片处从而作用组织切片，滴加染色液的量要足够浸泡组织切片；在所述拍照阶段，楔子退出，使盖玻片平放，紧贴组织切片，从而便于在显微镜下观察和拍照。所述染色，按试剂盒说明书操作，依次添加第一种第一抗体及相应的第二抗体等，至显色完成后（不进行苏木精复染细胞核和封片），终止显色反应，置于显微镜下拍照；所述拍照完成后，进行所述清洗，即先用酶消化组织切片，所述酶优选于胃蛋白酶或木瓜蛋白酶，使第一抗体的F(ab)2段和Fc段分离，缓冲液冲洗组织切片后，使Fc段及连接在Fc段上的第二抗体脱离组织切片，再用脱色剂将所述显色反应的产物完全清除；所述脱色剂，在采用3－氨基－9－乙基咔唑（3-amino－9－ethylcarbazole，AEC）作为显色剂时，优选于70%-100%乙醇作为脱色剂。所述清洗完成后，缓冲液冲洗组织切片，再进行所述再染色；所述再染色，即按照说明书操作，以类似于所述染色方法，依次添加第二种第一抗体及相应的第二抗体等，至显色完成后（不进行苏木精复染细胞核和封片），终止显色反应，置于显微镜下拍照；所述再清洗，方法与清洗完全相同。再按上述循环添加第三种第一抗体、第四种第一抗体等，直至完成拟研究的全部抗原表达的研究。按照所述多次染色法能对同一组织切片进行3次至20次染色。然后，作为染色质量控制方法，重复第一种第一抗体的染色（目的是评价在多次染色过程中是否存在抗原丢失现象，若抗原丢失超过20%，需考虑减少染色次数，即减少对同一组织切片的染色次数），拍照后，进行常规苏木素-伊红染色，中性树脂封片后进行拍照。在整个实验过程中，必须保持整个组织切片始终固定在最初所在位置，将多次染色后所获得的照片通过计算机软件系统进行比对分析，可获得组织切片上每一个细胞的相应抗原表达谱。
所述一种用于对同一组织切片进行多次免疫染色的装置和方法，其优势在于：①在染色和清洗阶段，由于所述楔子插入盖玻片和载玻片凹槽底之间，使盖玻片和载玻片凹槽底之间的缝隙增大，容纳较多染色试剂，从而使染色试剂充分浸泡组织切片，提高了染色的质量和效率；② 在拍照阶段，由于所述楔子的后撤，使盖玻片紧贴载玻片凹槽底，从而便于拍照以获得高质量的照片；③ 在清洗阶段，通过所述酶消化，使第一抗体的F(ab)2段和Fc段分离，所述F(ab)2段继续与抗原结合占据抗原表位，所述Fc段则离开组织切片，有利于减少后续染色过程中所产生的非特异性染色；④ 在采用AEC作为显色剂时，仅以乙醇作为脱色剂，能充分去除显色产物。
附图说明
图1是组织切片承载装置楔子退出状态的平面视图；
图2是组织切片承载装置楔子退出状态的横切面视图；
图3是组织切片承载装置楔子插入状态的平面视图；
图4是组织切片承载装置楔子插入状态的横切面视图；
图中：1为带凹槽载玻片；2为凹槽；3为盖玻片；4为组织切片；5为楔子；6为缺口。
具体实施方法
下面结合附图和具体实例对本发明进行详细说明。
如图1-4所示，组织切片承载装置，包括带凹槽载玻片1、盖玻片3和楔子5。所述带凹槽载玻片1长度为60mm，宽度为40mm，除凹槽2以外部分的厚度为2.5mm，凹槽2底部厚度为1.0mm；所述凹槽2长度为42mm，宽度为26mm，深度为1.5mm；所述凹槽的右侧壁中部有宽度为3mm的缺口6，缺口6内可插入和退出楔子5，楔子5宽度2.8mm，楔子5的尖端指向凹槽；所述盖玻片3长度为40mm，宽度为24mm，厚度为0.13mm，盖玻片的右侧宽为2mm的部分向上弯曲，弯曲的程度可容纳楔子的尖端插入盖玻片与凹槽底部之间。凹槽底按说明书用多聚赖氨酸处理。
使用所述组织切片承载装置实现多次免疫染色，参考所用染色试剂使用说明书进行。
来自人淋巴结穿刺标本的石蜡包埋组织经常规切片（厚度4 μm）、漂片，用带凹槽载玻片1捞起一张组织切片4放置于凹槽2中央，按常规烤片、脱蜡、水化、抗原修复、封闭内源性过氧化氢酶，每步完成后用PBS（磷酸盐缓冲液，pH值7.3-7.4）浸泡，将组织切片承载装置平放在桌面上，将盖玻片3置于凹槽2内覆盖组织切片4，盖玻片向上弯曲的一边紧邻缺口，每一步操作完成后均用吸水纸尽可能把残留染色试剂吸干净，依次进行下列操作（未注明温度的步骤在室温进行）：
1.将楔子插入盖玻片与凹槽底之间；
2.滴加来自兔的抗人CD3第一抗体（IgG）工作液100微升，37℃孵育60分钟；
3.PBS洗3遍，每遍5分钟；
4.滴加适量生物素标记第二抗体（鼠抗兔）工作液，37℃孵育15分钟；
5.PBS洗3遍，每遍5分钟；
6.滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育15分钟；
7.PBS洗3遍，每遍5分钟；
8.显色剂AEC显色10分钟；
9.自来水充分冲洗；
10.将楔子撤离盖玻片与凹槽底之间，用吸水纸洗去盖玻片下的大部分液体；
11.显微镜下拍照；
12.将楔子插入盖玻片与凹槽底之间；
13.PBS浸泡组织切片3分钟；
14.0.4%胃蛋白酶液100微升，37℃孵育30分钟；
15.PBS浸泡组织切片3分钟；
16.无水乙醇浸泡组织切片3分钟；
17.PBS浸泡组织切片3分钟；
18.滴加来自兔的抗人CD4第一抗体（IgG）工作液100微升，37℃孵育60分钟；
19.重复上述步骤3~17；
20.滴加来自兔的抗人CD5第一抗体（IgG）工作液100微升，37℃孵育60分钟；
21.重复上述步骤3~17；
22.滴加来自兔的抗人CD7第一抗体（IgG）工作液100微升，37℃孵育60分钟；
23.重复上述步骤3~17；
24.滴加来自兔的抗人CD8第一抗体（IgG）工作液100微升，37℃孵育60分钟；
25.重复上述步骤3~17；
26.滴加来自兔的抗人CD10第一抗体（IgG）工作液100微升，37℃孵育60分钟；
27.重复上述步骤3~17；
28.滴加来自兔的抗人CD15第一抗体（IgG）工作液100微升，37℃孵育60分钟；
29.重复上述步骤3~17；
30.滴加来自兔的抗人CD20第一抗体（IgG）工作液100微升，37℃孵育60分钟；
31.重复上述步骤3~17；
32.滴加来自兔的抗人CD30第一抗体（IgG）工作液100微升，37℃孵育60分钟；
33.重复上述步骤3~17；
34.滴加来自兔的抗人CD56第一抗体（IgG）工作液100微升，37℃孵育60分钟；
35.重复上述步骤3~17；
36.滴加来自兔的抗人CD3第一抗体（IgG）工作液100微升，37℃孵育60分钟；
37.重复上述步骤3~17；
38.按说明书进行苏木素-伊红（HE）染色，中性树脂封片；
39.显微镜下拍照；
40.将所获得的照片进行对比分析，可显示组织切片上每一个细胞CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD15、CD20、CD30、CD56的抗原表达谱。
Claims (5)
1.一种用于对同一组织切片进行实现多次免疫染色的装置和方法，其特征在于：实现多次免疫染色的装置为组织切片承载装置，所述组织切片承载装置，包括带凹槽载玻片和盖玻片和楔子这三部分；实现多次免疫染色的方法为对组织切片进行依次循环的染色、拍照、清洗、再染色、再拍照、再清洗的多次染色。
2.根据权利要求1所述的一种用于对同一组织切片进行多次免疫染色的装置和方法，其特征在于：所述带凹槽载玻片中央有至少一个凹槽，凹槽的侧壁有一个缺口；所述盖玻片的一条边的边缘处与所述带凹槽载玻片的凹槽底不完全贴合，该边紧邻凹槽侧壁的缺口；所述缺口的宽度能容纳一个所述楔子伸入或退出凹槽；所述楔子根据需要将尖端插入或退出盖玻片与凹槽底之间。
3.根据权利要求1所述的一种用于对同一组织切片进行多次免疫染色的装置和方法，其特征在于：所述清洗，为先用酶消化组织切片，再用缓冲液冲洗组织切片。
4.根据权利要求1所述的一种用于对同一组织切片进行多次免疫染色的装置和方法，其特征在于：所述清洗，在采用3－氨基－9－乙基咔唑（3-amino－9－ethylcarbazole，AEC）作为显色剂时，采用70%-100%乙醇去除显色产物。
5.根据权利要求1所述的用于对同一组织切片进行多次免疫染色的装置和方法，其特征在于：所述多次染色过程中，在染色和清洗阶段，将所述楔子从缺口插入盖玻片与凹槽底之间；在所述拍照阶段，所述楔子从缺口退出盖玻片与凹槽底之间。
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| CN201610568530.5A Pending CN106092707A (zh) | 2016-07-19 | 2016-07-19 | 一种用于对同一组织切片进行多次免疫染色的装置和方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106092707A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108152109A (zh) * | 2017-12-14 | 2018-06-12 | 吴言 | 载玻片盖体及其用于组织切片清洗的方法 |
| WO2019157828A1 (zh) * | 2018-02-13 | 2019-08-22 | 京东方科技集团股份有限公司 | 生物片材固定装置 |
| CN110553889A (zh) * | 2019-09-18 | 2019-12-10 | 宋建华 | 自动染色机He染色工艺 |
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-
2016
- 2016-07-19 CN CN201610568530.5A patent/CN106092707A/zh active Pending
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20161109 |