CN105950762A - 一种水稻条纹叶枯病抗性检测方法 - Google Patents

一种水稻条纹叶枯病抗性检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105950762A
CN105950762A CN201610495876.7A CN201610495876A CN105950762A CN 105950762 A CN105950762 A CN 105950762A CN 201610495876 A CN201610495876 A CN 201610495876A CN 105950762 A CN105950762 A CN 105950762A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rice
spike
stripe
stripe disease
round
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610495876.7A
Other languages
English (en)
Inventor
许建中
林少会
安剑石
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuxi Nanligong Technology Development Co Ltd
Original Assignee
Wuxi Nanligong Technology Development Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuxi Nanligong Technology Development Co Ltd filed Critical Wuxi Nanligong Technology Development Co Ltd
Priority to CN201610495876.7A priority Critical patent/CN105950762A/zh
Publication of CN105950762A publication Critical patent/CN105950762A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种水稻条纹叶枯病抗性检测方法，本发明选育水稻条纹叶枯病抗性品种杂交种F1，并对杂交种F1通过分子标记得到抗条纹叶枯病的基因位点，并确定抗条纹叶枯病在第4号染色体上的位置。本发明涉及的水稻条纹叶枯病抗性检测方法，通过检测水稻品种第4号染色体上引物标记的带型数据，评估其对水稻条纹叶枯病的抗性，大大提高抗条纹叶枯病水稻的选择效率。

Description

一种水稻条纹叶枯病抗性检测方法
技术领域
本发明涉及一种水稻条纹叶枯病抗性检测方法，具体涉及在水稻条纹叶枯病抗性品种的4号染色体上分子标记出水稻条纹叶枯病抗性基因的方法，属于农业生物技术领域。
背景技术
水稻条纹叶枯病是由灰飞虱介导的水稻条纹叶枯病毒(rice stripe virus，RSV)引起的一类病毒病，该病多在中国、日本、朝鲜等东亚温、热带地区发生。植物对这类病毒病的抗性可分为对病毒的抗侵染性、对病毒的忍耐性以及对介体昆虫的抗性。由于我国水稻种植区内大部分地区的主栽品种都是中感或高感品种，该病发生极为严重。自20世纪90年代RSV在江苏再次发生以来，已相继蔓延至整个长江中下游稻区，并迅速上升为该地区水稻生产上最主要的病害之一。该病在江苏地区发生所带来的危害逐年加重，严重的甚至出现大面积的失收田块，造成了巨大的经济损失。
现有技术防治水稻条纹叶枯病主要方法是利用化学药剂，但目前生产上广泛使用的农药只针对介体昆虫，植株一旦染病就没有十分有效的防治措施，其效果有限；而且化学药剂的使用不可避免地对环境造成污染和破坏。生产过程中还有通过改进栽培技术条件对水稻条纹叶枯病进行防治的措施，但收效甚微。
现有技术在水稻生产上对水稻条纹叶枯病的防治对策在一定程度上增加了水稻生产的成本，并且加重了环境压力。
利用水稻品种抗性被认为是目前防治条纹叶枯病最经济、有效的手段。将栽培水稻或野生稻中的水稻条纹叶枯病抗性基因转育到主栽稻品种中，是获得安全的水稻条纹叶枯病抗性品种的最有效方法，但现有技术育种的进程缓慢且未有专门针对水稻条纹叶枯病抗体的育种方法。
发明内容
基于现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种水稻条纹叶枯病抗性检测方法，选育水稻条纹叶枯病抗性品种杂交种F1，并运用SSR分子标记从水稻条纹叶枯病抗性品种中在4号染色体上标记出水稻条纹叶枯病抗性基因。
具体步骤如下：
(1)杂交种F1的获得：以水稻条纹叶枯病抗源武陵粳1号为母本，水稻条纹叶枯病高感品种连粳3号为父本，二者正季播种，于实验秧田，单株移栽，株行距为30×30cm；一般大田肥水和病虫草害管理，至植株正常生长到扬花期，将武陵粳1号植株的稻穗浸入39～46℃的温水中，浸泡6～10分钟后取出，自然冷却30分钟，剪去l/3颖壳及未开颖的小花，用纸袋将武陵粳1号植株的稻穗套好并作标记，待用。当连粳3号植株进入开花期时，将连粳3号植株上稻穗的花药均匀落到纸袋中武陵粳1号植株稻穗的柱头上，人工授粉完成后将纸袋继续套好，等待杂交稻穗的籽粒成熟，即获得杂交种F1。
(2)杂交种F1的花药愈伤诱导：杂交种F1正季播种，稻穗中部花药位置占颖壳的1/2为标准取穗，取穗后用70％乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整个稻穗，保持稻穗湿润放入冰箱中，在4℃下低温预处理3天；剪去l/3颖壳及未开颖的小花，在85％的酒精中消毒处理2～10分钟，晾干后用剪开花药上部，将花药置于第一培养基中，进行诱导培养，在22～28℃下暗培养2～3天后，转移至第二培养基中，于25～29℃、光周期16h7500lx光照8h黑暗下进行继代培养，50天后将获得的杂交种F1的花药愈伤组织，继续培养出花培苗、育苗、移植到大田，等待稻穗籽粒成熟，通过筛选即获得水稻条纹叶枯病抗性品种。
所述第一培养基的成分为：N6基础培养基1900mg/L、甘氨酸2.0mg/L，烟酸0.5mg/L，琼脂7.5g/L；激动素KT 2.0mg/L，山梨醇25g/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺500mg/L，丙氨酸0.6mg/L，叶酸0.5mg/L，秋水仙碱0.3mg/L；pH值为6.0。
所述第二培养基的成分为：MS基本培养基1900mg/L、肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/L，维生素B1 0.4mg/L，维生素B6 0.5mg/L，蔗糖25g/L，萘乙酸NAA 0.5mg/L，生物素0.1mg/L，甲基亚硝基脲0.8mg/L，调环酸钙0.4mg/L，水解蛋白1.0g/L；以及浓度20％的水稻条纹叶枯病毒粗毒素提取液，pH值为6.0。
所述水稻条纹叶枯病毒粗毒素提取液的制备方法为：将感染水稻条纹叶枯病水稻的穗颈部剪下，清洁表面后置于湿润培养皿中，在30℃条件下暗培养，在菌丝产生后加入营养琼脂继续培养，得到菌株；将菌株接种到液体培养基中30℃下摇床培养30天，超声振荡15～60分钟、过滤、以500～1500rpm的速度离心5～10分钟，得到的上清液即水稻条纹叶枯病毒粗毒素。
(3)预处理：取新鲜水稻叶片加入液氮研磨成细粉，加入体积百分比2％的β-巯基乙醇，震荡，加入50mM的三(羟甲基)氨基甲烷Tris-HCl、30mM的乙二胺四乙酸EDTA、质量体积百分比为2％的聚乙烯吡咯烷酮PVP以及质量体积百分比为5％的十六烷基三甲基溴化铵CTAB，混合均匀，将混合物加热到50～60℃并保持该温度，在水浴摇床上摇摆50～80min，将混合物离心分散15～30min，提取上清液，在-20℃环境中沉淀120～480min，离心分散后弃上清液得到DNA沉淀物。
所述水稻叶片与β-巯基乙醇、Tris-HCl、PVP、CTAB的质量体积比mg/μL/μL/μL/μL为1:1～5:1～5:3～8:8～12，优选为1:3:3:5:10。
所述两次离心分散的速率为800～1600rpm，优选为900rpm。
(4)SSR引物：用实验室已有的大体平均分布于水稻12条染色体的296对SSR引物，所述296对SSR引物含54对自行合成引物。
(5)PCR反应：PCR反应体系为：总体积为10μL，0.5μL15mM的脱氧核糖核苷三磷酸dNTP，1.2μL10×PCR buffer，上下游引物各1.5μL，5U/μL的Taq酶0.2μL，补水至10μL；PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后得到的PCR扩增产物4℃保存1h。
(6)染色：向PCR扩增产物加入2μL上样缓冲液，混合均匀后加入10％的聚丙烯酰胺PAGE的点样孔，恒压180V电泳2～3h，PAGE在硝酸银溶液和蒸馏水中银染15min，在显影液作用下染色。
(7)检测：根据定位群体各单株分子标记多态性检测结果，并结合其抗性表型参数，进行基因和分子标记位点的遗传连锁分析；检测水稻条纹叶枯病的抗性数量性状基因座QTL，LOD值的阈值定为2.5～3.0，按P＝0.005的概率值检测抗性QTL的数目及其在染色体上的位置。
本发明涉及的一种水稻条纹叶枯病抗性检测方法，以水稻条纹叶枯病抗源武陵粳1号为母本，水稻条纹叶枯病高感品种连粳3号为父本，选育水稻条纹叶枯病抗性品种杂交种F1。通过对杂交种F1通过花药愈伤诱导培育的新品种进行分子标记得到抗条纹叶枯病基因位点qRBSDV15，位于第4号染色体分子标记RM7396与自行合成的分子标记04-17之间。本发明涉及的水稻条纹叶枯病抗性染色体的分子标记方法，可以通过检测某一品种第4号染色体上下游两个引物标记的带型数据，评估其对水稻条纹叶枯病的抗性，大大提高抗条纹叶枯病水稻的选择效率。
本发明通过分子标记的方法对水稻条纹叶枯病的抗性进行评估，避免使用化学药剂增加水稻生产的成本且避免对环境造成污染和破坏，无需多世代重复杂交回交，缩短了育种周期。
附图说明
图1为4号染色体上抗条纹叶枯病基因位点qRBSDV15在染色体上的位置。
图2为4号染色体上抗条纹叶枯病基因位点评估水稻品种对水稻条纹叶枯病的抗性的电泳图谱。M：Mark；1：武陵粳1号；2：连粳3号；3：F1；4-11：抗病单株；12-20：感病单株。
具体实施方式
下面通过具体实施例，进一步对本发明的技术方案进行具体说明。应该理解，下面的实施例只是作为具体说明，而不限制本发明的范围，同时本领域的技术人员根据本发明所做的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。
实施例1
(1)杂交种F1的获得：正季收集来源于15个省份共251份水稻品种进行抗水稻条纹叶枯病田间诱发鉴定，结果表明，不同省区水稻品种对条纹叶枯病的抗性存在明显差异，来自于江苏的粳稻品种武陵粳1号水稻条纹叶枯病抗性较好，大田发病率仅有5％，属于高抗水平。以水稻条纹叶枯病抗源武陵粳1号为母本，水稻条纹叶枯病高感品种连粳3号为父本，二者正季播种于实验秧田，单株移栽，株行距为30×30cm；一般大田肥水和病虫草害管理，至植株正常生长到扬花期，将武陵粳1号植株的稻穗浸入39～46℃的温水中，浸泡6～10分钟后取出，自然冷却30分钟，剪去l/3颖壳及未开颖的小花，用纸袋将武陵粳1号植株的稻穗套好并作标记，待用。当连粳3号植株进入开花期时，将连粳3号植株上稻穗的花药均匀落到纸袋中武陵粳1号植株稻穗的柱头上，人工授粉完成后将纸袋继续套好，等待杂交稻穗的籽粒成熟，即获得杂交种F1。
(2)杂交种F1的花药愈伤诱导：
杂交种F1正季播种，稻穗中部花药位置占颖壳的1/2为标准取穗，取穗后用70％乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整个稻穗，保持稻穗湿润放入冰箱中，在4℃下低温预处理3天；剪去l/3颖壳及未开颖的小花，在85％的酒精中消毒处理2～10分钟，晾干后用剪开花药上部，将花药置于第一培养基中，进行诱导培养，在22～28℃下暗培养2～3天后，转移至第二培养基中，于25～29℃、光周期16h7500lx光照8h黑暗下进行继代培养，50天后将获得的杂交种F1的花药愈伤组织，继续培养出花培苗、育苗、移植到大田，等待稻穗籽粒成熟，通过筛选即获得水稻条纹叶枯病抗性品种。
所述第一培养基的成分为：N6基础培养基1900mg/L、甘氨酸2.0mg/L，烟酸0.5mg/L，琼脂7.5g/L；激动素KT 2.0mg/L，山梨醇25g/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺500mg/L，丙氨酸0.6mg/L，叶酸0.5mg/L，秋水仙碱0.3mg/L；pH值为6.0。
所述第二培养基的成分为：MS基本培养基1900mg/L、肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/L，维生素B1 0.4mg/L，维生素B6 0.5mg/L，蔗糖25g/L，萘乙酸NAA 0.5mg/L，生物素0.1mg/L，甲基亚硝基脲0.8mg/L，调环酸钙0.4mg/L，水解蛋白1.0g/L；以及浓度20％的水稻条纹叶枯病毒粗毒素提取液，pH值为6.0。
所述水稻条纹叶枯病毒粗毒素提取液的制备方法为：将感染水稻条纹叶枯病水稻的穗颈部剪下，清洁表面后置于湿润培养皿中，在30℃条件下暗培养，在菌丝产生后加入营养琼脂继续培养，得到菌株；将菌株接种到液体培养基中30℃下摇床培养30天，超声振荡15～60分钟、过滤、以500～1500rpm的速度离心5～10分钟，得到的上清液即水稻条纹叶枯病毒粗毒素。
(3)预处理：取新鲜水稻叶片加入液氮研磨成细粉，加入体积百分比2％的β-巯基乙醇，震荡，加入50mM的三(羟甲基)氨基甲烷Tris-HCl、30mM的乙二胺四乙酸EDTA、质量体积百分比为2％的聚乙烯吡咯烷酮PVP以及质量体积百分比为5％的十六烷基三甲基溴化铵CTAB，混合均匀，将混合物加热到50～60℃并保持该温度，在水浴摇床上摇摆50～80min，将混合物离心分散15～30min，提取上清液，在-20℃环境中沉淀120～480min，离心分散后弃上清液得到DNA沉淀物。
所述水稻叶片与β-巯基乙醇、Tris-HCl、PVP、CTAB的质量体积比mg/μL/μL/μL/μL为1:3:3:5:10。
所述两次离心分散的速率为800～1600rpm。
(4)SSR引物：用实验室已有的大体平均分布于水稻12条染色体的296对SSR引物，所述296对SSR引物含54对自行合成引物。
(5)PCR反应：PCR反应体系为：总体积为10μL，0.5μL15mM的脱氧核糖核苷三磷酸dNTP，1.2μL10×PCR buffer，上下游引物各1.5μL，5U/μL的Taq酶0.2μL，补水至10μL；PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后得到的PCR扩增产物4℃保存1h。
(6)检测：PCR扩增产物用10％的聚丙烯酰胺PAGE经硝酸银染色后，再用NaOH显色。
向PCR扩增产物加入2μL上样缓冲液，混合均匀后加入PAGE的点样孔，恒压180V电泳2～3h，PAGE在硝酸银溶液和蒸馏水中银染15min，在显影液作用下染色。
(7)根据定位群体各单株分子标记多态性检测结果，并结合其抗性表型参数，用Mapmaker/Exp3.0软件进行基因和分子标记位点的遗传连锁分析，利用Kosambi作图函数将交换率转换为遗传距离(CM)。
(8)采用基于复合区间作图法软件Windows QTL Cartographer V2.5检测水稻条纹叶枯病的抗性QTL，LOD值的阈值定为2.8，按P＝0.005概率值检测抗性QTL的数目及其在染色体上的位置。在4号染色体上检测到1个水稻条纹叶枯病抗性QTL，LOD值为3.88，贡献率为17.9％，命名为qRBSDV15，位于第4号染色体分子标记RM7396：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2与自行合成的分子标记引物04-17：SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4之间(如图1)。
(9)用第4号染色体分子标记RM7396引物：如果用分子标记RM7396引物：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2能够扩增出140bp的扩增片段，或用自行合成的分子标记引物04-17：SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4能够扩增出92bp的扩增片段，则标志着水稻材料内存在抗水稻条纹叶枯病位点qRBSDV15(如图2)，通过检测第4号染色体上该两个引物标记的带型数据，评估该植株对水稻条纹叶枯病的抗性。

Claims (5)

1.一种水稻条纹叶枯病抗性检测方法，其特征在于：其步骤如下：
(1)杂交种F1的获得：以水稻条纹叶枯病抗源武陵粳1号为母本，水稻条纹叶枯病高感品种连粳3号为父本，二者正季播种，于实验秧田，单株移栽，株行距为30×30cm；一般大田肥水和病虫草害管理，至植株正常生长到扬花期，将武陵粳1号植株的稻穗浸入39～46℃的温水中，浸泡6～10分钟后取出，自然冷却30分钟，剪去l/3颖壳及未开颖的小花，用纸袋将武陵粳1号植株的稻穗套好并作标记，待用；当连粳3号植株进入开花期时，将连粳3号植株上稻穗的花药均匀落到纸袋中武陵粳1号植株稻穗的柱头上，人工授粉完成后将纸袋继续套好，等待杂交稻穗的籽粒成熟，即获得杂交种F1；
(2)杂交种F1的花药愈伤诱导：杂交种F1正季播种，稻穗中部花药位置占颖壳的1/2为标准取穗，取穗后用70％乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整个稻穗，保持稻穗湿润放入冰箱中，在4℃下低温预处理3天；剪去l/3颖壳及未开颖的小花，在85％的酒精中消毒处理2～10分钟，晾干后用剪开花药上部，将花药置于第一培养基中，进行诱导培养，在22～28℃下暗培养2～3天后，转移至第二培养基中，于25～29℃、光周期16h7500lx光照8h黑暗下进行继代培养，50天后将获得的杂交种F1的花药愈伤组织，继续培养出花培苗、育苗、移植到大田，等待稻穗籽粒成熟，通过筛选即获得水稻条纹叶枯病抗性品种；
(3)预处理：取新鲜水稻叶片加入液氮研磨成细粉，加入体积百分比2％的β-巯基乙醇，震荡，加入50mM的三(羟甲基)氨基甲烷Tris-HCl、30mM的乙二胺四乙酸EDTA、质量体积百分比为2％的聚乙烯吡咯烷酮PVP以及质量体积百分比为5％的十六烷基三甲基溴化铵CTAB，混合均匀，将混合物加热到50～60℃并保持该温度，在水浴摇床上摇摆50～80min，将混合物离心分散15～30min，提取上清液，在-20℃环境中沉淀120～480min，离心分散后弃上清液得到DNA沉淀物；
所述水稻叶片与β-巯基乙醇、Tris-HCl、PVP、CTAB的质量体积比mg/μL/μL/μL/μL为1:1～5:1～5:3～8:8～12；
所述两次离心分散的速率为800～1600rpm；
(4)SSR引物：用实验室已有的大体平均分布于水稻12条染色体的296对SSR引物，所述296对SSR引物含54对自行合成引物；
(5)PCR反应：PCR反应体系为：总体积为10μL，0.5μL15mM的脱氧核糖核苷三磷酸dNTP，1.2μL10×PCR buffer，上下游引物各1.5μL，5U/μL的Taq酶0.2μL，补水至10μL；PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后得到的PCR扩增产物4℃保存1h；
(6)染色：向PCR扩增产物加入2μL上样缓冲液，混合均匀后加入10％的聚丙烯酰胺PAGE的点样孔，恒压180V电泳2～3h，PAGE在硝酸银溶液和蒸馏水中银染15min，在显影液作用下染色；
(7)检测：根据定位群体各单株分子标记多态性检测结果，并结合其抗性表型参数，进行基因和分子标记位点的遗传连锁分析；检测水稻条纹叶枯病的抗性数量性状基因座QTL，LOD值的阈值定为2.5～3.0，按P＝0.005的概率值检测抗性QTL的数目及其在染色体上的位置。
2.根据权利要求1所述的一种水稻条纹叶枯病抗性检测方法，其特征在于：步骤(2)所述第一培养基的成分为：N6基础培养基1900mg/L、甘氨酸2.0mg/L，烟酸0.5mg/L，琼脂7.5g/L；激动素KT2.0mg/L，山梨醇25g/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺500mg/L，丙氨酸0.6mg/L，叶酸0.5mg/L，秋水仙碱0.3mg/L；pH值为6.0。
3.根据权利要求1所述的一种水稻条纹叶枯病抗性检测方法，其特征在于：步骤(2)所述第二培养基的成分为：MS基本培养基1900mg/L、肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/L，维生素B10.4mg/L，维生素B60.5mg/L，蔗糖25g/L，萘乙酸NAA0.5mg/L，生物素0.1mg/L，甲基亚硝基脲0.8mg/L，调环酸钙0.4mg/L，水解蛋白1.0g/L；以及浓度20％的水稻条纹叶枯病毒粗毒素提取液，pH值为6.0。
4.根据权利要求3所述的一种水稻条纹叶枯病抗性检测方法，其特征在于：步骤(2)所述水稻条纹叶枯病毒粗毒素提取液的制备方法为：将感染水稻条纹叶枯病水稻的穗颈部剪下，清洁表面后置于湿润培养皿中，在30℃条件下暗培养，在菌丝产生后加入营养琼脂继续培养，得到菌株；将菌株接种到液体培养基中30℃下摇床培养30天，超声振荡15～60分钟、过滤、以500～1500rpm的速度离心5～10分钟，得到的上清液即水稻条纹叶枯病毒粗毒素。
5.根据权利要求1所述的一种水稻条纹叶枯病抗性检测方法，其特征在于：步骤(3)所述水稻叶片与β-巯基乙醇、Tris-HCl、PVP、CTAB的质量体积比mg/μL/μL/μL/μL为1:3:3:5:10；
所述两次离心分散的速率为900rpm。
CN201610495876.7A 2016-06-29 2016-06-29 一种水稻条纹叶枯病抗性检测方法 Pending CN105950762A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610495876.7A CN105950762A (zh) 2016-06-29 2016-06-29 一种水稻条纹叶枯病抗性检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610495876.7A CN105950762A (zh) 2016-06-29 2016-06-29 一种水稻条纹叶枯病抗性检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105950762A true CN105950762A (zh) 2016-09-21

Family

ID=56902904

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610495876.7A Pending CN105950762A (zh) 2016-06-29 2016-06-29 一种水稻条纹叶枯病抗性检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105950762A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108901822A (zh) * 2018-06-22 2018-11-30 安徽袁粮水稻产业有限公司 一种双抗性双功能性水稻的高效育种方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104542256A (zh) * 2015-01-04 2015-04-29 陈丁龙 一种籼稻稻曲病抗性高效导入粳稻的育种方法
CN106834281A (zh) * 2015-12-04 2017-06-13 无锡南理工科技发展有限公司 4号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性qtl紧密连锁的ssr标记及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104542256A (zh) * 2015-01-04 2015-04-29 陈丁龙 一种籼稻稻曲病抗性高效导入粳稻的育种方法
CN106834281A (zh) * 2015-12-04 2017-06-13 无锡南理工科技发展有限公司 4号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性qtl紧密连锁的ssr标记及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
朱镇: "优质高产抗条纹叶枯病水稻新品种南粳52的选育与利用", 《江苏农业科学》 *
李明桃: "水稻条纹叶枯病的发病规律与防治技术研究", 《农业灾害研究》 *
王宝祥: "灰飞虱传播的水稻黑条矮缩病和条纹叶枯病抗性QTL定位", 《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）农业科技辑》 *
王英存: "抗条纹叶枯病基因qSTV11KAS新分子标记建立及23种香型水稻qSTV11KAS基因的调查分析", 《上海师范大学学报（自然科学版）》 *
蔡之军: "水稻条纹叶枯病抗性基因SSR标记的筛选及应用", 《安徽农业科学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108901822A (zh) * 2018-06-22 2018-11-30 安徽袁粮水稻产业有限公司 一种双抗性双功能性水稻的高效育种方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bimpong et al. Improving salt tolerance of lowland rice cultivar ‘Rassi’through marker-aided backcross breeding in West Africa
CN104542256B (zh) 一种籼稻稻曲病抗性高效导入粳稻的育种方法
CN102181440B (zh) 水稻抗褐飞虱主效基因bph7的分子标记及其应用
CN106912372A (zh) 利用长雄野生稻无性繁殖特性培育多年生稻不育系的方法
CN104255443B (zh) 一种聚合含抗三种病害基因的水稻选育方法
CN101914531A (zh) 水稻抗褐飞虱主效基因Bph6的分子标记及其应用
CN104488694A (zh) 一种快速培育转基因玉米自交系的方法
CN104774945A (zh) 一种携带抗稻瘟病基因Pi65(t)水稻新品种的分子育种方法
CN105794631A (zh) 硬粒小麦-长穗偃麦草7e抗赤霉病双体附加系的创建方法
CN110358861B (zh) 与水稻广谱高抗白叶枯病基因Xa45(t)紧密连锁分子标记R13I14
CN105734057B (zh) 与甜瓜霜霉病抗性主效qtl连锁的ssr标记及其应用
CN105950763A (zh) 一种稻粒黑粉病抗性检测方法
CN105950762A (zh) 一种水稻条纹叶枯病抗性检测方法
CN110878300A (zh) 小麦7dl染色体抗赤霉病基因紧密连锁的dna标记及其应用
CN102766625A (zh) 抗稻褐飞虱主效基因bph22(t)的分子标记及其应用
CN106086196B (zh) 一种水稻稻曲病抗性检测方法
CN102676685B (zh) 一种用于改良感病水稻品种黑条矮缩病抗性的引物和方法
CN104521758A (zh) 一种籼粳交基因渐渗抗稻瘟病育种新方法
CN105821135B (zh) 与甜瓜抗霜霉病基因紧密连锁的分子标记及应用
CN109006456A (zh) 一种甜椒核雄性不育两用系的选育方法
CN108703063A (zh) 一种利用单片段置换系聚合改良水稻抽穗扬花期及灌浆期耐热性的分子育种方法
CN107299149A (zh) 利用分子标记辅助培育抗除草剂咪草烟粳稻品种的方法
CN108165649B (zh) 水稻抗褐飞虱主效基因qBph4(t)的分子标记及其应用
JP2017535268A (ja) 春化非依存的なリシアンサス植物
CN111357642A (zh) 一种大白菜的育种方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160921

RJ01 Rejection of invention patent application after publication