CN106086078A - 一种car‑t细胞毒性指示载体 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞免疫治疗领域，具体涉及一种CAR‑T细胞毒性指示载体，该细胞毒性指示载体为一种重组慢病毒载体，由原始慢病毒载体和插入序列组成。插入序列从5’端到3’端依次为肿瘤相关靶抗原编码基因、连接肽编码基因和荧光素酶编码基因。当CAR‑T细胞与CAR‑T细胞毒性指示细胞混合后，指示细胞表达的肿瘤相关靶抗原能够靶向引导CAR‑T进行结合，并裂解指示细胞，释放荧光素酶。由于裂解细胞位于上清中，未裂解细胞位于沉淀中，因此通过检测上清和沉淀中的荧光素酶活力值，再根据指示细胞数目和荧光素酶活力值的关系，即可推算出裂解和未裂解细胞的数目，计算裂解细胞比例，指示CAR‑T细胞毒性。
Description
技术领域
本发明属于细胞免疫治疗领域，具体涉及一种CAR-T细胞毒性指示载体。
背景技术
CAR-T细胞指能够表达嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)的T细胞(CAR-T)，CAR由胞外抗原结合域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域组成。CAR-T细胞治疗技术是指通过将上述CAR结构在体外进行基因重组得到重组质粒再在体外将其导入到患者的T细胞内，从而获得能够表达上述嵌合抗原受体的CAR-T细胞，然后经过纯化和体外大规模扩增后，再将上述CAR-T细胞输回患者体内行使杀灭肿瘤细胞的功能。CAR-T疗法的优势在于：第一、其与肿瘤抗原的结合不需要依赖于HLA的呈递，有效避免了肿瘤细胞HLA表达下调这一免疫逃逸机制；第二、由于CAR-T治疗的基本原理是按照抗体针对抗原或一个特殊靶点的特异性结合，CAR结构中包括一个肿瘤相关胞外抗原结合域，因此CAR-T治疗是一种专一性的靶向治疗，相比较而言，相对传统的细胞免疫治疗诸如细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK，Cytokine Induced Killer Cell)和NK自然杀伤细胞(NK，Natural Killer Cell)多半都属于非靶向特异的；第三、CAR-T疗法能够在短时间内产生大量具有肿瘤杀伤效力的T细胞。因此，CAR-T疗法对肿瘤的治愈具备重要临床应用前景。
在医学研究和实际应用中，对CAR-T细胞毒性的指示或表征是一个不可避免的重要问题，如果不能更好地解决这一问题，CAR-T细胞治疗技术的研究和应用发展都将受到严重制约。然而，目前遍采用的方法是使用CAR-T杀伤离体培养的靶细胞，通过间接测定方法来检测其作用效果，从而得出实验结论；在目前常用的CAR-T细胞毒性测定方法中，在CAR-T细胞和靶细胞混合后，通常需要超过两天的培养期(如MTT比色法等)，因此所需检测时间相对较长。缺乏直接和高效的CAR-T细胞毒性检测方法成为了CAR-T细胞治疗技术研发和应用的一大障碍。
综上所述，开发一种直接高效的CAR-T细胞毒性检测工具和相应检测方法，是CAR-T细胞治疗技术的研发和应用过程中亟待解决的重要问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有CAR-T细胞治疗研发中缺乏直接高效的细胞毒性检测方法的不足，提供一种CAR-T细胞毒性指示载体。该指示载体为重组慢病毒载体，且含有CAR-T可识别的肿瘤相关靶抗原基因和荧光素酶基因，使用此载体包装慢病毒，筛选到CAR-T细胞毒性指示细胞的稳转细胞，该稳转细胞裂解后释放出荧光素酶，荧光素酶活力值和指示细胞数目相关。当CAR-T细胞与CAR-T细胞毒性指示细胞混合后，指示细胞表达的肿瘤相关靶抗原能够靶向引导CAR-T进行结合，并裂解指示细胞，释放荧光素酶。由于裂解细胞位于上清中，未裂解细胞位于沉淀中，因此通过检测上清和沉淀中的荧光素酶活力值，可得推算裂解和未裂解细胞的数目，计算裂解细胞比例，指示CAR-T细胞毒性。
一个方面，本发明提供了一种CAR-T细胞毒性指示载体，所述的CAR-T细胞毒性指示载体为一种重组慢病毒载体，所述的重组慢病毒载体由原始慢病毒载体和插入序列组成。
所述的原始慢病毒载体可以为Plent-EF1α-Blasticidin-CMV、Plent-EF1α-Puro-CMV或Plent-EF1α-Neo-CMV，优选为Plent-EF1α-Puro-CMV或Plent-EF1α-Neo-CMV，进一步优选为Plent-EF1α-Puro-CMV。
所述的插入序列从5’端到3’端依次为肿瘤相关靶抗原编码基因、2A肽编码基因和荧光素酶编码基因。
所述的肿瘤相关靶抗原优选为CD分子。所述的CD分子可以为CD3、CD20、CD19、CD22、CD33、CD70或CD123，优选为CD19、CD20或CD123，进一步优选为CD19。
所述的2A肽的功能是将肿瘤相关靶抗原编码基因和荧光素酶编码基因连接起来，使二者通过同一个启动子CMV表达，但最终形成两个不融合的蛋白，让二者分开行使各自功能。所述的2A肽可以为T2A、F2A或P2A；优选为F2A或P2A；进一步优选为P2A。
所述的P2A的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的P2A编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
所述的荧光素酶优选为Luciferase，但并不局限于Luciferase。
所述的Luciferase编码基因如SEQ ID NO：3所示。
另一个方面，本发明提供了一种CAR-T细胞毒性指示细胞，其特征在于：所述的CAR-T细胞毒性指示细胞中含有上述CAR-T细胞毒性指示载体；所述的CAR-T细胞毒性指示细胞是使用本发明所述的CAR-T细胞毒性指示载体装慢病毒并筛选到的稳转细胞株。
在一个优选的实施方案中，所述的CAR-T细胞毒性指示细胞为含有上述CAR-T细胞毒性指示载体的HEK293细胞。
再一个方面，本发明提供了一种利用上述CAR-T细胞毒性指示载体或CAR-T细胞毒性指示细胞进行CAR-T细胞毒性检测的方法，其特征在于：所述的检测方法包括以下步骤：
(1)包装CAR-T细胞毒性指示载体，获得病毒颗粒；
(2)使用步骤(1)获得的病毒颗粒感染细胞，获得CAR-T细胞毒性指示细胞的稳转细胞；
(3)检测步骤(2)得到的CAR-T细胞毒性指示细胞的稳转细胞的荧光素酶活力值，根据荧光素酶活力值和指示细胞数量的关系绘制标准曲线；
(4)将待检测的CAR-T细胞和步骤(2)得到的稳转细胞混合孵育后，分别收集上清和沉淀，检测上清和沉淀中的荧光素酶活力值，根据步骤(3)获得的标准曲线分别推算上清和沉淀中的细胞数目，按下式计算裂解细胞比例，指示CAR-T细胞毒性；
被裂解的细胞比例＝上清细胞数/(上清细胞数+沉淀细胞数)。
与现有技术相比，本发明提供的CAR-T细胞毒性指示载体、CAR-T细胞毒性指示细胞以及相应的CAR-T细胞毒性检测方法更加直接、高效、快速、稳定。本发明提供的CAR-T细胞毒性指示载体使用慢病毒载体作为原始载体，可根据具体需要使用原核宿主进行大规模制备或使用真核细胞构建指示细胞，工业化生产前景优异。众所周知，不同类型的肿瘤细胞合成的肿瘤相关靶抗原的种类和数量不同，本发明提供的CAR-T细胞毒性指示载体可根据具体需要装载不同的肿瘤相关靶抗原编码基因，用于检测针对不同类型肿瘤的CAR-T细胞毒性，灵活性和特异性更加优异。利用本发明提供的CAR-T细胞毒性指示细胞的稳转细胞株只需三步即可获得实验结果，实现对CAR-T细胞毒性情况的分析；在将CAR-T细胞和靶细胞(即本发明提供的稳转细胞)混合后，仅需10-18左右小时即可进行测定，比常规方法的相应步骤所需时间缩短2倍以上；并且检测稳定性高，多次平行检测结果间无明显差异。
附图说明
图1为实施例3中的CD19单克隆抗体免疫荧光染色结果。
图2为实施例4步骤(1)获得的标准曲线。
图3为实施例4中裂解细胞比例的柱状图。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
术语：
在本发明中，术语“CD19-P2A-Luciferase”指从5’端到3’端依次为CD19编码基因、P2A编码基因和Luciferase编码基因的核苷酸序列，其中CD19的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，P2A编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，Luciferase编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；术语“Plent-EF1α-Puro-CMV-CD19-P2A-Luciferase”指插入了CD19-P2A-Luciferase序列的Plent-EF1α-Puro-CMV慢病毒载体；术语“ddH2O”指双蒸水；术语“FBS”指胎牛血清；术语“PEI”指聚乙烯亚胺。
本发明中，Plent-EF1α-Puro-CMV载体、助感染试剂ADV-HR购自维真生物科技有限公司；限制性内切酶Asis I和MluI、T4DNA连接酶购自NEB公司；DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；发光检测仪、Nano-GloTM荧光素酶检测试剂盒，购自Promega公司；K562细胞和HEK293T细胞购自ATCC公司；DMEM培养基购自Hyclone公司；PMD2G质粒和PSPAX2质粒购自Invitrogen公司；裂解液为Nano-Luciferase Assay，购自Promega公司。
核苷酸序列合成委托金斯瑞生物科技有限公司完成。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
实施例1构建CAR-T细胞毒性指示载体
(1)合成CD19-P2A-Luciferase序列，并在上下游分别引入Asis I和MluI酶切位点；
(2)酶切Plent-EF1α-Puro-CMV载体和步骤(1)得到的含有Asis I和MluI酶切位点的CD19-P2ALuciferase序列，酶切体系如下：
加样加样混匀后置于37℃酶切3h，反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切酶切后的CD19-P2A-Nanoluc Luciferase序列和Plent-EF1α-Puro-CMV载体，并用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后的CD19-P2A-Luciferase序列和Plent-EF1α-Puro-CMV载体；
(3)将Asis I和MluI酶切后的CD19-P2A-Luciferase序列和Plent-EF1α-Puro-CMV载体于22℃连接2小时，连接体系如下，
连接产物采用化学法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，使用含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上进行涂布培养，挑取单菌落培养后提取质粒进行酶切和测序验证序列准确性，得到CAR-T细胞毒性指示载体Plent-EF1α-Puro-CMV-CD19-P2A-Luciferase。
实施例2包装慢病毒
(1)将细胞生长量为10cm培养盘最大负载量的90％以上的HEK293T细胞按1：3的比例传至10cm细胞培养盘(每盘细胞数约为2.5×106)，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；获得待转染细胞；1:3的比例指1个10cm培养盘的细胞，平均传代到三个同样的培养盘里；
(2)转染前换液，对步骤(1)获得的待转染细胞用电动移液器更换5ml含10％FBS的DMEM培养基，获得转染前细胞；
按下表配制转染试剂：
将试剂1和2分别配置好，室温放置5-10分钟后；将试剂1和2混合均匀，室温放置15-30分钟后，得到试剂3；将试剂3逐滴加入转染前细胞中，操作保持稳定，使转染体系均匀分布于10cm细胞培养盘，然后置于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时后，用电动移液器更换5ml含10％FBS的DMEM培养基；48小时后，收取转染体系上清培养基，将上清培养基过0.22μm滤膜后，超速离心滤液，弃上清，将沉淀重悬于1ml TBS缓冲液中，获得慢病毒颗粒。
实施例3制备CAR-T细胞毒性指示细胞
感染实验按照本领域技术人员已知的常规方法进行，简述感染步骤如下：
(1)慢病毒感染
在6孔板中，使用助感染试剂ADV-HR和实施例2所得的慢病毒颗粒感染K562细胞，按照感染复数为MOI＝10计算慢病毒颗粒用量，感染过程中每隔一天用DMEM培养基对细胞进行换液，维持细胞浓度在0.5-2×106/mL。
(2)抗性筛选
感染72小时后，开始进行抗性筛选：
使用浓度为2μg/mL的嘌呤霉素经过14天筛选，获得具有嘌呤霉素抗性的多克隆细胞株，使用浓度为2μg/mL的嘌呤霉素进一步筛选得到单克隆细胞株，对单克隆细胞株进行CD19单克隆抗体免疫荧光染色法进行鉴定，染色结果如图1所示，显示单克隆细胞株CD19表达阳性率100％，将CD19表达为阳性的单克隆细胞株转盘并冻存，得到CAR-T细胞毒性指示细胞HEK-CD19-nanoluc。
实施例4CAR-T细胞毒性的检测
(1)按照10、100、1000、10000和100000的细胞数目取实施例3所得的指示细胞HEK-CD19-nanoluc，分别于100μL裂解液中裂解30分钟，使用Nano-GloTM荧光素酶检测试剂盒和发光检测仪检测各个裂解液中的荧光素酶活力值，测定结果如下表所示，以指示细胞数目对荧光素酶活力值作图，得到如图2所示的标准曲线。
| 指示细胞数目D | D10 | D100 | D1000 | D10000 | D100000 |
| 荧光素酶活力值 | 681 | 8554 | 85870 | 975411 | 31931660 |
(2)将待测CART-19效应细胞与实施例3所得的指示细胞HEK-CD19-nanoluc按照细胞数目比CART-19：HEK-CD19-nanoluc分别为10：1、2：1、和1：2混合，孵育18小时后，2000rcf离心5min，分别收集上清和沉淀，使用Nano-GloTM荧光素酶检测试剂盒和发光检测仪检测上清和沉淀中的荧光素酶活力值，利用步骤(1)所得的标准曲线，推算上清和沉淀中的细胞数目，按照下式计算被裂解的细胞比例，裂解细胞比例结果如图3所示。
被裂解的细胞比例＝上清细胞数/(上清细胞数+沉淀细胞数)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110>宜明细胞生物科技有限公司
<120>一种CAR-T细胞毒性指示载体
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> PRT
<213>人工序列
<400> 1
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 2
<211> 66
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60
ggacct 66
<210> 3
<211> 516
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 3
atggtcttca cactcgaaga tttcgttggg gactggcgac agacagccgg ctacaacctg 60
gaccaagtcc ttgaacaggg aggtgtgtcc agtttgtttc agaatctcgg ggtgtccgta 120
actccgatcc aaaggattgt cctgagcggt gaaaatgggc tgaagatcga catccatgtc 180
atcatcccgt atgaaggtct gagcggcgac caaatgggcc agatcgaaaa aatttttaag 240
gtggtgtacc ctgtggatga tcatcacttt aaggtgatcc tgcactatgg cacactggta 300
atcgacgggg ttacgccgaa catgatcgac tatttcggac ggccgtatga aggcatcgcc 360
gtgttcgacg gcaaaaagat cactgtaaca gggaccctgt ggaacggcaa caaaattatc 420
gacgagcgcc tgatcaaccc cgacggctcc ctgctgttcc gagtaaccat caacggagtg 480
accggctggc ggctgtgcga acgcattctg gcgtaa 516
<210> 4
<211> 1671
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 4
atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60
gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataacg ctgtgctgca gtgcctcaag 120
gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 180
ttcttaaaac tcagcctggg gctgccaggc ctgggaatcc acatgaggcc cctggccatc 240
tggcttttca tcttcaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 300
cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 360
ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc 420
tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc 480
aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag cctccgtgtc tcccaccgag ggacagcctg 540
aaccagagcc tcagccagga cctcaccatg gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt 600
ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag 660
gggcctaagt cattgctgag cctagagctg aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg 720
gtaatggaga cgggtctgtt gttgccccgg gccacagctc aagacgctgg aaagtattat 780
tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc cacctggaga tcactgctcg gccagtacta 840
tggcactggc tgctgaggac tggtggctgg aaggtctcag ctgtgacttt ggcttatctg 900
atcttctgcc tgtgttccct tgtgggcatt cttcatcttc aaagagccct ggtcctgagg 960
aggaaaagaa agcgaatgac tgaccccacc aggagattct tcaaagtgac gcctccccca 1020
ggaagcgggc cccagaacca gtacgggaac gtgctgtctc tccccacacc cacctcaggc 1080
ctcggacgcg cccagcgttg ggccgcaggc ctggggggca ctgccccgtc ttatggaaac 1140
ccgagcagcg acgtccaggc ggatggagcc ttggggtccc ggagcccgcc gggagtgggc 1200
ccagaagaag aggaagggga gggctatgag gaacctgaca gtgaggagga ctccgagttc 1260
tatgagaacg actccaacct tgggcaggac cagctctccc aggatggcag cggctacgag 1320
aaccctgagg atgagcccct gggtcctgag gatgaagact ccttctccaa cgctgagtct 1380
tatgagaacg aggatgaaga gctgacccag ccggtcgcca ggacaatgga cttcctgagc 1440
cctcatgggt cagcctggga ccccagccgg gaagcaacct ccctggcagg gtcccagtcc 1500
tatgaggata tgagaggaat cctgtatgca gccccccagc tccgctccat tcggggccag 1560
cctggaccca atcatgagga agatgcagac tcttatgaga acatggataa tcccgatggg 1620
ccagacccag cctggggagg agggggccgc atgggcacct ggagcaccag g 1671
Claims (10)
1.一种CAR-T细胞毒性指示载体，其特征在于：所述的指示载体为一种重组慢病毒载体，所述的重组慢病毒载体由原始慢病毒载体和插入序列组成。
2.如权利要求1所述的CAR-T细胞毒性指示载体，其特征在于：所述的原始慢病毒载体为Plent-EF1α-Blasticidin-CMV、Plent-EF1α-Puro-CMV或Plent-EF1α-Neo-CMV。
3.如权利要求1所述的CAR-T细胞毒性指示载体，其特征在于：所述的插入序列从5’端到3’端依次为肿瘤相关靶抗原编码基因、2A肽编码基因和荧光素酶编码基因。
4.如权利要求3所述的CAR-T细胞毒性指示载体，其特征在于：所述的肿瘤相关靶抗原为CD分子；所述的CD分子为CD3、CD20、CD19、CD22、CD33或CD70；优选为CD19、CD20或CD123。
5.如权利要求3所述的CAR-T细胞毒性指示载体，其特征在于：所述的2A肽为T2A、F2A或P2A；优选为F2A或P2A。
6.一种CAR-T细胞毒性指示细胞，其特征在于：所述的指示细胞中含有权利要求1-5任意一项所述的CAR-T细胞毒性指示载体。
7.一种CAR-T细胞毒性检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包含权利要求1-5任意一项所述的CAR-T细胞毒性指示载体。
8.一种CAR-T细胞毒性检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包含权利要求6所述的CAR-T细胞毒性指示细胞。
9.权利要求6所述的CAR-T细胞毒性指示细胞在制备CAR-T细胞毒性检测试剂中的应用。
10.一种利用权利要求1-5任意一项所述的CAR-T细胞毒性指示载体进行CAR-T细胞毒性检测的方法，其特征在于：所述的检测方法包括以下步骤：
(1)包装CAR-T细胞毒性指示载体，获得病毒颗粒；
(2)使用步骤(1)获得的病毒颗粒感染细胞，获得CAR-T细胞毒性指示细胞的稳转细胞；
(3)检测步骤(2)得到的CAR-T细胞毒性指示细胞的稳转细胞的荧光素酶活力值，根据荧光素酶活力值和指示细胞数量的关系绘制标准曲线；
(4)将待检测的CAR-T细胞和步骤(2)得到的稳转细胞混合孵育后，分别收集上清和沉淀，检测上清和沉淀中的荧光素酶活力值，根据步骤(3)获得的标准曲线分别推算上清和沉淀中的细胞数目，按下式计算裂解细胞比例，指示CAR-T细胞毒性；
被裂解的细胞比例＝上清细胞数/(上清细胞数+沉淀细胞数)。
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