CN106061937B

CN106061937B - 新大麻萜酚衍生物

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Publication number: CN106061937B
Application number: CN201580010458.8A
Authority: CN
Inventors: 乔瓦尼·阿彭迪诺; 玛丽亚·卢斯·贝利多卡韦略德阿尔瓦; 爱德华多·穆尼奥斯布兰科
Original assignee: Vivacell Biotechnology Espana SL
Current assignee: Vivacell Biotechnology Espana SL
Priority date: 2014-02-27
Filing date: 2015-02-12
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2035-02-12
Also published as: EP2913321A1; EP2913321B1; BR112016019891A2; US20170247308A1; CA2937275A1; KR102422492B1; MX2016010952A; JP2017513810A; MX358084B; BR112016019891B1; RU2684913C2; AU2015222384B2; IL247149A0; AU2015222384A1; ES2894760T3; US9802880B2; IL247149B; DK2913321T3; RU2016132415A3; RU2016132415A

Abstract

本发明涉及式(I)的新大麻萜酚醌衍生物，其中R是由以下表示的直链或支链基团的碳原子：芳基、烯基、炔基或烷氧羰基(alcoxycarbonil)；或其中R是由以下表示的直链或支链基团的氮原子：烷基氨基、芳基氨基、烯基氨基或炔基氨基；或，备选地，R表示形成二聚体的2个式(I)的分子之间的键。本发明还涉及式(I)的化合物中的任一种，由于它们的缺少亲电子(Nrf2活化)和细胞毒活性的高PPARg激动作用，作为药物在治疗中的用途，特别是用于治疗PPARg‑相关疾病的用途。本发明还提供包含所述化合物的药物组合物，和用所述化合物治疗疾病的方法。

Description

新大麻萜酚衍生物

发明领域

本发明涉及新大麻萜酚醌衍生物，和那些化合物的合成。此外，本发明涉及它们作为药物和在治疗中，特别是作为过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARg)调节剂，用于治疗响应于PPARg调节的疾病和病症的用途。本发明还提供包含所述化合物的药物组合物和利用所述化合物治疗疾病的方法。

发明背景

核受体(NR)是药物发现的主要靶标。NR是配体依赖性的转录因子，其具有直接与调节它们的靶向基因的转录活性的DNA相互作用的能力。这些受体在发育、细胞稳态和代谢中发挥重要作用。此外，NR牵涉到各种各样的疾病中，由此是制药产业的药物开发工作的焦点。

在对于核受体的最新命名中，过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)，核亚族1C(NR1C)包含三个亚型的哺乳动物PPARs：PPARα(也称为NR1C1)，PPARβ/δ(也称为NR1C2)和PPARγ(也称为PPARg，格列酮(glitazone)受体或NR1C3)。

PPAR控制参与脂肪形成、脂代谢、炎症和代谢稳态维持的基因网络的表达[Barish等人，2006]。那些核受体通过结合DNA序列的元件(称为过氧化物酶体增殖物响应元件(PPRE)，以与类视黄醇X受体(称为RXR)的异二聚体的形式)激活转录。

类似于典型的核受体，PPAR包含不同的功能结构域，包括N-末端反式激活结构域(AF1)，高度保守的DNA-结合结构域(DBD)和含有配体-依赖性反式激活功能(AF2)的C-末端配体-结合结构域(LBD)[Poulsen等人，2012]。由两个锌指构成的DNA-结合C结构域，结合PPAR靶基因的调节区中的过氧化物酶体增殖物响应元件(PPRE)。

PPAR通过拮抗激活蛋白-1(AP-1)、核因子-κB(NF-kB)、信号转换剂和转录3(STAT3)和激活的T-细胞的核因子(NFAT)信号通路的激活剂，负调节炎性反应基因的转录[Vanden Berghe等人2003]。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARg)得到特别关注，因为其参与脂肪细胞形成、胰岛素敏感性和炎症的调节[Fievet等人2006][Stienstra等人2007][Tontonoz和Spiegelman，2008]。该核受体在一些组织中表达，包括脂肪组织、骨骼肌细胞、破骨细胞、成骨细胞、多种免疫类型细胞，和在脑和周围神经系统中。

明确的是，PPARg是脂肪形成的占优势的或“主要的”调节剂，因为对于脂肪分化是充分和必要的。大量在脂肪生成和胰岛素敏感性中发挥重要作用的基因的调节区域含有对于PPARg的结合位点，包括aP2、LPL、脂连蛋白和Glut4[Rosen和MacDougald，2006]。因此，脂肪细胞中PPARg的激活影响全身胰岛素敏感性。

另一方面，PPARg的激活通过抑制促炎性基因的表达在多个细胞类型中发挥抗炎活性，从而降低细胞因子、金属蛋白酶和急性期蛋白的产生[Tontonoz和Spiegelman，2008]。其还作用以增加抗炎性细胞因子，并抑制诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达[Széles等人，2007]。

PPARg被认为通过其引导免疫细胞向抗炎性表型分化的能力在免疫应答中发挥根本性的重要作用[Tontonoz和Spiegelman，2008]。有趣的是，PPARg激动剂在帕金森病(Parkinson’s diseases)、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)、多发性硬化(multiple sclerosis)和卒中的几个实验模型中，以及在一些临床研究中显示抗炎性和神经保护作用[Bernardo和Minghetti，2008]。此外，PPARg在遗传的意义上必须正式地被认为是肿瘤抑制剂。其在多种肿瘤细胞中表达，并且配体导致的PPARg活化导致抑制细胞增殖或引起凋亡[Tachibana等人，2008][Tontonoz和Spiegelman，2008]。

PPARg活化的有益作用可以用于治疗多种PPARg介导的疾病，如表1中所示。为了本说明书的目的，PPARg介导的疾病意为观察到的任何病理效果，所述效果可能由于正常非病理状况中PPARg功能的改变造成。该表总结了PPAR在炎性疾病、癌症疾病和其他疾病中的作用。

表1

缩写：↓抑制，↑刺激，肝星形细胞(HSC)，血管平滑肌细胞(VSMC)，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，T-辅助细胞(Th)，肿瘤坏死因子-α(TNFα)，环氧合酶(COX)，干扰素-γ(INFγ)，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，细胞间粘附分子-1(ICAM-1)[改自Kostadinova等人，2005]。

核因子(红细胞来源的2)-样2，也称为NFE2L2或(Nrf2)，是在人中由NFE2L2基因编码的转录因子。Nrf2抗氧化反应通路是针对氧化应激的细胞毒作用的主要细胞防御。在其他作用中，Nrf2增加多种抗氧化酶的表达。

Keap1-Nrf2通路是对活性氧类别(ROS)和亲电子试剂引起的内源和外源应激的细胞保护性反应的主要调节剂。该通路内的关键信号转导蛋白是转录因子Nrf2，其与小Maf蛋白一起结合靶基因的调节区中的抗氧化剂响应元件(ARE)。在基础条件下，Nrf2-依赖性转录被负性调节剂，Keap1(Kelch ECH相关蛋白1)抑制。当细胞暴露于氧化应激、亲电子试剂或化学保护剂时，Nrf2逃脱Keap1-介导的抑制并激活抗氧化剂响应元件(ARE)-依赖性基因表达，以维持细胞的氧化还原平衡。

因为该Nrf2-依赖性细胞防御反应能够保护多个器官或多个组织，所以Nrf2的激活牵涉针对很多人疾病的保护的赋予，所述疾病包括癌症、神经变性疾病、心血管疾病、急性和慢性肺损伤、自身免疫疾病和炎症。

Nrf2可以通过增加很多细胞保护性基因的表达，保护细胞和组织免受多种毒剂和致癌物影响。正如Nrf2保护正常细胞，研究表明，Nrf2还可以保护癌症细胞免受化疗剂影响，并且促进癌症进展[Na和Surh 2013]。

癌细胞幸免于持续内源性氧应激(oxystress)或活性氧类别(ROS)-引起的细胞应激，并且变得对某些通过ROS产生发挥细胞毒性的抗癌剂有抗性。在这样的情况下，活性Nrf2通路可能通过将ROS水平维持在促进它们的生长和存活的范围内来维持癌症细胞中有利的氧化还原平衡。猜测Nrf2的持续积累或激活赋予一个亚类的恶化前的细胞或癌细胞有利的环境，以增殖、逃避凋亡、转移和耐受治疗干预。

已知抑制Nrf2过表达逆转癌症细胞的表型特性，对该猜测予以支持[Sporn和Liby，2012]。已经在很多种类型的恶性肿瘤中观察到组成型过度激活Nrf2，所述恶性肿瘤如鳞状细胞癌、肺癌、乳腺癌、胆囊癌、前列腺癌、肾癌、室管膜瘤(ependymomas)、卵巢上皮癌、子宫内膜癌、和胰腺癌[Na和Surh，2013]。在其肿瘤中具有组成型升高水平的Nrf2表达的癌症患者，通常显示较低的存活率[Solis等人，2010]。因此，Nrf2被认为是用于确定癌症进展的状态的预后分子标志物，并且促进内在的和获得的化学抗性。因此，该抗氧化剂转录因子也可以用作原癌基因并且增强的Nrf2活性促进实体癌症的形成和化学抗性[Sporn和Liby，2012]。

CBG-Q(化合物I)，本发明的CBG-Q化学衍生物(化合物II至XII)的前体，对PPARg产生活化作用。然而，CBG-Q还诱导Nfr2的活化(参见比较实施例4和图4)，其随着肿瘤变得对化疗剂有抗性，导致不希望的副作用，并且用Nrf2-激活剂治疗可以导致致癌作用，如上文解释的。因此，本发明的新的CBG衍生物，提供了更有效地针对癌症的备选治疗，因为不存在当体外施用CBG时观察到的，由于Nrf2过表达导致的诱导的化疗抗性的副作用。

在PPARg配体的激活剂中，噻唑烷二酮(TZDs)是临床上最重要的[Lehmann等人，1995]。由于此原因，迄今在临床实践上主要使用罗格列酮(rosiglitazone)和吡格列酮(pioglitazone)。它们对血糖控制提供类似的作用，以及一些类似的副作用，如重量的增加、液体潴留和增加的心力衰竭的风险，这似乎是PPARg介导的。有趣的是，那些噻唑啉在对脂和心血管安全特性方面的作用不同，表示PPARg-不依赖的机制。实际上，由于增加的2型糖尿病患者中的心血管事件的风险，罗格列酮近期在欧洲被召回并且其使用在美国已经受限。

尽管TZD是潜在的PPARg完全激动剂(PPARg-fa)，它们的基于机制的副作用限制了那些化合物的充分治疗潜力[Gelman等人，2007][Ciudin等人，2012]。但PPARg通路的生理和治疗相关性促进了新的研究以开发更新类型的减少或缓解副作用的分子[Ahmadian等人，2013]。因此，已经在作为PPARg-fa的更安全备选方案的选择性PPARg调节剂(PPARg-m)的发现和开发中获得很多进展。临床前和临床研究结果明确表明，选择性PPARg-m具有成为下一代PPARg激动剂的可能：与PPARg-fa相比具有优越安全特性的有效胰岛素敏化剂。[Doshi等人2010]。

在此意义上，天然和合成的大麻素被认为是通过活化PPARg缓解炎性过程的PPARg-m。基于大麻素的PPARg-m的一些实例是ajulemic酸[Liu等人，2003]，[BursteinS.2005]，WIN55212-2[Sun和Bennett，2007]，⁹Δ-THC和CBD[O'Sullivan 2007]，以及CBG和衍生物[Granja等人，2012]。

通过小分子对可成药蛋白共价修饰的临床相关性在过去数年由制药产业广泛争论，并且有时共价修饰构成成功药物的活性的基础[Singh等人，2011]。尽管如此，仍然存在对共价药物的根深蒂固的偏见，而不考虑它们最终结合生物分子的机制。醌表示一类毒物学中间体，其可以在体内产生多种有害作用，包括急性细胞毒作用和免疫毒作用[Bolton等人，2000]。醌引起这些作用的机制可以很复杂。醌是Michael受体，并且细胞损伤可以通过烷基化关键细胞蛋白和/或DNA发生。备选地，醌是高度氧化还原活性的分子，其可以与其半醌自由基进行氧化还原循环，导致形成活性氧类别(ROS)，其可以通过形成氧化的细胞大分子，包括脂、蛋白和DNA引起细胞内严重的氧化应急[Monks和Jones，2012]。尽管存在很多基于醌的化合物的治疗用途的实例，但是关于非特异毒性和选择性的缺失有顾虑，Michael受体基序很少通过在药物线索中设计而引入。

基于醌的治疗性化合物的一个实例是专利WO2011117429中的报道，其描述了大麻萜酚羟基-醌(在前述国际专利申请中也称为CBG-Q或VCE-003，并且为了本说明书目的，也称为化合物I)的合成及其在响应于PPARg调节的疾病和病症中的用途。WO/2011/117429中提到的疾病是：动脉粥样硬化、炎性肠病、类风湿性关节炎、肝纤维化、肾病、银屑病、皮肤伤口愈合、皮肤再生、胰腺炎(pancreatitis)、胃炎、神经变性疾病、癌症；高血压、高甘油三酯血症(hypertrigliceridemia)、高胆固醇血症(hypercholesterolemia)、肥胖和II型糖尿病。大麻萜酚分子中醌基序的引入增加其结合PPARg的亲和力并且增加其转录活性。

进一步的研究表明，大麻萜酚羟基醌(CBG-Q或化合物I)也激活转录因子Nrf2，一种氧化/亲电子应激的细胞传感器。因此，在大麻萜酚中引入醌基序导致两种独立的活性，如PPARg激动剂和Nrf2激活剂展现的那些。

为了仅改善PPARg激动活性，但不诱导Nrf2的活化，为了避免引起对化疗的抗性，本发明从作为模板的大麻萜酚羟基醌开始，开发了新化合物库，并且我们出人意料地发现，位置2上的特定修饰造成新化合物，由于其缺乏亲电子活性(Nrf2活化)和细胞毒活性的高PPARg激动作用而适于治疗PPARg-相关疾病。

本发明的那些大麻萜酚羟基-醌衍生物不同于WO20011117429中描述的化合物，因为位置2的修饰赋予本发明的化合物激活PPARg和保护免受谷氨酸(glutamate)-诱导的细胞毒性的能力。与现有技术中包含的CBG-Q(化合物I)相比，这些化合物还在神经元来源的细胞系中显示显著低的细胞毒性。此外，该化合物的衍生物在广泛用于评价PPARg激动剂的临床效力的疾病(多发性硬化、帕金森病和亨廷顿病)的动物模型中显示治疗效率。

发明概述

背离现有技术，本发明的问题是提供大麻萜酚羟基-醌衍生物，其在调节PPARg而不引起Nrf2活化方面呈现活性。

本发明的化合物还包含其类似物、衍生物、互变异构形式、异构体、立体异构体、多晶型物、药用盐、药用溶剂化物和含有其的组合物。

为了本发明的目的，术语“一种/多种类似物”是指与式(I)的化合物结构上衍生的或同源的任意实体。

在本发明的情况下，式(I)的化合物的“一种/多种类似物”应该解释为任何CBG-Q类似物，其总是在位置2被取代并且显示与在位置2中的该取代相关的药物性质，如本文所述，但还在CBG-Q分子的不同于所述式(I)中所示的基团的其他位置中具有结构部分替代。

术语“互变异构体”是通过化学反应容易互变的有机化合物的结构异构体(互变异构)。

术语"异构体"或"立体异构体"是指这样的化合物，其具有相同的化学结构，但关于原子或基团的空间排列是不同的。

如本文使用的"多晶型物"是指具有相同化学组成，但形成晶体的分子、原子和/或离子的空间排列不同的晶体。

术语"药用盐"是指任意这样的药用盐，其在施用给患者后能够(直接或间接地)提供如本文中所述的化合物。这样的盐优选为与生理学可接受的有机或无机酸的酸加成盐。酸加成盐的实例包括无机酸加成盐如，例如，盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐，和有机酸加成盐如，例如，乙酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐和对甲苯磺酸盐。碱加成盐的实例包括无机盐如，例如，钠盐、钾盐、钙盐和铵盐，和有机碱盐如，例如，乙二胺盐、乙醇胺盐、N,N-二亚烷基乙醇胺盐、三乙醇胺盐和碱性氨基酸盐。然而，将理解，非药用盐也落在本发明的范围内，因为那些可以在药用盐的制备中有用。盐形成的步骤在本领域中是常规的。

根据本发明，术语"溶剂化物"应该理解为意为根据本发明的任何形式的活性化合物，其中所述化合物通过非共价键与另一分子(通常是极性溶剂)键合，特别包括水合物和醇合物。

更具体地，在本发明中，化合物是式(I)的大麻萜酚-羟基-醌衍生物(CBG-Q衍生物)的衍生物：

其中R是由以下表示的基团的碳原子：芳基、直链或支链烯基、直链或支链炔基或直链或支链烷氧羰基基团；或其中R是由以下表示的基团的氮原子：直链或支链烷基氨基、芳基氨基、直链或支链烯基氨基或直链或支链炔基氨基；或，备选地，R表示形成二聚体的2个式(I)的分子之间的键。在优选的实施方案中，本发明的化合物是式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(X)、(XI)和(XII)的那些。

6-(3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-5-羟基-3-戊基-2-甲氧基羰基-[1,4]苯醌。

6-(3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-5-羟基-3-戊基-2-乙基氨基-[1,4]苯醌。

6-(3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-5-羟基-3-戊基-2-戊基氨基-[1,4]苯醌。

6-(3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-5-羟基-3-戊基-2-异丁基氨基[1,4]苯醌。

6-(3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-5-羟基-3-戊基-2-丁基氨基[1,4]苯醌。

6-(3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-5-羟基-3-戊基-2-甲基氨基-[1,4]苯醌。

6-(3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-5-羟基-3-戊基-2-异丙基氨基-[1,4]苯醌。

6-(3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-5-羟基-3-戊基-2-苄基氨基[1,4]苯醌

6-(3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-5-羟基-3-戊基-2-(2,2-二甲基-丙基氨基)-[1,4]苯醌。

6-(3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-5-羟基-3-戊基-2-(3-甲基-丁基氨基)-[1,4]苯醌。

3,3'-双((E)-3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-4,4'-二羟基-6,6'-二戊基-1,1'-二(环己-3,6-二烯)-2,2',5,5'-四酮

如将从以下实施例和附图推出的，通式I中包含的位置2的修饰赋予本发明的化合物激活PPARg并保护免受谷氨酸-诱导的细胞毒性的能力。与现有技术中包含的CBG-Q(化合物I)相比，这些化合物还在神经元来源的细胞系中显示显著较低的细胞毒性。此外，化合物III和XII)，如从该系列表示的，在广泛使用以评价PPARg激动剂的临床效力的疾病(多发性硬化、帕金森病和亨廷顿病)的动物模型中显示疗效。

CBG-Q(化合物I)，是本发明的式I的所有衍生物(以化合物II至XII为例)的前体。CBG-Q前体可以通过取代一些特定自由基从天然大麻素如CBG(大麻萜酚)和CBGA(大麻萜酚酸)开始初始合成。

对大麻萜酚羟基醌衍生物的引用将理解为还包括这样的化合物的药用盐。术语"药用盐"是指从药用碱或酸制备的盐或酯，包括无机碱或酸和有机碱或酸，如任何本领域技术人员公知的。

本发明的进一步的实施方案涉及使用式(I)的化合物或其衍生物作为药物，特别是作为不诱导Nfr2活化的PPARg受体的PPARg激动剂，特别是在疾病如动脉粥样硬化、炎性肠病、类风湿性关节炎、肝纤维化、肾病、银屑病、皮肤伤口愈合、皮肤再生、胰腺炎、胃炎、神经变性疾病、神经炎性疾病、硬皮病、癌症、高血压、肥胖、II型糖尿病、和可以用PPARg激动剂治疗的其他疾病的治疗中。

本发明的其他实施方案是指式(I)的化合物用于制造用于治疗PPRAg相关疾病的、具有较低细胞毒性的组合物的用途，所述疾病如动脉粥样硬化、炎性肠病、类风湿性关节炎、肝纤维化、肾病、银屑病、皮肤伤口愈合、皮肤再生、胰腺炎、胃炎、神经变性疾病、神经炎性疾病、硬皮病、癌症、高血压、肥胖、II型糖尿病、和可以用PPARg激动剂治疗的其他疾病。

本发明的备选实施方案是指上述式(I)的化合物或衍生物，单独或配制在组合物中，特别是药物组合物中的用途，所述组合物包含与具有加和或协同的生物活性的至少另一种活性化合物组合的至少一种本发明的化合物。备选地，所述组合物可以与至少一种作为载体或赋形剂的惰性成分配制，所述惰性成分如：共溶剂、表面活性剂、油、湿润剂、润滑剂、防腐剂、稳定剂和抗氧化剂。可以使用任何药理学可接受的缓冲液，例如，TRIS或磷酸盐缓冲液。

为了本说明书的目的，术语“活性化合物或活性成分”应为被认为是同义的，并且意为当施用给人或动物时发挥疗效的化学实体。

典型的组合物包括本发明的化合物，或其衍生物，其与药用赋形剂相关联，作为实例，所述药物赋形剂可以是载体或稀释剂。这样的组合物可以是胶囊、小袋、纸张或其他容器的形式。在制备组合物的过程中，可以使用制备药物组合物的常规技术。例如，目的化合物通常与载体混合，或用载体稀释，或装入载体内，所述载体是安瓿、胶囊、小袋、纸张或其他容器。当载体用作稀释剂时，其可以是用作媒介物、赋形剂或用于活性化合物的介质的固体、半固体或液体。目标化合物可以吸附在颗粒固体容器例如小袋中。合适的载体的一些实例是水、盐溶液、醇、聚乙二醇、多羟基乙氧基化的蓖麻油、花生油、橄榄油、乳糖、白土、蔗糖、环糊精、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸或纤维素的低级烷基醚、硅酸、脂肪酸、脂肪酸胺、脂肪酸单甘油脂和二甘油酯、戊赤藓醇脂肪酸酯、聚氧乙烯、羟基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。类似地，载体或稀释剂可以包括任何本领域已知的任何持续释放材料，如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，其单独或与蜡混合。制剂还可以包括湿润剂、乳化剂和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或调味剂。可以配制本发明的制剂，从而在通过使用本领域中公知的步骤施用给患者后提供快速、持续或延迟的活性成分释放。

可以将药物组合物灭菌，并且如果需要，与辅助剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂和/或着色物质等混合，其不与活性化合物有害反应。

组合物可以用于治疗疾病如动脉粥样硬化、炎性肠病、类风湿性关节炎、肝纤维化、肾病、银屑病、皮肤伤口愈合、皮肤再生、胰腺炎、胃炎、神经变性疾病、神经炎性疾病、硬皮病、癌症、高血压、肥胖、II型糖尿病、和可以用PPARg激动剂治疗的其他疾病。

本发明的一个优选的实施方案涉及施用途径，其可以是有效转运目的化合物至适当的或所需的作用位点的任何途径，如口服、经鼻、局部、肺的、经皮或肠胃外，例如直肠、皮下、静脉内、鞘内、肌肉内、鼻内、眼用溶液或软膏。

为了鼻施用，所述制剂可以含有溶解或悬浮在液体载体，特别是水性载体中的化合物，用于气溶胶应用。载体可以含有添加剂如增溶剂，例如丙二醇、表面活性剂、吸收促进剂如卵磷脂(磷脂酰胆碱)，或环糊精，或防腐剂如尼泊金酯。

为了制备局部制剂，将目的化合物置于本领域中已知的皮肤媒介物中。要施用的目的化合物的量和局部制剂中化合物的浓度取决于媒介物、选择的递送系统或装置、患者的临床状况、制剂中化合物的副作用和稳定性。因此，医生使用含有适当浓度的目的化合物的适当的制剂，并且选择要施用的制剂的量，这取决于讨论的患者或类似的患者的经验。

为了眼用，将目的化合物配制为适于在眼中使用的溶液、悬浮液和软膏。浓度通常如上文对于局部制剂讨论的。

为了口服施用，可以制备固体或液体单位剂型。为了制备固体组合物如片剂，将目的化合物与作为药物稀释剂或载体的常规成分如滑石、硬脂酸镁、磷酸二钙、硅酸镁铝、硫酸钙、淀粉、乳糖、阿拉伯胶、甲基纤维素，和功能类似的材料混合入制剂。

胶囊通过将目的化合物与惰性药物稀释剂混合并且将混合物装入适当尺寸的硬明胶胶囊中来制备。软明胶胶囊通过将目的化合物与可接受的植物油、轻液体矿脂或其他惰性油的浆液机械封装入胶囊制备。可以制备用于口服施用的液体单位剂型如糖浆、酏剂和悬浮液。水溶形式可以与糖、芳香调味剂和防腐剂一起溶解在水性媒介物中以形成糖浆。酏剂通过使用水醇的(例如，乙醇)媒介物与合适的甜味剂如糖和糊精，连同芳香调味剂制备。悬浮液可以利用水性媒介物，在悬浮剂如阿拉伯胶、黄芪胶、甲基纤维素等的帮助下制备。

用于肠胃外使用的适当的制剂对于普通技术人员来说是明显的，如合适的可注射溶液或悬浮液的使用。无菌制剂适于各种局部或肠胃外途径，包括皮内、肌肉内、血管内和皮下。

除了目的化合物，组合物可以包括(取决于所需递送的制剂和模式)药用、无毒载体或稀释剂，其包括通常用于形成用于动物或人施用的药物组合物的媒介物。选择稀释剂从而不会不适当地影响组合的生物活性。

特别用于可注射制剂的这样的稀释剂的实例是水、各种盐水、有机或无机盐溶液、Ringer's溶液、葡萄糖溶液、和Hank's溶液。此外，药物组合物或制剂可以包括添加剂如其他载体；佐剂；或无毒、非治疗、非免疫原稳定剂等。

此外，赋形剂可以包括在制剂中。实例包括共溶剂、表面活性剂、油、湿润剂、润滑剂、防腐剂、稳定剂和抗氧化剂。可以使用任何药理学可接受的缓冲液，例如tris或磷酸盐缓冲液。稀释剂、添加剂和赋形剂的有效量是有效获得关于溶解度、生物活性等的药用制剂的那些量。

目的化合物可以并入微球中。目的化合物可以加载入白蛋白微球中，由此可能将该微球恢复在干粉中用于鼻内施用。其他适于制备微球的材料包括琼脂、藻酸盐、几丁质、淀粉、羟基乙基淀粉、白蛋白、琼脂糖、葡聚糖、透明质酸、明胶、胶原蛋白和酪蛋白。微球可以通过本领域技术人员已知的各种方法制造，如喷雾干燥方法或乳化方法。

例如，白蛋白微球可以通过将磷酸缓冲液中的兔血清白蛋白加入橄榄油中并搅拌以产生油包水乳状液来制备。然后将戊二醛溶液加入至乳状液中，并将乳状液搅拌以交联白蛋白。然后可以通过离心将微球分离，去除油并且例如用石油洗涤球，接着用乙醇洗涤。最后，可以将微球过筛并收集并通过过滤干燥。

淀粉微球可以通过将温的淀粉水溶液，例如马铃薯淀粉的水溶液加入至热的聚乙二醇的水溶液，并搅拌以形成乳状液来制备。当形成两相(淀粉溶液作为内部相)体系时，然后在连续搅拌下将混合物冷却至室温，此时内部相转变为凝胶颗粒。然后在室温将这些颗粒过滤去，并在溶剂如乙醇中成浆，这之后再次将颗粒滤去并在空气中放置至干燥。微球可以通过公知的交联步骤如热处理或通过使用化学交联剂硬化。合适的试剂包括二醛，包括乙二醛、丙二醛、丁二醛、己二醛、戊二醛和苯二醛，二酮如丁二酮，表氯醇，多磷酸盐和硼酸盐。二醛用于通过与氨基相互作用交联蛋白如白蛋白，并且二酮与氨基形成希夫碱。表氯醇利用亲核试剂如氨基或羟基激活化合物得到环氧化物衍生物。

本发明的另一优选的实施方案是剂量方案。术语"单位剂型"是指适合作为用于受试者，例如，哺乳动物受试者，例如人、狗、猫和啮齿类的单一剂量的物理上分离的单位，各个单位含有预定量的活性材料，所述活性材料计算为产生与所需药物稀释剂、载体或媒介物相关的药效。用于本发明的单位剂型的详述受控于(a)活性材料的特性和要获得的特别效果和(b)化合在人和动物中使用的该活性的技术中固有的限制，并且依赖于(a)活性材料的特性和要获得的特别效果和(b)化合在人和动物中使用的该活性的技术中固有的限制。单位剂型的实例是片剂、胶囊、丸剂、粉末包、薄饼(wafer)、栓剂、颗粒、扁形胶囊、一茶匙的量、一大汤匙的量、一滴的量(dropperfuls)、安瓿、小瓶、计量放出的气溶胶、前述任一项的隔离的多次量、和本文中所述的其他形式。组合物可以包括在试剂盒中，所述试剂盒可以含有一种以上单位剂型的组合物和使用以治疗本文所述的一种以上病症的说明。

缓慢或延长释放递送系统，包括很多生物聚合物(基于生物的系统)、使用脂质体的系统、胶体、树脂和其他多聚递送系统或隔室化的储库中的任一种，可以与本文中所述的组合物一起使用以提供治疗性化合物的连续或长期来源。这样的缓慢释放系统可用于经局部、眼内、口服和肠胃外途径递送的制剂。

有效量的目的化合物用于治疗。根据本发明使用的化合物的剂量根据化合物和治疗的状况例如接受者患者的年龄、体重和临床状况而改变。其他因素包括：施用途径、患者、患者的医疗史、疾病过程的严重度和具体的化合物的效力。剂量应该足以缓解治疗的疾病的症状或征兆，而不对患者产生不可接受的毒性。通常，有效量的化合物是提供由医师或其他有资质的观察者注意的主观的症状减轻或客观的可鉴定的改善的量。

本发明的最后一个实施方案是指治疗疾病的方法，所述疾病如动脉粥样硬化、炎性肠病、类风湿性关节炎、肝纤维化、肾病、银屑病、皮肤伤口愈合、皮肤再生、胰腺炎、胃炎、神经变性疾病、神经炎性疾病、硬皮病、癌症、高血压、肥胖和II型糖尿病，其可以用PPARg激动剂治疗；其包括向患者施用有效量的上述组合物。

缩写：

CBG：大麻萜酚。

CBGA：大麻萜酚酸。

CBG-Q(化合物I)：大麻萜酚羟基醌。

DCC：二环己基碳二亚胺。

Keap1：Kelch ECH相关蛋白1。

NFE2L2或(Nrf2)：核因子(红细胞来源的2)-样2。

NR1C：核亚类1C。

NRs：核受体。

PPARs：过氧化物酶体增殖物激活的受体。

PPARg：过氧化物酶体增殖物激活受体γ，也称为PPARγ，格列酮受体或NR1C3。

PPARα：过氧化物酶体增殖物激活受体α，也称为NR1C1。

PPARβ/δ：过氧化物酶体增殖物激活受体β/δ也称为NR1C2。

附图描述

以下简述本发明的附图。各图的深入解释包括在每个相关实施例中。

附图缩写：

I：是指CBG-Q。

II：是指式(II)的化合物。

III：是指式(III)的化合物。

IV：是指式(IV)的化合物。

V：是指式(V)的化合物。

VI：是指式(VI)的化合物。

VII：是指式(VII)的化合物。

VIII：是指式(VIII)的化合物。

IX：是指式(IX)的化合物。

X：是指式(X)的化合物。

XI：是指式(XI)的化合物。

XII：是指式(XII)的化合物。

图1.HEK-293细胞中的PPARg反式激活测定

测试的化合物的浓度(μM)显示在x-轴并且PPARg活化倍数显示在y-轴。该图表明相对于化合物II-VI的效果(图1A)和相对于化合物VII-XII的效果(图1B)，CBG-Q或化合物I对于PPARg活性的效果，核准CBG-Q(化合物I)的衍生物，并且特别是化合物II，III，IV，V，VII，VIII，和XII，能够比CBG-Q(化合物I)更高效地诱导PPARg活化。PPARγ完全激动剂罗格列酮(RZG)1μM用作比较对照。用不存在任何PPARg激动剂或激活剂的对照样品(-)作为参考，计算倍数活化水平。数据表达为至少三次独立实验的平均±S.D.。

图2.人真皮原代成纤维细胞中的PPARg反式激活测定。

测试的化合物的浓度(μM)显示在x-轴并且PPARg活化倍数显示在y-轴。该图显示相对于化合物II，III，IV，和V，CBG-Q(化合物I)对于PPARg活性的效果，核准那些化合物II，III，IV，和V能够比CBG-Q(化合物I)更高效地诱导PPARg活化。PPARγ完全激动剂罗格列酮(RZG)1μM用作比较对照。用不存在任何PPARg激动剂或激活剂的对照样品(-)作为参考，计算倍数活化水平。数据表达为至少三次独立实验的平均±S.D.。

图3.细胞毒性活性。

相对于化合物II至XII，将细胞系N2a(A)，HT22(B)和MO3.13(C)细胞与指定剂量的CBG-Q(化合物I)孵育24h，并且通过MTT测定定量细胞生存力。结果显示为至少三次独立实验的平均值±S.D.，并且表达为相对于不存在任何PPARg激动剂或激活剂的对照样品(-)的细胞存活力的百分数。对照设置为100％并且数据参考该值。结果表明，与CBG-Q(化合物I)相关的细胞毒性活性在本发明中所述的所有的在位置2处的CBG-Q衍生物中丢失。

图4.Nrf2转录测定

将HaCaT-ARE-Luc细胞于指定浓度与化合物CBG-Q化合物I)和与化合物I至VI(A)或与化合物VII至XII(B)孵育6h，并且制备蛋白裂解物并分析荧光素酶活性。20μM的促氧化剂叔丁基氢醌(tBHQ)(一种诱导细胞氧化应激的化合物)用作阳性对照。用不存在任何PPARg激动剂或激活剂的对照样品(-)作为参考，计算倍数活化水平。数据表达为至少三次独立实验的平均±S.D.。结果核准，与CBG-Q(化合物I)相关的反应的亲电子活性在本发明中所述的所有化合物(位置2中的衍生物)中丢失。

图5.神经保护活性。

将N2a细胞于指定浓度与化合物(II)至(V)和(XII)预孵育1h，然后，将细胞用5mM谷氨酸处理24h以在神经元细胞中诱导通过神经递质诱导的兴奋性中毒或细胞毒性。细胞存活力通过MTT测定定量。结果显示为来自至少三次独立实验的平均值±S.D.，并表达为相对于不存在任何PPARg激动剂或活化剂并且具有(-,+)或没有(-,-)谷氨酸的对照样品(-)的细胞存活力的百分数。对照设置为100％并且数据参考该值。

图6.化合物(III)缓解EAE

将C57BL/6小鼠用MOG_35–55免疫并且每天评价其临床得分。在免疫后第6天和接着的21天每天用化合物(III)(10mg/kg)处理小鼠。图表显示每天平均临床得分(平均值±SEM)。值表达为10只动物/组的平均值±SEM。

图7.化合物(III)对促炎性标志物(EAE)的作用

与EAE+媒介物小鼠相比，包括CCL2、IFNγ、INOS、TNFα、IL-1β和IL-17的炎性标志物在脊柱中的基因表达在EAE+化合物(III)(10mg/kg)组中下调。表达水平使用2^-ΔΔCt方法计算。

图8.化合物(XII)缓解EAE

将C57BL/6小鼠用MOG_35–55免疫并且每天评价其临床得分。在免疫后第6天和接着的21天每天用化合物(XII)(5mg/kg)处理小鼠。图表显示每天平均临床得分(平均值±SEM)。值表达为10只动物/组的平均值±SEM。

图9.3NP中毒后的行为得分。

在用化合物I(10mg/kg)(A)、III(10mg/kg)(B)和XII(10mg/kg)(C)处理后将小鼠进行行为测试以确定其神经系统状态。基于严重度，将后肢抱紧、运动活动、后肢肌张力障碍和躯干肌张力障碍评价为0至2：得分0通常表示正常功能并且2是严重受影响的。值表达为8只动物/组的平均值±SEM。

图10.化合物III降低纹状体中炎性标志物mRNA的表达

与3NP+媒介物小鼠相比，包括COX-2、TNFα、IL-6和iNOS的炎性标志物的基因表达在3NP+化合物III(10mg/kg)处理的小鼠中下调。表达水平使用2^-ΔΔCt方法计算。值表达为6只动物/组的平均值±SEM。

图11.化合物XII降低纹状体中炎性标志物mRNA的表达。

与3NP+媒介物小鼠相比，包括COX-2、TNFα、IL-6和iNOS的炎性标志物的基因表达在3NP+XII(10mg/kg)处理的小鼠中下调。表达水平使用2^-ΔΔCt方法计算。值表达为6只动物/组的平均值±SEM。

图12.化合物XII对神经变性的标志物(3NP)的作用

NeuN(神经元标志物)，GFAP(星形胶质细胞标志物)，和Iba1(小胶质标志物)通过用媒介物，3NP+媒介物，3NP+化合物XII(10mg/kg)和XII(10mg/kg)处理的小鼠的纹状体的冠状面中的免疫染色检测。小鼠纹状体中NeuN(A)，GFAP(B)和Iba1(C)阳性细胞的定量。显示神经元、星形胶质细胞和小胶质的总平均数。值表达为6只动物/组的平均值±SEM。

图13.化合物(III)对6-OHDA-诱导的帕金森症候的作用。

将C57BL/6小鼠用6-羟基多巴胺(6-OHDA)或盐水(对照小鼠)单侧脑室内(intracerebroventricullarly)注射并且在6-OHDA注射后16h开始用化合物III(10mg/ml)或媒介物慢性腹膜内处理(14天)。通过转杆(rotarod)性能评价运动协调，并且使用计算机辅助的活动计(actimeter)评价运动活动。值表达为6只动物/组的平均值±SEM。

实施例

下文描述的本发明实施例旨在说明其优选的实施方案，不限制其保护范围。

实施例1.化学合成和NMR分析

源自CBGA的化合物的一般步骤。化合物(II)和(XII))的合成

向CBGA(大麻萜酚酸)(360mg，0.80mmol)在甲醇(10mL)中的溶液中加入二环己基碳二亚胺(DCC)(331mg，1.6mmol)和催化的对甲苯磺酸(约10mg)。搅拌40分钟后，通过蒸发处理反应(方案1)。将残留物溶解在甲苯(约10mL)中，并冷却(-18℃)以沉淀脲。1h后，将溶液在烧结的玻璃滤器上过滤，并且将残留物通过RP C-18硅胶的急骤色谱法纯化，获得260mg的(E)-3-(3,7-二甲基辛-2,6-二烯基)-2,4-二羟基-6-戊基苯甲酸甲酯[无色泡沫，产率：70％]。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δppm 12.00(bs，1H)，6.25(s，1H)，5.27(bt，J＝6.5Hz，1H)，5.04(bt，J＝6.5Hz，1H)，3.90(s，3H)，3.41(d，J＝6.8Hz，1H)，2.05(bm，4H)，1.80(bs，3H)，1.66(bs，3H)，0.89(t，J＝6.0Hz，3H)。

方案1

制备化合物II。

方案2

向100mg(0.27mmol)的(E)-3-(3,7-二甲基辛-2,6-二烯基)-2,4-二羟基-6-戊基苯甲酸甲酯在4mL EtOAc中的溶液中加入SIBX(465mg，0.77mmol，3mol当量)，并且将反应回流1h。冷却并经C盐过滤后，将滤液顺序用饱和NaHCO₃和盐水洗涤。干燥(Na₂SO₄)和蒸发后，将残留物通过硅胶上的柱色谱法(石油醚-CH2Cl2 8：5作为洗脱剂)纯化，获得28mg6-(3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-5-羟基-3-戊基-2-甲氧基羰基-[1,4]苯醌。[棕色固体，产率：25％]。

¹H NMR(CDCl3，300MHz)δppm 6.95(bs，1H)，5.11(bt，J＝6.5Hz，1H)，5.04(bt，J＝6.5Hz，1H)，3.89(s，3H)，3.13(d，J＝6.5Hz，2H)，2.38(m，2H)，1.72(bs，3H)，1.65(bs，3H)，1.57(bs，3H)，0.89(t.J＝6.5Hz，3H)。

制备化合物XII

3,3'-双((E)-3,7-二甲基辛-2,6-二烯基)-4,4'-二羟基-6,6'-二戊基-1,1'-双(环己-3,6-二烯)-2,2',5,5'-四酮

方案3

向大麻萜酚(CBG)(500mg，0.16mmol)在甲苯(100mL)中的溶液中，加入NaH(95％，150mg，0.48mmol，3mol.当量)，并且在打开烧瓶的情况下将反应剧烈搅拌(方案3)。几乎即刻显紫色，并且12h后，通过用2N H₂SO₄酸化至pH 3将反应后处理，并在盐水和EtOAc之间分配。将有机相干燥(Na₂SO₄)并蒸发，并且将残留物通过重力柱色谱法在硅胶(石油醚-EtOAc9：1作为洗脱剂)上纯化，获得120mg 3,3'-双((E)-3,7-二甲基辛-2,6-二烯基)-4,4'-二羟基-6,6'-二戊基-1,1'-二(环己-3,6-二烯)-2,2',5,5'-四酮[深棕色胶质，产率：24％]。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δppm：6.99(bs，2H)，5.10(bt，J＝6.5Hz，，2H)，5.05(bt，J＝6.5Hz，2H)3.13(d，J＝6.5Hz，4H)，1.71(s，6H)，1.65(s，6H)，1.57(s，6H)，0.81(t，J＝7.0Hz,

实施例2.化学合成和NMR分析

源自CBG的化合物的一般步骤。化合物(III)至(XI))的合成

在空气的存在下通过使用甲苯中的tBuOK在室温进行从CBG(大麻萜酚)开始的CBG-Q(化合物I)的合成(方案4)

方案4

将tBuOK(2.00g，17.824mmol)加入至大麻萜酚(CBG)(2.00g，6.319mmol)在甲苯(400mL)中的溶液，得到紫色溶液。在开放于空气的圆底烧瓶中将反应混合物在室温搅拌，并且通过TLC分析检测转化(洗脱剂：10％EtOAc/己烷)(方案5)。2h后，将反应混合物用HCl(5％水溶液，300mL)洗涤并将水层用EtOAc(100mL)萃取。将合并有机层经Na₂SO₄(无水)干燥，过滤并浓缩。将粗制残留物在SiO₂(2至4％EtOAc/己烷)上急骤色谱分离，得到1.10g的CBG-Q(化合物I)[橙色固体，产率：53％]。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：δ6.94(s，-OH，1H)，6.45(s，1H)，5.13(br t，J＝6.8Hz，1H)，5.04(br t，J＝6.8Hz，1H)，3.14(s，J＝6.8Hz，2H)，2.41(t，J＝7.8Hz，2H)，2.09-1.92(m，4H)，1.73(br s，3H)，1.57(br s，3H)，ca.1.52(m，2H)，1.38-1.17(m，4H)，0.89(t，J＝7.8Hz，3H)。

通过将CBG-Q(化合物I)与大量过量的胺在室温在开放于空气的反应体系中反应来完成在位置2处用烷基氨基、芳基氨基、烯基氨基或炔基氨基取代的衍生物的合成(方案5)

方案5

数小时内获得高转化，以得到点对点反应。浓缩去除溶剂，并且将粗制残留物通过反相色谱纯化，得到产物，纯度约95％。

化合物III的制备

6-(3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-5-羟基-3-戊基-2-乙基氨基-[1,4]苯醌

方案6

将乙胺(5.2mL，H₂O中70％溶液，65.403mmol)加入至CBG-Q(化合物I)(510mg，1.543mmol)在EtOH(50mL)中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌2h(方案6)。将其倒入H₂O(120mL)中，用HCl(10％水溶液)调至pH＝2并用CH₂Cl₂(2x80mL)萃取。将有机层经Na₂SO₄(无水)干燥，过滤并浓缩。将粗制残留物通过反相色谱(30至100％CH₃CN/H₂O)纯化，得到435mg的2-(3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-6-乙基氨基-3-羟基-5-戊基-[1,4]苯-醌[紫色固体，产率：75％]。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δppm：6.39(bs，1H)，5.09(m，2H)，3.54(t，J＝6.6Hz，2H)，3.05(d，J＝6.6Hz，2H)，2.49(m，2H)，1.99(m，4H)，1.72(s，3H)，1.64(s，3H)，1.57(s，3H)，1.44-1.22(m，9H)，0.88(m，3H)。

制备化合物IV

方案7

将戊胺(1.5mL，12.943mmol)加入至化合物CBG-Q(化合物I)(109mg，0.330mmol)在EtOH(10mL)中的溶液。将反应混合物在室温搅拌22h(方案7)。将其倒入H₂O(50mL)，用HCl(10％水溶液)调至pH＝2并用CH₂Cl₂(30mL)萃取。将有机层经Na₂SO₄(无水)干燥，过滤并浓缩。将粗制残留物通过反相色谱(30至100％CH₃CN/H₂O)纯化，得到88mg的2-(3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-3-羟基-5-戊基-6-戊基氨基-[1,4]苯醌[紫色固体，产率：64％]。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δppm：6.38(bs，1H)，5.13(t，J＝7.1Hz，1H)，5.05(t，J＝6.0Hz，1H)，3.47(q，J＝6.6Hz，2H)，3.06(d，J＝7.1Hz，2H)，2.49(m，2H)，2.08-1.93(m，4H)，1.72(s，3H)，1.65(s，3H)，1.57(s，3H)，1.42-1.28(m，12H)，0.91(m，6H)。

制备化合物V

方案8

将异丁胺(1.3mL，13.082mmol)加入至化合物CBQ-G(化合物I)(101mg，0.306mmol)在EtOH(10mL)中的溶液。将反应混合物在室温搅拌8h(方案8)。将其倒入H₂O(50mL)中，用HCl(10％水溶液)调至pH＝2并用CH₂Cl₂(30mL)萃取。将有机层经Na₂SO₄(无水)干燥，过滤并浓缩。将粗制残留物通过反相色谱(30至100％CH₃CN/H₂O)纯化，得到59mg的2-(3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-3-羟基-6-异丁基氨基-5-戊基-[1,4]苯醌[紫色固体，产率：48％]。

¹H NMR(CDCl₃，250MHz)δppm：6.60(bs，1H)，5.11(m，2H)，3.28(t，J＝6.3Hz，2H)，3.06(d，J＝7.1Hz，2H)，2.49(m，2H)，2.07-1.84(m，4H)，1.72(s，3H)，1.65(s，3H)，1.57(s，3H)，1.41-1.27(m，7H)，1.02(s，3H)，0.98(s，3H)，0.89(m，3H)。

制备化合物VI

方案9

将正丁胺(1.2mL，12.143mmol)加入至化合物CBG-Q(化合物I)(102mg，0.309mmol)在EtOH(12mL)中的溶液。将反应混合物在室温搅拌18h(方案9)。将其倒入H₂O(50mL)中，用HCl(10％水溶液)调至pH＝2并用CH₂Cl₂(30mL)萃取。将有机层经Na₂SO₄(无水)干燥，过滤并浓缩，得到190mg的2-丁基氨基-6-(3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-5-羟基-3-戊基-[1,4]苯醌[紫色固体，产率：98％]。

¹H NMR(CDCl₃，250MHz)δppm：6.50(bs，1H)，5.09(m，2H)，3.47(q，J＝7.1Hz，2H)，3.05(d，J＝7.1Hz，2H)，2.48(m，2H)，2.08-1.90(m，4H)，1.72(s，3H)，1.64(s，3H)，1.57(s，3H)，1.50-1.22(m，10H)，1.00-0.84(m，6H)。

制备化合物VII

方案10

甲胺(0.6mL，EtOH中8M溶液，4.8mmol)加入至化合物CBG-Q(化合物I)(102mg，0.309mmol)在EtOH(10mL)中的溶液。将反应混合物在室温搅拌6h(方案10)。将其倒入H₂O(50mL)，用HCl(10％水溶液)调至pH＝2并用CH₂Cl₂(30mL)萃取。将有机层经Na₂SO₄(无水)干燥，过滤并浓缩。将粗制残留物通过反相色谱(30至100％CH₃CN/H₂O)纯化，得到23mg的2-(3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-3-羟基-6-甲基氨基-5-戊基-[1,4]苯醌[紫色固体，产率：20％]。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δppm：6.48(bs，1H)，5.12(t，J＝6.6Hz，1H)，5.06(t，J＝6.6Hz，1H)，3.20(d，J＝6.0Hz，3H)，3.06(d，J＝7.1Hz，2H)，2.55(t，J＝7.1Hz，2H)，2.07-1.92(m，4H)，1.72(s，3H)，1.65(s，3H)，1.57(s，3H)，1.49-1.23(m，6H)，0.89(m，3H)。

制备化合物VIII

方案11

异丙胺(1.0mL，11.639mmol)加入至化合物CBG-Q(化合物I)(101mg，0.306mmol)在EtOH(10mL)中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌18h(方案11)。将其倒入H₂O(50mL)，用HCl(10％水溶液)调至pH＝2并用CH₂Cl₂(30mL)萃取。将有机层经Na₂SO₄(无水)干燥，过滤并浓缩。将粗制残留物通过反相色谱(30至100％CH₃CN/H₂O)纯化，得到62mg的2-(3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-3-羟基-6-异丙基氨基-5-戊基-[1,4]苯醌[紫色固体，产率：52％]。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δppm：6.37(s，1H)，5.13(t，J＝6.6Hz，1H)，5.05(t，J＝6.6Hz，1H)，3.98(m，1H)，3.06(d，J＝7.1Hz，2H)，2.47(m，2H)，2.08-1.92(m，4H)，1.72(s，3H)，1.65(s，3H)，1.57(s，3H)，1.42-1.29(m，6H)，1.28(s，3H)，1.25(s，3H)，0.89(m，3H)。

制备化合物IX

6-(3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-5-羟基-3-戊基-2-苄基氨基[1,4]苯醌。

方案12

将苄胺(1.3mL，11.913mmol)加入至化合物CBG-Q(化合物I)(100mg，0.302mmol)在EtOH(13mL)中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌18h(方案12)。将其倒入H₂O(50mL)中，用HCl(10％水溶液)调至pH＝2并用CH₂Cl₂(30mL)萃取。将有机层经Na₂SO₄(无水)干燥，过滤并浓缩。将粗制残留物通过反相色谱(30至100％CH₃CN/H₂O)纯化，得到61mg的2-苄基氨基-6-(3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-5-羟基-3-戊基-[1,4]苯醌[紫色固体，产率：46％]。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δppm：7.43-7.27(m，5H)，6.80(bs，1H)，5.18-5.02(m，2H)，4.67(d，J＝5.5Hz，2H)，3.07(d，J＝6.6Hz，2H)，2.47(t，J＝7.7Hz，2H)，2.09-1.92(m，4H)，1.72(s，3H)，1.65(m，3H)，1.57(s，3H)，1.47-1.24(m，6H)，0.88(m，3H)。

制备化合物X

方案13

将新戊胺(1.4mL，12.063mmol)加入至化合物CBG-Q(化合物I)(100mg，0.303mmol)在EtOH(14mL)中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌18h(方案13)。将其倒入H₂O(50mL)中，用HCl(10％水溶液)调至pH＝2并用CH₂Cl₂(30mL)萃取。将有机层经Na₂SO₄(无水)干燥，过滤并浓缩。将粗制残留物通过反相色谱(30至100％CH₃CN/H₂O)纯化，得到72mg的2-(3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-6-(2,2-二甲基-丙基氨基)-3-羟基-5-戊基[1,4]苯醌[紫色固体，产率：65％]。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δppm：6.62(s，1H)，5.14(t，J＝6.6Hz，1H)，5.05(t，J＝6.6Hz，1H)，3.27(d，J＝6.0Hz，2H)，3.07(d，J＝7.1Hz，2H)，2.50(t，J＝7.1Hz，2H)，2.09-1.92(m，4H)，1.72(s，3H)，1.65(s，3H)，1.57(s，3H)，1.47-1.25(m，6H)，1.02(s，9H)，0.90(t，J＝6.6Hz，3H)。

制备化合物XI

方案14

将异戊胺(1.4mL，11.886mmol)加入至化合物CBG-Q(化合物I)(100mg，0.303mmol)在EtOH(14mL)中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌18h(方案14)。将其倒入H₂O(50mL)，用HCl(10％水溶液)调至pH＝2并用CH₂Cl₂(30mL)萃取。将有机层经Na₂SO₄(无水)干燥，过滤并浓缩。将粗制残留物通过反相色谱(30至100％CH₃CN/H₂O)纯化，得到40mg的2-(3,7-二甲基-辛-2,6-二烯基)-3-羟基-6-(3-甲基-丁基氨基)-5-戊基-[1,4]苯醌[紫色固体，产率：55％]。

¹H NMR(CDCl₃，300MHz)δppm：6.38(bs，1H)，5.09(m，2H)，3.50(q，J＝6.0Hz，2H)，3.06(d，J＝7.1Hz，2H)，2.51(t，J＝7.1Hz，2H)，2.11-1.92(m，4H)，1.72(s，3H)，1.65(s，3H)，1.57(s，3H)，1.48-1.24(m，7H)，0.96(s，3H)，0.94(s，3H)，0.89(m，3H)。

体外测定

实施例2.PPARg激动活性.

为了研究新化合物的生物活性，我们在HEK-293细胞和人原代成纤维细胞中进行了PPARg反式激活测定。

HEK293T细胞和人原代成纤维细胞在37℃在含有5％CO₂的潮湿气氛中，在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％(v/v)青霉素/链霉素的DMEM中维持。罗格列酮购自Cayman化学公司(Ann Arbor，MI，USA)。所有其他试剂来自Sigma Co(St Louis，MO，USA)。将HEK293T细胞(2x10³/孔)(图1)或人真皮原代成纤维细胞(5x10³/孔)(图2)接种在具有明亮底96-孔Microtest^TM Optilux^TM板的BD Falcon^TM White中24小时。之后，按照制造商的使用说明将细胞用表达载体GAL4-PPARγ和萤光素酶报告载体GAL4-luc，使用

-Fect(CarlRoth，Karlsruhe，德国)瞬时共转染。转染后二十四小时，将细胞用递增剂量的化合物预处理6小时。然后，将细胞在25mM Tris-磷酸盐pH 7.8，8mM MgCl₂，1mM DTT，1％Triton X-100，和7％甘油中裂解。使用TriStar LB 941多模微孔板读数器(Berthold)并按照萤光素酶测定试剂盒(Promega，Madison，WI，USA)的使用说明，测量细胞裂解物中的萤光素酶活性。通过Bradford测定(Bio-Rad，Richmond，CA，USA)测量蛋白浓度。在每个实验值中减去用裂解缓冲液获得的背景，并且特异反式激活表达为相对于未处理细胞的倍数诱导。所有实验重复至少三次。使用的质粒是Gal4-hPPARγ(质粒名称：pCMV-BD-hPPARg，在Sinal实验室，药理学系，Dalhousie大学制备)和Gal4luc报告质粒，其包括五个与萤光素酶基因融合的Gal4DNA结合位点。上述测定由图1和图2说明，其通过在瞬时过表达PPARg连同萤光素酶报告基因(PPARg-GAL4/GAL4-LUC)并且用化合物处理6小时的细胞中进行的反式激活测定的方式，显示CBG-Q(化合物I)和衍生物对PPARg活性的作用。数据以平均值连同三次重复的标准差误差线给出。与未处理的细胞相比，对于醌衍生物观察到萤光素酶活性的显著增加。该结果证实，化合物II比化合物CBG-Q(化合物I)显著更有效地在1至25μM的浓度激活PPARg。化合物III至XII以浓度依赖的方式增加PPARg反式激活，III、IV、V和XII是最具活性的化合物。此外，与CBG-Q(化合物I)相比，这些化合物的较高浓度(25和50μM)对于激活PPARg特别有效。罗格列酮，一种PPARg激动剂，在1μM的浓度增加PPARg的活性多于100倍。相比之下，1μM浓度的本发明中所述的化合物诱导的PPARg活性的最大诱导从未高于12倍(即化合物II)，表明这些新化合物是PPARg调节剂而不是PPARg完全激动剂。

实施例3.细胞毒性测定。

亲电子醌诱导细胞毒性并激活Nrf2通路，一种反应性氧种类产生的细胞传感器。在图3中，在三种不同类型的细胞(N2a，HT22和MO3.13)中分析了由化合物CBG-Q(化合物I)和化合物(II)至(XII)诱导的细胞死亡。

将三种细胞系，MO3.13，N2A和HT22细胞在37℃在含有5％CO₂的潮湿气氛中、在补充以10％胎牛血清(FBS)和1％(v/v)青霉素/链霉素的DMEM中维持。通过MTT测定确定N2A，HT22和MO3.13细胞存活力。简言之，将细胞以10⁴个细胞/孔的密度接种在96-孔板中，200μl细胞悬浮液/孔，并培养24小时。然后将细胞与数个浓度的化合物孵育24小时。之后，将来自MTT：DMEM(1：2)的混合物溶液的100μl的MTT(5mg/ml)加入至各个孔中，并且将细胞在黑暗中在37℃孵育4h。然后终止反应，移除上清并且将100μl的DMSO加入各个孔中，并且缓慢震荡孵育10分钟。最后，使用TriStar LB 941(Berthold Technologies，GmbH&Co.KG)在550nm测量吸光度。对照细胞设为100％并且数据参考该值。将细胞系N2a(图3A)，HT22(图3B)和MO3.13(图3C)细胞与指定剂量的化合物CBG-Q(化合物I)和化合物(II)至(XII)孵育24h，并且通过MTT测定定量细胞存活力。结果显示为来自至少三次独立实验的平均值±S.D.，并且表达为相对于对照样品(-)的细胞存活力百分数。对照设置为100％并且数据参考该值。结果表明，与CBG-Q(化合物I)相关的细胞毒性活性与其诱导Nrf2活化的能力相关。在同样的意义上，对于本发明中所述的CBG-Q)的位置2中的化合物II至XII衍生物缺乏细胞毒性活性，与其不能激活Nrf2相关。

实施例4.Nrf2转录活性。

为了研究化合物对Nrf2通路的活性，我们建立了HaCaT-ARE-Luc细胞系。使用

2000转染试剂(Life Technologies，Carlsbad，Ca，USA)将Nqo1ARE-Luc报告质粒和pPGK-Puro质粒共转染入HaCat细胞。选择稳定转化子并维持在含有10％FBS，1％青霉素-链霉素和10μl/ml嘌呤霉素的RPMI 1640中。将HaCaT-ARE-Luc细胞以指定浓度与CBG-Q(化合物I)和与化合物(II)-(VI)(A)或与化合物(VII)-(XII)(B)孵育6h，并且制备蛋白裂解物，并分析实施例1中描述的萤光素酶活性。20μM的促氧化剂叔丁基氢醌(tBHQ)用作阳性对照。采用对照样品(-)作为参考，计算倍数活化水平(图4A和4B)。数据表达为来自至少三次独立实验的平均值±S.D.。结果核准，与CBG-Q(化合物I)相关的反应性亲电子活性在本发明所述的所有化合物(位置2中的衍生物)中丢失。

实施例5.神经保护测定。

抗炎性核受体PPARg的激活在神经保护方面发挥重要作用，并且已知PPARg激动剂预防神经元细胞中谷氨酸-诱导的细胞毒性。

将培养的N2A细胞与指定浓度的化合物II，III，IV，V和XII预孵育1h并且然后用5mM谷氨酸处理以在24h期间诱导兴奋毒性(图5)。通过MTT方法确定细胞毒性，如实施例3中所述。结果表示为至少三次独立实验的平均值±S.D.，并且表达为相对于对照样品(-)的细胞存活力的百分比。对照设置为100％并且数据参考该值。

那些结果表明，化合物II，III，IV，V和XII(其是PPARg调节剂)，也保护神经元细胞免于谷氨酸-诱导的凋亡。

体内测定

实施例6.实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的诱导

PPARg调节剂用于神经变性疾病和炎性疾病的治疗，并且我们研究了本发明的两种代表性化合物在三种良好定义的炎症和神经变性的动物模型中的作用。

通过用与不完全弗氏佐剂(CFA，Sigma-Aldrich，Madrid，西班牙)1：1混合的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白多肽(MOG_35-55)(300μg)和200μg结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)(H37Ra Difco，Franklin Lakes，NJ，USA)皮下免疫，在6-8周龄雌性C57BL/6小鼠中诱导EAE。同日和2天后，将小鼠用0.1ml PBS中的200ng百日咳毒素(Sigma-Aldrich，Madrid，西班牙)腹膜内注射(ip)。将对照动物(CFA)用没有MOG的相同乳液接种，并且它们不接受百日咳毒素。处理在免疫(p.i.)后6天开始并且在之后21天持续每天以指定剂量的化合物III(图6)和XII(图8)或单独媒介物(DMSO/PBS)注射。每天检查小鼠的EAE临床征兆并且如下测量疾病得分：0，无疾病；1，跛的尾部；2，跛的尾部和后肢弱；3，后肢瘫痪；4，后肢和前肢瘫痪；5，垂死和死亡。(p.i.)后28天处死所有动物用于进一步的分析。一旦处死，就将动物解剖并且快速摘取脊柱并快速冷冻在RNAlater(Sigma-Aldric，德国)中。

图6中显示，化合物III明确减弱用(MOG_35-55)皮下免疫诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的临床表现。媒介物-处理的小鼠发展出严重的疾病，在注射后(pi)16天到峰值，达到2.5的得分(最大得分是3)。在接收化合物III的小鼠中，疾病在注射后17天达到峰值，整个实验过程(第6天-第28天)未达到1,3的得分。EAE的临床症状与仅接受媒介物的EAE小鼠的脊柱中促炎性基因Ccl2，iNOs，TNFa，IFNg，IL-1b和IL-17的表达相关。相反，在接受化合物III的EAE小鼠中所有这些参数存在显著减少(图7)。此外，在图8中，我们表明化合物XII也缓解EAE小鼠的临床症状至与化合物III相同的程度，确认本发明中所述化合物的抗炎活性。

实施例7.亨廷顿病(3NP模型)的诱导。

小鼠3-硝基丙酸(3-NP)(线粒体复合物II酶的有效的可逆抑制剂)中毒，导致动物模型中线粒体功能失调和氧化应激，这导致暗示HD病理学的一些方面的各种神经学、生物化学和组织学作用。例如，与对照动物相比，3NP-处理的小鼠在后肢抱紧、肌张力障碍、脊柱后弯和一般运动活动方面呈现高得分。

利用3-NP在成年(16周龄；30g)雄性C57BL/6小鼠(Harlan Ibérica，Barcelona，西班牙)中诱导纹状体的损伤。为此，将小鼠进行七次50mg/kg(在磷酸盐缓冲盐水中制备)的3NP(每12小时一次注射)的腹膜内(i.p.)注射达3天。将这些动物和它们各自的非损伤对照用于利用化合物CBG-Q(化合物I)和化合物III和XII的药理学研究(图9)。每个实验组使用至少6-8只动物。治疗由注射3NP前30min的四次腹膜内注射指定剂量的化合物(每24小时一次注射)，或媒介物(DMSO 0,2％，BSA 5％，在PBS中)组成。在最后的3NP注射后12小时将所有动物安乐死。一旦安乐死，就将动物解剖并快速取出它们的脑。右半球用于解剖纹状体，将其快速冷冻入RNAlater(Sigma-Aldrich，德国)中以通过实时PCR分析炎性标志物。将左半球在4℃在新鲜的4％多聚甲醛(0.1M磷酸缓冲-盐水中)中固定48小时，并且包封入石蜡中用于组织学分析。将小鼠进行行为测试以确定它们的神经学状态。我们评估了一般运动活动、后肢抱紧和肌张力障碍，以及躯干肌张力障碍。所有行为测试在药物注射前进行以避免在研究下化合物的急性作用。

图9表明，CBG-Q(化合物I)不能预防3-NP中毒引起的临床症状，但化合物III和XII明显缓解这种症状。

我们还使用3NP-l损伤的小鼠的纹状体实质用于分析一些与炎症和神经变性相关的组织学和分子标志物，其在这些实验模型中受影响。炎性酶COX-2和iNOs的表达在3NP-损伤的小鼠中显著上调，同时增加促炎性细胞因子TNFα和IL-6的表达。化合物III(图10)和XII(图11)减弱用3NP处理的小鼠的纹状体中促炎性标志物COX-2、iNOS、TNFα和IL-6的上调。

在图12中显示：这些3NP-损伤的动物的纹状体实质显示神经元死亡的重要程度，其由NeuN免疫组化确认，这证明了纹状体实质中的该神经元标志物的免疫标记的多于50％的减少。神经元的损失伴随GFAP⁺细胞(星形胶质增生)的显著减少和增加的Iba-1⁺细胞(反应性小胶质增生)表达。如由NeuN染色表明的，化合物XII引起针对3NP毒性的纹状体神经元的保留。此外，用化合物XII处理抵消3NP诱导的GFAP⁺细胞的损失，并且防止反应性小胶质增生(Iba-1⁺细胞)的诱导。

实施例8.帕金森病(6-OHDA模型)的诱导。

化合物III还用于小鼠模型中帕金森病(PD)的治疗。

将脑室内(i.c.v.)预处理的C57BL/6小鼠利用腹膜内(i.p.)注射200mg/kg 2,2,2-三溴乙醇(Sigma-Aldrich)麻醉，并且置于具有小鼠适应物的立体定位架(David KopfInstruments，Tujunga，CA，USA)中。使用Hamilton注射器(Hamilton，Bonaduz，Switzerland)，将0.02％抗坏血酸中的4μL 6-OHDA-HBr溶液(5μg/μL)(SigmaAldrich)在以下立体定位坐标(距前囱的mm)注射入两处沉积处的左纹状体中：AP，+0.65；L，-2.0；V1，-4和V2，-3.5，靶向背外侧的纹状体。注射后，缝合皮肤并且将动物从立体定位仪移开，并且置于加热垫30分钟。将小鼠进行利用化合物III(10mg/ml)或媒介物(14天)的慢性腹膜内处理，在6-OHDA注射后的16h开始。在转杆测试(Ugo Basile，Rome，意大利)中以渐强的速度评估运动协调。每天，小鼠具有在固定杆中的1min训练期。如果小鼠在训练期从转杆跌落，则将其放回。然后每20分钟测试5min区段中的小鼠的表现。因此，杆的速度调至至多40rpm达五分钟。化合物III施用或媒介物对照后在连续日在损伤的小鼠中测量从杆跌落的延时。使用计算机辅助的活动计评价运动活动(走动活动、平均速度、休息时间、快速移动和直立次数)(图13)。

图13表明，类似于由6-羟基多巴胺(6OHDA)产生的人PD的运动症状(走动活动、平均速度、休息时间、快速移动、直立次数和转杆表现的改变)的出现几乎完全通过用化合物III处理而得到抑制。

实施例9.组织学分析(实施例7)。

将来自3NP模型的脑固定在4％多聚甲醛中并且5-μm-厚切片用于NeuN(图12A)(神经元的标志物)，GFAP(图12B)(星形胶质细胞的标志物)和Iba-1(图12C)(小胶质细胞的标志物)的免疫组化分析。为了免疫组化，将切片与以下在4℃孵育过夜：(i)单克隆抗-小鼠NeuN抗体(Millipore，MA，USA)，以1/100使用；(ii)单克隆抗-小鼠Iba-1抗体(Millipore，MA，USA)，以1/50使用，(iii)单克隆抗-小鼠GFAP抗体(Santa Cruz Biotechnology，CA，USA)，以1/50使用。在用相应第一抗体孵育后，将切片用0.1M PBS洗涤并用山羊抗-小鼠(Millipore，MA，USA)第二抗体在4°孵育过夜。用二氨基联苯胺显示反应。使用相同步骤但不用第一抗体获得阴性对照切片。用于每个免疫组化步骤的所有切片同时并且在相同条件下加工。Leica DM2500显微镜和Leica DFC 420C照相机用于载玻片观察和照相，并且所有图像处理使用ImageJ进行，ImageJ是美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)(Bethesda.MD，USA)开发并免费发布的软件。

实施例10.用于本发明(实施例6和7)中的实时定量PCR。

使用RNeasy脂组织小提试剂盒(Qiagen，GmbH)从纹状体(3NP模型)或脊柱(EAE模型)中分离总RNA。提取的RNA的总量通过光谱测定法在260nm定量，并且其纯度来自260和280nm的吸光度值的比率。去除基因组DNA以消除DNA污染。从多至1μg总RNA(来自至少3只动物/组的汇合体)使用iScript^TM cDNA合成试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)合成单链互补DNA。将反应混合物保持冷冻在-20℃直到酶扩增。根据疾病模型，将iQ^TM SYBR GreenSupermix(Bio-Rad)用于定量COX-2，TNF-α，IL-6，IL-17，IL-1β，IFN-γ，CCL-2或iNOS的mRNA水平。实时PCR使用CFX96实时PCR检测体系(Bio-Rad)进行。GAPDH持家基因用于标准化每个样品中的mRNA表达。使用2^-ΔΔCt方法计算表达水平。寡核苷酸引物的序列在表2中给出。

表2.用于定量聚合酶链式反应的小鼠引物序列表

本结果证实了本发明中所述的化合物，特别是化合物II，III，IV，V和XII在神经变性疾病和外伤性脑疾病(其中神经炎症和神经毒性发挥重要作用)中的治疗用途。此外，本发明的化合物特别适合作为PPARg激动剂，特别是用于治疗炎性疾病(参见现有技术的表1)，代谢疾病和II型糖尿病。

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