CN105918610B - 一种具有降胆固醇作用的亚麻籽肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有降胆固醇作用的亚麻籽肽及其制备方法，其制备步骤包括亚麻粕清选除杂、一次低温弱酸水洗，一次打浆、一次果胶裂解酶酶解脱胶、一次木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、β‑葡萄糖苷酶、α‑羟腈酶水解蛋白和生氰糖苷分解反应，一次超声高温灭酶和脱毒，再经离心、纳滤浓缩和喷雾干燥即可得到具有降胆固醇作用的亚麻籽肽。本发明解决了亚麻籽胶对亚麻籽蛋白水解的影响，脱除了亚麻籽肽产品中的生氰糖苷和氢氰酸，首次制备出了亚麻籽肽产品，可应用于食品和保健食品行业，具有广阔的商业前景。

Description

一种具有降胆固醇作用的亚麻籽肽及其制备方法

技术领域

本发明属于食源性蛋白深加工技术领域，涉及一种以亚麻粕为原料制备具有降胆固醇活性的亚麻籽肽及其方法。

背景技术

亚麻(又称胡麻)是古老的经济作物，也是世界十大油料作物之一，广泛分布于世界各地。中国亚麻籽产量居全球第二，2013年产量约40万吨。亚麻籽含有脂肪酸、蛋白、亚麻籽胶、木酚素、矿物质、维生素等具有营养价值和功能的成分。除了传统上已开发利用的亚麻籽油外，提炼亚麻油后的剩余产物亚麻籽粕，则基本被用作肥料或是限量添加到动物饲料中，其潜在的价值远没有被开发利用。亚麻粕含有30-40％的蛋白质、10-15％左右的亚麻籽胶，0.7％左右的木酚素。目前国内有较多研究围绕亚麻籽胶和木酚素的提取进行，但亚麻籽胶基本都是通过整粒亚麻籽浸提生产，从亚麻籽粕中提取亚麻籽胶和木酚素却始终未见规模化生产报道。国内外从事亚麻籽蛋白开发的人极少，仅有少量文献提及从亚麻油中发现一种含量极低的天然环肽，更是没有利用亚麻籽粕制备亚麻籽肽相关的文献报道，究其原因是缺少一套可行的脱胶、脱毒和酶解工艺。

亚麻籽胶又名富兰克胶、胡麻胶，是一种新型的食品添加剂，广泛应用于食品工业。但对于亚麻籽蛋白深加工，亚麻籽胶却是最大的障碍之一。有文献对亚麻籽和亚麻籽粕进行了脱胶研究，大部分均采用高温、强酸或物理方法进行脱胶，但胶很难脱除干净，且高温会造成亚麻籽蛋白的大量损失。目前并未见通过低温弱酸水洗和果胶裂解酶联合用于脱胶的报道。

亚麻籽粕中存在生氰糖苷和氢氰酸等毒素，严重限制了亚麻籽蛋白深加工和应用。有文献报道采用水煮法、烘烤法、微波法、蒸煮法等进行脱毒，其仅对氢氰酸进行了挥发脱除。对于亚麻籽粕中存在生氰糖苷，因榨油高温过程使其自身含有的β-葡萄糖苷酶已失活，所以生氰糖苷能稳定的存在于亚麻籽粕中。而当人体食用含有生氰糖苷的亚麻粕后，经肠道微生物作用有10-20％生氰糖苷可分解为有毒的氢氰酸，从而严重限制了亚麻籽粕的应用。目前并未见通过低温弱酸水洗粗脱毒，添加β-葡萄糖苷酶和α-羟腈酶将生氰糖苷分解为易挥发的氢氰酸，进而完全脱除生氰糖苷和氢氰酸毒素的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有降胆固醇作用的亚麻籽肽及其制备方法，该方法解决了亚麻籽胶对多肽酶解的影响，也解决了亚麻粕中毒素对产品的影响，制备的亚麻籽肽具有较好的降胆固醇作用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种具有降胆固醇作用的亚麻籽肽及其制备方法，其包括有以下步骤：对亚麻籽粕原料采用清选机除杂，加入其质量5-20倍的弱酸溶液进行低温水洗0.5-2h，沥干，加亚麻籽粕原料质量10-20倍的水打浆。将打浆后的料液用5％氢氧化钠调节至pH 8-10，进行水解脱胶。将脱胶后的料液用5％盐酸调节至pH5.0-8.0，进行水蛋白水解和生氰糖苷毒素的分解反应，酶解过程为1-5h。将酶解得到的水解液加热至沸腾并保持，并加入超声辅助脱毒，灭活的同时脱毒，时间为0.5-2h。对灭活后的水解液降温至60-80℃，进行离心操作，取离心所得上清液进行纳滤浓缩至固含15-35％，喷雾干燥，制得成品。

作为一种优选方案，如上所述亚麻籽肽的制备方法，其中所述的水洗粗脱胶和脱毒采用的弱酸为亚麻粕原料质量0.1-1％的柠檬酸和0.1-1％的冰醋酸，水洗温度为20-50℃。

作为一种优选方案，如上所述亚麻籽肽的制备方法，其中所述的酶解脱胶过程中，加入亚麻籽粕原料质量0.5％-2％的果胶裂解酶，25-35℃酶解0.5-3h。

作为一种优选方案，如上所述亚麻籽肽的制备方法，其中所述在蛋白的水解过程中同时进行了生氰糖苷毒素的分解反应。

作为一种优选方案，如上所述亚麻籽肽的制备方法，其中所述在蛋白水解过程中依次加入亚麻粕原料质量0.5-2％的木瓜蛋白酶、0.5-3％的中性蛋白酶、0.2-2％的β-葡萄糖苷酶、0.2-2％的α-羟腈酶，从加完酶开始计时，25-55℃酶解1-5h。

作为一种优选方案，如上所述亚麻籽肽的制备方法，其中所述在沸腾灭酶过程中对水解液进行超声，超声波频率20-40KHZ，在灭酶结束前连续处理2-10min。

作为一种优选方案，如上所述亚麻籽肽的制备方法，其中所述纳滤浓缩环节采用截留分子量为150Da的有机膜，浓缩前后产品灰分降低30％以上。

本发明制备的亚麻籽肽产品多肽含量大于60％，分子量在2000Dal以下多肽占多肽总量85％以上。且亚麻籽肽产品具有降低胆固醇的功效。

本发明与现有领域相比，首次对亚麻籽粕采用低温弱酸水洗进行初步的脱胶和脱毒，并尽量减少了蛋白质的损失；同时通过果胶裂解酶对残留的少量亚麻籽胶进行酶解脱胶。在亚麻籽蛋白酶解过程中首次同时添加了β-葡萄糖苷酶和α-羟腈酶，在亚麻籽蛋白酶解制备多肽的同时，将生氰糖苷通过两部酶解反应分解成易脱除的氢氰酸。亚麻籽蛋白水解液灭酶过程中首次添加了超声技术，在酶灭活的同时，通过高温和超声两个技术快速的将溶液中的氢氰酸完全脱出。首次通过酶解技术制备得到了具有降胆固醇生理活性的亚麻籽肽。

附图说明

图1为本发明制备方法的流程图。

具体实施方式

以下通过实施例形式对本发明降胆固醇亚麻籽肽及其制备方法再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的保护范围。

实施例1降胆固醇亚麻籽肽的制备

将亚麻粕经过清选除杂，按料水比1:5(w/v)加入含有0.1％的柠檬酸和0.1％冰醋酸溶液，控制温度20℃水洗0.5h，沥干，按照料液比1:10(w/v)加水打浆。将打浆液调pH8.0，加入底物浓度1％的果胶裂解酶，30℃酶解1h。酶解脱胶完毕后调节pH至7.5，并依次加入底物浓度1％的木瓜蛋白酶、2％的中性蛋白酶、1％的β-葡萄糖苷酶、1％的α-羟腈酶，酶解2h。将酶解液加热至沸腾并保持1h，在灭酶结束前5min开启超声，频率30KHZ连续超声5min。灭酶结束后降温至80℃开始离心，上清液浓缩至固含30％，喷雾干燥，制得成品。产品得率34.6％，水分3.8％，灰分4.2％，总氮12.03％，多肽65.5％，游离氨基酸1.8％，分子量≤2000Dal以下多肽占多肽总量89.7％以上，生氰糖苷8ppm(以亚麻苦苷、β-龙胆二糖丙酮氰醇、β-龙胆二糖甲乙酮氰醇总含量计),氢氰酸未检出。

实施例2降胆固醇亚麻籽肽的制备

将亚麻粕经过清选除杂，按料水比1:20(w/v)加入含有0.2％的柠檬酸和0.5％冰醋酸溶液，控制温度25℃水洗1.5h，沥干，按照料液比1:20(w/v)加水打浆。将打浆液调pH9.5，加入底物浓度1.5％的果胶裂解酶，32℃酶解2h。酶解脱胶完毕后调节pH至7.0，并依次加入底物浓度2％的木瓜蛋白酶、2％的中性蛋白酶、1.5％的β-葡萄糖苷酶、1.5％的α-羟腈酶，酶解3h。将酶解液加热至沸腾并保持2h，在灭酶结束前8min开启超声，频率40KHZ连续超声8min。灭酶结束后降温至60℃开始离心，上清液浓缩至固含35％，喷雾干燥，制得成品。产品得率35.4％，水分3.6％，灰分3.9％，总氮12.34％，多肽66.4％，游离氨基酸1.9％，分子量≤2000Dal以下多肽占多肽总量90.5％以上，生氰糖苷6ppm(以亚麻苦苷、β-龙胆二糖丙酮氰醇、β-龙胆二糖甲乙酮氰醇总含量计),氢氰酸未检出。

实施例3降胆固醇亚麻籽肽的制备

将亚麻粕经过清选除杂，按料水比1:10(w/v)加入含有0.2％的柠檬酸和0.2％冰醋酸溶液，控制温度40℃水洗1h，沥干，按照料液比1:12(w/v)加水打浆。将打浆液调pH9.3，加入底物浓度0.8％的果胶裂解酶，26℃酶解2h。酶解脱胶完毕后调节pH至6.5，并依次加入底物浓度1％的木瓜蛋白酶、1％的中性蛋白酶、1％的β-葡萄糖苷酶、1％的α-羟腈酶，酶解1.5h。将酶解液加热至沸腾并保持0.5h，在灭酶结束前3min开启超声，频率25KHZ连续超声3min。灭酶结束后降温至75℃开始离心，上清液浓缩至固含25％，喷雾干燥，制得成品。产品得率33.9％，水分3.7％，灰分4.6％，总氮11.94％，多肽64.8％，游离氨基酸1.3％，分子量≤2000Dal以下多肽占多肽总量88.6％以上，生氰糖苷9ppm(以亚麻苦苷、β-龙胆二糖丙酮氰醇、β-龙胆二糖甲乙酮氰醇总含量计),氢氰酸未检出。

实施例4降胆固醇亚麻籽肽的制备

将亚麻粕经过清选除杂，按料水比1:20(w/v)加入含有1％的柠檬酸和1％冰醋酸溶液，控制温度50℃水洗2h，沥干，按照料液比1:15(w/v)加水打浆。将打浆液调pH 9.8，加入底物浓度0.5％的果胶裂解酶，25℃酶解0.5h。酶解脱胶完毕后调节pH至5.0，并依次加入底物浓度0.5％的木瓜蛋白酶、0.5％的中性蛋白酶、0.5％的β-葡萄糖苷酶、0.5％的α-羟腈酶，酶解1h。将酶解液加热至沸腾并保持0.5h，在灭酶结束前2min开启超声，频率20KHZ连续超声2min。灭酶结束后降温至70℃开始离心，上清液浓缩至固含15％，喷雾干燥，制得成品。产品得率31.8％，水分4.2％，灰分5.2％，总氮11.54％，多肽61.7％，游离氨基酸0.8％，分子量≤2000Dal以下多肽占多肽总量86.5％以上，生氰糖苷7ppm(以亚麻苦苷、β-龙胆二糖丙酮氰醇、β-龙胆二糖甲乙酮氰醇总含量计),氢氰酸未检出。

实施例5降胆固醇亚麻籽肽的制备

将亚麻粕经过清选除杂，按料水比1:12(w/v)加入含有0.5％的柠檬酸和0.5％冰醋酸溶液，控制温度35℃水洗1h，沥干，按照料液比1:18(w/v)加水打浆。将打浆液调pH 10，加入底物浓度1.5％的果胶裂解酶，28℃酶解3h。酶解脱胶完毕后调节pH至8.0，并依次加入底物浓度2％的木瓜蛋白酶、3％的中性蛋白酶、2％的β-葡萄糖苷酶、2％的α-羟腈酶，酶解5h。将酶解液加热至沸腾并保持2h，在灭酶结束前10min开启超声，频率25KHZ连续超声10min。灭酶结束后降温至78℃开始离心，上清液浓缩至固含28％，喷雾干燥，制得成品。产品得率36.9％，水分3.0％，灰分3.8％，总氮12.42％，多肽66.8％，游离氨基酸1.5％，分子量≤2000Dal以下多肽占多肽总量89.6％以上，生氰糖苷3ppm(以亚麻苦苷、β-龙胆二糖丙酮氰醇、β-龙胆二糖甲乙酮氰醇总含量计),氢氰酸未检出。

实施例6降胆固醇亚麻籽肽的毒性试验研究

取实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5降胆固醇亚麻籽肽，按照《保健食品检验与评价技术规范》，以昆明小鼠为实验动物，雌雄各半，采用最大灌胃量法(MTD)进行实验，剂量设计为10.0g/kg.bw，24h内灌胃3次，连续观察两周，五个实施例组小鼠均无死亡，毛色光泽，体重有所增长，与空白对照组比不具有显著性差异。固本发明降胆固醇亚麻籽肽属于实际无毒物质。

实施例7亚麻籽肽降胆固醇动物实验研究

受试动物：

清洁级Wistar大鼠，体重170-190g，雄性，共计70只。

大鼠高胆固醇模型的建立、分组及给药：

制作高胆固醇血症大鼠模型时所用的高脂饲料组成为:5％猪油，1.2％胆固醇，0.2％胆盐和93.6％的普通饲料。

将实验动物适应性饲养一周后，按体重随机分成2组，10只动物给予维持饲料作为空白对照组，60只给予模型饲料作为模型对照组，模型对照组给予模型饲料2周，每周称量体重1次，空白对照组和模型对照组动物不禁食尾部取血，测定血清总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)水平。根据TC水平将模型对照组随机分成6组，分组后空白对照组和模型对照组比较TC、TG、LDL-C、HDL-C差异均无显著性(P>0.05)。

实验组分别是实施例1组、实施例2组、实施例3组、实施例4组、实施例5组，五个实施例组每天经口给予受试样品500mg/kg剂量1mL，空白对照组和模型对照组同时给予同体积的相应溶剂，连续给药4周。空白对照组继续给予维持饲料，模型对照组及五个实施例组继续给予模型饲料，并定期称量体重，于实验结束时不禁食采血，采血后尽快分离血清，测定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

实验结果：

表1建模两周后高脂组与对照组大鼠血脂情况

60只实验大鼠经过2周高胆固醇血症的诱导后，血清总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高，明显高于对照组，而两组之间血清甘油三酯(TG)差异无显著性，因此判定建模成功。

表2受试物对大鼠体重的影响

表2结果显示，与高胆固醇对照组比较，正常对照组、实施例1组、实施例2组、实施例3组、实施例4组、实施例5组试验结束时大鼠体重明显低于高胆固醇对照组比较，差异达到极显著水平(p<0.01)。与空白对照组比较，五个实施例组试验结束时大鼠体重与空白对照组体重接近，未达到显著水平。

表3受试物对大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量的影响

表3结果显示，与高胆固醇对照组相比，五个实施例组试验后大鼠血清TC、LDL-C明显低于高胆固醇对照组，五个实施例组HDL-C明显高于高胆固醇对照组，差异均达到显著水平(p<0.05)，各组之间TG差异不显著。因此可以判定5个实施例样品辅助降低血清胆固醇功能动物实验结果阳性。

以上所述实施例只是本发明的较佳实例，而没有限制本发明的实施范围。因此，凡是根据本发明内容的实质所作出的等效修改，都应属于在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种具有降胆固醇作用的亚麻籽肽，所述的亚麻籽肽以亚麻籽粕为原料制备得到，其特征在于，亚麻籽肽中多肽含量大于60％，其中分子量≤2000Dal以下多肽占多肽总量85％以上，生氰糖苷小于等于9ppm，生氰糖苷含量是以亚麻苦苷、β-龙胆二糖丙酮氰醇、β-龙胆二糖甲乙酮氰醇总含量计算，基本不含有氢氰酸，即氢氰酸小于1ppm；亚麻籽肽的制备步骤包括亚麻粕清选除杂、一次低温弱酸水洗，一次打浆、一次果胶裂解酶酶解脱胶、一次木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、β-葡萄糖苷酶、α-羟腈酶水解蛋白和生氰糖苷分解反应，一次超声高温灭酶和脱毒，再经离心、纳滤浓缩和喷雾干燥即可得到具有降胆固醇作用的亚麻籽肽。

2.一种具有降胆固醇作用的亚麻籽肽制备方法，其特征在于，其包括有以下步骤：

亚麻籽粕清选除杂，加入其质量5-20倍的弱酸水溶液进行低温水洗0.5-2h，沥干，加亚麻籽粕原料质量10-20倍的水打浆备用；

将打浆后的料液调节至pH 8-10，水解脱胶；

将脱胶后的料液至pH 5.0-8.0，进行蛋白水解和生氰糖苷毒素的分解反应，酶解过程为1-5h；

将酶解得到的水解液加热至沸腾并超声，灭活0.5-2h；

对灭活后的水解液降温至60-80℃，进行离心操作；

对离心所得上清液进行纳滤浓缩至固含15-35％，喷雾干燥，制得成品。

3.根据权利要求2所述的亚麻籽肽制备工艺，其特征在于，水洗采用弱酸为亚麻粕原料质量0.1-1％的柠檬酸和0.1-1％的冰醋酸，水洗温度为20-50℃。

4.根据权利要求2所述的亚麻籽肽制备工艺，其特征在于，酶解脱胶过程中，加入亚麻籽粕原料质量0.5％-2％的果胶裂解酶，25-35℃酶解0.5-3h。

5.根据权利要求2所述的亚麻籽肽制备工艺，其特征在于，在蛋白的水解过程中同时进行了生氰糖苷毒素的分解反应。

6.根据权利要求2所述的亚麻籽肽制备工艺，其特征在于，在蛋白水解过程中依次加入亚麻粕原料质量0.5-2％的木瓜蛋白酶、0.5-3％的中性蛋白酶、0.2-2％ 的β-葡萄糖苷酶、0.2-2％的α-羟腈酶，从加完酶开始计时，25-55℃酶解1-5h。

7.根据权利要求2所述的亚麻籽肽制备工艺，其特征在于，在沸腾灭酶过程中对水解液进行超声，超声波频率20-40KHZ，在灭酶结束前连续处理2-10min。

8.根据权利要求2所述的亚麻籽肽制备工艺，其特征在于，纳滤浓缩环节采用截留分子量为150Da的有机膜，浓缩前后产品灰分降低30％以上。

9.根据权利要求2所述的亚麻籽肽制备工艺，其特征在于，所获得的亚麻籽肽产品多肽含量大于60％，分子量在2000Dal以下多肽占多肽总量85％以上；生氰糖苷小于等于9ppm，生氰糖苷含量是以亚麻苦苷、β-龙胆二糖丙酮氰醇、β-龙胆二糖甲乙酮氰醇总含量计算，基本不含有氢氰酸，即氢氰酸小于1ppm。

10.根据权利要求1所述的亚麻籽肽或者权利要求2-9任一项所述的制备工艺所制备得到的亚麻籽肽在制备具有降低胆固醇的功效的药品中的应用。