CN105928771B - 一种检测疫苗抗原含量的样品前处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测疫苗抗原含量的样品前处理方法，步骤如下：(1)取待检疫苗，离心，去上清，得沉淀；(2)用超纯水清洗1～5次；(3)加入超纯水重悬，即可。本发明还公开了一种检测疫苗抗原含量的方法。本发明采用超纯水对待检疫苗进行前处理，可以有效減少了辅料成分对疫苗中抗原含量检测的干扰，进而实现准确检测，本发明疫苗抗原含量的检测方法具有耐用性强、准确度高、精密度高的特点，且操作步骤简单，成本低廉，抗原回收率非常接近理论值，实际应用前景良好。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种新的检测疫苗抗原含量的样品前处理方法。
背景技术
抗原是疫苗中的主要有效成分，其含量与疫苗接种后的保护效果直接相关，所以抗原含量是疫苗质量控制的一项重要检测项目。
目前对于吸附型疫苗中抗原含量的检测大多采用先解吸附然后再使用酶联免疫吸附法进行测定。由于抗原与氢氧化铝佐剂之间主要通过静电吸引力、疏水作用及配基交换作用这三种方式进行相互吸附，所以首先需要破坏这三种作用力，以使抗原从氢氧化铝佐剂上解离下来并暴露出相应的抗原决定簇。而采用先解离再进行酶联免疫吸附法检测的整个过程耗时较长，且其中的样品处理液(超纯水)对于不用种类的吸附型抗原的解离效果存在差异，因此对于每一种吸附型抗原都需要进行处理液的研究，方法的普适性相对较差。
传统的抗原含量测定方法主要包括考马斯亮蓝染色法、双缩脲法、Lowry法、BCA法等蛋白含量检测方法，其作用原理主要是通过样品与染色剂作用或样品经过反应后与试剂发生显色反应生成有色物质的原理，最后根据颜色的变化来进行定量，其普适性较强，但是直接测量容易受到样品中各种成分的干扰，导致结果不准确。
为了提高检测的准确性，目前有对传统Lowry法进行改进的方法，比如，采用三氯乙酸(TCA)对样品进行加热、降温、离心、超声等处理后，可以有效降低各种干扰，提高检测结果的准确度，但是，该方法的实验步骤较多，且繁杂，不利于实验连贯顺利的完成，且抗原回收率偏低，与实际值偏差较大。
因此，有必要开发一种简单的、可以排除干扰的、抗原回收率高的检测方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的检测疫苗抗原含量的样品前处理方法以及新的检测疫苗抗原含量的方法。
本发明检测疫苗抗原含量的样品前处理方法，步骤如下：
(1)取待检疫苗，离心，去上清，得沉淀；
(2)用超纯水清洗1～5次；
(3)加入超纯水重悬，即可。
超纯水，是指电阻率达到18MΩ*cm(25℃)的水。
步骤(1)中，所述待检疫苗是以氢氧化铝作为佐剂的疫苗；其中，所述疫苗可以是吸附型重组破伤风疫苗。
步骤(1)中，所述离心的转速为12000rpm，离心的时间为10min。
步骤(2)中，清洗的方法是：在沉淀中加入超纯水重悬，离心，去上清，得沉淀。优选地，加入的超纯水的量为：每1ml待检疫苗，超纯水的使用量为1.6～9ml，优选超纯水的使用量为1.6～3.2ml，进一步优选超纯水的使用量为1.6ml。优选地，所述离心的转速为12000rpm，离心的时间为10min。
步骤(3)中，所述超纯水的量为：每1ml待检疫苗，超纯水的使用量为0.8ml。
本发明检测疫苗抗原含量的方法，步骤如下：
a、按照前述任意一项所述方法处理待检疫苗，得供试品溶液；
b、对照品制备：取牛血清白蛋白作为对照品，制备对照品溶液；
c、采用Lowry法测定抗原含量。
Lowry法是依据如下原理检测蛋白的方法：蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu2+螯合形成蛋白质-铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中的酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应。在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。
步骤b中，对照品的制备方法为：分别取浓度为0.1mg/ml的牛血清白蛋白溶液0ml、0.01ml、0.02ml、0.04ml、0.06ml、0.08ml、0.1ml，加超纯水至0.1ml，即可。
步骤c中，Lowry法测定抗原含量的步骤如下：
①取对照品溶液和供试品溶液各0.1ml分别加入对照品管及样品管中；取4％碳酸钠溶液和0.2mol/L氢氧化钠溶液各25ml，0.04mol/L硫酸铜溶液和0.1mol/L酒石酸钾溶液各0.5ml，混匀，对照品管及样品管各加入0.5ml，混匀，室温放置10min；
②对照品管及样品管各加入酸浓度为1mol/L的福林酚试液0.05ml，立即混匀，37℃孵育20～30min，再室温放置10min；
③12000rpm离心5min，采用紫外-可见光分光光度法在650nm的波长处测定吸光度，即可。
本发明采用超纯水对待检疫苗进行前处理，可以有效減少了辅料成分对疫苗中抗原含量检测的干扰，进而实现准确检测，本发明疫苗抗原含量的检 测方法具有耐用性强、准确度高、精密度高的特点，且操作步骤简单，成本低廉，抗原回收率非常接近理论值，实际应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实验材料和仪器
材料：超纯水(纯水系统制备)，10μl移液枪吸头(RAININ)，100μl移液枪吸头(RAININ)，1000μl移液枪吸头(RAININ)；福林酚试液0.05ml(1mol/L酸浓度，SIGMAALDRICH)。
重组破伤风疫苗：破伤风毒素亚单位疫苗Hc的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，按照公告号为CN 101880675 B公开的的重组破伤风疫苗制备方法制备，具体的步骤如下：
破伤风毒素亚单位疫苗Hc表达载体构建：
将Tet-Hc基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)用EcoRI和XhoI双酶切后，连接入同样用EcoRI和XhoI双酶切后的表达载体pET32a(+)上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，37℃培养过夜。次日挑取单克隆于5mLLB(Amp+)培养基中，37℃，220rpm培养12h，提取质粒，EcoRI和XhoI双酶切鉴定目的基因的插入，并送测序。测序正确的质粒命名为pET32a-Tet-Hc。
破伤风毒素亚单位疫苗Hc的大肠杆菌发酵及纯化：
将pET32a-Tet-Hc载体，转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，制备种子液。
取种子液1L，转接入30L发酵罐中，培养至OD600nm≌0.6时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃，300rpm继续培养6h。10,000g，4℃离心收集菌体，用20mMTris-HCl缓冲液(pH8.5)重悬后匀浆碎菌。0,000g，4℃离心收集上清。上清液过QFF柱进行阴离子交换，用20mMTris-HCl缓冲液(pH8.5)平衡后，用含0-0.5M NaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱。含有目的蛋白的洗脱液加入终浓度为0.5M的(NH4)2SO4后，过苯基疏水柱进行下一步纯化。目的蛋白用含浓度0.5-0M的(NH4)2SO4的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱。含有目的蛋白的洗脱液用脱盐柱置换缓冲液为20mM NaAc(pH4.0)后，过SP柱进行阳离子交换，目的蛋白用含0-0.5M NaCl的20mM NaAc(pH 4.0)缓冲液进行梯度洗脱，目的蛋白最终保存在PBS缓冲液中。
用氢氧化铝佐剂调配制剂分装:取蛋白浓度为1mg/ml的原液10ml，加入10mg/ml的氢氧化铝佐剂75ml，并用无菌生理盐水定容至250ml，混合均匀后按0.6ml/支进行分装,即可。
仪器：明澈TM-D 24UV纯水系统，涡旋震荡仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，Thermo Scientific Sorvall LegendMicro 21R微量离心机，UV-1800 SHIMADZU SPECTROPHOTOMETER，RAININ Pipet-Lite XLS(METTLER TOLEDO)。
具体实施方式
实施例1 本发明检测方法
(1)疫苗样品前处理
取理论抗原浓度为0.04mg/ml疫苗样品(吸附型重组破伤风疫苗)一支，分取三管各0.125ml(三个平行样品)，在12000rpm离心10min，弃上清，加0.2ml超纯水重悬，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀加入0.1ml超纯水，得供试品；
(2)对照品处理
取浓度为1mg/ml的牛血清白蛋白标准液，稀释至0.1mg/ml，分别取稀释后标准液0ml，0.01ml，0.02ml，0.04ml，0.06ml，0.08ml，0.1ml，加超纯水至0.1ml。
(3)抗原含量检测
(3-1)取4％碳酸钠溶液和0.2mol/L氢氧化钠溶液各25ml，0.04mol/L硫酸铜溶液和0.1mol/L酒石酸钾溶液各0.5ml，混匀，对照品管及样品管各加入0.5ml，混匀，室温放置10min；
(3-2)对照品管及样品管各加入福林酚试液0.05ml(1mol/L酸浓度)，立即混匀，37℃孵育20min，再室温放置10min；
(3-3)12000rpm离心5min，取上清照紫外-可见光分光光度法，在650nm的波长处测定吸光度。
(4)结果计算
以对照品溶液浓度与其相对应吸光度计算线性回归方程。从线性回归方程计算样品溶液中蛋白质浓度，得到每个供试品所对应的抗原含量,并乘以0.8，即得到供试品实际浓度；对同一支供试品三管的抗原含量测定值取平均值,作为供试品中的抗原回收率。
回收率计算:回收率(％)＝(疫苗样品测得平均抗原含量/疫苗样品理论抗原含量)x100％。
实施例2 加入样品处理液(超纯水)的体积对检测的影响
(1)疫苗样品处理
取同一批次理论抗原浓度为0.04mg/ml的疫苗(吸附型重组破伤风疫苗)样品五支(每支0.5ml装)，每支分别取三管各0.125ml(三个平行样品)，12000rpm离心10min，弃上清。
取疫苗样品离心后沉淀，五支样品分别加入0.2ml(1号)，0.4ml(2号)，0.6ml(3号)，0.8ml(4号)，1.0ml(5号)超纯水重悬，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀加入0.1ml超纯水；
其余步骤同实施例1，进行抗原含量检测，结果见表1。
表1结果汇总
分析：从表1可以看出，随着加入的样品处理液(超纯水)体积增加，测得的重组破伤风疫苗抗原含量回收率呈现降低趋势，加入样品处理液(超纯水)0.2ml洗样品抗原回收率较高。
实验结果说明，采用本发明方法检测时，样品重悬时加入的超纯水的体积优选为0.2～0.4ml，可以保证较高的样品回收率，且回收率偏差小，进一步优选加入的体积为0.2ml。
实施例3 加入样品处理液(超纯水)洗的次数对检测的影响
(1)疫苗样品处理
取同一批次理论抗原浓度为0.04mg/ml的疫苗(吸附型重组破伤风疫苗)样品五支(每支0.5ml装)，每支分别取三管各0.125ml(三个平行样品)，12000rpm离心10min，弃上清。
一支样品直接加0.1ml加样品处理液(超纯水)重悬，作为检测样品；其余四支加0.2ml样品处理液(超纯水)，在12000rpm离心10min，弃上清，其中一支加0.1ml样品处理液(超纯水)重悬，作为检测样品；剩余三支分别重复加0.2ml样品处理液(超纯水)，12000rpm离心10min这个条件1,2,3次；沉淀各加0.1ml样品处理液(超纯水)重悬，再进行抗原含量检测。
其余步骤同实施例1，进行抗原含量检测，结果见表2。
表2结果汇总
分析：从表2中的结果可以看出，样品离心后直接加处理液重悬测定回收率偏差较大；样品离心后加入处理液重悬再离心，随着重悬离心次数增加，回收率逐渐减小；排除取样误差，0.2ml处理液洗一次的结果比较稳定，接近100％。
实验结果说明，采用本发明方法检测时，优选重悬次数为1～2次，可以保证回收率的偏差小，且回收率高，进一步优选的重悬次数为1次。
实施例4 处理温度及时间对检测方法的影响
除抗原含量检测方法作如下调整外，其余步骤同实施例1，进行抗原含量检测：对照品与样品按实施例1(3-2)加入0.05ml福林酚试液后，一支室温放置30min；一支37℃孵育30min；一支37℃孵育20min，再室温放置10min。照紫外-可见光分光光度法，在650nm的波长处测定吸光度。
具体结果见表3。
表3结果汇总
分析：从实验结果可以看出，加入福林酚试液后，在37℃孵育20min后，再在室温放置10min，不仅平行管间差异较小，且抗原回收率较高。
实验结果说明，采用本发明方法中，优选在37℃孵育20～30min后，再在室温放置10min条件下检测，回收率较高且偏差小，进一步优选的的孵育时间为30min。
以下通过实验例的方式说明本发明的有益效果：
实施例1 本发明方法的方法学检测
一、重复性检测
(1)疫苗样品处理
取同一批次理论抗原浓度为0.04mg/ml的疫苗(吸附型重组破伤风疫苗)样品六支(每支0.5ml装)，每支分别取三管各0.125ml(三个平行样品)，12000rpm离心10min，弃上清。
取疫苗样品离心后沉淀，加0.2ml样品处理液(超纯水)，重悬，在12000rpm离心10min，弃上清，沉淀加0.1ml样品处理液(超纯水)，重悬，作为待检测样品。
其他操作步骤与实施例1相同，实施结果见表4。
表4结果汇总
分析:表4结果表明，对吸附型重组破伤风疫苗样品进行处理后，其平均抗原回收率可达97.2％，且该实施结果的相对标准偏差小于5％,表明处理过程对供试品中抗原含量检测的关键性,并说明了本发明方法有很好的重复性。
二、中间精密度检测
(1)疫苗样品处理
取同一批次理论抗原浓度为0.04mg/ml的疫苗(吸附型重组破伤风疫苗)样品(每支0.5ml装)，由同一操作人员按本发明方法分别在2015年6月24日,6月29日，2015年7月6日、7日,7月30日、31日六个不同时间进行检测，其他所有操作步骤均与实施例1相同，实施结果见表5。
取同一批次理论抗原浓度为0.04mg/ml的疫苗样品(每支0.5ml装)，由三个实验员操作人员按本发明方法进行检测，其他所有操作步骤均与实施例1相同，实施结果见表5。
表5结果汇总
分析：由表5可以看出，实验结果的相对标准偏差均低于5％，表明该实验方法在不同的检测时间，不同由不同的操作人员检测，其结果都具有一定的稳定性，表明本发明方法的中间精密度高。
三、耐用性检测
取同一批次理论抗原浓度为0.04mg/ml的疫苗(吸附型重组破伤风疫苗)样品四支(每支0.5ml装)，由同一操作人员按照本发明方法进行实验,除样品处理步骤与对照品处理步骤如下外,其他所有操作步骤均见实施例1。
样品：将四支样品按照实施例1方法处理，在加入福林酚试液放入37℃孵育20min后，分别放在15℃，20℃，25℃，30℃水浴中10min，并使在检测前均保持在相应温度。
对照品：将四支对照品按照实施例1方法处理，在加入福林酚试液放入37℃孵育20min后，分别放在15℃，20℃，25℃，30℃水浴中10min，并使在检测前均保持在相应温度。结果详见表6。
表6实验结果汇总
分析：实施例10实验结果表明了该方法在不同室温条件下,在15℃-30℃其相对标准偏差均小于5％,说明该方法的耐用性好。
四、准确性检测
取三个批次理论抗原浓度为0.04mg/ml的疫苗(吸附型重组破伤风疫苗)样品各一支(每支0.5ml装)，由同一操作人员按照本发明方法进行实验,所有操作步骤均见实施例1，结果详见表7。
表7结果汇总
分析：实验结果说明本发明方法对于吸附型重组破伤风疫苗抗原含量测 定的准确性高。
综上，本发明检测方法可以有效排除干扰，抗原回收率高，且偏差小，准确度高，重复性好，精密度高，耐用性好。
对比例
对比例1直接使用Lowry法测定吸附型重组破伤风疫苗样品抗原含量。
取同一批次理论抗原浓度为0.04mg/ml的疫苗(吸附型重组破伤风疫苗)样品三支(每支0.5ml装)，每支分别取三管各0.1ml(三个平行样品)。
(1)对照品处理
取浓度为1mg/ml的牛血清白蛋白标准液，稀释至0.1mg/ml，分别取0ml，0.01ml，0.02ml，0.04ml，0.06ml，0.08ml，0.1ml，加超纯水至0.1ml。
(2)抗原含量检测
(2-1)取4％碳酸钠溶液和0.2mol/L氢氧化钠溶液各25ml，0.04mol/L硫酸铜溶液和0.1mol/L酒石酸钾溶液各0.5ml，混匀，对照品管及样品管各加入0.5ml，混匀，室温放置10min；
(2-2)对照品管及样品管各加入福林酚试液0.05ml(1mol/L酸浓度)，立即混匀，37℃孵育30min；
(2-3)照紫外-可见光分光光度法，在650nm的波长处测定吸光度。
(3)结果计算
以对照品溶液浓度与其相对应吸光度计算线性回归方程。从线性回归方程计算样品溶液中蛋白质浓度，得到每个供试品所对应的抗原含量；对同一支供试品三管的抗原含量测定值取平均值,作为供试品中的抗原回收率。
回收率计算:回收率(％)＝(疫苗样品测得平均抗原含量/疫苗样品理论抗原含量)x100％。具体结果见表8。
表8结果汇总
分析：直接使用Lowry法进行测定样品抗原含量，平行样间相差较大，且回收率偏差大。
对比例2使用TCA-Lowry法检测吸附型重组破伤风疫苗抗原含量
现在对于吸附型重组破伤风疫苗抗原含量的测定方法已有TCA-Lowry法，故使用TCA-Lowry法进行检测。
(1)对照品处理和样品处理
(1-1)取浓度为1mg/ml的牛血清白蛋白标准液，分别取0ml，0.02ml，0.04ml，0.06ml，0.1ml，加超纯水至1ml；取三个批次待测样品各1ml每管(三个平行样)。
(1-2)向每个标准品和样品管中加入1ml 10％三氯乙酸溶液，80℃水浴加热15min，冷却至室温后，2600g，4℃离心20min，弃掉上清。
(1-3)向每个标准品和样品管中加入2ml 5％三氯乙酸溶液，2600g，4℃离心20min，弃掉上清。
(2)抗原含量检测
(2-1)取4％碳酸钠溶液和0.2mol/L氢氧化钠溶液各25ml，0.04mol/L硫酸铜溶液和0.1mol/L酒石酸钾溶液各0.5ml，混匀，对照品管及样品管各加入2.5ml，充分振荡溶解(样品管可使用超声帮助溶解)后，室温放置10min。
(2-2)向每管中加入2.5ml超纯水，1N酚试剂0.5mL，混匀，于室温放置30min。
(2-3)冰浴10min，使用分光光度计测量各管溶液在750nm的吸光度(其
中样品管溶液需700g离心10min后再测)。
(3)结果计算
以对照品溶液浓度与其相对应吸光度计算线性回归方程。从线性回归方程计算样品溶液中蛋白质浓度，得到每个供试品所对应的抗原含量；对同一支供试品三管的抗原含量测定值取平均值,作为供试品中的抗原回收率。
回收率计算:回收率(％)＝(疫苗样品测得平均抗原含量/疫苗样品理论抗原含量)x100％。具体结果见表9。
表9结果汇总
分析：使用TCA-Lowry法检测样品抗原含量，实验过程包含加热、降温、离心、超声等过程，实验步骤较多，且繁杂，不利于实验连贯顺利的完成。且抗原回收率偏低。
对比例3使用样品处理液(超纯水)处理同一批次的吸附型重组破伤风疫苗样品,并对疫苗样品的抗原含量进行检测。
取同一批次理论抗原浓度为0.04mg/ml的疫苗样品三支(每支0.5ml装)，每支分别取三管各0.125ml(三个平行样品)，12000rpm离心10min，取沉淀。
(1)制备处理液
(1-1)超纯水；
(1-2)用氯化钠配制0.9％的生理盐水；
(1-3)配制pH为7.4的磷酸盐缓冲液。
(2)采用处理液处理疫苗样品
取样品离心后沉淀加0.2ml处理液重悬，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀加入0.1ml处理液；
(3)对照品处理
取浓度为1mg/ml的牛血清白蛋白标准液，稀释至0.1mg/ml，分别取0ml，0.01ml，0.02ml，0.04ml，0.06ml，0.08ml，0.1ml，加超纯水至0.1ml。
(4)抗原含量检测
(4-1)取4％碳酸钠溶液和0.2mol/L氢氧化钠溶液各25ml，0.04mol/L硫酸铜溶液和0.1mol/L酒石酸钾溶液各0.5ml，混匀，对照品管及样品管各加入0.5ml，混匀，室温放置10min；
(4-2)对照品管及样品管各加入福林酚试液0.05ml(1mol/L酸浓度)，立即混匀，37℃孵育20min，再室温放置10min；
(4-3)12000rpm离心5min，取上清照紫外-可见光分光光度法，在650nm的波长处测定吸光度。
(5)结果计算
以对照品溶液浓度与其相对应吸光度计算线性回归方程。从线性回归方程计算样品溶液中蛋白质浓度，得到每个供试品所对应的抗原含量,并乘以0.8，即得到供试品实际浓度；对同一支供试品三管的抗原含量测定值取平均值,作为供试品中的抗原回收率。
回收率计算:回收率(％)＝(疫苗样品测得平均抗原含量/疫苗样品理论抗原含量)x100％。具体结果见表3。
表10分别使用(3-1)、(3-2)、(3-3)处理液抗原回收率测定结果汇总
分析：使用0.9％的生理盐水以及pH为7.4的磷酸盐缓冲液对样品进行检测时，测定的疫苗抗原含量平行管间数值相差较大，且回收率偏高或偏低，而采用本发明超纯水则回收率高且偏差小。
实验结果说明，采用常规的Lowry法检测疫苗，平行样间偏差大，且回收率的偏差大，存在无法准确检测的问题，而采用其他常规的样品处理液，如0.9％的生理盐水，pH为7.4的磷酸盐缓冲液处理后，同样存在回收率的偏差大，无法准确检测的问题，而采用TCA-Lowry法检测样品抗原含量，实验过程包含加热、降温、离心、超声等过程，实验步骤较多，且繁杂，不利于实验连贯顺利的完成，且抗原回收率偏低。
综上，本发明采用超纯水对待检疫苗进行前处理，可以有效減少了辅料 成分对疫苗中抗原含量检测的干扰，进而实现准确检测；采用本发明方法检测疫苗中的抗原含量，回收率高且偏差小，能够准确检测，重复性好，精密度高，耐用性好，且操作简单，成本低廉，应用前景良好。
Claims (12)
1.一种检测以氢氧化铝作为佐剂的疫苗抗原含量的样品前处理方法，其特征在于：步骤如下：
(1)取待检疫苗，离心，去上清，得沉淀；
(2)用超纯水清洗1～5次；
(3)加入超纯水重悬。
2.根据权利要求1所述的样品前处理方法，其特征在于：步骤(1)中，所述待检疫苗是吸附型重组破伤风疫苗。
3.根据权利要求1所述的样品前处理方法，其特征在于：步骤(1)中，所述离心的转速为12000rpm，离心的时间为10min。
4.根据权利要求1所述的样品前处理方法，其特征在于：步骤(2)中，清洗的方法是：在沉淀中加入超纯水重悬，离心，去上清，得沉淀。
5.根据权利要求4所述的样品前处理方法，其特征在于：加入的超纯水的量为：每1ml待检疫苗，超纯水的使用量为1.6～9ml。
6.根据权利要求5所述的样品前处理方法，其特征在于：所述超纯水的使用量为1.6～3.2ml。
7.根据权利要求6所述的样品前处理方法，其特征在于：所述超纯水的使用量为1.6ml。
8.根据权利要求3所述的样品前处理方法，其特征在于：所述离心的转速为12000rpm，离心的时间为10min。
9.根据权利要求1所述的样品前处理方法，其特征在于：步骤(3)中，加入的超纯水的量为：每1ml待检疫苗，超纯水的使用量为0.8ml。
10.一种检测疫苗抗原含量的方法，其特征在于：步骤如下：
a、按照权利要求1～9任意一项所述方法处理待检疫苗，得供试品溶液；
b、对照品制备：取牛血清白蛋白作为对照品，制备对照品溶液；
c、采用Lowry法测定抗原含量。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：步骤b中，对照品的制备方法为：分别取浓度为0.1mg/ml的牛血清白蛋白溶液0ml、0.01ml、0.02ml、0.04ml、0.06ml、0.08ml、0.1ml，加超纯水至0.1ml，即可。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：步骤c中，Lowry法测定抗原含量的步骤如下：
①取对照品溶液和供试品溶液各0.1ml分别加入对照品管及样品管中；取4％碳酸钠溶液和0.2mol/L氢氧化钠溶液各25ml，0.04mol/L硫酸铜溶液和0.1mol/L酒石酸钾溶液各0.5ml，混匀，对照品管及样品管各加入0.5ml，混匀，室温放置10min；
②对照品管及样品管各加入酸浓度为1mol/L的福林酚试液0.05ml，立即混匀，37℃孵育20～30min，再室温放置10min；
③12000rpm离心5min，取上清，采用紫外-可见光分光光度法在650nm的波长处测定吸光度。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20181017 Address after: 850000 Room 501, unit 2, 1 B, sunshine District, Tibet economic and Technological Development Zone, Lhasa Applicant after: Tibet everlasting Investment Co.,Ltd. Address before: 610000 Sichuan province Meishan Economic Development Zone, western new drug Valley No. 9 road. Applicant before: SICHUAN ZIHAOSHIDAI PHARMACEUTICAL CO.,LTD. |
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| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20201012 Address after: 518000 Shenkan building 2111-2112, No. 1043 shangbuzhong Road, Fuqiang community, Huaqiang North Street, Futian District, Shenzhen City, Guangdong Province Patentee after: Shenzhen Changzhi Information Consulting Co.,Ltd. Address before: 850000 Room 501, unit 2, 1 B, sunshine District, Tibet economic and Technological Development Zone, Lhasa Patentee before: Tibet everlasting Investment Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 2001-2002 Shenkan building, 1043 Shangbu Middle Road, Fuqiang community, Huaqiangbei street, Futian District, Shenzhen, Guangdong 518000 Patentee after: Shenzhen changchangzhi Pharmaceutical Co.,Ltd. Address before: 518000 Shenkan building 2111-2112, No. 1043 shangbuzhong Road, Fuqiang community, Huaqiang North Street, Futian District, Shenzhen City, Guangdong Province Patentee before: Shenzhen Changzhi Information Consulting Co.,Ltd. |
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| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20190118 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |