CN105983392B - 基于三阳离子液体的液相色谱固定相及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及三阳离子液体键合硅胶液相色谱固定相。本发明还提供了上述液相色谱固定相的制备方法，首先制备了端烯基的三阳离子液体以及在硅球表面接枝了3‑巯基丙基基团，然后利用“巯基‑烯基”点击化学反应将端烯基的三阳离子液体键合至3‑巯基丙基修饰的硅球表面。该三阳离子液体键合硅胶液相色谱固定相具有反相疏水保留机理，对典型疏水物质苯系物、稠环类物质均显示一定的保留和选择性，且柱效理想，最高可达80,000/m。另外，该三阳离子液体键合硅胶液相色谱固定相还显示典型的亲水保留模式，对亲水化合物如核苷、核酸碱基和黄酮类物质均显示很好的保留和分离选择性，作为亲水作用色谱固定相显示良好的应用前景。

Description

基于三阳离子液体的液相色谱固定相及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于高效液相色谱固定相，具体涉及三阳离子液体键合硅胶液相色谱固定相以及其制备方法、分别在亲水和反相色谱条件下对亲水性物质和疏水性物质的分离应用。

背景技术

高效液相色谱是一种重要的现代分离分析技术，目前在很多方面都发挥了至关重要的作用，包括食品安全、环境监测与药物分析等领域。而在色谱分离过程中起关键作用的是固定相，因此对其的开发一直是色谱领域的研究热点。为了提高化合物的覆盖范围，从而提供更广范围的选择性，混合模式固定相的研究和开发引起了研究者的极大兴趣，近年来得到了迅速发展。混合模式固定相通过在同一固定相内引入不同模式的保留机理从而提高对复杂样品的选择性，主要有亲水作用/离子交换和反相色谱/离子交换混合模式固定相，目前在多肽、药物分子以及蛋白质等的分离中显示出许多优越的性能，例如可调节的选择性、更有效的保留和更好的分离能力。在固定相的开发方面，利用不同的选择分子对载体基质进行表面修饰是得到新型固定相的主要途径，近年来，离子液体作为液相色谱固定相选择分子受到极大的关注，得到了较快的发展与应用。研究表明，离子液体表面键合液相色谱固定相具有很好的色谱保留行为，能进行多重相互作用，包括静电作用、离子交换作用、π-π作用以及偶极相互作用和氢键键合作用。目前，所报道的离子液体液相色谱固定相绝大多数是基于单阳离子液体，主要呈现反相色谱与离子交换保留行为来分离阴阳离子以及一些中性化合物。最近中国科学院大连化学物理研究所1808研究组制备了基于咪唑双阳离子液体的液相色谱固定相，其显示典型的亲水保留行为，对亲水性物质具有很好的保留和分离选择性，而同类型的单阳离子液体在同样的亲水色谱条件下对亲水物质基本没有保留，据文献报道其呈现的是反相色谱保留以及离子交换等。对双阳离子液体键合硅胶固定相保留机理的研究表明，其呈现多重相互作用的基于亲水作用/阴离子交换混合保留机理，从而具备更宽范围的色谱选择性。当双阳离子液体被固定到硅胶材料的表面时，其液体性质丢失，但是其独特性能和对材料的表面修饰功能并不会改变，与单阳离子液体相比增强了表面的离子性和亲水性，这有利于亲水色谱模式下对亲水性特别是离子型化合物的保留。

三阳离子液体是近年来发展起来的，典型结构是由三个带正电荷的部分连接于中心核上与阴离子组成的，相比于双阳离子液体其具有更强的可设计性，另外其特殊的结构和空间排列能够带来独特的性能，比如，三阳离子液体作为毛细管气相色谱固定相具有独特的选择性，显示出很好的应用前景。除了游离的三阳离子液体，将三阳离子液体固定于固态载体上，在催化应用中显示更高的催化效率和回收率，这是由于其特殊的结构有利于形成三维催化骨架从而提供更多的催化活性位点。鉴于离子液体特别是双阳离子液体在键合硅胶液相色谱固定相方面显示出的优势与前景，三阳离子液体键合至基质表面也具有作为HPLC固定相的潜力，并且其阳离子数的增加和特殊的排列方式将带来独特的色谱行为和溶剂化性质，然而目前为止还未见相关报道。

发明内容

本发明提供了三阳离子液体键合硅胶液相色谱固定相及其制备方法和应用。

本发明的技术路线是：

三阳离子液体键合硅胶固定相，该固定相可作为亲水作用色谱固定相或反相色谱固定相，键合分子为三阳离子液体，

通过“巯基-双键”点击化学反应，将三阳离子液体A键合至3-巯基丙基修饰的二氧化硅球表面制备得到；

化合物A的结构如下：

其中，n为0或1，m为1～4的正整数，X^-为Br^-、NTf₂ ^-、PF₆ ^-、BF₄ ^-或TfO^-中的一种。优选为1,3,5-{三(3-乙烯基咪唑)甲基}三甲基苯三溴盐、1,3,5-{三(3-乙烯基咪唑)甲基}三甲基苯三(双-三氟甲基磺酰亚胺)盐、1,3,5-{三(3-乙烯基咪唑)甲基}苯三溴盐、1,3,5-{三(3-乙烯基咪唑)甲基}苯三(双-三氟甲基磺酰亚胺)盐、1,3,5-{三(3-烯丙基咪唑)甲基}三甲基苯三溴盐、1,3,5-{三(3-烯丙基咪唑)甲基}三甲基苯三(双-三氟甲基磺酰亚胺)盐、1,3,5-{三(3-烯丙基咪唑)甲基}苯三溴盐、1,3,5-{三(3-烯丙基咪唑)甲基}苯三(双-三氟甲基磺酰亚胺)盐中的一种或二种以上。

所述的固定相中二氧化硅球表面的三阳离子液体A的键合摩尔量为1.2～6.5×10^-5mol/g；二氧化硅球表面的3-巯基丙基的键合摩尔量为4.0～12.0×10^-5mol/g。

所述的3-巯基丙基修饰的二氧化硅球是通过(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷或(3-巯基丙基)三乙氧基硅烷与二氧化硅球在无水甲苯中回流制得的。

所述的三阳离子液体A通过“巯基-烯基”点击化学反应键合在硅球表面，可以是一端或两端键合在硅球表面，也可以是三端均键合至硅球表面。

所述的固定相的制备方法，包括如下三个制备步骤：

1)以无水甲苯作溶剂，将二氧化硅球与(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷或(3-巯基丙基)三乙氧基硅烷以质量比1:1～2:1在氩气保护下于100～120℃回流反应20～30小时得到表面键合有3-巯基丙基的硅球；

2)表面键合有3-巯基丙基的硅球分散于甲醇中，加入三阳离子液体A，三阳离子液体A的双键与3-巯基丙基的摩尔比为0.8-4.0：1，并加入表面键合有3-巯基丙基的硅球与三阳离子液体A二种原料总质量0.5～2％的引发剂AIBN，搅拌均匀后加热至50～70℃在氩气保护下回流24～40小时即得目标固定相；

3)利用匀浆法，将步骤2)所得到的目标固定相填料1.2g分散在12mL甲醇中制成匀浆液，以50mL甲醇作为顶替液，在60MPa的压力下填充至3.0mm×15cm的不锈钢管柱中，得到三阳离子液体液相色谱固定相。

利用所述三阳离子液体键合硅胶液相色谱固定相在反相色谱模式下对典型疏水物质苯系物、稠环类物质、Tanaka测试混合物进行分离，显示一定的保留和分离选择性，且柱效理想，最高可达80,000/m。此外，该三阳离子液体键合硅胶液相色谱固定相还显示典型的亲水保留模式，对亲水化合物如核苷、碱基和黄酮类物质均显示很好的保留和分离选择性，作为亲水作用色谱固定相显示良好的应用前景。

本发明提供的固定相结构新颖，柱效高，在亲水作用色谱和反相色谱条件下均具有很好的保留与分离选择性。

附图说明

图1为本发明制备的键合至硅胶填料表面的三阳离子液体TCIL1和TCIL2的结构示意图；

图2分别为咪唑三阳离子液体TCIL1(a)和TCIL2(b)的¹H NMR谱图；

图3为苯系物(a)和稠环类物质(b)在两种三阳离子液体固定相上的分离色谱图，色谱峰:1.苯,2.甲苯,3.乙苯,4.丙苯,5.丁苯,6.戊苯,7.己苯,1′.尿嘧啶,2′.硝基苯,3′.萘,4′.联苯,5′.芴,6′.菲,7′.芘；流动相:ACN/H₂O(50/50,v/v),等度洗脱,DAD:254nm；流速:0.4mL/min；柱温:30℃；

图4为Tanaka测试混合物在两种三阳离子液体固定相上的分离色谱图，色谱峰:1.苄胺,2.尿嘧啶,3.苯酚,4.丁苯,5.戊苯,6.邻三联苯,7.三亚苯；流动相:ACN/H₂O(50/50,v/v),等度洗脱；DAD:254nm；流速:0.4mL/min；柱温:30℃

图5为15种核苷(a)和8种碱基(b)在两种三阳离子液体固定相上的分离色谱图，色谱峰:1.胸腺嘧啶核苷,2.5’-脱氧-5’-甲硫腺苷,3.1-甲基腺苷,4.N6-甲基腺苷,5.5-甲基尿苷,6.5-甲基胞嘧啶,7.尿苷,8.腺苷,9.7-甲基尿苷,10.1-甲基尿苷,11.假尿苷,12.肌苷,13.胞苷,14.2’-脱氧鸟苷,15.鸟苷.Peaks for(b):1′.胸腺嘧啶,2′.尿嘧啶,3′.1-甲基黄嘌呤,4′.胞嘧啶,5′.腺嘌呤,6′.次黄嘌呤,7′.黄嘌呤,8′.鸟嘌呤；流动相:A相为H₂O(10mM NH₄FA),B相为ACN/H₂O(95/5,v/v,10mM NH₄FA),梯度洗脱10％A起始并保持6min,然后在6-10min内线性增加至30％A并保持在30％A；DAD:254nm；流速:0.4mL/min；柱温:30℃.

图6为两种三阳离子液体固定相对21种黄酮混合物(a)和大豆黄酮提取液(b)的分离图，色谱峰:1.2'-羟基查尔酮,2.樱黄素,3.刺芒柄花素,4.5,7-二羟黄酮,5.橙皮素,6.柚皮素,7.染料木素,8.大豆素,9.香叶木素,10.(±)-香橙素,11.芹菜素,12.根皮素,13.氯化花葵素,14.染料木苷,15.橙皮苷,16.大豆苷,17.川陈皮素,18.黄衫素,19.根皮苷,20.儿茶素,21.牡荆素.流动相A相为H₂O(10mM NH₄FA),B相为ACN/H₂O(95/5,v/v,10mMNH₄FA),梯度洗脱:21种黄酮混合物5％A起始并保持6min,6-12min内线性增加至30％A并保持，大豆黄酮提取物5％A起始保持6min,6-14min内线性升至40％A并保持；DAD:254nm；流速:0.4mL/min；柱温:30℃.

具体实施方式

下面通过实例进一步阐释本发明，实例仅限于说明本发明以便于理解，而非对本发明的限定。

实施例一：三阳离子液体的制备

将1-乙烯基咪唑与2,4,6-三溴甲基三甲基苯以摩尔比7:1在甲醇与异丙醇混合溶剂中，氩气保护下搅拌加热回流反应6天，冷却后，真空旋转蒸发除去溶剂，剩余混合物用乙酸乙酯洗涤除去未反应的原料，得到白色固体，即三阳离子液体1,3,5-{三(3-乙烯基咪唑)甲基}三甲基苯三溴盐，60℃真空干燥。接着，将4g三阳离子液体三溴盐溶于水中，在搅拌条件下加入5.5摩尔三阳离子液体三溴盐当量的双-三氟甲基磺酰亚胺锂盐(LiNTf₂)的水溶液，室温下搅拌48小时以上后，取出上面水层，然后继续用水洗涤四次，得到阴离子为双-三氟甲基磺酰亚胺的三阳离子液体1,3,5-{三(3-乙烯基咪唑)甲基}三甲基苯三(双-三氟甲基磺酰亚胺)盐(TCIL1)。

将1-乙烯基咪唑与1,3,5-三(溴甲基)苯以摩尔比7:1在异丙醇溶剂中，氩气保护下搅拌加热回流反应6天，冷却后，真空旋转蒸发除去溶剂，剩余混合物用乙酸乙酯洗涤除去未反应的原料，得到白色固体，即1,3,5-{三(3-乙烯基咪唑)甲基}苯三溴盐，60℃真空干燥。接着，将4g三阳离子液体三溴盐溶于水中，在搅拌条件下加入5.5摩尔三阳离子液体三溴盐当量的双-三氟甲基磺酰亚胺锂盐(LiNTf₂)的水溶液，室温下搅拌48小时以上后，加入与原溶液相等体积的二氯甲烷，静置分层后除去上层水层，然后继续用水洗涤直至洗出液用AgNO₃检测不到Br^-的存在，旋转蒸发除去溶剂，得到阴离子为双-三氟甲基磺酰亚胺的三阳离子液体1,3,5-{三(3-乙烯基咪唑)甲基}苯三(双-三氟甲基磺酰亚胺)盐(TCIL2)。其中，图1为所制备的三阳离子液体TCIL1和TCIL2的结构示意图，Br^-阴离子的三阳离子液体分别以氘代水和氘代二甲基亚砜作溶剂用核磁共振氢谱进行表征，结果如图2所示。

实施例二：三阳离子液体键合硅胶固定相的制备

将二氧化硅球(粒径5μm，孔径10nm，比表面积310m²g^-1)分散于无水甲苯中搅拌均匀，加入相当于硅球表面硅羟基摩尔数1.3倍的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，在氩气保护下加热回流反应24小时，离心，甲醇洗涤五次，得到表面键合有3-巯基丙基的二氧化硅球，真空60℃干燥。

通过巯基与双键的点击化学反应，将所制备的三阳离子液体TCIL1和TCIL2分别键合至表面键合有3-巯基丙基的硅球表面。取两份表面键合有3-巯基丙基的硅球各3.2g分别分散在两份甲醇中，其中一份加入三阳离子液体TCIL13.5g(双键基团摩尔数为硅球表面巯基的2.5倍)和二者1.5％质量比的引发剂AIBN，另一份加入三阳离子液体TCIL23.5g(双键基团摩尔数为硅球表面巯基的2.5倍)和二者1.5％质量比的引发剂AIBN，均在氩气保护下60℃回流反应25小时，离心，甲醇洗涤五次，产物目标固定相真空60℃干燥。

利用匀浆法，将所得到的两种三阳离子液体键合硅球填料装填成3.0mm×15cm的液相色谱柱：将所得到的目标固定相填料1.2g分散在12mL甲醇中制成匀浆液，以50mL甲醇作为顶替液，在60MPa的压力下填充至不锈钢管柱中。

实施例三：三阳离子液体键合硅胶固定相的评价

首先，对三阳离子液体键合硅胶固定相进行元素分析，结果如下：TCIL键合硅胶(C％9.62,N％2.22,H％1.22)和TCIL2键合硅胶(C％9.21,N％2.24,H％1.10)，所对应的表面键合量以N元素负载量计算分别为0.73和0.74μmol/m²。

其次，评价所制备的两种基于三阳离子液体的固定相的反相保留行为，在反相色谱条件下对苯系物、稠环类物质以及Tanaka测试混合物进行分离，分离色谱图如图3和图4所示。以萘为探针，流动相以ACN/H₂O(50/50,v/v)等度洗脱,DAD 254nm检测，流速为0.4mL/min的条件下，两种固定相TCIL1和TCIL2的柱效分别为80000plates/m和73000plates/m。可以看出，基于三阳离子液体的色谱柱具有一定的反相保留行为，在反相色谱条件下能够较好的保留疏水物质，并且显示很好的选择性。

另外，还评价了所制备的三阳离子液体键合硅胶固定相在亲水作用色谱模式下的分离选择性，分别对核苷、碱基以及黄酮类物质进行了分离，结果如图5和图6所示。结果表明，三阳离子液体键合硅胶固定相对典型亲水物质如核苷和碱基显示很好的保留和分离选择性，并且由于三阳离子液体的多重相互作用使得其在亲水作用色谱条件下对黄酮类物质也显示较好的保留行为和独特的选择性。

除此之外，还考察了三阳离子液体键合硅胶固定相在反相条件下流动相中ACN含量对疏水物质保留的影响和在亲水色谱条件下流动相中水含量对亲水性物质保留的影响，结果表明固定相同时具有典型的反相色谱保留行为和亲水色谱保留行为。

由此可见，三阳离子液体键合硅胶固定相不仅显示一定的反相保留与选择性，还具有很好的亲水保留行为，其作为RPLC固定相或HILIC固定相具有一定的应用潜力。

Claims (6)

1.三阳离子液体液相色谱固定相，其特征在于：该固定相为反相色谱固定相，通过“巯基-双键”点击化学反应，将三阳离子液体A键合至3-巯基丙基修饰的二氧化硅球表面制备得到；

化合物A的结构如下：

其中，n为0或1，m为1～4的正整数，X^-为Br^-、NTf₂ ^-、PF₆ ^-、BF₄ ^-或TfO^-中的一种，Y为H或-CH₃。

2.根据权利要求1所述的固定相，其特征在于：

所述的固定相中二氧化硅球表面的三阳离子液体A的键合摩尔量为1.2～6.5×10^{- 5}mol/g；二氧化硅球表面的3-巯基丙基的键合摩尔量为4.0～12.0×10^-5mol/g。

3.根据权利要求1所述的固定相，其特征在于：所述的三阳离子液体A通过“巯基-烯基”点击化学反应键合在硅球表面，是一端、两端或三端通过化学键键合于硅球表面。

4.根据权利要求1所述的固定相，其特征在于：

所述的化合物A为1,3,5-{三(3-乙烯基咪唑)甲基}三甲基苯三溴盐、1,3,5-{三(3-乙烯基咪唑)甲基}三甲基苯三(双-三氟甲基磺酰亚胺)盐、1,3,5-{三(3-乙烯基咪唑)甲基}苯三溴盐、1,3,5-{三(3-乙烯基咪唑)甲基}苯三(双-三氟甲基磺酰亚胺)盐、1,3,5-{三(3-烯丙基咪唑)甲基}三甲基苯三溴盐、1,3,5-{三(3-烯丙基咪唑)甲基}三甲基苯三(双-三氟甲基磺酰亚胺)盐、1,3,5-{三(3-烯丙基咪唑)甲基}苯三溴盐、1,3,5-{三(3-烯丙基咪唑)甲基}苯三(双-三氟甲基磺酰亚胺)盐中的一种或二种以上。

5.一种权利要求1所述的固定相的制备方法，其特征在于：包括如下三个制备步骤，

1)以无水甲苯作溶剂，将二氧化硅球与(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷或(3-巯基丙基)三乙氧基硅烷以质量比1:1～2:1在氩气保护下于100～120℃回流反应20～30小时得到表面键合有3-巯基丙基的硅球；

2)表面键合有3-巯基丙基的硅球分散于甲醇中，加入三阳离子液体A，三阳离子液体A的双键与3-巯基丙基的摩尔比为0.8-4.0：1，并加入表面键合有3-巯基丙基的硅球与三阳离子液体A二种原料总质量0.5～2％的引发剂AIBN，搅拌均匀后加热至50～70℃在氩气保护下回流24～40小时即得目标固定相；

3)利用匀浆法，将步骤2)所得到的目标固定相填料1.2g分散在12mL甲醇中制成匀浆液，以50mL甲醇作为顶替液，在60MPa的压力下填充至3.0mm×15cm的不锈钢管柱中，得到三阳离子液体液相色谱固定相。

6.一种权利要求1所述固定相的应用，其特征在于：将固定相在反相色谱模式下对典型疏水性物质进行分离，显示一定的保留和良好的分离选择性。