CN105985351A - 高纯度芝麻素单体和芝麻林素单体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物有效成分的分离纯化方法，特别涉及高纯度芝麻素和芝麻林素单体的制备方法，其包括(1)对芝麻回流提取；(2)用溶剂二次提取；(3)将A组分、B组分、C组分、D组分按体积比为1：0.2～1：0.5～3：0.2～1配成精制溶剂体系，得固定相和流动相；(4)利用高速逆流色谱仪和所述的固定相和流动相分离样品，根据所得的色谱图收集目标组分，分别得到高纯度的芝麻素单体和芝麻林素单体。本发明的制备方法的优点是：重现性和分离效果好、效率高、芝麻素和芝麻林素单体产品的纯度达到98％以上。
Description
技术领域
本发明涉及植物有效成分的分离纯化方法，特别涉及高纯度芝麻素和芝麻林素单体的制备方法。
背景技术
芝麻素和芝麻林素为存在于芝麻中的一类木脂素化合物，为芝麻的主要活性成分。芝麻素C20H18O6，熔点121-122℃，其含量约占芝麻的0.2％-0.5％，大量研究表明芝麻素可以抑制流感病毒、仙台病毒和结核杆菌等病毒，同时具有降低胆固醇、促进脂肪氧化、抑制脂肪的合成、治疗气管炎、抗高血压、抗癌等功效。农业上用作除虫菊酯的增剂。芝麻林素也是芝麻中的主要木脂素类成分之一，分子式C20H18O7，熔点93-94℃，药理研究结果表明芝麻林素具有抗氧化、清除自由基、降低胆固醇、抗血压、抗血栓，并有促进酒精代谢、保肝解毒等功效，应用前景广阔。
目前国内尚未有对芝麻素和芝麻林素单体进行分离的专利，现有关于高纯度芝麻素和芝麻林素单体分离制备的文献方法主要采用反复硅胶柱层析、葡聚糖凝胶LH-20柱色谱等方法，其局限性是费时费力、污染环境、样品纯度低，而且反复柱层析对样品有不可逆性吸附作用，分离得到高纯度芝麻素和芝麻林素单体制备效率低、成本较高，难以发展成为制备量大的分离技术。
高速逆流色谱(High-speed Counter-current Chromatography，HSCCC)是近30年发展起来的一种连续的无需任何固体支持物的高效、快速的液液分配色谱分离技术，它避免了固态支持体或载体带来的样品易被死吸附、损耗和变性等各种问题，使用其它液相色谱法进行制备型分离时，其分配效率会显著降低，溶剂消耗量大，HSCCC保证较高峰型分辨度，分离量大、样品无损失、回收率高、分离环境缓和，节约溶剂。高速逆流色谱能直接进大量粗提样品或合成混合物，分离结果能达到相当高的纯度，已广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。
经检索发现，公开号为CN102093461A的发明专利申请公开了一种高速逆流色谱纯化茶皂素的方法，其包括：1)茶皂素粗品的制备；2)溶剂的配置；3)样品制备；4)分离纯化。上述的高速逆流色谱纯化茶皂素的方法，设计合理，本发明对油茶饼粕进行预处理，并选择了正确的溶剂系统乙酸乙酯、正丁醇和水，使茶皂素在溶液系统中的分配系数K在0.5～2，最后通过对高速逆流色谱仪的控制调节，使得分离的茶皂素纯度可达95％以上。
公开号为CN103772472A的发明专利申请公开了一种利用高速逆流色谱法从贝母中分离纯化贝母辛的方法，包括：1)取干燥贝母鳞茎，制备贝母总生物碱；2)采用高速逆流色谱分离纯化贝母辛；以正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水按体积比为2～4:5:2～3:5配成的混合溶液作为固定相(上层)和流动相(下层)；取贝母总生物碱粉末溶于等量的流动相和固定相，由进样阀进样，观察色谱图，待目标峰出现时收集馏分，挥干溶剂，得贝母辛。
公开号为CN101602768的发明专利申请公开了一种芝麻素和芝麻林素的提纯方法，先从芝麻油中分离得到不含脂肪类成分的木脂素类化合物，之后加入乙醚析出芝麻素；过滤，所得滤液减压浓缩后用氯仿溶解，然后加入石油醚至有白色浑浊出现，加热溶解后静置析出芝麻林素。
发明内容
本发明的目的是提供一种高纯度芝麻素和芝麻林素单体的制备方法。
为达到上述目的，具体采用如下的技术方案：
一种高纯度芝麻素单体和芝麻林素单体的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用有机溶剂对芝麻进行回流提取，抽滤、将滤液浓缩成油状，得总提取物；
(2)将总提取物用溶剂二次提取，取上清液蒸干，得芝麻粗提物；
(3)将A组分、B组分、C组分、D组分按体积比为1：0.2～1：0.5～3：0.2～1配成精制溶剂体系，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，上层为固定相，下层为流动相，所述A组分为醚或烷烃，B组分为脂肪酯，C组分为脂肪醇，D组分为水；
(4)取芝麻粗提物溶于等量的流动相和固定相(流动相和固定相等量)中，得待分离样品；利用高速逆流色谱仪和所述的固定相和流动相分离待分离样品，根据检测器紫外光谱图接收馏分，分别得到高纯度的芝麻素单体和芝麻林素单体。
在本发明的技术方案中，具体的，所述步骤(1)中有机溶剂为石油醚或/和正己烷，芝麻与有机溶剂的料液比为1:5～1:20g/mL。步骤(1)中浓缩的方法可以采用真空旋转蒸发的方式。
具体的，所述步骤(2)中的溶剂为乙醇或/和甲醇，所述总提取物与溶剂的料液比为1:1～1:5g/mL。步骤(2)中浓缩的方法可以采用真空旋转蒸发的方式。
优选地，步骤(3)中将A组分、B组分、C组分、D组分按体积比为1：0.4～0.7：0.9～1.1：0.5～0.7配成精制溶剂体系。
步骤(4)的具体过程为：用输液泵快速将固定相注入高速逆流色谱仪的分离柱；开启高速逆流色谱仪，慢速注入溶剂系统的流动相进行平衡，溶剂系统达到流体动力学平衡即溶剂系统的上相(固定相)不流出时，注入由等量的流动相和固定相溶解的芝麻粗提物溶液；用紫外检测器检测流出液，根据所得的色谱图收集目标组分。
在本发明的技术方案中，具体的，所述A组分为石油醚或正己烷，B组分为乙酸乙酯或乙酸丙酯，C组分为甲醇或乙醇，D组分为水。
优选的，所述A组分为石油醚，B组分为乙酸乙酯，C组分为甲醇，D组分为水。
作为本发明最佳的实施方式，所述精制溶剂体系为按体积比，石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水＝1：0.4：1：0.5；或按体积比，正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1：0.5：1：0.5。
在本发明的技术方案中，步骤(4)中高速逆流色谱仪的转速为600-1000rpm，流动相的流速为0.5-3.0mL/min。
作为本发明的优选技术方案，所述高速逆流色谱仪柱体积为230mL，上样量为220mg，转速为800rpm，流动相流速为2.0mL/min，固定相保留率为57％，检测波长254nm。
本发明的制备方法的优点是：重现性和分离效果好、效率高、芝麻素和芝麻林素单体产品的纯度达到98％以上，芝麻素和芝麻林素单体的制备成本远低于现有技术，是一种经济、高效的从芝麻中分离制备高纯度芝麻素和芝麻林素单体的方法。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图；
图2为实施例1的高速逆流色谱图；
图3为实施例2的高速逆流色谱图；
图4为实施例1芝麻粗提物的高效液相色谱图；
图5为实施例1分离得到的芝麻素单体的高效液相色谱图；
图6为实施例1分离得到的芝麻林素单体的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中采用北京新技术所研制的半制备型高速逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为230mL)等组成。
实施例1
如图1所示，本实施例中高纯度芝麻素单体和芝麻林素单体的制备方法包括以下步骤：
(1)取芝麻1.1kg粉碎后用10L正己烷回流提取3次，每次2h，抽滤，滤液真空旋转蒸发成油状，得到总提取物489.5g；
(2)将上述总提取物加500mL乙醇超声提取3次，每次2h，取上清液真空旋转蒸发，得芝麻粗提物10.3g(如图4所示)；
(3)按体积比，将石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水＝1：0.4：1：0.5配成精制溶剂体系，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开上层为固定相，下层为流动相；
(4)取220mg芝麻粗提物溶解于5mL上相(固定相)和5mL下相(流动相)的混合物中待用。利用高速逆流色谱仪，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以灌满色谱分离柱，停泵。开启速度控制器，使高速流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800rpm时，设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相，达到流体动力学平衡后，将溶解好的样品用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱。然后根据检测器紫外光谱图(如图所示2)接收收目标成分，得芝麻素单体(如图5所示)和芝麻林素单体(如图6所示)62.0mg和5.0mg，HPLC分析纯度为99.5％和98.0％。
利用高效液相色谱分析分离物，液相条件：Agilent C18色谱柱(4.6×250mm，5μ)，紫外检测波长286nm，柱温：25℃，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，流动相为甲醇：水＝80：20。
结构鉴定：对分离得到的芝麻素和芝麻林素应用进行Agilent5973N质谱仪和Varian 600MHz核磁共振波谱仪分别进行MS，1H-NMR和13C-NMR谱的测定，所得数据如下：
芝麻素：白色粉末，ESI-MS(positive mode),m/z 355.1[M+H]+.1H-NMR(600MHz,CDCl3)δppm:3.04(2H,m,H-8′,H-8),3.86(2H,dd,J＝9.0,4.6Hz,H-9′α,H-9α),4.22(2H,dd,J＝9.0,6.6Hz H-9′β,H-9β),4.71(2H,d,J＝3.6Hz,H-7′,H-7),5.94(4H,s,OCH2O),6.77～6.84(3H×2,m,H-2′,H-5′,H-6′,H-2,H-5,H-6).13C-NMR(600MHz,CDCl3)δ:135.2(2C,C-1,C-1′),106.7(2C,C-2,C-2′),148.1(2C,C-3,C-3′),147.3(2C,C-4,C-4′),108.4(2C,C-5,C-5′),119.5(2C,C-6,C-6′),85.9(2C,C-7,C-7′),54.5(2C,C-8,C-8′),71.9(2C,C-9,C-9′),101.3(2OCH2O).
芝麻林素：白色粉末，ESI-MS(positive mode),m/z 371.2[M+H]+.1H-NMR(600MHz,CDCl3)δppm:3.31(H,m,H-8),2.95(H,m,H-8′),3.64(H,d,H-9),3.96(H,d,H-9′),4.13(H,d,J＝4.2Hz,H-9),4.45(H,t,J＝8.4Hz,H-9),5.50(H,s,H-7),4.40(H,d,J＝9.2Hz,H-7′),5.96(2H,s,OCH2O),5.93(2H,s,OCH2O),6.50(H,d,J＝2.4Hz,H-6),6.83(H,s,H-6′),6.71(H,s,H-5),6.79(H,s,H-5′),6.62(H,d,J＝2.4Hz,H-2),6.88(H,s,H-2′).13C-NMR(600MHz,CDCl3)δ:151.8(C-1),100.2(C-2),148.1(C-3),142.7(C-4),108.2(C-5),108.9(C-6),106.9(C-7),53.3(C-8),71.3(C-9),101.2(C-10),134.4(C-1′),106.6(C-2′),147.4(C-3′),148.0(C-4′),108.2(C-5′),119.7(C-6″,87.0(C-7′),52.8(C-8′),69.8(C-9′),101.1(C-10′)。
实施例2
芝麻素单体和芝麻林素单体制备流程图如图1所示。
1.取芝麻1.0kg粉碎后用石油醚回流提取3次，每次2h，过滤，滤液减压浓缩成浸膏，得到总提取物460.8g。
2.将上述总提取物加500mL甲醇超声提取3次，每次2h，取上清液真空旋转蒸发，得芝麻粗提物9.5g。
3.分离所选溶剂系统为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1：0.5：1：0.5，其余步骤同实施例1。得到纯度为99.6％和98.3％的芝麻素和芝麻林素单体70mg和6.2mg，高速逆流色谱分离紫外光谱图见图3。
实施例3
分离所选溶剂系统为石油醚：乙酸丙酯：乙醇：水＝1：0.5：1：0.6，其余步骤同实施例1。得到纯度为99.5％和98.2％的芝麻素和芝麻林素单体71mg和6.4mg。
实施例4
分离所选溶剂系统为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1：0.7：1.1：0.6，其余步骤同实施例1。得到纯度为99.1％和98.1％的芝麻素和芝麻林素单体58mg和5.6mg。
实施例5
分离所选溶剂系统为石油醚：乙酸丙酯：甲醇：水＝1：0.6：0.9：0.5，其余步骤同实施例1。得到纯度为99.4％和98.4％的芝麻素和芝麻林素单体65mg和6.4mg。
实施例6
分离所选溶剂系统为正己烷：乙酸乙酯：乙醇：水＝1：0.5：1.1：0.7，其余步骤同实施例1。得到纯度为99.0％和98.0％的芝麻素和芝麻林素单体66mg和6.7mg。
实施例7
分离所选溶剂系统为正己烷：乙酸丙酯：乙醇：水＝1：0.4：0.9：0.5，其余步骤同实施例1。得到纯度为99.2％和98.4％的芝麻素和芝麻林素单体68mg和7.1mg。
专利申请CN101602768介绍了一种芝麻素和芝麻林素的提纯方法，采用了分步重结晶的方法，获得纯度95％以上的芝麻素和芝麻林素，本申请纯化阶段采用高速逆流色谱法，一次分离得到纯度在98％含量以上的高纯度芝麻素单体和芝麻林素单体，该方法具有重现性好、分离量大、样品无损失、回收率高等优点。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种高纯度芝麻素单体和芝麻林素单体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采用有机溶剂对芝麻进行回流提取，抽滤、将滤液浓缩成油状，得总提取物；
(2)将总提取物用溶剂二次提取，取上清液蒸干，得芝麻粗提物；
(3)将A组分、B组分、C组分、D组分按体积比为1：0.2～1：0.5～3：0.2～1配成精制溶剂体系，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，上层为固定相，下层为流动相，所述A组分为醚或烷烃，B组分为脂肪酯，C组分为脂肪醇，D组分为水；
(4)取芝麻粗提物溶于等量的流动相和固定相中，得待分离样品；利用高速逆流色谱仪和所述的固定相和流动相分离待分离样品，用紫外检测器检测流出液，根据所得的色谱图收集目标组分，分别得到高纯度的芝麻素单体和芝麻林素单体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中有机溶剂为石油醚或/和正己烷，芝麻与有机溶剂的料液比为1:5～1:20g/mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的溶剂为乙醇或/和甲醇，所述总提取物与溶剂的料液比为1:1～1:5g/mL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述A组分为石油醚或正己烷，B组分为乙酸乙酯或乙酸丙酯，C组分为甲醇或乙醇，D组分为水。
5.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述A组分为石油醚，B组分为乙酸乙酯，C组分为甲醇，D组分为水。
6.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述精制溶剂体系为按体积比，石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水＝1：0.4：1：0.5。
7.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述精制溶剂体系为按体积比，正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1：0.5：1：0.5。
8.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中高速逆流色谱仪的转速为600-1000rpm，流动相的流速为0.5-3.0mL/min。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)采用有机溶剂对芝麻进行回流提取1～3次，每次1～3小时。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)将总提取物用溶剂二次提取1～3次，每次1～3小时。
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