CN106047851A - 一种酶法制备茶黄素双没食子酸酯的方法 - Google Patents

一种酶法制备茶黄素双没食子酸酯的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106047851A
CN106047851A CN201610435650.8A CN201610435650A CN106047851A CN 106047851 A CN106047851 A CN 106047851A CN 201610435650 A CN201610435650 A CN 201610435650A CN 106047851 A CN106047851 A CN 106047851A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ppo
magnetic
immobilized
polyphenol oxidase
nano particle
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610435650.8A
Other languages
English (en)
Inventor
曾晓雄
雷时成
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Agricultural University
Original Assignee
Nanjing Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Agricultural University filed Critical Nanjing Agricultural University
Priority to CN201610435650.8A priority Critical patent/CN106047851A/zh
Publication of CN106047851A publication Critical patent/CN106047851A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12N9/0059—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C12P17/162—Heterorings having oxygen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. Lasalocid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y110/00—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12Y110/03—Oxidoreductases acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with an oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12Y110/03001—Catechol oxidase (1.10.3.1), i.e. tyrosinase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种茶黄素双没食子酸酯(TF3)的酶法制备方法。该方法包括：以黄冠梨为原料，分离纯化得到多酚氧化酶(PPO)；通过两步法结合Triton X‑100反相油包水微乳系统制备得到磁性Fe3O4‑CS纳米载体；以戊二醛为交联剂将PPO固定在磁性Fe3O4‑CS纳米粒子的表面；以EGCG和ECG为反应物，利用固定化PPO催化合成得到TF3。

Description

一种酶法制备茶黄素双没食子酸酯的方法
技术领域
本发明涉及一种以固定化多酚氧化酶催化合成茶黄素双没食子酸酯的方法。
背景技术
茶黄素双没食子酸酯(TF3)是红茶中茶黄素类的一种主要单体，也是红茶茶汤的色泽及风味的主要指标。近年来，TF3的医药保健功能受到了极大的关注，但是红茶中TF3的含量极低，而且其纯化步骤繁琐耗时。
黄冠梨中多酚氧化酶(PPO)具有较强的催化合成TF3的能力。磁性纳米颗粒具有高的比表面积、超顺磁性、生物相容性、低毒以及高的回收率等特性，因此在食品加工、检测、药物给药以及生物分离等多种领域具有广泛的应用前景。然而，磁性纳米颗粒在水溶液中易发生凝聚沉降从而限制了其的实际应用。壳聚糖(CS)改性磁性纳米颗粒被广泛应用在生物医药、酶的固定化、生物分离、食品检验、废水处理和环境监测等邻域。以戊二醛为交联剂，将PPO固定在磁性壳聚糖纳米载体上具有重要的研究应用价值。
目前关于应用固定化的梨PPO催化合成TF3的方法尚未见报道。
发明内容
本发明目的旨在提供一种快速、高效的制备茶黄素双没食子酸酯的方法，实现本发明的具体方案如下：
(1)选用黄冠梨(Pyrus bretschneideri Rehd cv.Huangguan)为原料，进行多酚氧化酶(PPO)的分离纯化。匀浆法提取粗酶液，经不同饱和度硫酸铵溶液盐析，透析后上DEAE Sepharose Fast Flow层析柱，NaCl溶液梯度洗脱，收集具有酶活的洗脱组分，脱盐浓缩，纯化得到一种多酚氧化酶的同工酶。
(2)通过两步法结合Triton X-100反相油包水微乳系统制备得到磁性Fe3O4-CS纳米载体。
(3)以戊二醛为交联剂将步骤(1)中的PPO固定在磁性Fe3O4-CS纳米粒子的表面。
(4)以EGCG和ECG为反应物，利用步骤(3)中固定化酶催化合成得到TF3。催化反应的最佳时间约为1h，TF3产率为39.31％。重复利用性实验表明，固定化酶循环使用8次依然可以达到催化效率的90％以上。
(5)将步骤(4)制得的TF3粗液，经半制备高效液相色谱进行纯化。色谱柱为YMC-Pack ODS-A(250×20mm，5mm)，应用乙腈-乙酸乙酯(26∶74，v/v)溶液洗脱色谱柱，检测波长280nm。分离后的样品自动分部收集，合并TF3溶液，旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，得到TF3单体，纯度大于98％。
附图说明
图1多酚氧化酶NaCl梯度洗脱曲线
图2差示扫描量热分析图：(a)Fe3O4和(b)Fe3O4-CS
图3固定化PPO催化合成茶黄素双没食子酸酯HPLC色谱图
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明作进一步描述。
实施例1：
(1)称取500g梨(黄冠梨)切成碎块(冷冻-20℃)，放入组织捣碎机，加入适量PVPP，再加入250mL预冷的磷酸盐缓冲液(10mM，pH 6.9)。捣碎5min(3min+2min分两次进行，中间停5min)，四层纱布过滤，压挤法挤出滤液，滤渣放入研钵中，加入适量石英砂，250mL缓冲液冰浴中研磨(匀浆5min)，四层纱布过滤，挤压法挤出滤液，合并两次滤液，4℃条件下8000rpm离心15min，取上清即为粗酶液。
(2)在步骤(1)制得粗酶液中，缓慢加入硫酸铵粉至70％饱和度，操作在冰浴中进行。4℃冰箱过夜，10000rpm离心10min，收集盐析蛋白。
(3)将步骤(2)中得到的盐析蛋白装入孔径为8000-14000kDa的透析袋中，扎紧袋口浸没于10mM磷酸盐缓冲液(pH 6.9)中透析脱盐，每隔2h换次水，置于4℃冰箱中过夜后，聚乙二醇20000适当浓缩得粗酶液，4℃下保存备用。
(4)三氯化铁与硫酸亚铁以摩尔比为2∶1溶解于纯水中(纯水预先通入氮气20min排除其中溶解的O2)。在25℃搅拌转速为1000r/min条件下向反应体系中逐滴加入浓氨水溶液至反应液pH值在8-10之间化学沉淀被进行。沉淀在80℃水浴条件下加热30min陈化后，纯水洗涤三次。最后将磁性纳米颗粒湿法保存在-20℃条件下，避免磁性聚集体的生成和利于后续工作的使用。
(5)将2.0g壳聚糖(CS)粉末溶解在200mL 2％的醋酸溶液中。环己烷、正己烷和CS溶液按体积比为11∶6∶4进行混合后加入步骤(4)制得的适量Fe3O4悬浊液(Fe3O4干重约为2g)，逐渐加入Triton X-100并不断搅拌至溶液呈亮色。在反应体系中加入40mL 5M的NaOH溶液后，60℃水浴反应2h制备得到壳聚糖纳米颗粒。将得到的磁性Fe3O4-CS纳米颗粒用强力磁铁分离，先后用乙醇和纯水漂洗三次。最后将磁性Fe3O4-CS纳米颗粒湿法保存在4℃冰箱待用。
(6)将步骤(5)磁性Fe3O4-CS纳米颗粒(约100mg)被分散在60mL浓度为4％的戊二醛溶液中，常温条件下于摇床中以120r/min的转速震荡交联4h。强力磁铁收集纳米颗粒，用纯水将未交联上的戊二醛冲洗干净。将步骤(3)50mL梨多酚氧化酶液(25mg)加入到经戊二醛交联好的磁性壳聚糖纳米颗粒中，常温条件下于摇床中以120r/min的转速固定化3h。强力磁铁收集固定化酶。
(7)称取茶多酚粉末100mg溶解于200mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液(50mM，pH 5.8)中，加入步骤(6)固定化酶，加入1mL过氧化氢溶液，常温条件下于摇床中以120r/min的转速震荡反应1h，得到富含TF3粗品。
(8)将步骤(7)富含TF3粗品，经半制备高效液相色谱进行纯化。色谱柱为YMC-PackODS-A(250×20mm，5mm)，应用乙腈-乙酸乙酯(26∶74，v/v)溶液洗脱色谱柱，流速为1.5mL/min，检测波长280nm。分离后的样品自动分部收集，每管收集3mL，合并TF3溶液，旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，得到TF3单体，纯度大于98％。
实施例2：
(1)称取500g梨(黄冠梨)切成碎块(冷冻-20℃)，放入组织捣碎机，加入适量PVPP，再加入500mL预冷的磷酸盐缓冲液(50mM，pH 6.8)。捣碎5min(3min+2min分两次进行，中间停5min)，四层纱布过滤，压挤法挤出滤液，滤渣放入研钵中，加入适量石英砂，250mL缓冲液冰浴中研磨(匀浆5min)，四层纱布过滤，挤压法挤出滤液，合并两次滤液，4℃条件下8000rpm离心15min，取上清即为粗酶液。
(2)在步骤(1)制得粗酶液中，缓慢加入硫酸铵粉至70％饱和度，操作在冰浴中进行。4℃冰箱过夜，10000rpm离心10min，收集盐析蛋白。
(3)将步骤(2)中得到的盐析蛋白装入孔径为8000-14000kDa的透析袋中，扎紧袋口浸没于10mM磷酸盐缓冲液(pH 6.9)中透析脱盐，每隔2h换次水，置于4℃冰箱中过夜后，聚乙二醇20000适当浓缩得粗酶液，4℃下保存备用。
(4)将步骤(3)得到的粗酶液加样于经过10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0平衡的DEAESepharose Fast Flow阴离子交换柱(φ20×1.5cm)，应用蛋白质纯化仪用平衡缓冲液冲洗200mL，然后进行加盐梯度洗脱。分别用含0、0.05、0.1、0.3、0.5M NaCl，pH值7.0的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，洗脱速度为0.3mL/min，每个梯度洗脱3个柱体积，分部收集每管3mL，紫外检测波长为280nm。检测有紫外吸收管中PPO活性，收集PPO活性峰。将所得酶活最高的蛋白组分经10kDa超滤离心管浓缩脱盐后备用。
(5)三氯化铁与氯化亚铁以摩尔比为2∶1溶解于纯水中(纯水预先通入氮气20min排除其中溶解的O2)。在25℃搅拌转速为1000r/min条件下向反应体系中逐滴加入浓氨水溶液至反应液pH值在8-10之间化学沉淀被进行。沉淀在80℃水浴条件下加热30min陈化后，纯水洗涤三次。最后将磁性纳米颗粒湿法保存在-20℃条件下，避免磁性聚集体的生成和利于后续工作的使用。
(6)将1.0g壳聚糖(CS)粉末溶解在100mL 2％的醋酸溶液中。环己烷、正己烷和CS溶液按体积比为11∶6∶4进行混合后加入步骤(5)制得的适量Fe3O4悬浊液(Fe3O4干重约为1g)，逐渐加入Triton X-100并不断搅拌至溶液呈亮色。在反应体系中加入20mL 5M的NaOH溶液后，60℃水浴反应2h制备得到壳聚糖纳米颗粒。将得到的磁性Fe3O4-CS纳米颗粒用强力磁铁分离，先后用乙醇和纯水漂洗三次。最后将磁性Fe3O4-CS纳米颗粒湿法保存在4℃冰箱待用。
(7)将步骤(6)磁性Fe3O4-CS纳米颗粒(约10mg)被分散在6mL浓度为4％的戊二醛溶液中，常温条件下于摇床中以120r/min的转速震荡交联4h。强力磁铁收集纳米颗粒，用纯水将未交联上的戊二醛冲洗干净。将步骤(4)5mL梨多酚氧化酶(2mg)液加入到经戊二醛交联好的磁性壳聚糖纳米颗粒中，常温条件下于摇床中以120r/min的转速固定化3h。强力磁铁收集固定化酶。
(8)分别称取EGCG和ECG各15mg溶解于60mL磷酸盐缓冲液(50mM，pH 6.0)中，加入步骤(7)固定化酶，通入氧气(通入最大气流而不产生过量气泡)，搅拌，恒温水浴30℃反应1h，得到TF3粗品。
(9)将步骤(8)TF3粗品，经半制备高效液相色谱进行纯化。色谱柱为YMC-PackODS-A(250×20mm，5mm)，应用乙腈-乙酸乙酯(26∶74，v/v)溶液洗脱色谱柱，流速为1.5mL/min，检测波长280nm。分离后的样品自动分部收集，每管收集3mL，合并TF3溶液，旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，得到TF3单体，纯度大于98％。

Claims (2)

1.一种磁性纳米颗粒固定化多酚氧化酶的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)选用黄冠梨(Pyrus bretschneideri Rehd cv.Huangguan)为原料，进行多酚氧化酶(PPO)的分离纯化。
(2)通过两步法结合Triton X-100反相油包水微乳系统制备得到磁性Fe3O4-CS纳米载体。
(3)以戊二醛为交联剂将取步骤(1)中的PPO固定在磁性Fe3O4-CS纳米粒子的表面制备得到磁性纳米颗粒固定化PPO。
2.一种茶黄素双没食子酸酯的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)以EGCG和ECG为反应底物，利用磁性纳米颗粒固定化PPO催化合成得到TF3。
(2)将步骤(1)制得的TF3粗液，经半制备高效液相色谱进行纯化，得到TF3单体，纯度大于98％。
CN201610435650.8A 2016-06-14 2016-06-14 一种酶法制备茶黄素双没食子酸酯的方法 Pending CN106047851A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610435650.8A CN106047851A (zh) 2016-06-14 2016-06-14 一种酶法制备茶黄素双没食子酸酯的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610435650.8A CN106047851A (zh) 2016-06-14 2016-06-14 一种酶法制备茶黄素双没食子酸酯的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106047851A true CN106047851A (zh) 2016-10-26

Family

ID=57169275

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610435650.8A Pending CN106047851A (zh) 2016-06-14 2016-06-14 一种酶法制备茶黄素双没食子酸酯的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106047851A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109536544A (zh) * 2018-12-19 2019-03-29 江苏德和生物科技有限公司 一种利用固定化多酚氧化酶生产茶黄素的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1737135A (zh) * 2005-07-28 2006-02-22 浙江大学 纳米固定化酶体外定向生产tf2a粗提物的方法
CN101995403A (zh) * 2010-08-18 2011-03-30 南京农业大学 梨果实加工能力评价的生理标记方法
US20110082198A1 (en) * 2009-10-07 2011-04-07 Jiangsu Dehe Bio-Tech Co., Ltd. Theaflavin compositions, production, and methods to control physiological disorders in mammals

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1737135A (zh) * 2005-07-28 2006-02-22 浙江大学 纳米固定化酶体外定向生产tf2a粗提物的方法
US20110082198A1 (en) * 2009-10-07 2011-04-07 Jiangsu Dehe Bio-Tech Co., Ltd. Theaflavin compositions, production, and methods to control physiological disorders in mammals
CN101995403A (zh) * 2010-08-18 2011-03-30 南京农业大学 梨果实加工能力评价的生理标记方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHENLIANG PAN等: "Novel and efficient method for immobilization and stabilization of -d-galactosidase by covalent attachment onto magnetic Fe3O4–chitosan nanoparticles", 《JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS B: ENZYMATIC》 *
Z. ZHOU等: "Two-step preparation of nano-scaled magnetic chitosan particles using Triton X-100 reversed-phase water-in-oil microemulsion system", 《JOURNAL OF ALLOYS AND COMPOUNDS》 *
王坤波等: "梨多酚氧化酶同工酶组成及其对茶黄素合成的影响", 《湖南农业大学学报(自然科学版)》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109536544A (zh) * 2018-12-19 2019-03-29 江苏德和生物科技有限公司 一种利用固定化多酚氧化酶生产茶黄素的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103864922B (zh) 一种亲和层析纯化乌司他丁的方法
CN204455079U (zh) 一种蛹虫草发酵液分离提纯及浓缩装置
WO2016091121A1 (zh) 一种纯化还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法
CN105658313A (zh) 硫酸化纤维素水合物膜、其制备方法和该膜作为病毒纯化用吸附膜的用途
Bayramoglu et al. Preparation and characterization of mixed-mode magnetic adsorbent with p-amino-benzamidine ligand: Operated in a magnetically stabilized fluidized bed reactor for purification of trypsin from bovine pancreas
CN104497133A (zh) 一种吸附柱层析纯化乌司他丁的方法及含有乌司他丁的药物组合物
CN101845089B (zh) 一种适合规模化生产眼镜蛇蛇毒神经毒素并降低神经毒性的方法
CN100522990C (zh) 一种从制备海藻酸盐微胶囊的废弃物中回收蛋白的方法
CN106047851A (zh) 一种酶法制备茶黄素双没食子酸酯的方法
JP2012500636A5 (zh)
CN103073637B (zh) 一种吸附柱层析纯化乌司他丁的方法
CN110511423A (zh) 双模板表面分子印迹材料同时脱除水溶性茶提取物中吡虫啉和啶虫脒的方法
CN103130664A (zh) 一种膜分离技术提取γ-氨基丁酸的工艺方法
CN107828776B (zh) 一种双功能离子螯合磁性载体及其应用
CN107189023A (zh) 一种核壳式磁性复合微球及其制备方法和应用
CN104513308A (zh) 一种树脂再生提高柱效纯化乌司他丁的方法及含有乌司他丁的药物组合物
CN107265552B (zh) 磁性纤维素/聚谷氨酸耦合材料去除废水中六价铬的方法
CN102380353A (zh) 一种磁性氧化镁表面分子印迹固相萃取剂的制备方法
CN102199192A (zh) 一种从龟甲胶中分离功能多肽的方法
CN104497135A (zh) 一种病毒灭活去除纯化乌司他丁的方法及含有乌司他丁的药物组合物
CN104558212B (zh) 一种胺化生物纤维素在制备湿性敷料中的用途
CN104593351B (zh) 一种制备头孢菌素c酰化酶固定化酶的方法
CN105384813A (zh) 一种吸附柱层析纯化乌司他丁的方法及提高乌司他丁稳定性的药物组合物
CN106399417A (zh) 一种食品级高含量茶黄素类物质的制备方法
CN100334105C (zh) 纳米磁性颗粒分离纯化链酶亲合素的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20161026