CN106046142A

CN106046142A - 一种从猪肝中分离蛋白的方法

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Publication number: CN106046142A
Application number: CN201610465531.7A
Authority: CN
Inventors: 邹烨; 王道营; 卞欢; 吴海虹; 张牧焓; 李鹏鹏; 王立; 诸永志; 徐为民
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-06-24
Filing date: 2016-06-24
Publication date: 2016-10-26

Abstract

一种从猪肝中分离蛋白的方法，涉及生物技术领域，将新鲜猪肝匀浆后的沉淀物与乙醇混合进行脱脂反应，得脱脂猪肝粉；脱脂猪肝粉与氢氧化钠水溶液混合后，置于超声反应器中进行间歇式超声提取，提取溶液进行离心，取上清液；采用盐酸水溶液滴加于上清液中，直至蛋白等电点，再经离心、预冻、冷冻干燥，得蛋白干燥粉末。本发明利用超声波技术破坏细胞膜促进细胞内活性蛋白成分的充分溶出，利用低功率超声波穿透式作用，在降低活性蛋白结构破坏风险的同时促进蛋白溶出、节省提取时间，提高提取效率。

Description

一种从猪肝中分离蛋白的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及从猪肝中分离作为抗氧化剂和人体营养补充剂的蛋白技术，也属于保健食品技术领域。

背景技术

据国家统计局（NBSC）统计得知，于2011年我国每年屠宰猪总量达到7.96千万吨以上，其中猪肝总量已达60万吨。肝脏中富含蛋白质、脂肪、糖类、维生素和矿物质。每百克猪肝含蛋白质21.3g，是猪肉的两倍。肝脏中的蛋白被认为是一种优质完全蛋白质，是公认的高级蛋白，含量之高是许多其他蛋白源无法与之相比的。但大部分以鲜销为主，且由于其特殊的气味未能被充分利用，从而没有完全体现出其高附加值。另一方面，由于我国长期以来对猪肝方面的加工利用率低下，除了干燥粉碎后应用于畜禽饲料和营养源添加外，甚至有些猪肝粉被当做肥料或者直接废弃掉，因此，造成了巨大的资源浪费。

食物短缺，蛋白质不足，是第三世界普遍存在的问题，也可称为发展中国家存在的生命能源危机，与当前发达国家面临的工业能源危机并列为世界性的两种能源危机。农畜产品是目前食用蛋白质的主要来源。传统蛋白质生产数量逐年增加，但其增加速度小于人口的增长，因此蛋白质人均占有量的提高被人口不断增多而抵消了不少，发展中国家这种现象尤其明显。随着生活水平的提高，改善营养，提高食物口感，在膳食中增加动物蛋白的数量，是一自然趋势。从我国居民蛋白质的摄入量看，据2010年膳食调查，其中优质蛋白质摄入量在地区之间存在着很大差距，高者占41%，低者仅占18%。这说明，如何提高蛋白质尤其是优质蛋白质的供给水平，已成为改进居民膳食营养的一个关键。

从肝脏中提取蛋白的方法主要有水溶液提取法、有机溶剂提取法、碱溶酸沉法、蔗糖密度梯度离心法、超声波萃取法、双水向萃取法、微波辅助提取法、酶法等。中国专利CN103988971于2014年08月20日公开了一种可食用禽肝脏蛋白的提取方法，用氢氧化钠溶液调节pH11.0-11.5，离心得中间层再用盐酸调pH5.0-5.5，再次离心得沉淀即是肝脏蛋白。中国专利CN102250994于2011年11月23日公开了一种利用鱿鱼肝脏蛋白制备血管紧张素转换酶抑制肽的方法，制得的ACE抑制肽可应用于开发具有降血压功能食品及医药领域。中国专利CN101629168A于2010年01月20日公开了以动物肝脏为原料，经细胞破碎、溶液浸泡、固液分离、膜分离后的一种以动物肝脏为原料同时制备过氧化氢酶和水产诱食剂的工艺。目前，在动物肝脏的研究中，对各种酶的提取和纯化研究较多，但对蛋白还缺乏系统深入的研究，传统提取方法效率低、操作复杂、周期长。

因此，选择合适的提取技术，获得提取率较高的肝脏分离蛋白，并且还能保证其功能性质和活性将成为一个热点研究方向。

本发明的详细内容：

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、提取率高的响应曲面法优化猪肝分离蛋白的超声辅助碱溶提取方法。

本发明包括以下步骤：

1）将新鲜猪肝匀浆后过滤，取沉淀物；

2）将沉淀物与乙醇混合进行脱脂反应，经离心，收集沉淀干燥，得脱脂猪肝粉；

3）将脱脂猪肝粉与氢氧化钠水溶液混合后，置于超声反应器中进行间歇式超声提取，得提取溶液；

4）将提取溶液进行离心，取上清液；

5）采用盐酸水溶液滴加于上清液中，直至蛋白等电点，然后于2～6 ℃温度环境下静置后再经离心，取得沉淀于-70～-80 ℃下预冻，最后在大气压力为10～100 Pa、温度为-55～-70 ℃条件下冷冻干燥24～72 h，得蛋白干燥粉末。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明利用了超声波技术进一步破坏细胞膜促进细胞内活性蛋白成分的充分溶出，利用低功率超声波穿透式作用，在降低活性蛋白结构破坏风险的同时促进蛋白溶出、节省提取时间，提高提取效率。

2、与正交法相比，本发明采用Design Expert 8.0.6.1（BBD）中心组合设计模型的响应面分析法，用3因素3水平及少量的实验组（仅17组实验）就可得出优化结果，获得最佳产率，在提高提取效率的同时降低了能耗和污染物的排放，具有工业化生产的试剂意义。

3、本发明获得的猪肝分离蛋白最终产品为淡黄色粉末，易溶于水，经氨基酸组分分析，其碱性氨基酸含量达15.93% ，疏水性氨基酸含量高达36.73%，E/T > 43%。抗氧化实验结果表明该猪肝分离蛋白能显著清除羟自由基，其IC₅₀为1.6732 mg/mL。测试其体外消化率，结果显示其消化率高达94%，与原猪肝及常规碱提法相比，均具有显著性差异，表明合适的超声处理可改善猪肝分离蛋白的营养价值。从猪肝中分离出的蛋白可作为抗氧化剂，可制备成人体营养补充剂。

进一步地，为了使猪肝中的内源酶失活，本发明所述步骤1）中，取新鲜猪肝先用生理盐水冲洗，再剔除膜和结缔组织，经切碎后与沸水混合，再经煮沸8～15 min，然后置于高速匀浆机中进行匀浆处理。

所述步骤2）中，用于与沉淀物混合的乙醇为体积百分数为90%的乙醇水溶液，沉淀物与乙醇水溶液的体积比为1∶1～3，可使脂肪率降低至5%以下。

所述步骤2）中，所述脱脂反应是在反应体系的温度为60～80℃的条件下进行20～40min，脱脂反应结束后，经冷却至室温再离心。也使脂肪率降低至5%以下。

为了使蛋白不易变性，所述步骤2）中，所述干燥的温度环境为40～60℃。

为了提高蛋白得率，所述步骤3）中，所述氢氧化钠水溶液的质量百分数为0.50～1.0%，脱脂猪肝粉与氢氧化钠水溶液的混合比为1g∶40～80 mL。

同理，为了提高蛋白得率，所述步骤3）中，所述超声的功率为200～300 W，温度为40～60℃，以超声工作时间2 s和停歇3 s的间歇式超声提取30～50 min。

所述步骤5）中，所述盐酸水溶液的浓度为0.50～1.0mol/L，本发明仅需少量盐酸水溶液即可获得蛋白沉淀物。

附图说明

图1为超声波功率对蛋白提取率的影响图。

图2为超声时间对蛋白提取率的影响图。

图3为液料比对蛋白提取率的影响图。

图4为超声温度对蛋白提取率的影响图。

图5为氢氧化钠浓度对蛋白提取率的影响图。

图6为本发明抗氧化评价结果。

图7为本发明体外消化率。

具体实施方式

本发明中猪肝分离蛋白用Lowry法测定蛋白质含量。

本发明中超声波技术采用聚能式探头超声，超声方式为工作2 s，停歇3 s。

本发明中猪肝分离蛋白的抗氧化活性的测定包括：猪肝分离蛋白对羟基自由基的清除效果。

本发明中采用清除羟自由基试验考察猪肝分离蛋白的抗氧化活性。研究结果表明，与常规碱提法相比，超声作用后猪肝分离蛋白的抗氧化活性好。因此本发明的猪肝分离蛋白可用作抗氧化的功能性食品。

本发明中体外消化实验所使用的胃蛋白酶（国药公司产品），酶活1∶30000；胰酶（国药公司产品），酶活1∶4000。

为了更清楚地说明本发明内容，用具体实施例说明如下，具体实施例不限定本发明内容范围。

一、制备蛋白提取物干燥粉末：

实施例1

将新鲜猪肝用生理盐水冲洗，剔除膜和结缔组织，切碎；加入3～6倍的沸水，煮沸8～15min，置于高速匀浆机中，以8000～10000 rpm下匀浆2~4 min；过滤后沉淀加入1～3倍体积的90%的乙醇，60～80 ℃下脱脂20～40 min，冷却至室温后，3000～5000 g 离心10～20min，收集沉淀；于烘箱中40～60 ℃下干燥至恒重，研磨，取得脱脂猪肝粉，于干燥皿中保存备用。

以40 mL∶1g的液料比，将脱脂猪肝粉加入质量百分数为0.50%的氢氧化钠水溶液，在超声功率为200 W、40 ℃下提取共30 min，其中超声工作时间2 s，停歇3 s，提取后溶液分别以4000 rpm进行离心，15 min后收集上清液，再使用0.50 mol/L的盐酸水溶液滴至蛋白等电点，于2 ℃下静置12 h，再分别以4000rpm下进行离心，15 min后收集沉淀，该沉淀于-70℃下预冻5 h，最后在大气压力为100 Pa、温度为-55 ℃下冷冻干燥24 h，得猪肝分离蛋白提取物干燥粉末。

实施例2

制备脱脂猪肝粉方法同上。

按60 mL∶1g的液料比，将脱脂猪肝粉加入质量百分数为0.75%的氢氧化钠水溶液，在超声功率为250 W、50 ℃下提取40 min，其中超声工作时间2 s，停歇3s，提取后溶液分别以5000rpm进行离心，18 min后收集上清液，再使用0.75 mol/L的盐酸水溶液滴至蛋白等电点，于4 ℃下静置18 h，再分别以5000 rpm下进行离心，18 min后收集沉淀，该沉淀于-75℃下预冻5 h，最后在大气压力为50 Pa、温度为-60 ℃下冷冻干燥48 h，得猪肝分离蛋白提取物干燥粉末。

实施例3

制备脱脂猪肝粉方法同上。

按80mL∶1g的液料比，将脱脂猪肝粉加入质量百分数为1.0%的氢氧化钠水溶液，超声功率为300W、60℃下提取50min，其中超声工作时间2s，停歇3s，提取后溶液分别以6000rpm进行离心，20 min后收集上清液，再使用1.0 mol/L的盐酸水溶液滴至蛋白等电点，于6℃下静置24 h，再分别以6000 rpm下进行离心， 20 min后收集沉淀，该沉淀于-80 ℃下预冻4 h，最后在大气压力为10 Pa、温度为-70 ℃下冷冻干燥72 h，得猪肝分离蛋白提取物干燥粉末。

二、研究本发明方法中各单因素对蛋白提取率的影响：

1、超声波功率对蛋白提取率的影响试验：

以液料比为70mL∶1g的比例，将1%NaOH溶液与脱脂猪肝粉混合，超声时间30 min，超声水浴温度为50℃，超声功率分别为50 W、100 W、150 W、200 W、250 W和300 W进行单因素试验，在5000 rmp下离心10 min后收集上清液，使用0.75 mol/L的盐酸水溶液滴至蛋白等电点，于4 ℃下静置18h，再分别以5000 rpm下进行离心，18min后收集沉淀，该沉淀于-75 ℃下预冻5h，最后在大气压力为50 Pa、温度为-60 ℃下冷冻干燥48 h，蛋白得率见附图1所示。

图1的柱状图上不同字母表示具有显著性差异（P < 0.05）。图1说明：随着超声功率的增大，蛋白得率逐渐增加，在250W时，猪肝分离蛋白的得率最大，达到了65%。当功率在300W时，蛋白得率下降，其原因可能是较强的功率使蛋白发生更为强烈的变性，产生不可溶的蛋白增多，因而蛋白得率下降。

2、超声时间对蛋白提取率的影响试验：

以液料比为70mL∶1g的比例，将1%NaOH溶液与脱脂猪肝粉混合，超声功率为250 W，超声水浴温度为50℃，超声时间分别为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min和60 min进行单因素试验，使用0.75 mol/L的盐酸水溶液滴至蛋白等电点，于4 ℃下静置18 h，再分别以5000 rpm下进行离心，18 min后收集沉淀，该沉淀于-75 ℃下预冻5 h，最后在大气压力为50 Pa、温度为-60 ℃下冷冻干燥48 h，蛋白得率见附图2所示。

图2的柱状图上不同字母表示具有显著性差异（P < 0.05）。图2说明：随着超声时间的增大，蛋白得率逐渐增加，在40 min时，猪肝分离蛋白的得率最大，达到了71.5%。当超声时间大于40min时，蛋白得率下降，其原因可能是一定温度时，较长的超声时间下微生物对蛋白进行了分解，使蛋白得率下降。

3、液料比对蛋白提取率的影响试验：

量取1% NaOH溶液，超声功率为250 W，超声时间为40 min，室温下提取时间4 h，采用料液比分别为1g∶30 mL、1g∶40 mL、1g∶50 mL、1g∶60 mL、1g∶70mL和1g∶80 mL与脱脂猪肝粉混合进行单因素试验，在5000rmp下离心10 min后收集上清液，使用0.75 mol/L的盐酸水溶液滴至蛋白等电点，于4℃下静置18h，再分别以5000 rpm下进行离心，18 min后收集沉淀，该沉淀于-75℃下预冻5h，最后在大气压力为50Pa、温度为-60℃下冷冻干燥48 h，蛋白得率见附图3所示。

图3中柱状图上不同字母表示具有显著性差异（P < 0.05）。图3说明：随着料液比的增大，蛋白得率逐渐增加，在1g∶70mL时，猪肝分离蛋白的得率最大。溶剂体积越大意味着溶剂中蛋白质浓度较低，使固相和溶剂相中的蛋白质出现浓度差，这是提取中质量扩散的动力之一。当料液比大于1g∶70mL时，蛋白得率趋于平缓。

4、超声温度对蛋白提取率的影响试验：

以液料比为70mL∶1g的比例，将1%NaOH溶液与脱脂猪肝粉混合，超声功率为250 W，超声时间40 min，超声水浴温度分别为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃进行单因素试验，在5000 rmp下离心10 min后收集上清液，使用0.75 mol/L的盐酸水溶液滴至蛋白等电点，于4℃下静置18 h，再分别以5000 rpm下进行离心，18 min后收集沉淀，该沉淀于-75 ℃下预冻5h，最后在大气压力为50 Pa、温度为-60 ℃下冷冻干燥48 h，蛋白得率见附图4所示。

图4中柱状图上不同字母表示具有显著性差异（P < 0.05）。图4说明：随着超声温度的增加，蛋白得率逐渐增加，在温度为50 ℃时，猪肝分离蛋白的得率最大。在一定范围内，提取温度的升高有助于蛋白质溶解度的增加，从而提高蛋白得率。当温度大于50℃时，因过高的温度导致蛋白可能发生变性而产生不溶性蛋白。

5、氢氧化钠的浓度对蛋白提取率的影响试验：

先制备质量百分数分别为0.25%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的NaOH水溶液。

以液料比为70mL∶1g的比例，将不同浓度的NaOH水溶液与脱脂猪肝粉混合进行单因素试验，超声功率为250W，超声水浴温度分别为50℃，超声时间为40 min，在5000 rmp下离心10 min后收集上清液，使用0.75 mol/L的盐酸水溶液滴至蛋白等电点，于4℃下静置18h，再分别以5000 rpm下进行离心，18min后收集沉淀，该沉淀于-75℃下预冻5 h，最后在大气压力为50 Pa、温度为-60℃下冷冻干燥48h，蛋白得率见附图5所示。

图5中柱状图上不同字母表示具有显著性差异（P < 0.05）。图5说明：随着氢氧化钠浓度的增加，提取率先增加然后降低，氢氧化钠水溶液的质量百分数为0.75%时提取率最高。碱液浓度太低，蛋白质不能很好的溶解到溶液里，由于碱可以破坏蛋白分子的次级键尤其是氢键，使一些极性基团发生解离，使得蛋白表面分子具有相同的电荷从而对蛋白质有增溶作用，故随着碱液浓度的增加提取率显著上升。但是碱浓度过大又容易导致部分蛋白质发生脱氨、脱羧、肽键断裂等变性，降低溶解度。另外碱性过强使得等电点沉淀时用到大量的盐酸，会使蛋白产品中的盐分增加，在存在大量氯化钠的情况下，沉淀时会产生盐溶现象，这样既浪费酸碱，又不利于产品质量和蛋白质的功能性质。因此碱液浓度选为0.75%。

三、测定提取物干燥粉末中氨基酸组成：

1、实验方法：

氨基酸组成测定：分别精密量取常规碱提和本发明提所得的样品各0.2g置于25 mL容量瓶中，加水定容至25 mL，混匀，加入6 mol/L盐酸（优级纯），抽真空后进行封口处理，于110 ℃（烘箱）水解24 h后移入容量瓶定容，过滤，加1% 2,4－二硝基氟苯的乙腈溶液0.4mL，0.5 mol/L碳酸钠溶液1.0 mL，60 ℃水浴，避光，衍生60 min，取出放冷却至室温后，加磷酸盐缓冲液（pH7.0）稀释至刻度，摇匀备用。采用Agilent 1100型高效液相色谱仪测定氨基酸含量。色谱条件：C18柱（4.0 mm×125 mm，5 μm）；柱温：40 ℃；流速：1.0 mL/min；波长：360 nm；流动相：A，20 mmol/L醋酸钠溶液；B：醋酸钠（20 mmol/L）：甲醇：乙腈=1：2：2（v/v/v）。进样量：20 μL。按上述色谱条件分析。

2、下表PLPI 和UPLPI的氨基酸组成显示了实验结果：

PLPI 和UPLPI的氨基酸组成 (g/100 g 蛋白质) ^*.

说明：PLPI：常规碱提猪肝分离蛋白，UPLPI：超声辅助碱提猪肝分离蛋白，均以样品的干重作计算。

^#必需氨基酸 (EAA)。

^A蛋氨酸 + 胱氨酸；^B苯丙氨酸 + 酪氨酸。

^a,b同一行的不同字母表示具有显著性差异 (P < 0.05)。

猪肝分离蛋白是一种优质完全蛋白质，其碱性氨基酸含量达15.93% ，疏水性氨基酸含量高达36.73%，E/T值大于43%，符合FAO/WHO推荐范围，是许多蛋白源无法与之相比的。

3、结论：

从猪肝中分离出的蛋白是一种优质完全蛋白质，是其他许多蛋白无法与之相比的。

四、清除羟自由基试验：

1、实验方法：

取1 mL邻二氮菲无水乙醇溶液，加入2 mL、0.2 mL/L 、pH为7.4的磷酸盐缓冲液和1 mL蒸馏水，充分混合后，加入1 mL0.75 mmoL/L FeSO₄混合，再加入1 mL 0.01%H₂O₂，37 ℃水浴加热60 min，536 nm处测吸光值（A损），分别用PLPI和UPLPI样品 1 mL代替1 mL蒸馏水测得样品的吸光值（A样），1 mL蒸馏水代替1 mL双氧水测得吸光值（A未）。

清除率S（%）=（A样- A损）/（A未-A损）×100%。

2、实验结果：

图6为猪肝分离蛋白对羟基自由基的清除效果，超声辅助碱提的猪肝分离蛋白在2.0mg/mL时，其对羟自由基清除率达到61%，其IC₅₀为1.6732 mg/mL，可见猪肝分离蛋白对羟基自由基的清除效果好。

图6中：Vc曲线代表阳性对照，PLPI曲线代表PLPI样品，UPLPI曲线代表UPLPI样品。

3. 结论：

猪肝分离蛋白对羟自由基的清除效果好。

五、体外消化率试验：

1、实验方法

（1）蛋白质体外消化液的制备：

采用胃蛋白酶（1∶2000，600-1000 U/mg）和胰蛋白酶（1∶250）来测定体外消化率。将猪肝分离蛋白按照1%（w/v）的浓度溶于去离子水中用1.0 mol/L HCl 调pH至1.5，将200 mL猪肝分离蛋白溶液于37 ℃水浴预热3～5 min。然后加入一定量的胃蛋白酶液。胃蛋白酶与猪肝分离蛋白溶液混合均匀后，于37 ℃反应。在酶解反应120 min 时，沸水浴灭酶，以备后用。用1.0 mol/L NaOH调pH 至7.0终止胃蛋白酶反应，酶解液中加入胰蛋白酶液，使得酶与初始蛋白底物的比为1∶2 0（w/v），于37 ℃进一步消化，在酶解反应120 min 时，沸水浴灭酶，备用。

（2）消化过程中的氮释放率的测定：

取10 mL 消化液与等体积的10% 三氯乙酸（TCA）混合均匀（TCA 的终浓度为5%，w/v），然后于8000 g ，离心 30 min。将沉淀用10 mL10% TCA洗涤，在同样条件下离心，取沉淀。沉淀物中氮含量的测定采用凯式定氮法（N×6.25）。氮的释放率按照下公式计算：氮释放率（%）=（N0 −Nt）×100/Ntot，其中t 表示样品消化时间（min），N0 表示样品消化t 时刻时TCA 不溶物中氮含量（mg），N0 表示样品中TCA不溶物氮含量（mg），Ntot 表示样品中总氮含量（mg）。

2、实验结果：

超声辅助碱提猪肝分离蛋白的消化率（94.1%）是原猪肝消化率（45.2%）的两倍；与常规碱提蛋白相比，超声辅助碱提猪肝分离蛋白的消化率得到显著提高（P < 0.05），其差异可能是由于各样品中不同组分对胃蛋白酶和胰酶的敏感性差异引起的。

从图7中a、b、c、d、e分别代表在SPSS16.0统计分析软件中具有显著性差异（P <0.05）。

3、结论：

超声处理后的猪肝分离蛋白显示出较高的体外消化率，表明合适的超声处理可改善猪肝蛋白的营养价值。

Claims

1.一种从猪肝中分离蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将新鲜猪肝匀浆后过滤，取沉淀物；

4）将提取溶液进行离心，取上清液；

5）采用盐酸水溶液滴加于上清液中，直至蛋白等电点，然后于2～6℃温度环境下静置后再经离心，取得沉淀于-70～-80℃下预冻，最后在大气压力为10～100 Pa、温度为-55～-70℃条件下冷冻干燥24～72h，得蛋白干燥粉末。

2.根据权利要求1所述从猪肝中分离蛋白的方法，其特征在于：所述步骤1）中，取新鲜猪肝先用生理盐水冲洗，再剔除膜和结缔组织，经切碎后与沸水混合，再经煮沸8～15min，然后置于高速匀浆机中进行匀浆处理。

3.根据权利要求1所述从猪肝中分离蛋白的方法，其特征在于：所述步骤2）中，用于与沉淀物混合的乙醇为体积百分数为90%的乙醇水溶液，沉淀物与乙醇水溶液的体积比为1∶1～3。

4.根据权利要求1所述从猪肝中分离蛋白的方法，其特征在于：所述步骤2）中，所述脱脂反应是在反应体系的温度为60～80 ℃的条件下进行20～40 min，脱脂反应结束后，经冷却至室温再离心。

5.根据权利要求1所述从猪肝中分离蛋白的方法，其特征在于：所述步骤2）中，所述干燥的温度环境为40～60 ℃。

6.根据权利要求1所述从猪肝中分离蛋白的方法，其特征在于：所述步骤3）中，所述氢氧化钠水溶液的质量百分数为0.50～1.0%，脱脂猪肝粉与氢氧化钠水溶液的混合比为1g∶40～80 mL。

7.根据权利要求1或6所述从猪肝中分离蛋白的方法，其特征在于：所述步骤3）中，所述超声的功率为200～300 W，温度为40～60 ℃，以超声工作时间2s和停歇3s的间歇式超声提取30～50 min。

8.根据权利要求1所述从猪肝中分离蛋白的方法，其特征在于：所述步骤5）中，所述盐酸水溶液的浓度为0.50～1.0 mol/L。