CN106047935B - 一种靶向基因载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种骨靶向基因载体，所述骨靶向基因载体为阿仑膦酸钠改性的脂质体，所述阿仑膦酸钠改性的脂质体包括阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇以及阿仑膦酸钠改性的磷脂，所述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇构成磷脂层，所述阿仑膦酸钠改性的磷脂穿插于所述磷脂层中并与所述磷脂层形成囊泡结构，所述阿仑膦酸钠暴露在所述磷脂层之外。该骨靶向基因载体对骨组织有较高的靶向性和转染效率，可以负载基因物质在骨组织附近高效表达。本发明还提供了该骨靶向基因载体的制备方法及应用。

Description

一种靶向基因载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及非病毒基因传递系统领域，具体涉及一种骨靶向基因载体及其制备方法和应用。
背景技术
基因治疗是一种通过基因载体将目标基因传递到靶细胞内，通过添加、阻断、纠正基因等方法实现治疗疾病的目的。基因治疗为一些重大疾病提供了一种很有发展前途的治疗方法。然而，高效、靶向性的基因载体的匮乏，制约着基因治疗在临床上的广泛应用。无疑成为基因治疗成功与否的关键所在。
目前，基因载体主要有病毒型载体和非病毒型载体。应用较多的是无免疫反应、造价低廉、可大量重复生产的非病毒型载体。非病毒载体主要包括脂质体、聚乙烯亚胺(PEI)、壳聚糖等，这些非病毒载体通过静电作用与DNA复合形成基因传输系统进行基因转染。其中，脂质体是唯一被FDA批准的纳米载药体系，具有良好的生物相容性、可降解性，因而广泛地应用于非病毒转基因载体。但脂质体作为非病毒转基因载体的转染效率一般较低、缺乏靶向性，因此，如何提高脂质体非病毒转基因载体的靶向性以及转染效率成为研究重点。
发明内容
为解决上述问题，本发明旨在提供一种骨靶向基因载体及其制备方法和应用。该骨靶向基因载体具有双磷酸基，对骨组织有较高的靶向性和转染效率。该载体对基因物质有较好的稳定作用，可使基因物质在骨组织附近高效表达。该基因载体的毒性低、安全有效。
第一方面，本发明提供了一种骨靶向基因载体，所述骨靶向基因载体为阿仑膦酸钠改性的脂质体，所述阿仑膦酸钠改性的脂质体包括阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇以及阿仑膦酸钠改性的磷脂，所述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇构成磷脂层，所述阿仑膦酸钠改性的磷脂穿插于所述磷脂层中并与所述磷脂层形成囊泡结构，所述阿仑膦酸钠暴露在所述磷脂层之外。
优选地，所述骨靶向基因载体的粒径为40-200nm。
优选地，所述阿仑膦酸钠改性的磷脂与所述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇的摩尔比为(0.01-0.07)：(1-3)：(0.5-1)：(0.1-1)。这样的摩尔比，可有助于各个组分之间形成形貌较规则、分散性良好、粒径分布较均匀、结构稳定的骨靶向基因载体，不易被人体体液稀释、溶解而解体，有利于靶向到骨细胞，用该骨靶向基因载体包裹基因物质在生物医学应用有较大优势。
进一步优选地，所述阿仑膦酸钠改性的磷脂与所述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇的摩尔比为(0.01-0.07)：(2-3)：(0.5-1)：(0.5-1)。
本发明中，所述阿仑膦酸钠改性的磷脂包括阿仑膦酸钠以及通过酰胺键与其相连的磷脂。
优选地，所述阿仑膦酸钠改性的磷脂包括聚乙二醇衍生化磷脂和通过酰胺键与聚乙二醇衍生化磷脂连接的阿仑膦酸钠。
优选地，所述阳离子类脂包括(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane,DOTAP)、(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(N-[l-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-tri-methylammonium chloride,DOTMA)和双十八烷基二甲基溴化胺(DODAB)中的一种或多种。
本发明中，所述阳离子类脂为整个脂质体提高正电荷，在转运基因的过程中起主要作用，且具有在体外稳定性好、在体内可生物降解的特点。阳离子类脂的疏水尾链会影响所形成脂质体的稳定性与流动性，而亲水的阳离子头部的电荷特性则会影响到所形成脂质体的表面特性。
更优选地，所述阳离子类脂为DOTAP。
优选地，所述中性辅助类脂包括二油酰磷脂酰乙醇胺(1,2-dioleyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine,DOPE)、二油酰磷脂酰胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DOPC)、二油酰基甘油基磷脂酰丝氨酸(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine,DOPS)、双(单酰基甘油)磷酸酯(bis(monomyristoylglycero)phosphate,BMP)和卵磷脂(phosphatidylglycerol,PG)中的一种或多种。
更优选地，所述中性辅助类脂为二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。DOPE具有很强的细胞膜去稳定化作用，富含DOPE的阳离子脂质体可辅助DNA转染，提供转染效率。DOPE能促进脂质体的形成，尤其是在酸性条件下促进脂质体向反六角形相的过渡，有利于与细胞膜进行融合。
本发明的所述述骨靶向基因载体中，胆固醇可镶嵌于阳离子类脂、中性辅助类脂分子之间，共同形成磷脂层，可以提高所述基因载体包覆基因后形成的基因载体复合物的体内转染活性。
优选地，所述聚乙二醇衍生化磷脂是由聚乙二醇通过共价键和磷脂类物质相连得到，所述聚乙二醇分子的分子量为200～20000道尔顿。所述磷脂类物质可以为人工合成的或自然界存在的磷脂，所述磷脂类物质包括但不限于二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)或胆固醇。具体地，聚乙二醇分子的分子量可以为200、500、1000、2000、5000、7000、10000、15000或20000。
阿仑膦酸钠为双磷酸类化合物，其分子中含有-NH2活性官能团，可以理解的是，所述阿仑膦酸钠改性的磷脂是通过阿仑膦酸钠的氨基与羧基化的聚乙二醇衍生化磷脂通过酰胺键连接而成。
更优选地，所述羧基化的聚乙二醇衍生化磷脂为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧酸共聚(DSPE-PEG-COOH)。此时，所述阿仑膦酸钠改性的磷脂为阿仑膦酸钠-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG-Aln)。
进一步优选地，DSPE-PEG-Aln与所述DOTAP、DOPE、胆固醇的摩尔比为(0.01-0.07)：(1-3)：(0.5-1)：(0.5-1)。
本发明第一方面提供的所述骨靶向基因载体表面修饰有阿仑膦酸的主体部分，该基因载体对骨组织有较好的亲和性，其分子中的双磷酸基能与羟基磷灰石高效地结合，能够高靶向性地将目的基因物质递送到骨细胞内，有利于目的基因后续的表达。此外，所述骨靶向基因载体的表面稳定地修饰有阿伦膦酸-聚乙二醇，可以有效、长时间地稳定所述骨靶向基因载体，延长体内循环的时间，低成本，低毒，安全有效。
第二方面，本发明提供了一种骨靶向基因载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)将聚乙二醇衍生化磷脂溶于第一溶剂，并加入催化剂、缩合剂活化，再加入溶解在第一溶剂中的阿伦膦酸钠，在室温下进行酰胺化反应8-12h，得到反应液，将所述反应液经分离纯化后进行冷冻干燥，得到阿仑膦酸钠改性的磷脂，其中，所述聚乙二醇衍生化磷脂的羧基与阿仑膦酸钠的氨基的摩尔比为(1-10):1；
(2)取上述阿仑膦酸钠改性的磷脂，与阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇加入到反应器中，加入有机溶剂，混合均匀后得到第一混合溶液，通过旋转蒸发法去除所述第一混合溶液中的溶剂，得到膜状材料；
(3)加入磷酸盐缓冲溶液溶解所述膜材料，并进行超声处理，得到第二混合溶液，将所述第二混合溶液采用微孔过滤膜来回挤压过滤多次，得到骨靶向基因载体，其中，所述骨靶向基因载体为阿仑膦酸钠改性的脂质体，所述阿仑膦酸钠改性的脂质体包括阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇以及阿仑膦酸钠改性的磷脂，所述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇构成磷脂层，所述阿仑膦酸钠改性的磷脂穿插于所述磷脂层中并与所述磷脂层形成囊泡结构，所述阿仑膦酸钠暴露在所述磷脂层之外。
优选地，阿仑膦酸钠改性的磷脂与所述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇的摩尔比为(0.01-0.07)：(1-3)：(0.5-1)：(0.1-1)。
进一步优选地，所述阿仑膦酸钠改性的磷脂与所述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇的摩尔比为(0.01-0.07)：(2-3)：(0.5-1)：(0.5-1)。
优选地，所述骨靶向基因载体的粒径为40-200nm。
进一步优选地，所述骨靶向基因载体的粒径为50-150nm。
优选地，所述阳离子类脂包括DOTAP、DOTMA和DODAB的一种或多种。
更优选地，所述阳离子类脂为DOTAP。
优选地，所述中性辅助类脂包括DOPE、DOPC、DOPS、BMP和PG中的一种或多种。
更优选地，所述中性辅助类脂为DOPE。
优选地，所述阿仑膦酸钠改性的磷脂包括聚乙二醇衍生化磷脂和通过酰胺键与聚乙二醇衍生化磷脂连接的阿仑膦酸钠。所述磷脂类物质包括但不限于二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)或胆固醇。
进一步优选地，所述聚乙二醇衍生化磷脂是由聚乙二醇通过共价键和磷脂类物质相连得到，所述聚乙二醇分子的分子量为200～20000道尔顿。
更优选地，所述阿仑膦酸钠改性的磷脂为阿仑膦酸钠-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG-Aln)。
进一步优选地，DSPE-PEG-Aln与所述DOTAP、DOPE、胆固醇的摩尔比为(0.01-0.07)：(1-3)：(0.5-1)：(0.5-1)。
优选地，步骤(1)中，所述第一溶剂包括水、pH值为5.5～6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(简称为“MES缓冲溶液”)、pH值为7.0～7.4的磷酸盐缓冲液等。
优选地，步骤(1)中，所述分离纯化为采用截留分子量为500-1000Da的透析袋进行透析48-72h。
步骤(1)中，所述酰胺化反应的方法为本领域的技术人员所熟知。催化剂又可称为活化剂，常与缩合剂联用，用于酰胺化反应。
优选地，步骤(1)中，所述缩合剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称EDC)。
优选地，步骤(1)中，所述催化剂包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(Sufo-NHS)、1-羟基苯并三唑(HOBT)中的一种或多种。
进一步优选地，所述酰胺化反应的时间为8h。
优选地，所述活化的时间为1-4h。可以为1h、2h、3h或4h。
优选地，步骤(2)中，所述有机溶剂为氯仿或者为氯仿和甲醇的混合溶液。
进一步优选地，所述有机溶剂的体积为1-3mL。
优选地，步骤(2)中，在所述去除第一混合溶液中的溶剂之后，还包括：将烧瓶置于真空干燥箱中进行抽真空4-8h，并干燥过夜。
优选地，步骤(3)中，所述超声处理具体为：
先在功率为50W下进行水浴超声30-60min，然后采用探针式超声仪在20kHz的频率和750W的功率下进行超声4-8min。
优选地，步骤(3)中，所述微孔过滤膜为孔径为0.1-0.2μm的聚碳酸酯膜。
进一步优选地，步骤(3)中，将所述第二混合溶液先采用孔径为0.2μm的聚碳酸酯膜挤压2～5次后，再通过孔径为0.1μm的聚碳酸酯膜挤压2-5次。
本发明第二发明提供的所述骨靶向基因载体的制备方法，先通过聚乙二醇衍生化磷脂与阿伦磷酸钠的酰胺缩合反应形成阿仑膦酸钠改性的磷脂，再通过薄膜分散法将阿仑膦酸钠改性的磷脂与阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇构建阿伦磷酸修饰的脂质体，即骨靶向基因载体。此方法获得的基因载体的细胞毒性低、生物相容性好、骨靶向效率高、转染效率显著。所述骨靶向基因载体的制备方法简单，操作方便，条件温和，具有广阔的应用前景。
第三方面，本发明提供了一种基因递送系统，所述基因递送系统为基因物质和上述所述的骨靶向基因载体通过静电作用形成的纳米微球，其中，所述骨靶向基因载体与所述基因物质的氮磷比为(2-12)：1。
如本发明所述的，所述“氮磷比”为骨靶向基因载体的阳离子类脂中氨基的摩尔数与所述基因物质中磷酸根的摩尔数之比。
本发明中，骨靶向基因载体中的阳离子类脂与基因物质的氮磷比为(2-12)：1，可以有效地提高基因载体与基因物质的复合效率，以及基因递送系统的表面电荷、胶体稳定性及粒径大小。
优选地，所述基因递送系统的平均粒径为50-200nm。
所述基因物质包括但不限于脱氧核糖核酸、质粒DNA、微环DNA、核糖核酸中的一种或多种。
更优选地，所述基因物质包括pSDF-1质粒和peSDF-1质粒中的一种或两种。
所述基因递送系统中，所述骨靶向基因载体表面修饰有阿仑膦酸钠，该基因载体对骨组织有较好的亲和性，其分子中的双磷酸基能与羟基磷灰石高效地结合，能够高靶向性地将目的基因物质递送到骨细胞内，有利于目的基因后续的表达。
第四方面，本发明提供了一种基因递送系统的制备方法，包括以下步骤：
将基因物质和上述所述的骨靶向基因载体溶解于灭菌纯水后，得到混合液，然后室温静置，所述混合液中的骨靶向基因载体和所述基因物质通过静电作用形成纳米微球，得到所述基因递送系统，其中，所述骨靶向基因载体与所述基因物质的氮磷比为(2-12)：1。
优选地，所述骨靶向基因载体的浓度为0.7-2.1mg/mL(载体自身的浓度，未混合前)。以体系中阳离子类脂(如DOTAP)的质量含量进行计量。例如，可以是0.7、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0、2.1mg/mL。
优选地，所述基因物质和所述骨靶向基因载体的体积比为1:1。
优选地，所述孵育的时间为10-50min。所述孵育直接在室温下进行反应，无须加热或降温，所述孵育温度为20-37℃。
第五方面，本发明第一方面所述的骨靶向基因载体或如本发明第三方面所述的基因递送系统在制备基因治疗药物(优选为靶向投递药物)中的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的所述骨靶向基因载体，其表面修饰有阿仑膦酸钠，所述骨靶向基因载体对对骨组织有较好的亲和性、靶向性，其分子中的双磷酸基能与羟基磷灰石高效地结合；
(2)所述骨靶向基因载体具有良好的生物相容性和骨靶向性，能够有效与基因物质进行复合形成基因递送系统，将基因物质携带进入骨细胞，进而促进基因物质在骨组织局部高表达靶向目标物质，基因转染效率高，安全有效；
(3)可以通过调节阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇与及阿仑膦酸钠改性的磷脂之间的用量来调控制备的骨靶向基因载体的大小、稳定性；
(4)所述骨靶向基因载体的制备方法简单，操作方便，条件温和，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例一制得的骨靶向基因载体的结构示意图；
图2为本发明实施例一中制得的阿伦膦酸钠改性的磷脂的核磁谱图表征；
图3为本发明实施例一制得的骨靶向基因载体的透射电镜图；
图4为本发明实施例二制得的骨靶向基因载体的靶向效率图；
图5为本发明实施例一制得的骨靶向基因载体对GFP质粒的细胞转染效果图；
图6为本发明实施例一制得的骨靶向基因载体对pGL-3control质粒的转染效率柱状图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
pGL3-control这种质粒DNA中包含有北美萤火虫尾部的荧光素酶基因，它可以在哺乳动物细胞中表达出荧光素酶。而生成的荧光素酶作为一种生物催化剂可以催化某类化学反应，在发生化学反应的同时会产生生物荧光。所以采用该质粒DNA作为报告基因可以充分保证排除实验干扰，并且由于所发出荧光的强度可以用萤光计检测，从而可以通过测量转染后的荧光强度来定量的表征所制备的阳离子脂质体的转染效率。
实施例一
一种骨靶向基因载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备阿伦膦酸钠改性的磷脂DSPE-PEG2000-Aln：
以1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为活化剂，将0.24mmol的DSPE-PEG2000-COOH在室温下溶于MES缓冲溶液(0.05mol/L，pH＝5.5)中，向上述溶液中加入EDC和NHS在冰水浴条件下反应活化羧基2h，其中，DSPE-PEG2000-COOH:EDC:NHS的摩尔比为0.03：1.25：0.8；
将0.5mmol的阿伦磷酸钠预先溶于适量的MES缓冲溶液(0.05mol/L，pH＝5.5)中，再加入上述活化后的反应液中，在搅拌条件下进行酰胺化缩合反应8h，将得到的反应液用截留分子量为1000Da的透析袋在去离子水中透析48小时，以除去未反应的DSPE-PEG2000-COOH、阿伦磷酸钠等；将透析后的产品进行冷冻干燥得到白色固体，即为DSPE-PEG2000-Aln；其中，DSPE-PEG2000-COOH的羧基与阿仑膦酸钠的氨基的摩尔比为2.08：1；
(2)骨靶向基因载体的制备：
将DOTAP、DOPE、胆固醇Chol与上述制得的DSPE-PEG2000-Aln溶于氯仿，并加到烧瓶中，其中各物料的摩尔比为DSPE-PEG2000-Aln：DOTAP:DOPE:Chol:＝0.02:2:0.5:0.5；混合均匀后得到第一混合溶液，在40℃的真空条件下通过旋转蒸发法去除得到第一混合溶液中的氯仿，在烧瓶内壁形成一层均匀的薄膜，然后抽真空6h，并将上述烧瓶放置于真空干燥箱中真空干燥过夜，得到薄膜材料(脂质体薄层)；
(3)用pH为7.4的PBS缓冲溶液对上述干燥的薄膜材料进行水化，然后先在功率为50W下进行40℃的水浴超声60min，使烧瓶壁上的薄膜溶解于PBS溶液中；再采用探针式超声仪以20kHz的频率和750W的功率进行超声4min，超声间隔为2s，直至溶液呈现蓝色乳光状态，得到第二混合溶液；
将超声后的第二混合溶液于4℃下放置过夜，采用Avanti脂质体挤出器进行粒径控制，将所述第二混合溶液先采用孔径为0.2μm的聚碳酸酯膜挤压3次后，再通过孔径为0.1μm的聚碳酸酯膜挤压3次，获得骨靶向基因载体。
图1为实施例一制备的骨靶向基因载体的结构示意图，图中1为阿仑膦酸钠改性的磷脂，2为磷脂层。所述骨靶向基因载体为阿仑膦酸钠改性的脂质体，所述阿仑膦酸钠改性的脂质体包括阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇以及阿仑膦酸钠改性的磷脂1，所述阿仑膦酸钠改性的磷脂1包括聚乙二醇衍生化磷脂(DSPE-PEG-COOH)和通过酰胺键与聚乙二醇衍生化磷脂连接的阿仑膦酸钠；所述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇构成磷脂层2，所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂(即DSPE端)穿插于所述磷脂层中2并与所述磷脂层2形成囊泡结构，所述阿仑膦酸钠暴露在所述磷脂层2之外。
本实施例中，步骤(1)的反应式如下所示：
对实施例一步骤(1)中制备的DSPE-PEG2000-Aln溶于氘代氯仿中，在400MHzBruker ARX 400的核磁共振光谱仪上扫描氢谱以进行结构表征，结果见图2。从图1可以看出，与单独的DSPE-PEG2000-COOH和阿伦磷酸钠的核磁谱图相比，DSPE-PEG2000-Aln的氢谱出现的δ2.0(CONH–CHCH2CH2–)特征峰，这表明阿仑膦酸钠已经被修饰到DSPE-PEG2000-COOH的主链上。
实施例一的骨靶向基因载体的TEM表征：
用10μL的移液枪吸取1滴实施例一制备的骨靶向基因载体样品悬液，滴在含有碳膜的铜网上，用镊子夹着铜网，滴液后静置数分钟，然后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，滴上1％的磷钨酸负染色液，染色1～2分钟后用滤纸吸去负染色液，再用蒸馏水滴在铜网上洗1～2次，用滤纸吸去水，待干后用透射电镜观察。图3为本发明实施例一制得的骨靶向基因载体的透射电镜图(TEM)。从图3中可以看出，所述骨靶向基因载体的粒径为45±2nm。
实施例二
一种骨靶向基因载体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，采用荧光标记物NBD-F(4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂恶二唑)标记的二油酰磷脂酰胆碱DOPC(简写为NBD-PC)替换实施例1中的DOPE，其他条件同实施例一。
本发明实施例二所制得的骨靶向基因载体中，各物料的摩尔比为DSPE-PEG2000-Aln:DOTAP:NBD-PC:Chol＝0.02:2:0.5:0.5。所述骨靶向基因载体的粒径为50nm。
同时为了突出本发明的有益效果，还将未采用阿仑膦酸改性的脂质体(简称为“无靶向基因载体”)作为对照，即采用未经阿伦膦酸钠改性的磷脂DSPE-PEG2000替换实施例二的DSPE-PEG2000-Aln，其中，无靶向基因载体中各物料的摩尔比为DSPE-PEG2000:DOTAP:NBD-PC:Chol＝0.02:2:0.5:0.5。
实施例三
一种骨靶向基因载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备阿伦膦酸钠改性的磷脂DSPE-PEG2000-Aln：同实施例1；
(2)骨靶向基因载体的制备：
将DOTAP、DOPE、胆固醇Chol与上述制得的DSPE-PEG2000-Aln溶于氯仿，并加入烧瓶中，混合均匀后得到总体积为2mL的第一混合溶液，其中，各物料的摩尔比为DOTAP:DOPE:Chol:DSPE-PEG2000-Aln＝0.02:2:1:1；在40℃真空条件下通过旋转蒸发法去除所述第一混合溶液中的氯仿，在烧瓶内壁形成一层均匀的薄膜，然后将上述烧瓶放置于真空干燥箱中抽真空6h，并真空状态下干燥过夜，得到薄膜材料(脂质体薄层)；
(3)用pH为7.4的PBS缓冲溶液对上述干燥的薄膜材料进行水化，然后先在功率为50W下进行水浴超声30min，使烧瓶壁上的薄膜溶解于PBS溶液中；再采用探针式超声仪以20kHz的频率和750W的功率进行超声5min，超声间隔为2s，直至溶液呈现蓝色乳光状态，得到第二混合溶液；
将超声后的第二混合溶液于4℃下放置过夜以充分水化，采用Avanti脂质体挤出器，将脂质体依次通过孔径为0.2μm、0.1μm的聚碳酸酯膜进行粒径控制，获得骨靶向基因载体。
实施例四
一种骨靶向基因载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备阿伦膦酸钠改性的磷脂DSPE-PEG7000-Aln：同实施例1；
(2)骨靶向基因载体的制备：
将DOTAP、DOPE、胆固醇Chol与上述制得的DSPE-PEG7000-Aln溶于氯仿，以各物料的摩尔比为DSPE-PEG7000-Aln：DOTAP:DOPE:Chol＝0.05：3:1:1；用移液枪准确吸取各方组分物质，加入烧瓶中混合均匀后，得到总体积为1.5mL的第一混合溶液，在40℃真空条件下通过旋转蒸发法去除氯仿，在烧瓶内壁形成一层均匀的薄膜，然后将上述烧瓶放置于真空干燥箱中抽真空6h，并真空状态下干燥过夜，得到薄膜材料(脂质体薄层)；
(3)用pH为7.4的PBS缓冲溶液对上述干燥的薄膜材料进行水化，然后先在功率为50W下进行40℃的水浴超声45min，使烧瓶壁上的薄膜溶解于PBS溶液中；再采用探针式超声仪以20kHz的频率和750W的功率进行超声4min，超声间隔为2s，直至溶液呈现蓝色乳光状态，得到第二混合溶液；
将超声后的第二混合溶液于4℃下放置过夜充分水化，采用Avanti脂质体挤出器，将脂质体依次通过孔径为0.2μm、0.1μm的聚碳酸酯膜进行粒径控制，获得骨靶向基因载体。
实施例五
一种骨靶向基因载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备阿伦膦酸钠改性的磷脂DSPE-PEG10000-Aln：同实施例1；
(2)骨靶向基因载体的制备：
将DOTMA、DOPS、胆固醇Chol与上述制得的DSPE-PEG10000-Aln溶于氯仿，加入烧瓶中，其中各物料的摩尔比为DSPE-PEG10000-Aln：DOTMA:DOPS:Chol＝0.01:1:0.6:0.1；混合均匀后得到总体积为1mL的第一混合溶液，在40℃的真空条件下通过旋转蒸发法去除得到第一混合溶液中的氯仿，在烧瓶内壁形成一层均匀的薄膜，然后将上述烧瓶放置于真空干燥箱中抽真空4h，并真空状态下干燥过夜，得到薄膜材料(脂质体薄层)；
(3)用pH为7.4的PBS缓冲溶液对上述干燥的薄膜材料进行水化，然后先在功率为50W下进行40℃的水浴超声40min，使烧瓶壁上的薄膜溶解于PBS溶液中；再采用探针式超声仪以20kHz的频率和750W的功率进行超声5min，超声间隔为2s，直至溶液呈现蓝色乳光状态，得到第二混合溶液；
将超声后的第二混合溶液于4℃下放置过夜，采用Avanti脂质体挤出器进行粒径控制，将所述第二混合溶液先采用孔径为0.2μm的聚碳酸酯膜挤压5次后，再通过孔径为0.1μm的聚碳酸酯膜挤压5次，获得骨靶向基因载体。
实施例六
一种骨靶向基因载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备阿伦膦酸钠改性的磷脂DSPE-PEG20000-Aln：同实施例1；
(2)骨靶向基因载体的制备：
将DODAB、BMP、胆固醇Chol与上述DSPE-PEG20000-Aln溶于氯仿，以各物料的摩尔比为DSPE-PEG20000-Aln：DODAB:BMP:Chol＝0.07:2:0.8:0.6；用移液枪准确吸取各组分，加入烧瓶中，混合均匀后得到总体积为3mL的第一混合溶液，在40℃真空条件下通过旋转蒸发法去除氯仿，在烧瓶内壁形成一层均匀的薄膜，然后将上述烧瓶放置于真空干燥箱中抽真空5h，并真空状态下干燥过夜，得到薄膜材料(脂质体薄层)；
(3)用pH为7.4的PBS缓冲溶液对上述干燥的薄膜材料进行水化，然后先在功率为50W下进行40℃的水浴超声50min，使烧瓶壁上的薄膜溶解于PBS溶液中；再采用探针式超声仪以20kHz的频率和750W的功率进行超声6min，超声间隔为2s，直至溶液呈现蓝色乳光状态，得到第二混合溶液；
将超声后的第二混合溶液于4℃下放置过夜，采用Avanti脂质体挤出器进行粒径控制，将所述第二混合溶液先采用孔径为0.2μm的聚碳酸酯膜挤压4次后，再通过孔径为0.1μm的聚碳酸酯膜挤压4次，获得骨靶向基因载体。
实施例七
一种基因递送系统的制备方法，包括以下步骤：
将实施例一制得的骨靶向基因载体(浓度为0.7mg/mL)与质粒DNA(具体为pSDF-1质粒DNA)分别溶解在灭菌纯水后，用0.22μm滤膜过滤除菌得到骨靶向基因载体溶液、质粒DNA溶液，将两种溶液以等体积比进行混合，得到混合溶液，快速吹打上述混合溶液30次，并在室温下共同孵育30min，获得基因递送系统；其中，所述骨靶向基因载体在混合液中的最终浓度为0.35mg/mL，所述骨靶向基因载体与所述质粒DNA的氮磷比为4：1，所述基因递送系统为质粒DNA和上述骨靶向基因载体通过静电作用形成的纳米微球。
实施例八
一种基因递送系统的制备方法，包括以下步骤：
将实施例三制得的骨靶向基因载体(浓度为2.0mg/mL)与质粒DNA(具体为peSDF-1质粒DNA)分别溶解在灭菌纯水后，用0.22μm滤膜过滤除菌得到骨靶向基因载体溶液、质粒DNA溶液，将两种溶液以等体积比进行混合，得到混合溶液，快速吹打上述混合溶液30次，并在室温下共同孵育30min，获得基因递送系统；其中，所述骨靶向基因载体在混合液中的最终浓度为1.0mg/mL，所述骨靶向基因载体与所述质粒DNA的氮磷比为12：1，所述基因递送系统为质粒DNA和上述骨靶向基因载体通过静电作用形成的纳米微球。
效果实施例：
1、骨靶向基因载体的靶向效率测定
将本发明实施例二制得的荧光骨靶向基因载体与荧光无靶向基因载体使用荧光分光光度计在激发波长＝533nm下，分别检测DOTAP终浓度相同(均为0.7mg/mL)的靶向脂质体、无靶向脂质体的荧光强度a1；
取20mg的羟基磷灰石(HAP)分散至2mL的PBS配成10mg/mL的分散液；将10μL上述荧光靶向脂质体、荧光无靶向脂质体分别与HAP在缓慢震荡下共培养5h，在5000rpm下高速离心后，分别检测其上清液的荧光强度a2，其中：HAP的结合率＝(a1-a2)/a1×100％。靶向效率的测试结果如图4所示。其中，图4中A为荧光无靶向脂质体的靶向效率图(即结合HAP前后，上清液的荧光强度变化)，图4中B为荧光骨靶向基因载体的靶向效率图。
从图4可以明显看出，在荧光骨靶向基因载体与HAP共培养之后，两者高效结合，在离心之后，荧光骨靶向基因载体与HAP的复合物基本位于下层沉淀中，使得上清液的荧光强度大大降低。由图4可以看出，连接有DSPE-PEG2000-Aln的脂质体与HAP的结合能力显著高于无靶向脂质体，经计算，其结合率从13.7％提高到61.4％。由于实施例制得的骨靶向基因载体的外面修饰有阿仑膦酸，而阿仑膦酸钠分子中的双磷酸基能与羟基磷灰石高效结合，也进一步提高了所述骨靶向基因载体对HAP的亲和性，以上结果表明本发明制得的骨靶向基因载体具有良好的靶向性，也进一步佐证了阿仑膦酸改性的磷脂成功嵌入到脂质体上，并暴露在外面。
2、骨靶向基因载体的细胞相容性研究：
收集COS-1细胞，以1×104/孔的细胞浓度分于96孔板，体积100uL，边缘孔用无菌PBS填充。置37℃、5％CO2温箱培养使细胞贴壁。
将实施例一制得的骨靶向基因载体(起始浓度为0.7mg/mL)用DMEM基础培养基进行稀释，终浓度分别为2,6,10,50μg/mL,体积为100μL。以商业脂质体Lipofectamine 2000为阳性对照，正常培养的COS-1细胞为空白对照。并设置3个仅含培养液的复孔以扣除背景吸收。
弃去原有培养液，分别加入含各浓度载体药物的培养液，做好标记，放入培养箱培养48h。然后每孔加入10μL的cck-8溶液，继续培养4h。终止培养，使用酶标仪在450nm处测量各孔的吸光值OD。
细胞活性(％)＝[OD(加药)-OD(背景)]/[OD(0加药)-OD(背景)]×100％；
OD(加药)：含cell、cck-8和骨靶向基因载体(或Lipofectamine 2000)的孔的吸光值；
OD(背景)：仅含DMEM、cck-8的孔的吸光值；
OD(空白)：仅含cell、cck-8的孔的吸光值。
实验结果显示，实施例一制得的骨靶向基因载体对COS-1细胞显示出良好的细胞相容性。当载体的作用浓度高达50μg/mL时，细胞存活率达到91.45％，远远高于阳性对照Lipofectamine 2000脂质体相同浓度作用下的细胞存活率4.43％。
3、骨靶向基因载体的细胞转染效率研究
(1)GFP质粒转染细胞：
将COS-1细胞(1×105/孔)接种在24孔培养板中，加入0.5mL含有10％胎牛血清的DMEM培养基，置于CO2孵箱中37℃下培养过夜。
将实施例一制得的骨靶向基因载体(简写为Aln-lipo)用0.22μm过滤除菌后，用灭菌纯水稀释后与GFP质粒DNA溶液混合(脂质体与DNA混合的氮磷摩尔比为4:1)，培育30分钟后得到纳米微球，即基因递送系统。同时以商业脂质体LipofectamineTM 2000作为阳性对照，也以氮磷摩尔比为4:1与GFP质粒DNA复合，并单纯加质粒DNA为阴性对照。
用PBS轻轻洗涤细胞，每孔中加入无血清无抗生素的DMEM培养基0.5mL，以及50μL的以上不同处理药物(Aln-lipo复合的DNA、Lipo2000复合的DNA、单纯的质粒DNA)，每孔的DNA含量为1μg。轻轻摇晃混匀，置于CO2孵箱中37℃孵育6h。移去转染液，用10％胎牛血清的DMEM培养基替换转染液，继续培养42h。48h后利用倒置荧光显微镜观察GFP绿色荧光蛋白的表达，结果见图5。
图5的结果表明，本发明制得的骨靶向纳米转基因载体对GFP质粒DNA的转染效率高于LipofectamineTM 2000。
(2)pGL-3control转染细胞：
将COS-1细胞(1×105/孔)接种于24孔培养板，过夜培养至细胞融合度为70％～80％时，用PBS洗涤后加入450μL不含抗生素的培养基。将实施例一制得的骨靶向纳米转基因载体和商业上常用的脂质体LipofectamineTM 2000用0.22μm滤膜进行过滤除菌后，并用灭菌纯水稀释后，按不同的氮磷比分别与pGL-3control质粒DNA溶液混合(其中，实施例1制得的骨靶向基因载体和pGL-3control质粒DNA的氮磷比分别为2:1、4:1、6:1、8:1、10:1、12:1，LipofectamineTM 2000与pGL-3control质粒DNA的氮磷比为2：1)，培育30分钟后得到复合物。将含不同复合物总体积为50μL的溶液加入到COS-1细胞中，每孔的DNA含量为1μg。并以脂质体Lipofectamine 2000为阳性对照，水和单纯加质粒DNA(cDNA)为阴性对照。培养24h后，吸去转染液后，加入完整培养基继续培养48h后测量pGL3-control表达的荧光素酶。吸去培养基用PBS洗涤后，加入150μL的细胞裂解液裂解30分钟后，转移至1.5mL的离心管中，12000rpm高速离心5分钟。取50μL上清液与50μL荧光素酶检测试剂(Promega)反测定相对光单位。另取20μL上清液进行BCA蛋白含量测试。以每毫克蛋白的相对光度值(RLU/mg，荧光素酶的表达量)作为转染效率的评价指标，结果见图6。
从图6中可以看出，本发明制备的骨靶向基因载体的纳米复合物对pGL-3control质粒DNA的转染效率高于LipofectamineTM 2000作为载体时的纳米复合物的转染效率，而且优选采用骨靶向基因载体与质粒DNA的氮磷比为4:1。

Claims (6)

1.一种骨靶向基因载体，其特征在于，所述骨靶向基因载体为阿仑膦酸钠改性的脂质体，所述阿仑膦酸钠改性的脂质体包括阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇以及阿仑膦酸钠改性的磷脂，所述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇构成磷脂层，所述阿仑膦酸钠改性的磷脂穿插于所述磷脂层中并与所述磷脂层形成囊泡结构，所述阿仑膦酸钠暴露在所述磷脂层之外，所述阿仑膦酸钠改性的磷脂包括聚乙二醇衍生化磷脂和通过酰胺键与聚乙二醇衍生化磷脂连接的阿仑膦酸钠；所述阿仑膦酸钠改性的磷脂与所述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇的摩尔比为(0.01-0.07)：(1-3)：(0.5-1)：(0.1-1)；所述阳离子类脂选自(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵、(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵和双十八烷基二甲基溴化胺中的一种或多种；所述中性辅助类脂选自二油酰磷脂酰乙醇胺和二油酰磷脂酰胆碱中的一种或两种；所述聚乙二醇衍生化磷脂是由聚乙二醇通过共价键和磷脂类物质相连得到，所述聚乙二醇分子的分子量为200～20000道尔顿。
2.如权利要求1所述的骨靶向基因载体，其特征在于，所述骨靶向基因载体的粒径为40-200nm。
3.一种骨靶向基因载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将聚乙二醇衍生化磷脂溶于第一溶剂，并加入催化剂、脱水剂活化，再加入溶解在第一溶剂中的阿仑 膦酸钠，在室温下进行酰胺化反应8-12h，得到反应液，将所述反应液经分离纯化后进行冷冻干燥，得到阿仑膦酸钠改性的磷脂，其中，所述聚乙二醇衍生化磷脂的羧基与阿仑膦酸钠的氨基的摩尔比为(1-10):1；
(2)取上述阿仑膦酸钠改性的磷脂，与阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇加入到反应器中，加入有机溶剂，混合均匀后得到第一混合溶液，通过旋转蒸发法去除所述第一混合溶液中的溶剂，干燥得到膜状材料；其中，所述阿仑膦酸钠改性的磷脂与所述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇的摩尔比为(0.01-0.07)：(1-3)：(0.5-1)：(0.1-1)；
(3)加入磷酸盐缓冲溶液溶解所述膜状材料，并进行超声处理，得到第二混合溶液，将所述第二混合溶液采用微孔过滤膜来回挤压过滤多次，得到骨靶向基因载体，其中，所述骨靶向基因载体为阿仑膦酸钠改性的脂质体，所述阿仑膦酸钠改性的脂质体包括阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇以及阿仑膦酸钠改性的磷脂，所述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇构成磷脂层，所述阿仑膦酸钠改性的磷脂穿插于所述磷脂层中并与所述磷脂层形成囊泡结构，所述阿仑膦酸钠暴露在所述磷脂层之外。
4.一种基因递送系统，其特征在于，所述基因递送系统为基因物质和权利要求1所述的骨靶向基因载体通过静电作用形成的纳米微球，其中，所述骨靶向基因载体与所述基因物质的氮磷摩尔比为(2-12)：1。
5.一种基因递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将基因物质和如权利要求1所述的骨靶向基因载体溶解于灭菌水后，得到混合液，然后室温静置，所述混合液中的骨靶向基因载体和所述基因物质通过静电作用形成纳米微球，得到所述基因递送系统，其中，所述骨靶向基因载体与所述基因物质的氮磷比为(2-12)：1。
6.如权利要求1或2所述的骨靶向基因载体或如权利要求5所述的基因递送系统在制备基因治疗药物中的应用。
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