ES2894760T3 - Nuevos derivados de cannabigerol - Google Patents

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Abstract

Compuestos de Fórmula (I), **(Ver fórmula)** en donde R es el átomo de carbono de un grupo, representado por: grupo arilo, alquenilo lineal o ramificado, alquinilo lineal o ramificado, o alcoxicarbonilo lineal o ramificado; o en donde R es el átomo de nitrógeno de un grupo, representado por: grupo alquilamino lineal o ramificado, arilamino, alquenilamino lineal o ramificado, o alquinilamino lineal o ramificado; o, alternativamente, R representa un enlace entre 2 moléculas de Fórmula (I) que forman un dímero

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevos derivados de cannabigerol
Campo de la invención
La presente invención se refiere a nuevos derivados de cannabigerol quinona y la síntesis de esos compuestos. Además, la presente invención se refiere a su uso como medicamento y en terapia, particularmente como moduladores del receptor gamma activado por proliferador de peroxisomas (PPARg), para el tratamiento de enfermedades y afecciones que responden a la modulación de PPARg. Esta invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden dichos compuestos y un método para tratar enfermedades con dichos compuestos.
Antecedentes de la invención
Los receptores nucleares (NR) son un objetivo importante del descubrimiento de fármacos. Los NR son factores de transcripción dependientes de ligandos que poseen la capacidad de interactuar directamente con el ADN lo que regula la actividad transcripcional de sus genes diana. Estos receptores desempeñan un papel esencial en el desarrollo, la homeostasis celular y el metabolismo. Por otra parte, los NR han estado implicados en una amplia variedad de enfermedades y, como tales, han sido el centro de los esfuerzos de desarrollo de fármacos para la industria farmacéutica.
En la nomenclatura más reciente para receptores nucleares, receptores activados por proliferador de perixomas (PPAR), la subfamilia nuclear 1 C (NR1C) comprende tres subtipos de PPAR de mamíferos: PPARa (también llamado NR1C1), PPAPp/8 (también llamado NR1C2) y PPAPy (también llamado PPARg, receptor de glitazona o NR1C3).
Los PPAR controlan la expresión de redes de genes que intervienen en la adipogénesis, el metabolismo de los lípidos, la inflamación y el mantenimiento de la homeostasis metabólica [Barish y otros, 2006]. Esos receptores nucleares activan la transcripción al unirse a elementos de secuencias de ADN, conocidos como elementos de respuesta a proliferador de peroxisomas (PPRE), en forma de heterodímero con receptores de retinoides X (conocidos como RXR).
Al igual que los receptores nucleares típicos, los PPAR están compuestos por dominios funcionales distintos, que incluyen un dominio de transactivación N-terminal (AF1), un dominio de unión al ADN (DBD) altamente conservado y un dominio de unión a ligando (LBD) C-terminal que contiene una función de transactivación dependiente de ligando (AF2) [Poulsen y otros, 2012]. El dominio C de unión al ADN, compuesto por dos dedos de zinc, se une al elemento de respuesta a proliferador de peroxisomas (PPRE) en la región reguladora de los genes diana de PPAR.
Los PPAR regulan negativamente la transcripción de genes de respuesta inflamatoria al antagonizar las vías de señalización de la proteína activadora 1 (AP-1), el factor nuclear kappa B (NF-kB), el transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3) y el factor nuclear de linfocitos T activados (NFAT) [Vanden Berghe y otros 2003].
El receptor gamma activado por proliferador de peroxisomas (PPARg) es de especial interés porque interviene en la regulación de la formación de adipocitos, la sensibilidad a la insulina y la inflamación [Fievet y otros 2006] [Stienstra y otros 2007] [Tontonoz y Spiegelman, 2008]. Este receptor nuclear se expresa en una variedad de tejidos que incluyen tejido adiposo, células del músculo esquelético, osteoclastos, osteoblastos, varias células de tipo inmunológico y en el cerebro y el sistema nervioso periférico.
Está claro que PPARg es el regulador dominante o "maestro" de la adipogénesis, debido al hecho de que es suficiente y necesario para la diferenciación de las células adiposas. Las regiones reguladoras de un gran número de genes que desempeñan funciones importantes en la lipogénesis y la sensibilidad a la insulina contienen sitios de unión para PPARg, que incluyen aP2, LPL, adiponectina y Glut4 [Rosen y MacDougald, 2006]. Por lo tanto, la activación de PPARg en el tejido adiposo afecta la sensibilidad a la insulina de todo el cuerpo.
Por otro lado, la activación de PPARg ejerce actividades antiinflamatorias en varios tipos de células al inhibir la expresión de genes proinflamatorios, lo que reduce de este modo la producción de citocinas, metaloproteasas y proteínas de fase aguda [Tontonoz y Spiegelman, 2008]. También actúa mediante el aumento de las citocinas antiinflamatorias y la inhibición de la expresión de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) [Szélesy otros, 2007].
Se ha reconocido que PPARg desempeña un papel fundamentalmente importante en la respuesta inmunitaria a través de su capacidad para dirigir la diferenciación de las células inmunitarias hacia fenotipos antiinflamatorios [Tontonoz y Spiegelman, 2008]. Curiosamente, los agonistas de PPARg han mostrado efectos antiinflamatorios y neuroprotectores en varios modelos experimentales de enfermedades de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple e ictus, así como en algunos estudios clínicos [Bernardo y Minghetti, 2008]. Además, PPARg debe considerarse formalmente un gen supresor de tumores en el sentido genético. Se expresa en una variedad de células tumorales, y la activación de PPARg por ligandos condujo a la inhibición de la proliferación celular o la inducción de la apoptosis [Tachibana y otros, 2008] [Tontonoz y Spiegelman, 2008].
Los efectos beneficiosos de la activación de PPARg pueden usarse para el tratamiento de varias enfermedades mediadas por PPARg, como se muestra en la Tabla 1. Para los propósitos de la presente descripción, enfermedad mediada por PPARg significa cualquier efecto patológico observado que podría deberse a la alteración de la función de PPARg en condiciones normales no patológicas. Esta tabla resume las acciones de los PPAR en enfermedades inflamatorias, cancerosas y otras enfermedades.
Tabla 1
Figure imgf000003_0001
Abreviaturas: l inhibición, T estimulación, células estrelladas hepáticas (HSC), células de músculo liso vascular (VSMC), proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1), T-auxiliar (Th), factor de necrosis tumoral a (TNFa), ciclooxigenasa (COX), interferón gamma (INFy), óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1) [Adaptado de Kostadinova y otros, 2005].
La proteína 2 similar a factor nuclear (de origen eritroide 2), también conocida como NFE2L2 o (Nrf2), es un factor de transcripción que en los seres humanos está codificado por el gen de NFE2L2. La vía de respuesta antioxidante de Nrf2 es la principal defensa celular contra los efectos citotóxicos del estrés oxidativo. Entre otros efectos, Nrf2 aumenta la expresión de varias enzimas antioxidantes.
La vía Keap1-Nrf2 es el principal regulador de las respuestas citoprotectoras al estrés endógeno y exógeno provocado por especies reactivas del oxígeno (ROS) y electrófilos. Las proteínas de señalización fundamentales dentro de la vía son el factor de transcripción Nrf2 que se une junto con proteínas Maf pequeñas al elemento de respuesta antioxidante (ARE) en las regiones reguladoras de los genes diana. En la condición basal, la transcripción dependiente de Nrf2 se reprime por un regulador negativo, Keapl (proteína 1 asociada a ECH de Kelch). Cuando las células se exponen a estrés oxidativo, electrófilos o agentes quimiopreventivos, Nrf2 escapa de la represión mediada por Keap1 y activa la expresión génica dependiente del elemento de respuesta antioxidante (ARE) para mantener la homeostasis redox celular.
Dado que esta respuesta de defensa celular dependiente de Nrf2 puede proteger múltiples órganos o múltiples tejidos, la activación de Nrf2 se ha implicado en conferir protección contra muchas enfermedades humanas, que incluyen cáncer, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares, lesión pulmonar aguda y crónica, enfermedades autoinmunitarias e inflamación
Nrf2 puede proteger células y tejidos contra una variedad de tóxicos y carcinógenos mediante el aumento de la expresión de varios genes citoprotectores. Así como Nrf2 protege las células normales, los estudios han demostrado que Nrf2 también puede proteger a las células cancerosas contra los agentes quimioterapéuticos y facilitar la progresión del cáncer [Na y Surh 2013].
Las células cancerosas sobreviven al oxiestrés endógeno persistente o al estrés celular inducido por especies reactivas del oxígeno (ROS), y se vuelven resistentes a ciertos agentes antineoplásicos que ejercen citotoxicidad a través de la producción de rOs . En tales condiciones, una vía de Nrf2 activa podría mantener un equilibrio redox favorable en las células cancerosas al mantener los niveles de ROS dentro de un intervalo que promueve su crecimiento y sobrevivencia. Se especula que la acumulación o activación sostenida de Nrf2 confiere a un subconjunto de células premalignas o cancerosas un entorno ventajoso para proliferar, evadir la apoptosis, hacer metástasis y tolerar la intervención terapéutica.
Se conoce que la inhibición de la sobreexpresión de Nrf2 revierte las características fenotípicas de las células cancerosas, lo que respalda esta suposición [Sporn y Liby, 2012]. Se ha observado una sobreactivación constitutiva de Nrf2 en numerosos tipos de neoplasias malignas, tales como carcinomas de células escamosas, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de vesícula biliar, cáncer de próstata, cáncer renal, ependimomas, carcinoma epitelial de ovario, cáncer de endometrio y cáncer de páncreas [Na y Surh, 2013]. Los pacientes con cáncer con un nivel constitutivamente elevado de expresión de Nrf2 en su tumor, en general, muestran una tasa de sobrevivencia más baja [Solis y otros, 2010]. Por lo tanto, Nrf2 se considera un marcador molecular de pronóstico para determinar el estado de la progresión del cáncer y contribuye a la quimiorresistencia tanto intrínseca como adquirida. Por lo tanto, este factor de transcripción antioxidante también puede actuar como un protooncogén y el aumento de la actividad de Nrf2 promueve la formación y quimiorresistencia de cánceres sólidos [Sporn y Liby, 2012].
CBG-Q (compuesto I), precursor de derivados químicos de CBG-Q (compuestos II a XII) de la presente invención, ejerce un efecto de activación sobre PPARg. Sin embargo, CBG-Q también induce la activación (ver el Ejemplo comparativo 4 y la Figura 4) de Nfr2, lo que provoca un efecto secundario no deseado ya que los tumores se vuelven resistentes a los agentes de quimioterapia, y un tratamiento crónico con activadores de Nrf2 puede dar como resultado carcinogénesis, como se explicó anteriormente. Por lo tanto, los nuevos derivados de CBG de la presente invención, ofrecen un tratamiento alternativo para el cáncer más eficaz debido a que no está presente el efecto secundario de inducción de la resistencia a la quimioterapia, observado cuando se administró CBG in vitro, debido a la sobreexpresión de Nrf2.
Entre los activadores de los ligandos de PPARg, las tiazolidindionas (TZD) son las de mayor importancia clínica [Lehmann y otros, 1995]. Por esta razón, la rosiglitazona y la pioglitazona se han usado ampliamente hasta ahora en la práctica clínica. Proporcionan efectos similares sobre el control glucémico, así como una variedad de efectos adversos similares, tales como aumento de peso, retención de líquidos y mayor riesgo de insuficiencia cardíaca, que parecen estar mediados por PPARg. Curiosamente, esas tiazolinas difieren en su efecto sobre los lípidos y el perfil de seguridad cardiovascular, lo que indica un mecanismo independiente de PPARg. De hecho, la rosiglitazona se retiró recientemente en Europa y su uso se ha restringido en EE. UU. como consecuencia del mayor riesgo de eventos cardiovasculares en pacientes con diabetes tipo 2.
Aunque las TZD son potentes agonistas completos de PPARg (PPARg-fa), sus efectos secundarios basados en mecanismos han limitado el potencial terapéutico completo de esos compuestos [Gelman y otros, 2007] [Ciudin y otros, 2012]. Pero la importancia fisiológica y terapéutica de la vía de PPARg ha promovido nuevos estudios para desarrollar nuevas clases de moléculas que reducen o eliminan los efectos adversos [Ahmadian y otros, 2013]. Por lo tanto, se ha avanzado mucho en el descubrimiento y desarrollo de moduladores selectivos de PPARg (PPARg-m) como alternativas más seguras a PPARg-fa. Los hallazgos preclínicos y clínicos sugieren claramente que los PPARg-m selectivos tienen el potencial de convertirse en la próxima generación de agonistas de PPARg: sensibilizadores de insulina eficaces con un perfil de seguridad superior al de PPARg-fa. [Doshi y otros 2010].
En este sentido, los cannabinoides naturales y sintéticos se consideran PPARg-m que alivia el proceso inflamatorio a través de la activación de PPARg. Algunos ejemplos de PPARg-m basados en cannabinoides son el ácido ajulémico [Liuy otros, 2003], [Burstein S. 2005], WIN55212-2 [Sun y Bennett, 2007], 9A-THC y CBD [O'Sullivan 2007], y CBG y derivados [Granja y otros, 2012].
La importancia clínica de la modificación covalente de proteínas con capacidad farmacológica por moléculas pequeñas se ha debatido ampliamente en los últimos años en la industria farmacéutica y, en ocasiones, la modificación covalente es la base de la actividad de fármacos exitosos [Singh y otros, 2011]. Sin embargo, todavía existe un sesgo arraigado contra los fármacos covalentes independientemente del mecanismo por el que en última instancia se unen a las biomoléculas. Las quinonas representan una clase de intermediarios toxicológicos que pueden crear una variedad de efectos peligrosos in vivo, que incluyen la citotoxicidad aguda y la inmunotoxicidad [Bolton y otros, 2000]. Los mecanismos por los que las quinonas provocan estos efectos pueden ser bastante complejos. Las quinonas son aceptores de Michael y el daño celular puede ocurrir a través de la alquilación de proteínas celulares cruciales y/o ADN. Alternativamente, las quinonas son moléculas activas altamente redox que pueden realizar un ciclo redox con sus radicales semiquinona, lo que conduce a la formación de especies reactivas del oxígeno (ROS) que pueden provocar estrés oxidativo grave dentro de las células a través de la formación de macromoléculas celulares oxidadas, que incluyen lípidos, proteínas y ADN [Monks y Jones, 2012]. Aunque existen numerosos ejemplos de compuestos basados en quinonas con uso terapéutico, debido a la preocupación por la toxicidad inespecífica y la falta de selectividad, el motivo aceptor de Michael rara vez se introduce por diseño en fármacos potenciales.
Un ejemplo de compuestos terapéuticos basados en quinonas se informa en la patente WO2011117429 que describe la síntesis de cannabigerol hidroxiquinona (también denominado CBG-Q o VCE-003 en la solicitud de patente internacional mencionada anteriormente y, para los propósitos de la presente memoria descriptiva, también llamado compuesto I) y su uso en enfermedades y afecciones que responden a la modulación de PPARg. Las enfermedades mencionadas en el documento WO/2011/117429 son: aterosclerosis, enfermedades inflamatorias del intestino, artritis reumatoide, fibrosis hepática, nefropatía, psoriasis, cicatrización de heridas cutáneas, regeneración de la piel, pancreatitis, gastritis, trastornos neurodegenerativos, cáncer; hipertensión, hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia, obesidad y diabetes tipo II. La introducción de un motivo quinona en la molécula de cannabigerol aumenta su afinidad de unión a PPARg y aumenta su actividad transcripcional.
Investigaciones adicionales muestran que el cannabigerol hidroxiquinona (CBG-Q o compuesto I) también activa el factor de transcripción Nrf2, un detector celular de estrés oxidativo/electrofílico. Por lo tanto, la introducción de un motivo quinona en el cannabigerol da como resultado dos actividades independientes, tales como las que se ejercen como agonistas de PPARg y activadores de Nrf2.
Para mejorar solo la actividad agonista de PPARg, pero sin inducir la activación de Nrf2, para evitar la inducción de resistencia a la quimioterapia, la presente invención ha desarrollado una biblioteca de nuevos compuestos a partir de cannabigerol hidroxiquinona como molde y sorprendentemente hemos encontrado que modificaciones específicas en la posición 2 dieron como resultado nuevos compuestos adecuados para el tratamiento de enfermedades relacionadas con PPARg debido a su alto efecto agonista de PPARg que carece de actividades electrofílicas (activación de Nrf2) y citotóxicas.
Esos derivados de cannabigerol hidroxiquinona de la presente invención son diferentes de los compuestos descritos en el documento WO20011117429, ya que las modificaciones en la posición 2 confieren a los compuestos de la presente invención la capacidad de activar PPARg y proteger contra la citotoxicidad inducida por glutamato. Estos compuestos también mostraron una citotoxicidad notablemente baja en líneas celulares de origen neuronal en comparación con el CBG-Q (compuesto I) comprendido en el estado de la técnica. Además, los derivados de estos compuestos muestran eficacia terapéutica en modelos animales de enfermedades (esclerosis múltiple, enfermedades de Parkinson y Huntington) ampliamente usadas para evaluar la eficacia clínica de los agonistas de PPARg.
Resumen de la invención
Partiendo de la técnica anterior, el problema de la presente invención es proporcionar derivados de cannabigerol hidroxilquinona que exhiban actividad en la modulación de PPARg sin inducir la activación de Nrf2.
Los compuestos de la invención también comprenden sus análogos, derivados, formas tautoméricas, isómeros, estereoisómeros, polimorfos, sales farmacéuticamente aceptables, solvatos farmacéuticamente aceptables y composiciones que los contienen.
Para los propósitos de la presente descripción, el término "análogo/s" se refiere a cualquier entidad derivada estructuralmente u homóloga a los compuestos de Fórmula (I).
En el contexto de esta invención, el/los "derivado/s" de los compuestos de Fórmula (I) debe/n interpretarse como cualquier análogo de CBG-Q, siempre sustituido en la posición 2 y que muestra las propiedades farmacológicas asociadas a esa sustitución en la posición 2, como se define en el presente documento, pero que también tiene reemplazos de restos en otras posiciones de la molécula CBG-Q, diferentes a los grupos mostrados en dicha Fórmula (I).
El término "tautómeros" son isómeros constitucionales de compuestos orgánicos que se interconvierten fácilmente mediante una reacción química (tautomerización).
El término "isómeros" o "estereoisómeros" se refiere a compuestos que tienen una constitución química idéntica, pero que difieren con respecto a la disposición de los átomos o grupos en el espacio.
Como se usa en el presente documento, "polimorfo" se refiere a formas cristalinas que tienen la misma composición química pero diferentes disposiciones espaciales de las moléculas, átomos y/o iones que forman el cristal.
El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquier sal farmacéuticamente aceptable que, tras la administración al paciente, puede proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto como se describe en el presente documento. Preferentemente, tales sales son sales de adición de ácido con ácidos orgánicos o inorgánicos fisiológicamente aceptables. Ejemplos de sales de adición de ácido incluyen sales de adición de ácido mineral tales como, por ejemplo, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, nitrato, fosfato y sales de adición de ácido orgánico tales como, por ejemplo, acetato, trifluoroacetato, maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato, tartrato, malato, mandelato, metanosulfonato y p-toluenosulfonato. Ejemplos de sales de adición de álcali incluyen sales inorgánicas tales como, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio y amonio, y sales de álcali orgánicas tales como, por ejemplo, etilendiamina, etanolamina, N,N-dialquilenetanolamina, trietanolamina y sales de aminoácidos básicos. Sin embargo, se apreciará que las sales que no son farmacéuticamente aceptables también caen dentro del alcance de la invención ya que pueden ser útiles en la preparación de las sales farmacéuticamente aceptables. Los procedimientos para la formación de sales son convencionales en la técnica.
El término "solvato" de acuerdo con esta invención debe entenderse como cualquier forma del compuesto activo de acuerdo con la invención en la que dicho compuesto está unido por un enlace no covalente a otra molécula (normalmente un solvente polar), que incluye especialmente hidratos y alcoholatos.
Más específicamente, en la presente invención los compuestos son derivados de derivados de cannabigerol hidroxiquinona (derivados de CBG-Q) de Fórmula (I):
Figure imgf000006_0001
en donde R es el átomo de carbono de un grupo, representado por: grupo arilo, alquenilo lineal o ramificado, alquinilo lineal o ramificado, o alcoxicarbonilo lineal o ramificado; o en donde R es el átomo de nitrógeno de un grupo, representado por: grupo alquilamino lineal o ramificado, arilamino, alquenilamino lineal o ramificado o alquinilamino lineal o ramificado; o, alternativamente, R representa un enlace entre 2 moléculas de Fórmula (I) que forman un dímero. En una modalidad preferida, los compuestos de la invención son los de Fórmula (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (X), (XI) y (XII).
Figure imgf000006_0002
6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-metoxicarbonil-[1,4]benzoquinona.
Figure imgf000006_0003
6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-etilamino-[1,4]benzoquinona.
Figure imgf000006_0004
-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-pentilamino-[1,4]benzoquinona.
Figure imgf000007_0001
-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-isobutilamino[1,4]benzoquinona.
Figure imgf000007_0002
-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-metilamino-[1,4]benzoquinona.
Figure imgf000007_0003
-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-butilamino [1,4]benzoquinona.
Figure imgf000007_0004
-(3,7-imetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-isopropilamino-[1,4]benzoquinona.
Figure imgf000007_0005
-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-bencilamino[1,4]benzoquinona
Figure imgf000007_0006
6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-(2,2-dimetil-propilamino)-[1,4]benzoquinona.
Figure imgf000008_0001
6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-(3-metil-butilamino)-[1,4]benzoquinona.
Figure imgf000008_0002
3,3-bis((E)-3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-4,4-dihidroxi-6,6-dipentiM,1-bi(ciclohexa-3,6-dieno)-2,2',5,5-tetraona Como se deducirá a continuación de los ejemplos y figuras, las modificaciones en la posición 2 comprendidas en la Fórmula general I confieren a los compuestos de la presente invención la capacidad de activar PPARg y proteger contra la citotoxicidad inducida por glutamato. Estos compuestos también mostraron una citotoxicidad notablemente baja en líneas celulares de origen neuronal en comparación con el CBG-Q (compuesto I) comprendido en el estado de la técnica. Además, los compuestos III y XII), como representativos de esta serie, mostraron eficacia terapéutica en modelos animales de enfermedades (esclerosis múltiple, enfermedades de Parkinson y Huntington) ampliamente usados para evaluar la eficacia clínica de los agonistas de PPARg.
CBG-Q, el compuesto I, es el precursor de todos los derivados de Fórmula I de la presente invención, ejemplificados por los compuestos II a XII. El precursor de CBG-Q puede sintetizarse inicialmente a partir de cannabinoides naturales tales como CBG (cannabigerol) y CBGA (ácido cannabigerólico) mediante la sustitución de algunos radicales específicos.
Se entenderá que las referencias a derivados de cannabigerol hidroxiquinona también abarcan sales farmacéuticamente aceptables de tales compuestos. El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales o ésteres preparados a partir de bases o ácidos farmacéuticamente aceptables, que incluyen bases o ácidos inorgánicos y bases o ácidos orgánicos, como sería bien conocido por cualquier experto en la técnica.
Una modalidad adicional de la presente invención se refiere al uso de compuestos de Fórmula (I) o derivados de los mismos como medicamentos, particularmente como agonistas de PPARg de los receptores de PPARg que no inducen la activación de Nfr2, particularmente en el tratamiento de enfermedades tales como aterosclerosis, enfermedades inflamatorias del intestino, artritis reumatoide, fibrosis hepática, nefropatía, psoriasis, cicatrización de heridas cutáneas, regeneración de la piel, pancreatitis, gastritis, trastornos neurodegenerativos, trastornos neuroinflamatorios, esclerodermia, cáncer, hipertensión, obesidad, diabetes tipo II y otras enfermedades que pueden tratarse con agonistas de PPARg.
Otra modalidad de la presente invención se refiere al uso de compuestos de Fórmula (I) para la fabricación de una composición para el tratamiento de enfermedades relacionadas con PPRAg con menor citotoxicidad tales como aterosclerosis, enfermedades inflamatorias del intestino, artritis reumatoide, fibrosis hepática, nefropatía, psoriasis, cicatrización de heridas cutáneas, regeneración de la piel, pancreatitis, gastritis, trastornos neurodegenerativos, trastornos neuroinflamatorios, esclerodermia, cáncer, hipertensión, obesidad, diabetes tipo II y otras enfermedades que pueden tratarse con agonistas de PPARg.
Una modalidad alternativa de la presente invención se refiere al uso de los compuestos de Fórmula (I) mencionados anteriormente solos o formulados en composiciones, particularmente composiciones farmacéuticas, que comprenden al menos uno de los compuestos de la invención combinado con al menos otro compuesto activo que tiene actividades biológicas aditivas o sinérgicas. Alternativamente, dichas composiciones pueden formularse con al menos un ingrediente inerte como portador o excipiente, tal como: cosolventes, tensioactivos, aceites, humectantes, emolientes, conservantes, estabilizadores y antioxidantes. Puede usarse cualquier tampón farmacológicamente aceptable, por ejemplo, tampones TRIS o fosfato.
Para los propósitos de la presente descripción, el término "compuesto activo o principio activo" debe tomarse como sinónimos y significa una entidad química que ejerce efectos terapéuticos cuando se administra a seres humanos o animales.
Las composiciones típicas incluyen los compuestos de la invención, o derivados de los mismos, asociados con excipientes farmacéuticamente aceptables, que pueden ser un portador o un diluyente, a modo de ejemplo. Tales composiciones pueden estar en forma de una cápsula, bolsita, papel u otro recipiente. Al preparar las composiciones, pueden usarse técnicas convencionales para la preparación de composiciones farmacéuticas. Por ejemplo, el compuesto de interés se mezclará normalmente con un portador, o se diluirá con un portador, o se incluirá dentro de un portador que puede estar en forma de ampolla, cápsula, bolsita, papel u otro recipiente. Cuando el portador sirve como diluyente, puede ser un material sólido, semisólido o líquido que actúa como vehículo, excipiente o medio para el compuesto activo. El compuesto de interés puede adsorberse en un recipiente sólido granular, por ejemplo, en una bolsita. Algunos ejemplos de portadores adecuados son agua, soluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, aceite de ricino polihidroxietoxilado, aceite de cacahuete, aceite de oliva, lactosa, terra alba, sacarosa, ciclodextrina, amilosa, estearato de magnesio, talco, gelatina, agar, pectina, goma arábiga, ácido esteárico o éteres de alquilo inferior de celulosa, ácido silícico, ácidos grasos, aminas de ácidos grasos, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos de pentaeritritol, polioxietileno, hidroximetilcelulosa y polivinilpirrolidona. De manera similar, el portador o diluyente puede incluir cualquier material de liberación sostenida conocido en la técnica, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, solo o mezclado con una cera. Las formulaciones también pueden incluir agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes conservantes, agentes edulcorantes o agentes saborizantes. Las formulaciones de la invención pueden formularse para proporcionar una liberación rápida, sostenida o retardada del ingrediente activo después de la administración al paciente mediante el empleo de procedimientos bien conocidos en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas pueden esterilizarse y mezclarse, si se desea, con agentes auxiliares, emulsionantes, sal para influir en la presión osmótica, tampones y/o sustancias colorantes y similares, que no reaccionen de forma perjudicial con los compuestos activos.
La composición podría usarse para el tratamiento de enfermedades tales como aterosclerosis, enfermedades inflamatorias del intestino, artritis reumatoide, fibrosis hepática, nefropatía, psoriasis, cicatrización de heridas cutáneas, regeneración de la piel, pancreatitis, gastritis, trastornos neurodegenerativos, trastornos neuroinflamatorios, esclerodermia, cáncer, hipertensión, obesidad, diabetes tipo II y otras enfermedades que pueden tratarse con agonistas de PPARg
Una modalidad preferida de la presente invención se refiere a la vía de administración, que puede ser cualquier vía que transporte eficazmente el compuesto de interés al sitio de acción apropiado o deseado, tal como oral, nasal, tópica, pulmonar, transdérmica o parenteral, por ejemplo, solución rectal, subcutánea, intravenosa, intrauretral, intramuscular, intranasal, oftálmica o una pomada.
Para la administración nasal, la preparación puede contener el compuesto de interés disuelto o suspendido en un portador líquido, en particular un portador acuoso, para aplicación en aerosol. El portador puede contener aditivos tales como agentes solubilizantes, por ejemplo, propilenglicol, tensioactivos, potenciadores de la absorción tales como lecitina (fosfatidilcolina) o ciclodextrina, o conservantes tales como parabenos.
Para preparar formulaciones tópicas, el compuesto de interés se coloca en un vehículo dermatológico como se conoce en la técnica. La cantidad del compuesto de interés a administrar y la concentración del compuesto en las formulaciones tópicas dependen del vehículo, sistema de suministro o dispositivo seleccionado, el estado clínico del paciente, los efectos secundarios y la estabilidad del compuesto en la formulación. Por lo tanto, el médico emplea la preparación apropiada que contiene la concentración apropiada del compuesto de interés y selecciona la cantidad de formulación administrada, en dependencia de la experiencia clínica con el paciente en cuestión o con pacientes similares.
Para aplicaciones oftálmicas, el compuesto de interés se formula en soluciones, suspensiones y pomadas apropiadas para el uso en el ojo. Normalmente, las concentraciones son las descritas anteriormente para las preparaciones locales.
Para la administración oral, pueden prepararse formas de dosificación unitaria sólidas o líquidas. Para preparar composiciones sólidas tales como comprimidos, el compuesto de interés se mezcla en formulaciones con ingredientes convencionales tales como talco, estearato de magnesio, fosfato dicálcico, silicato de magnesio y aluminio, sulfato de calcio, almidón, lactosa, goma arábiga, metilcelulosa y materiales funcionalmente similares a los diluyentes o portadores farmacéuticos.
Las cápsulas se preparan mediante la mezcla del compuesto de interés con un diluyente farmacéutico inerte y envasado de la mezcla en una cápsula de gelatina dura de tamaño apropiado. Las cápsulas de gelatina blanda se preparan mediante encapsulación mecanizada de la suspensión del compuesto de interés con un aceite vegetal aceptable, vaselina líquida ligera u otro aceite inerte. Pueden prepararse formas de dosificación unitaria líquidas para administración oral tales como jarabes, elixires y suspensiones. Las formas solubles en agua pueden disolverse en un vehículo acuoso junto con azúcar, agentes saborizantes aromáticos y conservantes para formar un jarabe. Un elixir se prepara mediante el uso de un vehículo hidroalcohólico (por ejemplo, etanol) con edulcorantes adecuados tales como azúcar y sacarina, junto con un agente saborizante aromático. Las suspensiones pueden prepararse con un vehículo acuoso con la ayuda de un agente de suspensión tal como goma arábiga, tragacanto, metilcelulosa y similares.
Las formulaciones apropiadas para el uso parenteral son evidentes para el profesional con experiencia, tales como el uso de soluciones o suspensiones inyectables adecuadas. La formulación, que es estéril, es adecuada para diversas vías tópicas o parenterales, que incluyen intradérmica, intramuscular, intravascular y subcutánea.
Además del compuesto de interés, las composiciones pueden incluir, en dependencia de la formulación y el modo de suministro deseado, portadores o diluyentes no tóxicos, farmacéuticamente aceptables, que incluyen vehículos usados comúnmente para formar composiciones farmacéuticas para administración a animales o seres humanos. El diluyente se selecciona de manera que no afecte indebidamente a la actividad biológica de la combinación.
Ejemplos de tales diluyentes que son especialmente útiles para formulaciones inyectables son agua, las diversas soluciones salinas, de sales orgánicas o inorgánicas, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica puede incluir aditivos tales como otros portadores; adyuvantes; o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares.
Además, pueden incluirse excipientes en la formulación. Los ejemplos incluyen cosolventes, tensioactivos, aceites, humectantes, emolientes, conservantes, estabilizadores y antioxidantes. Puede usarse cualquier tampón farmacológicamente aceptable, por ejemplo, tampones tris o fosfato. Las cantidades eficaces de diluyentes, aditivos y excipientes son aquellas cantidades que son eficaces para obtener una formulación farmacéuticamente aceptable en términos de solubilidad, actividad biológica, etc.
El compuesto de interés puede incorporarse en una microesfera. El compuesto de interés puede cargarse en microesferas de albúmina, de las cuales es posible recuperar tales microesferas en un polvo seco para administración nasal. Otros materiales adecuados para la preparación de microesferas incluyen agar, alginato, quitosano, almidón, hidroxietil almidón, albúmina, agarosa, dextrano, ácido hialurónico, gelatina, colágeno y caseína. Las microesferas pueden producirse mediante diversos procesos conocidos por el experto en la técnica, tales como un proceso de secado por pulverización o un proceso de emulsificación.
Por ejemplo, pueden prepararse microesferas de albúmina mediante la adición de albúmina de suero de conejo en tampón fosfato al aceite de oliva con agitación para producir una emulsión de agua en aceite. Después, se añade una solución de glutaraldehído a la emulsión y la emulsión se agita para reticular la albúmina. Las microesferas pueden aislarse después por centrifugación, el aceite se elimina y las esferas se lavan, por ejemplo, con éter de petróleo seguido de etanol. Por último, las microesferas pueden tamizarse y recolectarse y secarse por filtración. Las microesferas de almidón pueden prepararse mediante la adición de una solución de almidón acuosa tibia, por ejemplo, de almidón de papa, a una solución calentada de polietilenglicol en agua con agitación para formar una emulsión. Cuando se ha formado el sistema bifásico (con la solución de almidón como fase interna), la mezcla se enfría después a temperatura ambiente con agitación continua, después de lo cual la fase interna se convierte en partículas de gel. Después, estas partículas se filtran a temperatura ambiente y se suspenden en un solvente tal como etanol, después de lo cual las partículas se filtran de nuevo y se dejan secar al aire. Las microesferas pueden endurecerse mediante procedimientos de reticulación bien conocidos tales como tratamiento térmico o mediante el uso de agentes de reticulación química. Los agentes adecuados incluyen dialdehídos, que incluyen glioxal, malondialdehído, succinicaldehído, adipaldehído, glutaraldehído y ftalaldehído, dicetonas tales como butadiona, epiclorhidrina, polifosfato y borato. Los dialdehídos se usan para reticular proteínas tales como la albúmina mediante la interacción con grupos amino y las dicetonas forman bases de Schiff con grupos amino. La epiclorhidrina activa compuestos con nucleófilos tales como amino o hidroxilo a un derivado epóxido.
Otra modalidad preferida de la invención es el esquema de dosificación. El término "forma de dosificación unitaria" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para sujetos, por ejemplo, sujetos mamíferos, por ejemplo, seres humanos, perros, gatos y roedores, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto farmacéutico deseado en asociación con el diluyente, portador o vehículo farmacéutico requerido. Las especificaciones para las formas de dosificación unitaria de esta invención están dictadas por y dependen de (a) las características únicas del material activo y el efecto particular a lograr y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de combinar dicho material activo para el uso en seres humanos y animales. Ejemplos de formas de dosificación unitaria son comprimidos, cápsulas, píldoras, paquetes de polvo, obleas, supositorios, gránulos, sellos, cucharaditas, cucharadas, goteros, ampollas, viales, aerosoles con descargas medidas, múltiples segregados de cualquiera de los anteriores y otras formas como se describe en el presente documento. Las composiciones pueden incluirse en kits, que pueden contener una o más formas de dosificación unitaria de la composición e instrucciones de uso para tratar uno o más de los trastornos descritos en el presente documento.
Los sistemas de suministro de liberación lenta o prolongada, que incluyen cualquiera de varios biopolímeros (sistemas de base biológica), sistemas que emplean liposomas, coloides, resinas y otros sistemas de suministro poliméricos o depósitos compartimentados, pueden utilizarse con las composiciones descritas en el presente documento para proporcionar un fuente continua o a largo plazo de compuesto terapéutico. Dichos sistemas de liberación lenta son aplicables a formulaciones para suministro por vía tópica, intraocular, oral y parenteral.
En el tratamiento se emplea una cantidad eficaz del compuesto de interés. La dosis de los compuestos usados de acuerdo con la invención varía en dependencia del compuesto y de la afección en tratamiento, por ejemplo, la edad, el peso y el estado clínico del paciente receptor. Otros factores incluyen: la vía de administración, el paciente, los antecedentes médicos del paciente, la gravedad del proceso de la enfermedad y la potencia del compuesto particular. La dosis debe ser suficiente para mejorar los síntomas o signos de la enfermedad tratada sin producir una toxicidad inaceptable para el paciente. En general, una cantidad eficaz del compuesto es aquella que proporciona un alivio subjetivo de los síntomas o una mejoría objetivamente identificable según lo observado por el médico u otro observador calificado.
Una última modalidad de la presente invención se refiere a un método para el tratamiento de enfermedades tales como aterosclerosis, enfermedades inflamatorias del intestino, artritis reumatoide, fibrosis hepática, nefropatía, psoriasis, cicatrización de heridas cutáneas, regeneración de la piel, pancreatitis, gastritis, trastornos neurodegenerativos, trastornos neuroinflamatorios, esclerodermia, cáncer, hipertensión, obesidad y diabetes tipo II, que pueden tratarse con agonistas de PPARg; que comprende la administración al paciente de una cantidad eficaz de la composición anterior.
Abreviaturas:
CBG: cannabigerol.
CBGA: ácido cannabigerólico.
CBG-Q (compuesto I): cannabigerol hidroxiquinona.
DCC: diciclohexilcarbodiimida.
Keap1: proteína 1 asociada a ECH de Kelch.
NFE2L2 o (Nrf2): proteína 2 similar a factor nuclear (de origen eritroide 2).
NR1C: subfamilia nuclear 1C.
NR: receptores nucleares.
PPAR: receptores activados por proliferador de perixomas.
PPARg: receptor gamma activado por proliferador de peroxisomas también llamado PPAPy, receptor de glitazona o NRlC3.
PPARa: receptor alfa activado por proliferador de peroxisomas también llamado NR1C1.
PPARp/5: Receptor beta/delta activado por proliferador de peroxisomas también llamado NR1C2.
Descripción de las figuras
Las figuras de la invención se describen brevemente a continuación. En cada ejemplo pertinente se incluye una explicación detallada de cada figura.
Abreviaturas en las figuras:
I: se refiere a CBG-Q.
II: se refiere al compuesto de Fórmula (II).
III: se refiere al compuesto de Fórmula (III).
IV: se refiere al compuesto de Fórmula (IV).
V: se refiere al compuesto de Fórmula (V).
VI: se refiere al compuesto de Fórmula (VI).
VII: se refiere al compuesto de Fórmula (VII).
VIII: se refiere al compuesto de Fórmula (VIII).
IX: se refiere al compuesto de Fórmula (IX).
X: se refiere al compuesto de Fórmula (X.
XI: se refiere al compuesto de Fórmula (XI).
XII: se refiere al compuesto de Fórmula (XII).
Figura 1. Ensayos de transactivación de PPARg en células HEK-293
La concentración del compuesto evaluado (j M) se muestra en el eje x y la activación en veces de PPARg se muestra en el eje y. Esta figura muestra el efecto de CBG-Q o compuesto I frente al efecto de los compuestos II-VI (Figura 1A) y frente al efecto de los compuestos VII-XII (Figura 1B) sobre la actividad de PPARg, lo que ratifica que los derivados de CBG-Q (compuesto I), y especialmente los compuestos II, III, IV, V, VII, VIII y XII, pueden inducir la activación de PPARg con mayor eficiencia que CBG-Q (compuesto I). El agonista completo de PPARy rosiglitazona (RZG) 1 j M se usó como control comparativo. Se calculó el nivel de activación en veces, tomando como referencia la muestra de control (-), sin presencia de ningún agonista o agente activador de PPARg. Los datos se expresan como media ± S.D. de al menos tres experimentos independientes.
Figura 2. Ensayos de transactivación de PPARg en fibroblastos primarios dérmicos humanos.
La concentración del compuesto evaluado (j M) se muestra en el eje x y la activación en veces de PPARg se muestra en el eje y. Esta figura muestra el efecto de CBG-Q (compuesto I) frente a los compuestos II, III, IV y V sobre la actividad de PPARg, lo que ratifica que esos compuestos II, III, IV y V pueden inducir la activación de PPARg con mayor eficiencia que CBG-Q (compuesto I). El agonista completo de PPARy rosiglitazona (RZG) 1 j M se usó como control comparativo. Se calculó el nivel de activación en veces, tomando como referencia la muestra de control (-), sin presencia de ningún agonista o agente activador de PPARg. Los datos se expresan como media ± S.D. de al menos tres experimentos independientes.
Figura 3. Actividad de citotoxicidad.
Las líneas celulares de células N2a (A), HT22 (B) y MO3.13 (C) se incubaron durante 24 h con las dosis indicadas de CBG-Q (Compuesto I) frente a los compuestos II a XII y la viabilidad celular se cuantificó mediante el ensayo de MTT. Los resultados se muestran como media ± S.D. de al menos tres experimentos independientes y se expresan como porcentaje de viabilidad celular contra la muestra de control (-), sin la presencia de ningún agonista o agente activador de PPARg. El control se estableció como 100 % y los datos se refirieron a ese valor. Los resultados demuestran que la actividad citotóxica asociada a CBG-Q (compuesto I) falta en todos los derivados de CBG-Q en la posición 2 descritos en la presente invención.
Figura 4. Ensayos transcripcionales de Nrf2
Las células HaCaT-ARE-Luc se incubaron durante 6 h con los compuestos CBG-Q compuesto I) y con los compuestos I a VI (A) o con los compuestos VII a XII (B) a las concentraciones indicadas, y se prepararon lisados de proteínas y se analizaron en cuanto a la actividad luciferasa. Como control positivo se usó el prooxidante tercbutilhidroquinona (tBHQ) a 20 |j M, un compuesto que induce estrés oxidativo celular. Se calculó el nivel de activación en veces, tomando como referencia la muestra de control (-), sin presencia de ningún agonista o agente activador de PPARg. Los datos se expresan como media ± S.D. de al menos tres experimentos independientes. Los resultados ratifican que la actividad electrofílica reactiva asociada a CBG-Q (compuesto I) falta en todos los compuestos (derivados en posición 2) descritos en la presente invención.
Figura 5. Actividad neuroprotectora.
Las células N2a se preincubaron durante 1 h con los compuestos (II) a (V) y (XII) a las concentraciones indicadas. Después, las células se trataron durante 24 h con glutamato 5 mM para inducir excitotoxicidad o citotoxicidad en células neuronales inducida por neurotransmisores. La viabilidad celular se cuantificó mediante el ensayo de MTT. Los resultados se muestran como media ± S.D. de al menos tres experimentos independientes y se expresan como porcentaje de viabilidad celular contra la muestra de control (-), sin la presencia de ningún agonista o agente activador de PPARg y con (-,+) o sin (-,-) glutamato. El control se estableció como 100 % y los datos se refirieron a ese valor.
Figura 6. El compuesto (III) alivia la EAE
Se inmunizaron ratones C57BL/6 con MOG35-55 y se evaluó diariamente su puntuación clínica. Los ratones se trataron diariamente con el compuesto (III) (10 mg/kg) el día 6 después de la inmunización y los 21 días siguientes. El gráfico muestra la puntuación clínica promedio diaria (media ± SEM). Los valores se expresan como medias ± SEM para 10 animales por grupo.
Figura 7. Efecto del compuesto (III) sobre marcadores proinflamatorios (EAE)
La expresión génica de marcadores de inflamación que incluyen CCL2, IFNy, INOS, TNFa, IL-1p e IL-17 en la médula espinal se reguló negativamente en el grupo EAE+compuesto (III) (10 mg/kg) en comparación con ratones EAE+vehículo. Los niveles de expresión se calcularon con el uso del método 2-ññCt.
Figura 8. El compuesto (XII) alivia la EAE
Se inmunizaron ratones C57BL/6 con MOG35-55 y se evaluó diariamente su puntuación clínica. Los ratones se trataron diariamente con el compuesto (XII) (5 mg/kg) el día 6 después de la inmunización y los 21 días siguientes. El gráfico muestra la puntuación clínica promedio diaria (media ± SEM). Los valores se expresan como medias ± SEM para 6 animales por grupo.
Figura 9. Puntuación de comportamiento después de la intoxicación con 3NP.
Los ratones se sometieron a pruebas de comportamiento para determinar su estado neurológico después del tratamiento con los compuestos I (10 mg/kg) (A), III (10 mg/kg) (B) y XII (10 mg/kg) (C). El agarre de las patas traseras, la actividad locomotora, la distonía de las patas traseras y la distonía del tronco se calificaron de 0 a 2 según la gravedad: una puntuación de 0 indica típicamente una función normal y 2 una afectación grave. Los valores se expresan como medias ± SEM para 8 animales por grupo.
Figura 10. El compuesto III reduce la expresión de los ARNm de marcadores de inflamación en el cuerpo estriado. La expresión génica de marcadores de inflamación, que incluyen COX-2, TNFa, IL-6 e iNOS, se reguló negativamente en ratones tratados con 3NP+compuesto III (10 mg/kg) en comparación con ratones con 3NP+vehículo. Los niveles de expresión se calcularon con el uso del método 2-ññCt. Los valores se expresan como medias ± SEM para 6 animales por grupo.
Figura 11. El compuesto XII reduce la expresión de los ARNm de marcadores de inflamación en el cuerpo estriado. La expresión génica de marcadores de inflamación, que incluyen COX-2, TNFa, IL-6 e iNOS, se reguló negativamente en ratones tratados con 3NP+XII (10 mg/kg) en comparación con ratones con 3NP+vehículo. Los niveles de expresión se calcularon con el uso del método 2'ññCt. Los valores se expresan como medias ± SEM para 6 animales por grupo.
Figura 12. Efecto del compuesto XII sobre marcadores neurodegenerativos (3NP)
NeuN (marcador neuronal), GFAP (marcador de astrocitos) e Iba1 (marcador de microglía) se detectaron mediante inmunotinción en los cortes coronales del cuerpo estriado de ratones tratados con vehículo, 3NP+vehículo, 3NP+compuesto XII (10 mg/kg) y XII (10 mg/kg). Cuantificación de células positivas para NeuN (A), GFAP (B) e Iba1 (C) en el cuerpo estriado de ratón. Se muestra el número promedio total de neuronas, astrocitos y microglía. Los valores se expresan como medias ± SEM para 6 animales por grupo.
Figura 13. Efecto del compuesto (III) sobre la sintomatología de Parkinson inducida por 6-OHDA.
Los ratones C57BL/6 se inyectaron unilateralmente por vía intracerebroventricular con 6-hidroxidopamina (6-OHDA) o solución salina (ratones de control) y se sometieron a un tratamiento intraperitoneal crónico con compuesto III (10 mg/ml) o vehículo (14 días), con inicio 16 h después de la inyección de 6-OHDA. La coordinación motora se evaluó mediante el desempeño en varilla giratoria y la actividad motora se evaluó con el uso de un actímetro asistido por ordenador. Los valores se expresan como medias ± SEM para 6 animales por grupo.
Ejemplos
Los ejemplos de la presente invención descritos a continuación tienen como objetivo ilustrar sus modalidades preferidas sin limitar su alcance de protección.
Ejemplo 1. Síntesis química y análisis de NMR
Procedimientos generales para compuestos derivados de CBGA. Síntesis de los compuestos (II) y (XII))
A una solución de CBGA (ácido cannabigerólico) (360 mg, 0,80 mmol) en metanol (10 ml), se añadió diciclohexilcarbodiimida (DCC) (331 mg, 1,6 mmol) y ácido p-toluenosulfónico catalítico (aprox. 10 mg). Después de agitar durante 40 min., la reacción se trató por evaporación (Esquema 1). El residuo se disolvió en tolueno (aproximadamente 10 ml) y se enfrió (-18 °C) para precipitar la urea. Después de 1 h, la solución se filtró en un filtro de vidrio sinterizado y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida en gel de sílice RP C-18 para producir 260 mg de (E)-3-(3,7-dimetilocta-2,6-dienil)-2,4-dihidroxi-6-pentilbenzoato de metilo [espuma incolora, rendimiento: 70 %].
1H NMR (CDCla, 300 MHz) 8 ppm 12,00 (bs, 1H), 6,25 (s, 1H), 5,27 (bt, J = 6,5 Hz, 1H), 5,04 (bt, J = 6,5 Hz, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,41 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 2,05 (bm, 4H), 1,80 (bs, 3H), 1,66 (bs, 3H), 0,89 (t, J = 6,0 Hz, 3H).
Figure imgf000014_0001
Preparación del compuesto II.
6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-metoxicarbonil-[1,4]benzoquinona.
Figure imgf000014_0002
Esquema 2
A una solución de 100 mg (0,27 mmol) de (E)-3-(3,7-dimetilocta-2,6-dienil)-2,4-dihidroxi-6-pentilbenzoato de metilo en 4 ml de EtOAc, se añadió SIBX (465 mg, 0,77 mmol, 3 equiv. mol) y la reacción se calentó a reflujo durante 1 h. Después de enfriar y filtrar sobre Celite, el filtrado se lavó secuencialmente con NaHCO3 sat. y salmuera. Después de secar (Na2SO4) y evaporar, el residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (éter de petróleo-CH2Cl28:5 como eluyente) para producir 28 mg de 6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-metoxicarbonil-[1,4]benzoquinona. [sólido de color pardo, rendimiento: 25 %].
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) 8 ppm 6,95 (bs, 1H), 5,11 (bt, J = 6,5 Hz, 1H), 5,04 (bt, J = 6,5 Hz, 1H), 3,89 (s, 3H), 3,13 (d, J = 6,5 Hz, 2H), 2,38 (m, 2H), 1,72 (bs, 3H), 1,65 (bs, 3H), 1,57 (bs, 3H), 0,89 (t. J = 6,5 Hz, 3H).
Preparación del compuesto XII
3,3-bis((E)-3,7-dimetilocta-2,6-dienil)-4,4-dihidroxi-6,6-dipentiM,1-bi(ciclohexa-3,6-dieno)-2,2',5,5-tetraona
Figure imgf000015_0001
Esquema 3
A una solución de cannabigerol (CBG) (500 mg, 0,16 mmol) en tolueno (100 ml), se añadió NaH (95 %, 150 mg, 0,48 mmol, 3 equiv. mol.) y la reacción se agitó vigorosamente con el matraz abierto (Esquema 3). Se desarrolló un color violeta casi instantáneamente y, después de 12 h, la reacción se trató mediante acidificación con H2SO42 N a pH 3 y se distribuyó entre salmuera y EtOAc. La fase orgánica se secó (Na2SO4) y se evaporó, y el residuo se purificó por cromatografía en columna por gravedad en gel de sílice (éter de petróleo-EtOAc 9:1 como eluyente) para producir 120 mg de 3,3-bis((£)-3,7-dimetilocta-2,6-dienil)-4,4-dihidroxi-6,6-dipentil-1,1-bi(ciclohexa-3,6-dieno)-2,2',5,5-tetraona [goma parda oscura, rendimiento: 24 %].
1H NMR (CDCla, 300 MHz) 8 ppm: 6,99 (bs, 2H), 5,10 (bt, J = 6,5 Hz,, 2H), 5,05 (bt, J= 6,5 Hz, 2H) 3,13 (d, J= 6,5 Hz, 4H), 1,71 (s, 6H), 1,65 (s, 6H), 1,57 (s, 6H), 0,81 (t, J= 7,0 Hz,
Ejemplo 2. Síntesis química y análisis de NMR
Procedimientos generales para compuestos derivados de CBG. Síntesis de los compuestos (III) a (XI))
La síntesis de CBG-Q (compuesto I) a partir de CBG (cannabigerol) se llevó a cabo mediante el uso de tBuOK en tolueno, a t.a., en presencia de aire (Esquema 4)
Figure imgf000015_0002
Se añadió tBuOK (2,00 g, 17,824 mmol) a una solución de cannabigerol (CBG) (2,00 g, 6,319 mmol) en tolueno (400 ml), para dar una solución de color púrpura. La mezcla de reacción se agitó a t.a., en un matraz de fondo redondo abierto al aire, y la conversión se monitorizó mediante análisis por TLC (eluyente: EtOAc al 10 %/hexanos) (Esquema 5). Después de 2 h, la mezcla de reacción se lavó con HCl (solución acuosa al 5 %, 300 ml) y la capa acuosa se extrajo con EtOAc (100 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 (anhidro), se filtraron y se concentraron. El residuo crudo se sometió a cromatografía ultrarrápida en SiO2 (2 a 4 % de EtOAc/hexanos), para dar 1,10 g de CBG-Q (compuesto I) [sólido de color naranja, rendimiento: 53 %].
1H NMR (CDCla , 300 MHz): 86,94 (s, -OH, 1H), 6,45 (s, 1H), 5,13 (br t, J= 6,8 Hz, 1H), 5,04 (br t, J = 6,8 Hz, 1H), 3,14 ' (s, J = 6,8 Hz, 2H), 2,41 (t, J = 7,8 Hz, 2H), 2,09-1,92 (m, 4H), 1,73 (br s, 3H), 1,57 (br s, 3H), ca. 1,52 (m, 2H), 1,38-1,17 (m, 4H), 0,89 (t, J= 7,8 Hz, 3H).
La síntesis de derivados sustituidos en la posición 2 con alquilamino, arilamino, alquenilamino o alquinilamino se realizó mediante la reacción de CBG-Q (compuesto I) con un gran exceso de amina, a t.a., en un sistema de reacción abierto al aire (Esquema 5)
Figure imgf000016_0001
Esquema 5
Se logró una alta conversión en varias horas, para dar reacciones de punto a punto. Se concentró el solvente y se purificó el residuo crudo por cromatografía de fase inversa, para dar productos con purezas de aproximadamente 95 %.
Preparación del compuesto III
6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-etilamino-[1,4]benzoquinona
Figure imgf000016_0002
Se añadió etilamina (5,2 ml, solución al 70 % en H2O, 65,403 mmol) a una solución de CBG-Q (compuesto I) (510 mg, 1,543 mmol) en EtOH (50 ml). La mezcla de reacción se agitó a t.a. durante 2 h (Esquema 6). Se vertió en H2O (120 ml), se llevó hasta pH = 2 con HCl (solución acuosa al 10 %) y se extrajo con CH2Cl2 (2x80 ml). La capa orgánica se secó con Na2SO4 (anhidro), se filtró y se concentró. El residuo crudo se purificó por cromatografía de fase inversa (30 a 100 % de CH3CN/H2O) para dar 435 mg de 2-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-6-etilamino-3-hidroxi-5-pentil-[1,4]benzo-quinona [sólido de color púrpura, rendimiento: 75 %].
1H NMR (CDCla, 300 MHz) 8 ppm: 6,39 (bs, 1H), 5,09 (m, 2H), 3,54 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 3,05 (d, J= 6,6 Hz, 2H), 2,49 (m, 2H), 1,99 (m, 4H), 1,72 (s, 3H), 1,64 (s, 3H), 1,57 (s, 3H), 1,44-1,22 (m, 9H), 0,88 (m, 3H).
Preparación del compuesto IV
6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-pentilamino-[1,4]benzoquinona.
Figure imgf000016_0003
Se añadió amilamina (1,5 ml, 12,943 mmol) a una solución de compuesto CBG-Q (compuesto I) (109 mg, 0,330 mmol) en EtOH (10 ml). La mezcla de reacción se agitó a t.a. durante 22 h (Esquema 7). Se vertió en H2O (50 ml), se llevó a pH = 2 con HCl (solución acuosa al 10 %) y se extrajo con CH2Ch (30 ml). La capa orgánica se secó con Na2SO4 (anhidro), se filtró y se concentró. El residuo crudo se purificó por cromatografía de fase inversa (30 a 100 % de CH3CN/H2O) para dar 88 mg de 2-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-3-hidroxi-5-pentil-6-pentilamino-[1,4]benzoquinona [sólido de color púrpura, rendimiento: 64 %].
1H NMR (CDCla , 300 MHz) 8 ppm: 6,38 (bs, 1H), 5,13 (t, J = 7,1 Hz, 1H), 5,05 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 3,47 (q, J = 6,6 Hz, 2H), 3,06 (d, J = 7,1 Hz, 2H), 2,49 (m, 2H), 2,08-1,93 (m, 4H), 1,72 (s, 3H), 1,65 (s, 3H), 1,57 (s, 3H), 1,42-1,28 (m, 12H), 0,91 (m, 6H).
Preparación del compuesto V
6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-isobutilamino [1,4]benzoquinona.
Figure imgf000017_0001
Esquema 8
Se añadió isobutilamina (1,3 ml, 13,082 mmol) a una solución de compuesto CBQ-G (compuesto I) (101 mg, 0,306 mmol) en EtOH (10 ml). La mezcla de reacción se agitó a t.a. durante 8 h (Esquema 8). Se vertió en H2O (50 ml), se llevó a pH = 2 con HCl (solución acuosa al 10 %) y se extrajo con CH2Ch (30 ml). La capa orgánica se secó con Na2SO4 (anhidro), se filtró y se concentró. El residuo crudo se purificó por cromatografía de fase inversa (30 a 100 % de CH3CN/H2O) para dar 59 mg de 2-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-3-hidroxi-6-isobutilamino-5-pentil-[1,4]benzoquinona [sólido de color púrpura, rendimiento: 48 %].
1H NMR (CDCla , 250 MHz) 8 ppm: 6,60 (bs, 1H), 5,11 (m, 2H), 3,28 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 3,06 (d, J= 7,1 Hz, 2H), 2,49 (m, 2H), 2,07-1,84 (m, 4H), 1,72 (s, 3H), 1,65 (s, 3H), 1,57 (s, 3H), 1,41-1,27 (m, 7H), 1,02 (s, 3H), 0,98 (s, 3H), 0,89 (m, 3H).
Preparación del compuesto VI
6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-butilamino [1,4]benzoquinona.
Figure imgf000017_0002
Se añadió n-butilamina (1,2 ml, 12,143 mmol) a una solución de compuesto CBG-Q (compuesto I) (102 mg, 0,309 mmol) en EtOH (12 ml). La mezcla de reacción se agitó a t.a. durante 18 h (Esquema 9). Se vertió en H2O (50 ml), se llevó a pH = 2 con HCl (solución acuosa al 10 %) y se extrajo con CH2Ch (30 ml). La capa orgánica se secó con Na2SO4 (anhidro), se filtró y se concentró para obtener 190 mg de 2-butilamino-6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-[1,4]benzoquinona [sólido de color púrpura, rendimiento: 98 %].
1H NMR (CDCla, 250 MHz) 8 ppm: 6,50 (bs, 1H), 5,09 (m, 2H), 3,47 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,05 (d, J= 7,1 Hz, 2H), 2,48 (m, 2H), 2,08-1,90 (m, 4H), 1,72 (s, 3H), 1,64 (s, 3H), 1,57 (s, 3H), 1,50-1,22 (m, 10H), 1,00-0,84 (m, 6H).
Preparación del compuesto VII
6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-metilamino-[1,4]benzoquinona.
Figure imgf000017_0003
Esquema 10
Se añadió metilamina (0,6 ml, solución 8 M en EtOH, 4,8 mmol) a una solución de compuesto CBG-Q (compuesto I) (102 mg, 0,309 mmol) en EtOH (10 ml). La mezcla de reacción se agitó a t.a. durante 6 h (Esquema 10). Se vertió en H2O (50 ml), se llevó a pH = 2 con HCl (solución acuosa al 10 %) y se extrajo con CH2Ch (30 ml). La capa orgánica se secó con Na2SO4 (anhidro), se filtró y se concentró. El residuo crudo se purificó por cromatografía de fase inversa (30 a 100 % de CH3CN/H2O) para dar 23 mg de 2-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-3-hidroxi-6-metilamino-5-pentil-[1,4]benzoquinona [sólido de color púrpura, rendimiento: 20 %].
1H NMR (CDCta, 300 MHz) 8 ppm: 6,48 (bs, 1H), 5,12 (t, J= 6,6 Hz, 1H), 5,06 (t, J= 6,6 Hz, 1H), 3,20 (d, J = 6,0 Hz, 3H), 3,06 (d, J= 7,1 Hz, 2H), 2,55 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 2,07-1,92 (m, 4H), 1,72 (s, 3H), 1,65 (s, 3H), 1,57 (s, 3H), 1,49­ 1,23 (m, 6H), 0,89 (m, 3H).
Preparación del compuesto VIII
6-(3,7-imetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-isopropilamino-[1,4]benzoquinona.
Figure imgf000018_0001
Esquema 11
Se añadió isopropilamina (1,0 ml, 11,639 mmol) a una solución de compuesto CBG-Q (compuesto I) (101 mg, 0,306 mmol) en EtOH (10 ml). La mezcla de reacción se agitó a t.a. durante 18 h (Esquema 11). Se vertió en H2O (50 ml), se llevó a pH = 2 con HCl (solución acuosa al 10 %) y se extrajo con CH2Ch (30 ml). La capa orgánica se secó con Na2SO4 (anhidro), se filtró y se concentró. El residuo crudo se purificó por cromatografía de fase inversa (30 a 100 % de CH3CN/H2O) para dar 62 mg de 2-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-3-hidroxi-6-isopropilamino-5-pentil-[1,4]benzoquinona [sólido de color púrpura, rendimiento: 52 %].
1H NMR (CDCla , 300 MHz) 8 ppm: 6,37 (s, 1H), 5,13 (t, J= 6,6 Hz, 1H), 5,05 (t, J= 6,6 Hz, 1H), 3,98 (m, 1H), 3,06 (d, J= 7,1 Hz, 2H), 2,47 (m, 2H), 2,08-1,92 (m, 4H), 1,72 (s, 3H), 1,65 (s, 3H), 1,57 (s, 3H), 1,42-1,29 (m, 6H), 1,28 (s, 3H), 1,25 (s, 3H), 0,89 (m, 3H).
Preparación del compuesto IX
6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-bencilamino [1,4]benzoquinona.
Figure imgf000018_0002
Esquema 12
Se añadió bencilamina (1,3 ml, 11,913 mmol) a una solución de compuesto CBG-Q (compuesto I) (100 mg, 0,302 mmol) en EtOH (13 ml). La mezcla de reacción se agitó a t.a. durante 18 h (Esquema 12). Se vertió en H2O (50 ml), se llevó a pH = 2 con HCl (solución acuosa al 10 %) y se extrajo con CH2Ch (30 ml). La capa orgánica se secó con Na2SO4 (anhidro), se filtró y se concentró. El residuo crudo se purificó por cromatografía de fase inversa (30 a 100 % de CH3CN/H2O) para dar 61 mg de 2-bencilamino-6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-[1,4]benzoquinona [sólido de color púrpura, rendimiento: 46 %].
1H NMR (CDCla , 300 MHz) 8 ppm: 7,43-7,27 (m, 5H), 6,80 (bs, 1H), 5,18-5,02 (m, 2H), 4,67 (d, J= 5,5 Hz, 2H), 3,07 (d, J= 6,6 Hz, 2H), 2,47 (t, J= 7,7 Hz, 2H), 2,09-1,92 (m, 4H), 1,72 (s, 3H), 1,65 (m, 3H), 1,57 (s, 3H), 1,47-1,24 (m, 6H), 0,88 (m, 3H).
Preparación del compuesto X
6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-(2,2-dimetil-propilamino)-[1,4]benzoquinona.
Figure imgf000018_0003
Se añadió neopentilamina (1,4 ml, 12,063 mmol) a una solución de compuesto CBG-Q (compuesto I) (100 mg, 0,303 mmol) en EtOH (14 ml). La mezcla de reacción se agitó a t.a. durante 18 h (Esquema 13). Se vertió en H2O (50 ml), se llevó a pH = 2 con HCl (solución acuosa al 10 %) y se extrajo con CH2Ch (30 ml). La capa orgánica se secó con Na2SO4 (anhidro), se filtró y se concentró. El residuo crudo se purificó por cromatografía de fase inversa (30 a 100 % de CH3CN/H2O) para dar 72 mg de 2-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-6-(2,2-dimetil-propilamino)-3-hidroxi-5-pentil [1,4]benzoquinona [sólido de color púrpura, rendimiento: 65 %].
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) 8 ppm: 6,62 (s, 1H), 5,14 (t, J= 6,6 Hz, 1H), 5,05 (t, J= 6,6 Hz, 1H), 3,27 (d, J= 6,0 Hz, 2H), 3,07 (d, J= 7,1 Hz, 2H), 2,50 (t, J= 7,1 Hz, 2H), 2,09-1,92 (m, 4H), 1,72 (s, 3H), 1,65 (s, 3H), 1,57 (s, 3H), 1,47­ 1,25 (m, 6H), 1,02 (s, 9H), 0,90 (t, J = 6,6 Hz, 3H).
Preparación del compuesto XI
6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-(3-metil-butilamino)-[1,4]benzoquinona.
Figure imgf000019_0001
Esquema 14
Se añadió isopentilamina (1,4 ml, 11,886 mmol) a una solución de compuesto CBG-Q (compuesto I) (100 mg, 0,303 mmol) en EtOH (14 ml). La mezcla de reacción se agitó a t.a. durante 18 h (esquema 14). Se vertió en H2O (50 ml), se llevó a pH = 2 con HCl (solución acuosa al 10 %) y se extrajo con CH2Ch (30 ml). La capa orgánica se secó con Na2SO4 (anhidro), se filtró y se concentró. El residuo crudo se purificó por cromatografía de fase inversa (30 a 100 % de CH3CN/H2O) para dar 40 mg de 2-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-3-hidroxi-6-(3-metilbutilamino)-5-pentil-[1,4]benzoquinona [sólido de color púrpura, rendimiento: 55 %].
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) 8 ppm: 6,38 (bs, 1H), 5,09 (m, 2H), 3,50 (q, J= 6,0 Hz, 2H), 3,06 (d, J= 7,1 Hz, 2H), 2,51 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 2,11-1,92 (m, 4H), 1,72 (s, 3H), 1,65 (s, 3H), 1,57 (s, 3H), 1,48-1,24 (m, 7H), 0,96 (s, 3H), 0,94 (s, 3H), 0,89 (m, 3H).
Ensayos in vitro
Ejemplo 2. Actividad agonista de PPARg.
Para investigar las actividades biológicas de los nuevos compuestos, se realizaron ensayos de transactivación de PPARg en células HEK-293 y células de fibroblastos primarios humanos.
Las células HEK293T y las células de fibroblastos primarios humanos se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía 5 % de CO2 en DMEM complementado con suero fetal de ternero (FBS) al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % (v/v). La rosiglitazona se adquirió de Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, EE. UU.). Todos los demás reactivos fueron de Sigma Co (St Louis, MO, EE. UU.). Se sembraron células HEK293T (2x103/pocillo) (Figura 1) o fibroblastos primarios dérmicos humanos (5x103/pocillo) (Figura 2) en BD Falcon™ White con placa Microtest™ Optilux™ de 96 pocillos de fondo transparente durante 24 horas. Posteriormente, las células se cotransfectaron transitoriamente con el vector de expresión GAL4-PPARy y el vector indicador de luciferasa GAL4-luc con el uso de Roti©-Fect (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se pretrataron con dosis crecientes de los compuestos durante 6 horas. Después, las células se lisaron en trifosfato 25 mM pH 7,8, MgCh 8 mM, DTT 1 mM, Triton X-100 al 1 % y glicerol al 7 %. La actividad luciferasa se midió en el lisado celular con el uso de un lector de microplacas multimodo TriStar LB 941 (Berthold) y según las instrucciones del kit de ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI, EE. UU.). La concentración de proteína se midió mediante el ensayo de Bradford (Bio-Rad, Richmond, CA, EE. UU.). El fondo obtenido con el tampón de lisis se restó en cada valor experimental y la transactivación específica se expresó como una inducción en veces respecto a las células no tratadas. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces. Los plásmidos usados fueron Gal4-hPPARgamma (nombre del plásmido: pCMV-BD-hPPARg, elaborado en el Laboratorio Sinal, Departamento de Farmacología, Universidad de Dalhousie) y el plásmido indicador Gal4 luc que incluye cinco sitios de unión al ADN de Gal4 fusionados con el gen de luciferasa. El ensayo anterior se ilustra en la Figura 1 y la Figura 2, que muestra el efecto de CBG-Q (compuesto I) y derivados sobre la actividad de PPARg mediante un ensayo de transactivación realizado en células que sobreexpresan transitoriamente PPARg en combinación con un gen indicador de luciferasa (PPARg-GAL4/GAL4-LUC) y tratadas con los compuestos durante 6 horas. Los datos se dan como medias con barras de error estándar de desviación de tres réplicas. Se observó un aumento significativo de la actividad luciferasa con los derivados de quinona en comparación con las células no tratadas. Este resultado confirma que el compuesto II es significativamente más potente que el compuesto CBG-Q (compuesto I) para activar PPARg a concentraciones de 1 a 25 pM. Los compuestos III a XII aumentan la transactivación de PPARg de una manera dependiente de la concentración, III, IV, V y XII son los compuestos más activos. Además, concentraciones más altas (25 y 50 mM) de estos compuestos son particularmente potentes para activar PPARg en comparación con CBG-Q (compuesto I). La rosiglitazona, un agonista completo de PPARg, aumentó más de 100 veces la actividad de PPARg a la concentración de 1 pM. Por el contrario, la inducción máxima de la actividad de PPARg inducida por una concentración de 1 pM de los compuestos descritos en la presente invención nunca fue superior a 12 veces (es decir, el compuesto II), lo que indica que estos nuevos compuestos son moduladores de PPARg y no agonistas completos de PPARg.
Ejemplo 3. Ensayos de citotoxicidad.
Las quinonas electrofílicas inducen citotoxicidad y activan la vía de Nrf2, un detector celular de generación de especies reactivas del oxígeno. En la Figura 3 se analiza la inducción de la muerte celular en tres tipos diferentes de células (N2a, HT22 y MO3.13) por los compuestos CBG-Q (compuesto I) y los compuestos (II) a (XII).
Tres líneas celulares, células MO3.13, N2A y HT22 se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía 5 % de CO2 en DMEM complementado con suero fetal de ternero (FBS) al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % (v/v). La viabilidad de las células N2A, HT22 y MO3.13 se determinó mediante el ensayo de MTT. Brevemente, las células se sembraron a una densidad de 104 células/pocillo en placas de 96 pocillos, 200 ml de suspensión celular por pocillo, y se cultivaron durante 24 horas. Después, las células se incubaron con varias concentraciones de los compuestos durante 24 horas. Después de eso, se añadió a cada pocillo 100 ml de MTT (5 mg/ml) de una solución de mezcla de MTT: DMEM (1:2) y las células se incubaron durante 4 h a 37 °C en la oscuridad. Después se detuvo la reacción, se eliminó el sobrenadante y se añadió 100 ml de DMSO a cada pocillo y se incubó durante 10 minutos con agitación suave. Por último, se midió la absorbancia a 550 nm con el uso de un TriStar LB 941 (Berthold Technologies, GmbH & Co. KG). Las células de control se establecieron como 100 % y los datos se refirieron a ese valor. Las líneas celulares de células N2a (Figura 3A), HT22 (Figura 3B) y MO3.13 (Figura 3C) se incubaron durante 24 h con las dosis indicadas de compuestos CBG-Q (compuesto I) y compuestos (II) a (XII), y la viabilidad celular se cuantificó mediante el ensayo de MTT. Los resultados se muestran como media ± S.D. de al menos tres experimentos independientes y se expresan como porcentaje de viabilidad celular contra la muestra de control (-). El control se estableció como 100 % y los datos se refirieron a ese valor. Los resultados demuestran que la actividad citotóxica asociada a CBG-Q (compuesto I) se correlacionó con su capacidad para inducir la activación de Nrf2. En el mismo sentido, la falta de actividad citotóxica para los derivados de los compuestos II a XII en la posición 2 de CBG-Q) descritos en la presente invención, se correlaciona con su incapacidad para activar Nrf2. Ejemplo 4. Actividad transcripcional de Nrf2.
Para estudiar la actividad de los compuestos en la vía de Nrf2 se generó la línea celular HaCaT-ARE-Luc. El plásmido indicador Nqo1 ARE-Luc y el plásmido pPGK-Puro se cotransfectaron en células HaCat con el uso del reactivo de transfección Lipofectamine© 2000 (Life Technologies, Carlsbad, Ca, EE. UU.). Se seleccionaron transformantes estables y se mantuvieron en RPMI 1640 que contenía FBS al 10 %, penicilina-estreptomicina al 1 % y puromicina 10 pl/ml. Las células HaCaT-ARE-Luc se incubaron durante 6 h con CBG-Q (compuesto I) y con los compuestos (II)-(VI) (A) o con los compuestos (VII)-(XII) (B) a las concentraciones indicadas, y se prepararon lisados de proteínas y se analizaron en cuanto a la actividad luciferasa como se describió en el Ejemplo 1. Se usó como control positivo el prooxidante terc-butilhidroquinona (tBHQ) a 20 pM. Se calculó el nivel de activación en veces, tomando como referencia la muestra de control (-) (Figura 4A y 4B). Los datos se expresan como media ± S.D. de al menos tres experimentos independientes. Los resultados ratifican que la actividad electrofílica reactiva asociada a CBG-Q (compuesto I) falta en todos los compuestos (derivados en posición 2) descritos en la presente invención. Ejemplo 5. Ensayos de neuroprotección.
La activación del receptor nuclear antiinflamatorio PPARg desempeña un papel importante en la neuroprotección y se conoce que los agonistas de PPARg previenen la citotoxicidad inducida por glutamato en las células neuronales. Las células N2A cultivadas se preincubaron con los compuestos II, III, IV, V y XII a las concentraciones indicadas durante 1 h y después se trataron con glutamato 5 mM para inducir excitotoxicidad durante 24 h (Figura 5). La citotoxicidad se determinó mediante el método de MTT como se describió en el Ejemplo 3. Los resultados se muestran como media ± S.D. de al menos tres experimentos independientes y se expresan como porcentaje de viabilidad celular contra la muestra de control (-). El control se estableció como 100 % y los datos se refirieron a ese valor.
Estos resultados muestran que los compuestos II, III, IV, V y XII, que son moduladores de PPARg, también protegen a las células neuronales contra la apoptosis inducida por glutamato.
Ensayos in vivo
Ejemplo 6. Inducción de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE)
Los moduladores de PPARg son de uso terapéutico para trastornos neurodegenerativos e inflamatorios y se han investigado los efectos de dos compuestos representativos de la presente invención en tres modelos animales bien definidos de inflamación y neurodegeneración.
Se indujo EAE en ratones C57BL/6 hembras a las 6-8 semanas de edad mediante inmunización subcutánea con polipéptido de glicoproteína oligodendrocitaria de la mielina (MOG35_55) (300 |jg) y 200 |jg de Mycobacterium tuberculosis (H37Ra Difco, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) en una mezcla 1:1 con adyuvante incompleto de Freund (CFA, Sigma-Aldrich, Madrid, España). El mismo día y 2 días después, los ratones se inyectaron por vía intraperitoneal (ip) con 200 ng de toxina pertussis (Sigma-Aldrich, Madrid, España) en 0,1 ml de PBS. Los animales de control (CFA) se inocularon con la misma emulsión sin MOG y no recibieron toxina pertussis. El tratamiento comenzó el día 6 después de la inmunización (p.i.) y consistió en inyecciones diarias de los compuestos III (Figura 6) y XII (Figura 8) a las dosis indicadas o del vehículo solo (DMSO/PBS) durante los siguientes 21 días. Los ratones se examinaron diariamente en busca de signos clínicos de EAE y las puntuaciones de enfermedad se midieron como sigue: 0, sin enfermedad; 1, cola flácida; 2, cola flácida y debilidad de las patas traseras; 3, parálisis de las patas traseras; 4, parálisis de las patas traseras y de las patas delanteras; 5, moribundo y muerto. Todos los animales se sacrificaron a los 28 días (p.i.) para su análisis adicional. Una vez sacrificados, los animales se diseccionaron y sus médulas espinales se extrajeron rápidamente y se congelaron enseguida en RNAlater (Sigma-Aldric, Alemania). En la Figura 6 se muestra que el compuesto III atenuó claramente las manifestaciones clínicas de la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) inducida por inmunización subcutánea con (MOG35-55). Los ratones tratados con vehículo desarrollaron una enfermedad grave que alcanzó su punto máximo el día 16 después de la inyección (pi) y alcanzó una puntuación de 2,5 (la puntuación máxima es 3). En los ratones que recibieron el compuesto III, la enfermedad alcanzó su punto máximo el día 17 después de la inyección sin alcanzar una puntuación de 1,3 durante el transcurso del experimento (día 6-día 28). Los síntomas clínicos en EAE se correlacionaron con la expresión de genes proinflamatorios Ccl2, iNOs, TNFa, IFNg, IL-1b e IL-17 en la médula espinal de ratones EAE que recibieron el vehículo solo. Por el contrario, hubo una disminución significativa en todos estos parámetros en los ratones EAE que recibieron el compuesto III (Figura 7). Por otra parte, en la Figura 8 se muestra que el compuesto XII también alivió los síntomas clínicos en ratones EAE en la misma medida que el compuesto III lo que confirma la actividad antiinflamatoria de los compuestos descritos en la presente invención.
Ejemplo 7. Inducción de la enfermedad de Huntington (modelo 3NP).
La intoxicación de ratones con ácido 3-nitropropiónico (3-NP), un potente inhibidor irreversible de la enzima del complejo mitocondrial II, conduce a disfunción mitocondrial y estrés oxidativo en modelos animales que da como resultado una miríada de efectos neurológicos, bioquímicos e histológicos que recuerdan algunos aspectos de la patología de la HD. Por ejemplo, los ratones tratados con 3NP exhibieron altas puntuaciones en el agarre de las patas traseras, distonía, cifosis y en la actividad locomotora general en comparación con los animales de control. Se indujeron lesiones del cuerpo estriado con 3-NP en ratones C57BL/6 machos adultos (16 semanas de edad; 30 g) (Harlan Ibérica, Barcelona, España). Con este fin, los ratones se sometieron a siete inyecciones intraperitoneales (i.p.) de 3NP (una inyección cada 12 horas) a una dosis de 50 mg/kg (preparada en solución salina tamponada con fosfato) durante 3 días. Estos animales y sus respectivos controles no lesionados se usaron para estudios farmacológicos con los compuestos CBG-Q (compuesto I) y con los compuestos III y XII (Figura 9). Se usaron al menos 6-8 animales por grupo experimental. Los tratamientos consistieron en cuatro inyecciones i.p. de los compuestos a las dosis indicadas (una inyección cada 24 horas), o vehículo (DMSO al 0,2 %, BSA al 5 % en PBS) 30 min antes de las inyecciones de 3NP. Todos los animales se sacrificaron 12 horas después de la última inyección de 3NP. Una vez sacrificados, los animales se diseccionaron y sus cerebros se extrajeron rápidamente. Se usó el hemisferio derecho para diseccionar el cuerpo estriado, que se congeló enseguida en RNAlater (Sigma-Aldrich, Alemania) para analizar los marcadores de inflamación mediante PCR en tiempo real. El hemisferio izquierdo se fijó en paraformaldehído fresco al 4 % (en solución salina tamponada con fosfato 0,1 M) durante 48 horas a 4 °C y se incluyó en cera de parafina para análisis histológico. Los ratones se sometieron a pruebas de comportamiento para determinar su estado neurológico. Se evaluó la actividad locomotora general, el agarre y distonía de las patas traseras y la distonía del tronco. Todas las pruebas de comportamiento se realizaron antes de las inyecciones de fármacos para evitar efectos agudos de los compuestos en investigación.
La Figura 9 muestra que CBG-Q (compuesto I) no pudo prevenir los síntomas clínicos inducidos por la intoxicación con 3-NP pero los compuestos III y XII alivian claramente tal sintomatología.
También se usó el parénquima estriatal de ratones lesionados con 3NP para el análisis de algunos marcadores histológicos y moleculares relacionados con la inflamación y la neurodegeneración, que se ven afectados en este modelo experimental. La expresión de las enzimas inflamatorias COX-2 e iNOs se reguló positivamente de manera significativa en los ratones lesionados con 3NP en paralelo al aumento de la expresión de las citocinas proinflamatorias TNFa e IL-6. Los compuestos III (Figura 10) y XII (Figura 11) atenuaron la regulación positiva de los marcadores proinflamatorios COX-2, iNOS, TNFa e IL-6 en el cuerpo estriado de ratones tratados con 3NP.
En la Figura 12 se muestra que el parénquima estriatal de estos animales lesionados con 3NP mostró un importante grado de muerte neuronal que se confirmó por inmunohistoquímica de NeuN, que demostró una reducción de más del 50 % en el inmunomarcaje de este marcador neuronal en el parénquima estriatal. La pérdida de neuronas estuvo acompañada de una notable disminución de las células GFAP+ (astrogliosis) y una mayor expresión de células Iba-1+ (microgliosis reactiva). El compuesto XII originó una conservación de las neuronas estriatales contra la toxicidad por 3NP según reveló la tinción de NeuN. Por otra parte, el tratamiento con el Compuesto XII contrarrestó la pérdida de células GFAP+ inducida por 3NP y previno la inducción de microgliosis reactiva (células Iba-1+).
Ejemplo 8. Inducción de la enfermedad de Parkinson (modelo 6-OHDA).
El compuesto III también fue de uso terapéutico en un modelo murino de enfermedad de Parkinson (PD).
Se anestesiaron ratones C57BL/6 pretratados por vía intracerebroventricular (i.c.v.) con una inyección intraperitoneal (i.p.) de 200 mg/kg de 2,2,2-tribromoetanol (Sigma-Aldrich) y se colocaron en un marco estereotáxico con un adaptador de ratón (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EE. UU.). Con el uso de una jeringa Hamilton (Hamilton, Bonaduz, Suiza), se inyectaron 4 ml de solución de 6-OHDA-HBr (5 pg/pl) en ácido ascórbico al 0,02 % (SigmaAldrich) en el cuerpo estriado izquierdo en dos depósitos en las siguientes coordenadas estereotáxicas (mm desde el bregma): AP, 0,65; L, -2,0; V1, -4 y V2, -3,5, dirigidas al cuerpo estriado dorsolateral. Después de la inyección, la piel se suturó y los animales se retiraron del instrumento estereotáxico y se colocaron sobre una almohadilla térmica durante 30 min. Los ratones se sometieron a tratamiento intraperitoneal crónico con compuesto III (10 mg/ml) o vehículo (14 días), con inicio 16 h después de la inyección de 6-OHDA. La coordinación motora se evaluó en la prueba de varilla giratoria (Ugo Basile, Roma, Italia) a velocidad creciente. Cada día, los ratones tenían una sesión de entrenamiento de 1 min en la varilla inmóvil. Si el ratón se caía de la varilla giratoria durante la sesión de entrenamiento, se volvía a colocar. Después, se evaluó el desempeño de los ratones en sesiones de 5 min cada 20 min. Así, la velocidad de la varilla se puso en marcha hasta 40 rpm durante cinco minutos. La demora en caerse de la varilla se midió en días consecutivos en ratones lesionados tras la administración del compuesto III o el control de vehículo. La actividad motora (actividad ambulatoria, velocidad media, tiempo de reposo, movimientos rápidos y número de incorporaciones) se evaluó con el uso de un actímetro asistido por ordenador (Figura 13).
La Figura 13 muestra que la aparición de síntomas motores que se asemejan a la PD humana (cambios en la actividad ambulatoria, velocidad media, tiempo de reposo, movimiento rápido, número de incorporaciones y desempeño en varilla giratoria) producidos con 6-hidroxidopamina (6OHDA) se suprimieron casi por completo mediante el tratamiento con el compuesto III.
Ejemplo 9. Análisis histológico (Ejemplo 7).
Los cerebros del modelo 3NP se fijaron en paraformaldehído al 4 % y cortes de 5 pm de grosor para el análisis inmunohistoquímico de NeuN (Figura 12A), un marcador de neuronas, GFAP (Figura 12B), un marcador de astrocitos e Iba-1 (Figura 12C), un marcador de células microgliales. Para la inmunohistoquímica, los cortes se incubaron durante la noche a 4 °C con: (i) anticuerpo monoclonal anti-NeuN de ratón (Millipore, MA, EE. UU.) usado a 1/100; (ii) anticuerpo monoclonal anti-Iba-1 de ratón (Millipore, MA, EE. UU.) usado a 1/50, (iii) anticuerpo monoclonal anti-GFAp de ratón (Santa Cruz Biotechnology, CA, EE. UU.) usado a 1/50. Después de la incubación con el anticuerpo primario correspondiente, los cortes se lavaron en PBS 0,1 M y se incubaron O/N a 4° con anticuerpo secundario de cabra antirratón (Millipore, MA, EE. UU.). La reacción se reveló con diaminobencidina. Se obtuvieron cortes de control negativo con el uso del mismo protocolo con omisión del anticuerpo primario. Todos los cortes de cada procedimiento inmunohistoquímico se procesaron al mismo tiempo y en las mismas condiciones. Se usaron un microscopio Leica DM2500 y una cámara Leica DFC 420C para la observación y fotografiado de los portaobjetos, y todo el procesamiento de imágenes se hizo con el uso de ImageJ, el software desarrollado y distribuido sin costos por los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (Bethesda. MD, EE. UU.).
Ejemplo 10. PCR cuantitativa en tiempo real usada en la invención (Ejemplos 6 y 7).
Se aisló el ARN total del cuerpo estriado (modelo 3NP) o de la médula espinal (modelo EAE) con el uso del mini kit de tejido lipídico RNeasy (Qiagen, GmbH). La cantidad total de ARN extraído se cuantificó por espectrometría a 260 nm y su pureza a partir de la relación entre los valores de absorbancia a 260 y 280 nm. Se eliminó el ADN genómico para eliminar la contaminación por ADN. Se sintetizó ADN complementario monocatenario a partir de hasta 1 pg de ARN total (combinación de al menos 3 animales por grupo) con el uso del kit de síntesis de ADNc iScript™ (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). La mezcla de reacción se mantuvo congelada a -20 °C hasta la amplificación enzimática. Se usó la mezcla iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) para cuantificar los niveles de ARNm de COX-2, TNF-a, IL-6, IL-17, IL-1p, IFN-y, CCL-2 o iNOS en dependencia del modelo de enfermedad. La PCR en tiempo real se realizó con el uso de un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad). Se usó el gen constitutivo de GAPDH para estandarizar los niveles de expresión de ARNm en cada muestra. Los niveles de expresión se calcularon con el uso del método 2'ññCt. Las secuencias de los cebadores oligonucleotídicos se proporcionan en la Tabla 2.
Tabla 2. Lista de secuencias de cebadores de ratón usadas en la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa.
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Los presentes resultados corroboran el uso terapéutico de los compuestos descritos en las presentes invenciones, particularmente los compuestos II, III, IV, V y XII en enfermedades neurodegenerativas y trastornos cerebrales traumáticos en los que la neuroinflamación y la neurotoxicidad desempeñan un papel importante. Además, los compuestos de la invención son particularmente adecuados como agonistas de PPARg particularmente para el tratamiento de enfermedades inflamatorias (ver la Tabla 1 del estado de la técnica), enfermedades metabólicas y diabetes tipo II.
Referencias:
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Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Compuestos de Fórmula (I),
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en donde R es el átomo de carbono de un grupo, representado por: grupo arilo, alquenilo lineal o ramificado, alquinilo lineal o ramificado, o alcoxicarbonilo lineal o ramificado; o en donde R es el átomo de nitrógeno de un grupo, representado por: grupo alquilamino lineal o ramificado, arilamino, alquenilamino lineal o ramificado, o alquinilamino lineal o ramificado; o, alternativamente, R representa un enlace entre 2 moléculas de Fórmula (I) que forman un dímero
2. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 seleccionado de:
Figure imgf000027_0002
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3. Composiciones que comprenden un compuesto de Fórmula I y, opcionalmente, al menos un compuesto activo adicional que tiene actividades biológicas aditivas o sinérgicas y/o al menos un ingrediente farmacéutico inerte, tal como un excipiente y/o un portador, en donde el compuesto de Fórmula (I) es
Figure imgf000029_0002
en donde R es el átomo de carbono de un grupo, representado por: grupo arilo, alquenilo lineal o ramificado, alquinilo lineal o ramificado, o alcoxicarbonilo lineal o ramificado; o en donde R es el átomo de nitrógeno de un grupo, representado por: grupo alquilamino lineal o ramificado, arilamino, alquenilamino lineal o ramificado, o alquinilamino lineal o ramificado; o, alternativamente, R representa un enlace entre 2 moléculas de Fórmula (I) que forman un dímero.
4. Composición de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el compuesto de Fórmula I se selecciona de:
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Figure imgf000030_0001
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5. Compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para el uso como medicamento.
6. Compuesto, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, para el uso en el tratamiento de enfermedades mediadas por PPRAg.
7. Compuesto para el uso, de acuerdo con la reivindicación 6, en el tratamiento de una enfermedad mediada por PPRAg seleccionada de: aterosclerosis, enfermedades inflamatorias del intestino, artritis reumatoide, fibrosis hepática, nefropatía, psoriasis, cicatrización de heridas cutáneas, regeneración de la piel, pancreatitis, gastritis, trastornos neurodegenerativos, trastornos neuroinflamatorios, esclerodermia, cáncer, hipertensión, obesidad o diabetes tipo II.
8. Composición, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4 para el uso como medicamento
9. Composición, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, para el uso en el tratamiento de enfermedades mediadas por PPRAg.
10. Composición para el uso, de acuerdo con la reivindicación 9, en el tratamiento de una enfermedad mediada por PPRAg seleccionada de: aterosclerosis, enfermedades inflamatorias del intestino, artritis reumatoide, fibrosis hepática, nefropatía, psoriasis, cicatrización de heridas cutáneas, regeneración de la piel, pancreatitis, gastritis, trastornos neurodegenerativos, trastornos neuroinflamatorios, esclerodermia, cáncer, hipertensión, obesidad o diabetes tipo II.
11. Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 seleccionado de 6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-metoxicarbonil-[1,4]benzoquinona; 6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-etilamino-[1,4]benzoquinona; 6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-pentilamino-[1,4]benzoquinona; 6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-isobutilamino-[1,4]benzoquinona; 6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-butilamino-[1.4] benzoquinona; 6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-metilamino-[1,4]benzoquinona; 6-(3,7-imetilocta-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-isopropilamino-[1,4]benzoquinona; 6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-bencilamino-[1,4]benzoquinona; 6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-(2,2-dimetilpropilamino)[1,4]benzoquinona; 6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-(3-metilbutilamino)[1,4]benzoquinona; y 3,3'-bis((E)-3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-4,4'-dihidroxi-6,6'-dipentil-1,1'-bi(ciclohexa-3,6-dieno)-2,2',5,5'-tetraona.
12. Composición de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el compuesto de Fórmula (I) se selecciona de 6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-metoxicarbonil-[1,4]benzoquinona; 6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-etilamino-[1,4]benzoquinona; 6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-pentilamino-[1.4] benzoquinona; 6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-isobutilamino-[1,4]benzoquinona; 6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-butilamino-[1,4]benzoquinona; 6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-metilamino-[1,4]benzoquinona; 6-(3,7-imetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-isopropilamino-[1.4] benzoquinona; 6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-bencilamino-[1,4]benzoquinona; 6-(3,7 dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-(2,2-dimetil-propilamino)[1,4]benzoquinona; 6-(3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-5-hidroxi-3-pentil-2-(3-metil-butilamino)[1,4]benzoquinona; y 3,3'-bis((E)-3,7-dimetil-octa-2,6-dienil)-4,4'-dihidroxi-6,6-dipentiM,1-bi(ddohexa-3,6-dieno)-2,2',5,5-tetraona.
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