CN105969712B - 一种共表达分子伴侣蛋白提高重组大肠杆菌1,2,4-丁三醇产量的方法 - Google Patents

一种共表达分子伴侣蛋白提高重组大肠杆菌1,2,4-丁三醇产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种共表达分子伴侣蛋白提高重组大肠杆菌中1,2,4‑丁三醇产量的方法，属于遗传工程领域。本发明是以重组大肠杆菌E.coli(pEtac‑mdlC‑tac‑xdh)作为出发菌株，通过共表达分子伴侣蛋白，辅助1,2,4‑丁三醇合成途径中关键酶的折叠，增强关键酶活性，从而提高1,2,4‑丁三醇产量的方法。最后优选分子伴侣Trigger factor，使重组大肠杆菌1,2,4‑丁三醇产量提高了1.4倍。

Description

一种共表达分子伴侣蛋白提高重组大肠杆菌1,2,4-丁三醇产 量的方法
技术领域
本发明涉及一种共表达分子伴侣蛋白提高重组大肠杆菌中1,2,4-丁三醇的方法，属于遗传工程领域。
技术背景
1,2,4-丁三醇是一种四碳多元醇，无色，无臭，无味，性质与甘油类似，主要应用于军工、医药、化妆品、化工等领域。目前，1,2,4-丁三醇主要通过化学法生产，但化学法存在着反应条件严苛，所用催化剂昂贵，易造成环境污染、副产物较多，不利于分离纯化的弊端，故近年来，研究的焦点逐渐转向生物合成法。
迄今为止，尚未在生物体内发现1,2,4-丁三醇，故生物法合成丁三醇是通过引进外源蛋白，构建合成路径。目前已在大肠杆菌中构建成功且研究较多的合成途径为：从木糖出发，在木糖脱氢酶作用下，生成木糖酸，木糖酸经木糖酸脱水酶，苯甲酰甲酸脱羧酶及醇脱氢酶的作用，生成1,2,4-丁三醇。但该方法产量仍未达到工业生产的要求，主要是由于关键代谢酶催化活性低下。因此，提高关键代谢酶活性是提高1,2,4-丁三醇产量的关键。
分子伴侣蛋白(chaperone)是一类蛋白，他们可以介导蛋白质的正确装配，但并不作为蛋白的组成部分。目前常见于大肠杆菌中的分子伴侣蛋白有三种：GroES-GroEL、DnaK-DnaJ-GrpE和Trigger factor。其中，GroEL属于Hsp60伴侣家族，GroES为其辅助分子伴侣，两者在ATP的共同作用下可以与未折叠或部分折叠的多肽结合，释放未折叠的多肽进入折叠池，以及对折叠好的蛋白进行结构重排。DnaK、DnaJ均属于Hsp70家族，主要功能包括辅助体内蛋白质折叠以及跨膜转运、降解以及调节异常蛋白质。GrpE作为二者的辅助因子，可以辅助正确折叠蛋白的释放。Trigger factor是一个三亚基蛋白，可以与新生肽链结合，辅助蛋白折叠。另外，不同的伴侣蛋白间也存在协同作用。在大肠杆菌中共表达分子伴侣蛋白可以辅助外源蛋白的折叠，提高目的蛋白酶活水平，如trigger factor的引入促进小鼠内皮抑制素、人体氧调节蛋白的溶解程度。在本研究中，引入分子伴侣蛋白，可能提高代谢酶活性，从而提升1,2,4-丁三醇产量。
发明内容
本发明首先提供五种共表达分子伴侣蛋白的重组大肠杆菌，是以E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)为出发菌株，分别转入含有分子伴侣蛋白基因的质粒pG-KJE8、pGro7、pTf16、pKJE7、pG-Tf2，构建而成的重组大肠杆菌E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)/pG-KJE8，E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)/pGro7，E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)/pTf16，E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)/pKJE7，E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)/pG-Tf2。
其中，所述E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)，是以E.coli W3100为宿主，以启动子Ptac调控Xdh、MdlC表达，具体构建方法参见文献(孙文龙,陆信曜,宗红,等.代谢工程改造大肠杆菌合成D-1,2,4-丁三醇[J].微生物学通报,2014,41(10))。
本发明所述质粒pG-KJE8、pGro7、pTf16、pKJE7、pG-Tf2含有不同分子伴侣蛋白基因，其中，pG-KJE8含有DnaK-DnaJ-GrpE及GroES-GroEL编码基因，pG-Tf2携带Triggerfactor及GroES-GroEL，而质粒pGro7、pTf16、pKJE7则分别带有GroES-GroEL、Triggerfactor、DnaK-DnaJ-GrpE蛋白。
所述DnaK编码基因如NCBI-Gene ID:944750所示，DnaJ编码基因如NCBI-Gene ID:944753所示，GrpE基因如NCBI-Gene ID:947097所示。所述GroES编码基因如NCBI-Gene ID:948655所示，GroEL编码基因如NCBI-Gene ID:948665所示，tig基因如NCBI-Gene ID:945081所示。
分子伴侣蛋白氨基酸序列如下：
GroES：
MNIRPLHDRVIVKRKEVETKSAGGIVLTGSAAAKSTRGEVLAVGNGRILENGEVKPLDVKVGDIVIFNDGYGVKSEKIDNEEVLIMSESDILAIVEA
GroEL：
MAAKDVKFGNDARVKMLRGVNVLADAVKVTLGPKGRNVVLDKSFGAPTITKDGVSVAREIELEDKFENMGAQMVKEVASKANDAAGDGTTTATVLAQAIITEGLKAVAAGMNPMDLKRGIDKAVTAAVEELKALSVPCSDSKAIAQVGTISANSDETVGKLIAEAMDKVGKEGVITVEDGTGLQDELDVVEGMQFDRGYLSPYFINKPETGAVELESPFILLADKKISNIREMLPVLEAVAKAGKPLLIIAEDVEGEALATLVVNTMRGIVKVAAVKAPGFGDRRKAMLQDIATLTGGTVISEEIGMELEKATLEDLGQAKRVVINKDTTTIIDGVGEEAAIQGRVAQIRQQIEEATSDYDREKLQERVAKLAGGVAVIKVGAATEVEMKEKKARVEDALHATRAAVEEGVVAGGGVALIRVASKLADLRGQNEDQNVGIKVALRAMEAPLRQIVLNCGEEPSVVANTVKGGDGNYGYNAATEEYGNMIDMGILDPTKVTRSALQYAASVAGLMITTECMVTDLPKNDAADLGAAGGMGGMGGMGGMM
DnaK：
MGKIIGIDLGTTNSCVAIMDGTTPRVLENAEGDRTTPSIIAYTQDGETLVGQPAKRQAVTNPQNTLFAIKRLIGRRFQDEEVQRDVSIMPFKIIAADNGDAWVEVKGQKMAPPQISAEVLKKMKKTAEDYLGEPVTEAVITVPAYFNDAQRQATKDAGRIAGLEVKRIINEPTAAALAYGLDKGTGNRTIAVYDLGGGTFDISIIEIDEVDGEKTFEVLATNGDTHLGGEDFDSRLINYLVEEFKKDQGIDLRNDPLAMQRLKEAAEKAKIELSSAQQTDVNLPYITADATGPKHMNIKVTRAKLESLVEDLVNRSIEPLKVALQDAGLSVSDIDDVILVGGQTRMPMVQKKVAEFFGKEPRKDVNPDEAVAIGAAVQGGVLTGDVKDVLLLDVTPLSLGIETMGGVMTTLIAKNTTIPTKHSQVFSTAEDNQSAVTIHVLQGERKRAADNKSLGQFNLDGINPAPRGMPQIEVTFDIDADGILHVSAKDKNSGKEQKITIKASSGLNEDEIQKMVRDAEANAEADRKFEELVQTRNQGDHLLHSTRKQVEEAGDKLPADDKTAIESALTALETALKGEDKAAIEAKMQELAQVSQKLMEIAQQQHAQQQTAGADASANNAKDDDVVDAFEEVKDKK
DnaJ：
MAKQDYYEILGVSKTAEEREIRKAYKRLAMKYHPDRNQGDKEAEAKFKEIKEAYEVLTDSQKRAAYDQYGHAAFEQGGMGGGGFGGGADFSDIFGDVFGDIFGGGRGRQRAARGADLRYNMELTLEEAVRGVTKEIRIPTLEECDVCHGSGAKPGTQPQTCPTCHGSGQVQMRQGFFAVQQTCPHCQGRGTLIKDPCNKCHGHGRVERSKTLSVKIPAGVDTGDRIRLAGEGEAGEHGAPAGDLYVQVQVKQHPIFEREGNNLYCEVPINFAMAALGGEIEVPTLDGRVKLKVPGETQTGKLFRMRGKGVKSVRGGAQGDLLCRVVVETPVGLNERQKQLLQELQESFGGPTGEHNSPRSKSFFDGVKKFFDDLTR
GrpE：
MSSKEQKTPEGQAPEEIIMDQHEEIEAVEPEASAEQVDPRDEKVANLEAQLAEAQTRERDGILRVKAEMENLRRRTELDIEKAHKFALEKFINELLPVIDSLDRALEVADKANPDMSAMVEGIELTLKSMLDVVRKFGVEVIAETNVPLDPNVHQAIAMVESDDVAPGNVLGIMQKGYTLNGRTIRAAMVTVAKAKA
Trigger factor：
MQVSVETTQGLGRRVTITIAADSIETAVKSELVNVAKKVRIDGFRKGKVPMNIVAQRYGASVRQDVLGDLMSRNFIDAIIKEKINPAGAPTYVPGEYKLGEDFTYSVEFEVYPEVELQGLEAIEVEKPIVEVTDADVDGMLDTLRKQQATWKEKDGAVEAEDRVTIDFTGSVDGEEFEGGKASDFVLAMGQGRMIPGFEDGIKGHKAGEEFTIDVTFPEEYHAENLKGKAAKFAINLKKVEERELPELTAEFIKRFGVEDGSVEGLRAEVRKNMERELKSAIRNRVKSQAIEGLVKANDIDVPAALIDSEIDVLRRQAAQRFGGNEKQALELPRELFEEQAKRRVVVGLLLGEVIRTNELKADEERVKGLIEEMASAYEDPKEVIEFYSKNKELMDNMRNVALEEQAVEAVLAKAKVTEKETTFNELMNQQA
本发明还提供了应用所述重组大肠杆菌发酵生产1,2,4-丁三醇的方法，将37℃、200rpm下培养12h的重组大肠杆菌以1％的接种量转入发酵培养基，同时根据需要加入2mg/mL阿拉伯糖，10ng/mL四环素，0.5mmol/L IPTG，在37℃、200rpm下培养50h。
重组大肠杆菌种子培养及发酵：
种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。
发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，木糖20。
培养条件：将37℃、200rpm下培养12h的种子以1％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养50h。
本发明是以重组大肠杆菌E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)作为出发菌株，通过共表达分子伴侣蛋白提高关键代谢酶的折叠效率，进而提高关键酶催化活性，从而提高1,2,4-丁三醇的产量。在摇瓶发酵过程中，含有质粒pTf16的重组大肠杆菌1,2,4-丁三醇产量达到1.01g/L，提高1.4倍。本发明为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产1,2,4-丁三醇奠定了基础。本发明提供的重组大肠杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。
具体实施方式
实例1
将E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)菌体培养到OD600等于0.4-0.6时，从摇床取出，冰浴30min后离心。用0.1mol/L的CaCl2洗涤菌体，培养1h后涂布相应抗性平板，待其长出后挑取正确转化子，得到含有相应质粒的重组大肠杆菌E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)/pG-KJE8，E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)/pGro7，E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)/pTf16，E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)/pKJE7，E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)/pG-Tf2。
实例2
从平板上挑取不同重组菌的单菌落，过夜培养后作为种子液，以1％的接种量接种于45mL LB中，同时加入2mg/ml阿拉伯糖或10ng/ml四环素诱导分子伴侣蛋白表达。待培养至OD600＝0.6时加入IPTG和木糖母液，至IPTG、木糖终浓度分别为0.5mmol/L和20g/L，在37℃、200rpm下培养50h，取发酵上清液进行高效液相色谱检测。
实例3
首先将发酵液12 000rpm离心除去细胞，上清液用0.22μm混合纤维素酯微孔膜过滤即可用于HPLC检测。检测条件：Agilent 1260，RID检测器，色谱柱为Bio-Rad AminexHPX-87 column(300mm×7.8mm)，柱温60℃，流动相为5mmol/L H2SO4，流速0.6mL/min。结果如表1所示，其中E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)/pTf16的1,2,4-丁三醇产量达到1.01g/l。
表1含有不同分子伴侣蛋白的重组大肠杆菌的1,2,4-丁三醇产量
虽然本发明已以较佳实例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (1)

1.一种高产1,2,4-丁三醇的重组大肠杆菌，其特征在于，以重组大肠杆菌E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)为出发菌株，导入含有分子伴侣蛋白的质粒pTf16，其中重组大肠杆菌E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)是以E.coli W3100为宿主，以启动子Ptac调控Xdh、MdlC表达。
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