CN105917231B - 改进的用于评价疗法适用性的患者分层 - Google Patents

改进的用于评价疗法适用性的患者分层 Download PDF

Info

Publication number
CN105917231B
CN105917231B CN201580005565.1A CN201580005565A CN105917231B CN 105917231 B CN105917231 B CN 105917231B CN 201580005565 A CN201580005565 A CN 201580005565A CN 105917231 B CN105917231 B CN 105917231B
Authority
CN
China
Prior art keywords
transcription factor
patient
pathway
directed against
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201580005565.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105917231A (zh
Inventor
D.哈特
R.维姆伯格-弗里伊德
A.范德斯托佩
F.范赫梅特
G.C.达姆-德维恩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Koninklijke Philips NV
Original Assignee
Koninklijke Philips NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Koninklijke Philips NV filed Critical Koninklijke Philips NV
Publication of CN105917231A publication Critical patent/CN105917231A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105917231B publication Critical patent/CN105917231B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/743—Steroid hormones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明主要涉及用于分层患者而用于评价疗法的适用性的方法。本发明还涉及用于预后患者的疾病的结果的方法，以及用于预测和/或检测患者针对疗法的疗法耐受性的方法。此外，本发明涉及新颖试剂盒及其相应的用途。

Description

改进的用于评价疗法适用性的患者分层
发明领域
本发明主要涉及用于分层患者、优选癌症患者，用于评价疗法、诸如靶向疗法(所述疗法优选针对雌激素受体(ER)和/或孕酮受体(PR)信号传导途径(其它合适的途径在下文描述))对于所述患者的适用性的改进方法。本发明进一步涉及用于患者、优选癌症患者的疾病、优选癌症的结果预后的方法，以及用于预测和/或检测患者、优选癌症患者针对疗法的疗法耐受性的方法。此外，本发明涉及新颖试剂盒及其相应的用途。
发明背景
Musgrove等人的文章“Biological determinants of endocrine resistance inbreast cancer”, Nature Reviews Cancer, 第9卷, 第631至643页 (2009)公开了与靶向雌激素作用的内分泌/激素疗法的失败相关的细胞信号传导途径。为了医疗领域中的改进的诊断和疗法响应预测的目的应当改进该论文中公开的显示某些途径是否是活性的方法。
Díaz Flaqué等人的文章“Progesterone receptor assembly of atranscriptional complex along with activator protein 1, signal transducer andactivator of transcription 3 and ErbB-2 governs breast cancer growth andpredicts response to endocrine therapy”, Breast Cancer Research, 第15卷, 第6号, 第R118页 (2013)研究了控制乳腺癌生长和内分泌疗法耐受性的协调的PR快速和非经典转录效果。
Poulard等人的文章“Activation o f rapid oestrogen signalling inaggressive human breast cancers”, EMBO Molecular Medicine, 第4卷, 第11号, 第1200至1213页 (2012)报道了人乳腺肿瘤细胞中的内源ERα/PI3K和ERα/Src相互作用的检测。
论文“The Akt/mTOR Pathway and Estrogen Receptor Phosphorylations – acrosstalk with potential to predict tamoxifen resistance in breast cancer”,Linköping University Medical Dissertations, No. 1379 (2013)涉及作为现有标志物的补充的用于确定具有原发性侵袭性乳腺癌的最佳治疗的生物标志物的研究。
文献Flaqué等人 (“Progesterone receptor assembly of a transcriptionalcomplex along with activator protein 1, signal transducer and activator oftranscription 3 and ErbB-2 governs breast cancer grwoeth and predictsresponse to endocrine therapy”, 2013年12月17日, Bresat Cancer Research, 第15卷, 第6号, DOI:10.1186/BCR3587)公开了黄体酮诱导了AP-1、Stat3、PR和ErbB-2间的转录复合物在细胞周期蛋白D1启动子处的组装，并且通过协调的快速和转录影响，所述复合物作为增强体发挥功能。
文献Poulard等人 (“Activation of rapid oestrogen signaling inaggressive human breast cancers”, 2012年10月5日, EMBO Molecular Medicine, 第4卷, 第11号, DOI:10.1002/emmm.201201615)公开了PLA测定法以表明Erα/Src/PI3K复合物存在于乳腺癌细胞系的胞质中。
文献Bostner, Josefine (“The Akt/mTOR Pathway and Estrogen ReceptorPhosphorylations – a crosstalk with potential to predict tamoxifen resistancein breast cancer”, Dissertation, 2013年11月12日)涉及研究作为现有标志物的补充的生物标志物用于确定具有原发性侵袭性乳腺癌的患者的最佳治疗。
发明概述
目前的染色测定法基于当使用靶向ER途径的药物时，细胞中或癌细胞中的特定位置中一种蛋白(不是(活性)转录因子或者，分别地，转录因子复合物)的表达的染色，如例如细胞核中的ER染色，已知其与ER途径的活化和与疗法响应相关。然而，这样的单一蛋白染色不提供活性途径的证据。例如，在ER的情况下，单一蛋白当不在活性ER转录因子复合物中时也可以存在于核中。
乳腺癌中的常规病理染色使得需要ER、PR和HER2染色。如果超过1％(美国)或10％(欧盟)的癌细胞分别表达核ER或PR，则ER和PR通常被认为是阳性的。这被用作这些途径在各自患者中有活性的指示。阳性测试结果所需的阳性癌细胞的最小百分比在不同中心之间变化。这些患者被认为是激素(抗ER途径)疗法的候选。ER阳性患者用激素疗法(在新辅助、辅助或转移性设置中)治疗；然而，25-50％的患者对治疗不响应或变得耐受。因此，需要用于改进的疗法响应预测的测定法。
这样的常规ER染色也用于预后目的。然而，在ER阳性组内，许多患者似乎具有比原始预测更差的预后。这需要改进的预测测定法。
在对抗ER途径疗法(主要或次要)不响应的患者的ER阳性组内，已经描述了多种生化耐受机制，其与另一种肿瘤驱动信号传导途径(而不是ER途径)相关，例如HER2途径、Wnt途径、HH (hedgehog)途径等。(本文下面将进一步描述关于耐受性的细节)。需要表明对激素疗法耐受的ER阳性患者中的耐受性途径的测定法。
鉴于上述情况，本发明的一个主要目标是提供用于分层患者、优选癌症患者、尤其是乳腺癌或前列腺癌患者、特别是ER和/或PR阳性和HER2阴性乳腺癌患者，用于评价疗法、诸如激素疗法(所述疗法优选针对ER和/或PR信号传导途径)对于所述患者的适用性的改进方法。关于本发明可以解决的进一步信号传导途径包括，但不限于，雄激素受体(AR)信号传导途径、视黄酸受体(RAR)信号传导途径、VitD途径和过氧化物酶体增殖物活化受体(PPAR)信号传导途径。本发明的进一步目标涉及提供用于患者、优选癌症患者的疾病、优选癌症的结果预后，以及用于预测和/或检测患者、优选癌症患者针对特定疗法的疗法耐受性的改进方法。当研究以下说明书、特别是随附专利权利要求时，作为本发明基础的额外目标变得显而易见。
本发明的主要目标通过用于分层患者、优选癌症患者，用于评价疗法、优选激素疗法(所述疗法优选针对雌激素受体(ER)和/或孕酮受体(PR)信号传导途径)对于所述患者的适用性的方法来实现，所述方法包括以下步骤
(i) 通过应用邻近连接测定法以检测组织样品中、优选肿瘤组织样品中、更优选患者的活检样品中ER家族的至少一个成员(所述至少一个成员是转录因子复合物的部分)和至少一种选自TAFs、TBP、POLII、TFII、p300、CREB和CBP的蛋白(其中所述至少一种蛋白是相同转录因子复合物的部分)的存在而确定ER和/或PR信号传导途径的活化状态，
其中所述分层基于步骤(i)中确定的活化状态，且所述疗法的适用性基于所述分层进行评价。
这样的方法的优选实施方案描述于权利要求和下文中。
关于ER(参见上文)，存在两种不同形式的ER，通常被称为α和β，各自由单独基因(分别为ESR1和ESR2)编码。激素活化的雌激素受体形成二聚体，并且，由于两种形式在许多细胞类型中共表达，所以所述受体可以形成ERα (αα)或ERβ (ββ)同二聚体或ERαβ (αβ)异二聚体。因此，ER家族的至少一个家族成员优选选自ERα、ERβ，以形成ERαα(同二聚体)、ERββ(同二聚体)和ERαβ(异二聚体)，或与另一种转录因子、如例如AP1 (Fos、Jun)或NFkappaB家族或CREB的成员的异二聚体，其中出于本发明的目的，至少一个成员优选地是ER蛋白。
如上所提及，关于本发明的方法待优选检测的ER家族的所述至少一个成员是转录因子复合物的部分。术语“转录因子复合物”意指包含至少两种转录因子或（分别地）蛋白或由其组成的复合物。例如，这样的转录因子复合物可以由一种或多种同二聚体和/或异二聚体、优选ER单体或二聚体和/或一种或多种、优选两种或更多种选自上述定义的组群的蛋白(例如p300)组成。
可以与上述方式类似地确定PR途径的活性状态。存在两种孕酮受体，PR-A和PR-B，其通过配体孕酮的结合而变得活化，其将所述受体转化为活性转录因子，所述活性转录因子类似于ER结合共活化因子样CREB/p300且结合至靶基因的启动子区域中的特定应答元件，由其产生mRNA。
根据本发明的方法(如本文所述)特别适合于分层癌症患者，特别是用于分层乳腺癌或前列腺癌患者，尤其是ER和/或PR阳性和HER2阴性乳腺癌患者。具体而言，根据本发明的方法可以有利地用于评价激素疗法对于所述患者的适用性。
癌症是全世界死亡的主要原因，在2008年导致760万例死亡(所有死亡的约13％)。那些中，458000例死亡据称由乳腺癌引起。乳腺癌是全世界妇女中的最常见癌症(妇女中的所有癌症的约16％)，但它也可以影响男性，然而经常少得多(~100例乳腺癌中仅在男性中诊断到1例)。存在几种不同形式的乳腺癌，因此也需要不同的治疗。治疗乳腺癌的传统方法已经是(原发性)肿瘤的手术切除，其经常与辅助化学疗法和/或放射疗法组合。疾病机制的更好理解已经导致针对所谓的靶向疗法的模式转变(也被描述为个性化疗法、个性化药物或精确药物)，其中不非选择性杀死细胞(引起严重的副作用)，但其中非常特异性地攻击含有负责疾病的缺陷的细胞。
这样的靶向治疗的最突出实例是Genentech/Roche的Herceptin (又名Trastuzumab)。Herceptin结合HER2受体(又名HER2/neu或erbb2)。HER2过表达导致细胞信号传导的超活化(最突出的：PI3K-途径和MAPK-途径)，其最终导致异常细胞生长。
另一个实例已经是乳腺癌的治疗，其中定义(>1-10%；参见上文)百分比的癌细胞表达ER和/或PR。这些受体可以分别活化ER和PR信号传导途径。那些病例用激素(或内分泌)疗法治疗。那些疗法阻断雌激素的产生或与雌激素竞争有限的ER结合位点(例如，他莫昔芬是这样的雌激素类似物)。
对于初步诊断(即，限定癌症是否存在)，通常对可疑组织的活检样品或薄切片进行苏木精和伊红(H&E)染色。所述组织包含新鲜冷冻的组织，或更常见地，福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织。
如果已经诊断出癌症，需要进行进一步测试，以决定何种靶向疗法(如果有的话)可以有益于患者。在目前的指南(例如，用于治疗乳腺癌的国家综合临床网络(NCCN)指南)中，如下描述针对上述受体分子(HER2、ER、PR)的存在/过表达的病理学测试。这些测试通常以免疫组织化学(IHC)测定法的形式进行，所述测定作为用于诊断的H&E染色在来自相同组织样品/块的组织切片上、但在该样品的不同薄切片上进行。作为例如HER2-IHC的替代方案(或者如果IHC结果是不明确的)，经常进行原位杂交(ISH)以测量HER2-基因的扩增。
根据这些测试，然后将患者分层为属于四种以下乳腺癌类别之一：
(1) ER或PR(或两者)阳性且HER2阴性
→ 激素受体阳性乳腺癌
(2) ER和PR两者阴性，但HER2阳性
→ HER2阳性乳腺癌
(3) ER或PR(或两者)阳性且HER2阳性
→ 激素受体和HER2阳性乳腺癌
(4) 所有受体都阴性
→ 所谓的三阴性乳腺癌
(侧注：如果ER或PR是阳性的，则其可以被称为激素受体阳性(没有提及是否意指ER或PR)，因为其(目前)具有相同的治疗含义)。
尽管不限于乳腺癌患者，本发明-根据本发明的一个方面-聚焦于分层乳腺癌患者、特别是属于上述乳腺癌类别的类别(1)(即ER/PR+和HER2-)的乳腺癌患者。类别(1)是乳腺癌的最常见类型。
根据患者是何种标志物测试阳性的，即，根据患者属于上述乳腺癌类别中的何种，不同的治疗是所选择的疗法。不依赖于那些标志物，需要决定是否必须应用化学疗法和/或放射疗法。基于提及的标志物或（分别地）类别，可以决定是否可以/应当应用靶向疗法之一：
(1): 如果患者是ER或PR的表达测试阳性的，内分泌治疗是所选择的疗法。治疗种类然后再次取决于患者的激素状态，这首先根据患者是绝经前还是绝经后。
如果选择基于药物的方法，存在以下可能性：
(i) 使用选择性雌激素受体调节剂(SERM)，其通过阻断雌激素与乳房组织中的雌激素受体的结合(拮抗剂作用，同时在其它组织中具有激动剂作用)而发挥作用；最已知的实例：他莫昔芬；
(ii) 使用芳香化酶抑制剂(AI)，其防止机体经由芳香化酶产生雌激素；实例为：Arimidex(阿那曲唑)、Aromasin(依西美坦)、Femara(来曲唑)和Fadrozole；
(iii) 使用雌激素受体拮抗剂，其通过下调雌激素受体而发挥作用；例如：氟维司群。
(2): HER2阳性的患者可以得到HER2-特异性治疗，其包含任一对于HER2(或HER2家族)受体特异性的抗体，诸如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗或酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，诸如拉帕替尼，或其组合。
(3): 如果患者是HER2和激素受体之一阳性的，选择(1)和(2)中提及的治疗的组合，因为针对两种病况。
(4): 所有三种受体都是测试阴性的；这意味着无一应用靶向疗法且必须选择替代方法，如化疗。
尽管IHC具有证明的临床价值，但其就仅存在蛋白给不出关于其信号传导活性的指示的事实而言是有限的。通常，为了能够告知蛋白是否正在活跃地信号传导，需要检测其磷酸化状态或其是否正在与其它蛋白形成复合物的方法。
相关相互作用因此尤其由多种蛋白(其相互作用可以表明特定途径的活化)的聚集体(转录因子复合物)构成。它们的邻近可能是肿瘤驱动途径的鉴定和因此所述肿瘤的治疗的相关信息。在例如典型ER途径中，ER作为二聚体进入核，其可以使用PLA进行检测。进入核之后，形成涉及许多因子的转录因子复合物(参见图1)，其中任何两种都可以用作PLA测定法的基础(靶标)。核中仅存在ER或例如一般辅因子p300可以是无意义的，尽管它们的邻近表明全功能转录因子复合物的形成和因此一组基因的活化转录。
除了上述以外，邻近连接测定法允许几个进一步优点，诸如使图像分析和定量与IHC/IF相比更容易和更可靠。具体而言，邻近连接测定法产生离散信号(点)，可以测量单分子相互作用(由于原位信号扩增)，获得高灵敏度，并且存在较少的背景信号/自发荧光的问题(信号可以更容易与噪音分开(点相比于“弥散”))。此外，改进和简化的图像分析便于自动化图像分析和更准确的定量。
邻近连接测定法(比较Weibrecht等人, Expert Rev. Proteomics, 7(3), 第401–409页 (2010); “Proximity ligation assays: a recent addition to theproteomics toolbox” (经由引用包括于本文中)，该方法的动画可以见于: http://www.youtube.com/watch?v=KbpUU7jQTF8&)是能够报道两个蛋白表位的共定位的方法。所述方法使用两种用DNA寡核苷酸标记的抗体。需要两种寡核苷酸以形成两种次级DNA寡核苷酸之外的闭环，其在所述抗体已经发现其表位之后添加至样品。一旦形成闭环，使用滚环扩增(RCA)以产生数百个拷贝的环形探针。后来，用荧光团标记的互补探针与RCA产物退火，在两种蛋白共定位的位置得到非常亮的点。
例如，来自Olink S.A., 瑞典的Duolink邻近连接测定法可以与本发明结合使用。然而，不排除其它可能性。
如上所示，癌症治疗中的关键问题是，很大百分比的属于类别(1)(如上所述)的乳腺癌患者不对上述疗法(ER拮抗剂、SERM或AI)反应，或者在一段时间之后变得耐受，这样的耐受性经常由其它变得活化的途径介导。例如，ER+乳腺癌中的细胞逃逸激素依赖性的一种方式是PI3K-的超活化。换言之，在那些细胞中，ER途径不再驱动癌症，但PI3K途径已经接管，并且应当反而被疗法靶向。从ERα转变为ERα/ERβ异二聚体或ERβ同二聚体也可以是诱导耐药性的方式。存在耐受性的进一步机制，并且下面将进一步描述额外的实施例，具体而言，与根据本发明的方法的优选实施方案结合(参见，具体而言，如下面进一步描述的步骤(ⅱ)至(ⅵ))。
此外，(仅)检测ER受体的过表达没有证明ER信号传导负责疾病进展。在这方面，如现有技术中已知的目前方法的一个明显缺点是，目前的ER诊断测试无法确定ER途径在检测到ER的肿瘤细胞中是否实际上有活性。这降低了正确分类对适当治疗具有期望特异性的患者的价值。
上述问题或（分别地）缺点由根据本发明的方法(如本文所述)解决，其，例如，允许精确测定(经典)ER-途径的活性，优选地，还有相关“逃逸”或（分别地）“耐受性”途径(如具体而言下面与根据本发明的方法的优选实施方案进一步结合描述)。
本发明人已经发现，通过使用本发明的本文描述的方法，可能测量标准地用于组织病理学诊断(与其中单独蛋白的ER蛋白的核存在被当作ER途径活化的指示的标准地使用的方法相反)的组织样品中的细胞中的蛋白水平上的典型途径、如经典ER途径的实际活化状态。
此外，可能用本发明的方法(如本文所述)以便从组织样品得到空间和单细胞信息，而Musgrove等人描述的方法使整个样品的信号平均化。例如，在单细胞水平获得空间信息对于确定在组织中的哪些细胞中ER途径被活化，例如计算具有活化的ER途径的细胞的百分比是必要的。通过例如组合本发明的方法与其它组织生物标志物染色，将可能鉴定哪些生物标志物一起在一个细胞中有活性，其可以对于疗法选择是重要的。相比之下，当从分离自组织切片的RNA/DNA推断途径活性时，这是不可能的。这样的其它生物标志物可以例如是另一途径的DNA突变或信号传导蛋白或转录因子，如果存在于相同细胞中，其可以赋予对激素疗法的耐受性。
如上所示，如本文所述分层的(癌症)患者优选是乳腺癌或前列腺癌患者，因此，待与本发明的方法(如本文所述)结合使用的组织样品优选来自乳腺癌或前列腺癌患者。进一步优选的是本发明的方法，其中所述癌症患者是ER和/或PR阳性和HER2阴性的乳腺癌患者，并且因此，所述组织样品来自ER和/或PR阳性和HER2阴性乳腺癌患者。
有利的是，本发明的方法，不仅对于确定ER和/或PR信号传导途径的活性状态，而且对于评价对激素疗法的耐受性的潜在机制，是特别合适的。在这方面，优选的是，本发明的方法额外包括确定一种或多种“逃逸”或“耐受性”途径或（分别地）机制的活性的步骤。下面描述这样的方法的优选实施方案和步骤。
优选地，本发明的方法额外包括以下步骤中的至少一个，即，一个、多个或所有：
(ii) 通过应用原位染色测定法、优选邻近连接测定法以检测(癌症)患者的相同或不同的组织样品中ER家族的至少一个成员和至少一种选自c-Fos、c-Jun (AP1)、SP1、CREB、GATA-转录因子、NFkappaB家族、c/EBP蛋白、FOXO、SMAD转录因子蛋白的蛋白的存在而确定不同于步骤(i)中评价的信号传导途径的信号传导途径的活化状态，优选地其中所述ER家族的至少一个成员和所述至少一种蛋白是相同转录因子复合物的部分，
其中所述分层进一步基于步骤(ii)中确定的活化状态，
(iii) 确定(癌症)患者的组织样品中ER家族的至少一个成员在丝氨酸305的磷酸化状态，
其中所述分层进一步基于步骤(iii)中确定的磷酸化状态，
(iv) 通过应用原位染色测定法、优选邻近连接测定法确定一种或多种信号传导途径的活化状态，所述信号传导途径不同于步骤(i)评价的信号传导途径，并且选自PI3K途径、Wnt途径、HH途径、NFkappaB、Notch途径、TGFbeta、FGF、VEGF、EMT途径、其它核受体途径如AR、RAR、PPAR、糖皮质激素、VitD途径，其中使用(癌症)患者的相同或不同组织样品，
其中所述分层进一步基于步骤(iv)中确定的活化状态，
(v) 通过应用原位染色测定法、优选邻近连接测定法以通过测量PBK/Akt的磷酸化状态(优选在苏氨酸308和/或丝氨酸473)检测(癌症)患者的相同或不同组织样品中的活性PKB/Akt蛋白而确定PI3K途径的活化状态，
其中所述分层进一步基于步骤(v)中确定的活化状态，且
(vi) 应用原位染色测定法、优选邻近连接测定法以检测(癌症)患者的相同或不同的组织样品中ER家族的至少一个成员和至少一种组分（优选转录因子）的存在，其中预期所述至少一种组分或（分别地）转录因子存在于任何ERE(雌激素响应元件)半位点或任何非ERE位点和/或其中所述至少一种组分或（分别地）转录因子选自AP1 (c-Fos、c-Jun)、cAMP响应元件-结合蛋白/CREB、GATA转录因子和NFkappaB、SP1、C/EBP、FOXO、SMAD转录因子蛋白，
其中所述分层进一步基于步骤(iv)中的检测。
根据如本文所述的根据本发明的方法的预期目的和/或（分别地）根据(癌症)患者的类型、疗法的类型、必须评价的适用性、和/或信号传导途径、必须确定的活化，还可以进行步骤(iv)(如上所述)替代步骤“(ⅰ)”(如介绍性描述)，或者，作为步骤“(ⅰ)”(如介绍性描述)。
步骤(ii)基于以下知识：雌激素-ER复合物不仅可以直接结合至基因的启动子区域中的雌激素响应元件(ERE的)，而且可以充当与其它DNA-结合元件诸如c-Jun或c-Fos相互作用在非ERE位点的辅因子。(在这方面，还参见步骤(vi)，其通常是指预期存在于任何非ERE位点或任何ERE半位点(例如AP1)的转录因子)。
对激素疗法(例如，对他莫昔芬治疗)的耐受性的另一种可能的机制，其通过上述步骤(iii)解决，是ER中的位置305上的丝氨酸的磷酸化(在配体和DNA结合结构域之间的区域)。确定ER的磷酸化状态优选通过使用PLA进行。在这方面，可以使用的ER特异性抗体是可得的，例如抗ERαS305-P(可得自Millipore/Upstate)。
根据本发明的特别优选的实施方案，本发明的方法额外包括确定PI3K途径、Wnt途径和/或HH途径的活化状态的步骤(参见上文，步骤(iv))。那些途径还可以对潜在耐受性具有影响，或者，分别可以表明这样的耐受性。对于那些途径，也可以确定特定转录因子，并且优选经由PLA方法进行检测。PI3K-途径是特别感兴趣的。除了涉及ER转录因子复合物的途径以外，优选测试该途径。因此，本发明的方法优选额外包括如上所述的步骤(v)。测试结果然后被定义为pAkt阳性或pAkt阴性。或者，例如，也可以确定来自FOXO类别的PI3K-途径的转录因子。
特别优选的是根据本发明的方法，其中所述方法聚焦于通过检测ER转录因子复合物而确定ER途径的活化状态，和额外确定PI3K途径的活化状态。因此，本发明的方法优选包括以下步骤：
(i) 通过应用邻近连接测定法以检测癌症患者的组织样品中ER家族的至少一个成员、优选ER二聚体(所述至少一个成员是转录因子复合物的部分)和至少一种选自TAFs、TBP、POLII、TFII、p300、CREB和CBP、优选p300的蛋白(其中所述至少一种蛋白是相同转录因子复合物的部分)的存在而确定ER和/或PR信号传导途径的活化状态，且
(v) 通过应用原位染色测定法、优选邻近连接测定法以通过测量PBK/Akt的磷酸化状态而检测癌症患者的相同组织样品中的活性PKB/Akt蛋白而确定PI3K途径的活化状态，
其中所述分层基于步骤(i)中确定的的活化状态和步骤(v)中确定的活化状态，
优选地，其中(如上所述)癌症患者优选为乳腺癌患者，特别是ER和/或PR阳性和HER2阴性的乳腺癌患者，且分别地，组织样品优选来自乳腺癌患者，特别是来自ER和/或PR阳性和HER2阴性乳腺癌患者。
如本文所使用的术语“组织样品”优选是指患者的活检样品(诸如例如通过/来自细胞学、液体活检、血液细胞、切除的肿瘤组织或细针活检获得的活检样品)，更优选为患者的肿瘤组织样品，特别是癌症患者。在与本发明的方法结合使用肿瘤组织样品的情况下，这样的肿瘤组织样品优选选自新鲜冷冻(FF)肿瘤组织样品和福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肿瘤组织样品和/或选自切除肿瘤的薄切片、活检样品的薄切片、捕获的循环肿瘤细胞(CTC)和细针抽吸物。在那些组织样品上可以容易且有效地进行根据本发明的方法。
本发明的一个进一步方面涉及用于患者、优选癌症患者的疾病、优选癌症的结果预后的方法，其中所述方法包括通过应用邻近连接测定法确定ER和/或PR信号传导途径的活化状态，其中所述方法包括至少如上所定义的步骤(i)，其中所述预后基于确定的活化状态。
本发明的另一个方面涉及用于预测和/或检测患者、优选癌症患者针对疗法诸如激素疗法的疗法耐受性的方法，所述疗法优选针对ER和/或PR信号传导途径，其中所述方法包括通过应用邻近连接测定法确定ER和/或PR信号传导途径的活化状态，其中所述方法包括至少如上所定义的步骤(i)，其中所述预测和/或检测基于确定的活化状态。
这样的方法还可以包括上述额外步骤(ii)至(vi)中的一个、多个或所有。特别优选地，这样的方法额外包括以下步骤中的一个或多个：
(ii) 通过应用原位染色测定法、优选邻近连接测定法以检测(癌症)患者的相同或不同的组织样品中ER家族的至少一个成员和至少一种选自c-Fos、c-Jun (AP1)、SP1、CREB、GATA-转录因子、NFkappaB家族、c/EBP蛋白、FOXO、SMAD转录因子蛋白的蛋白的存在而确定不同于步骤(i)中评价的信号传导途径的信号传导途径的活化状态，优选地其中所述ER家族的至少一个成员和所述至少一种蛋白是相同转录因子复合物的部分，
其中所述预后或预测和/或检测进一步基于步骤(ii)中确定的活化状态，
(iii) 确定(癌症)患者的组织样品中ER家族的至少一个成员在丝氨酸305的磷酸化状态，
其中所述预后或预测和/或检测进一步基于步骤(iii)中确定的磷酸化状态，
(iv) 通过应用原位染色测定法、优选邻近连接测定法确定一种或多种信号传导途径的活化状态，所述信号传导途径不同于步骤(i)评价的信号传导途径，并且选自PI3K途径、Wnt途径、HH途径、NFkappaB、Notch途径、TGFbeta、FGF、VEGF、EMT途径、其它核受体途径如AR、RAR、PPAR、糖皮质激素、VitD途径，其中使用(癌症)患者的相同或不同组织样品，
其中所述预后或预测和/或检测进一步基于步骤(iv)中确定的活化状态，
(v) 通过应用原位染色测定法、优选邻近连接测定法以通过测量PBK/Akt的磷酸化状态(优选在苏氨酸308和/或丝氨酸473)检测(癌症)患者的相同或不同组织样品中的活性PKB/Akt蛋白而确定PI3K途径的活化状态，且
其中所述预后或预测和/或检测进一步基于步骤(v)中确定的活化状态，
(vi) 应用原位染色测定法、优选邻近连接测定法以检测(癌症)患者的相同或不同的组织样品中ER家族的至少一个成员和至少一种组分（优选转录因子）的存在，其中预期所述至少一种组分或（分别地）转录因子存在于任何ERE(雌激素响应元件)半位点或任何非ERE位点和/或其中所述至少一种组分或（分别地）转录因子选自AP1 (c-Fos、c-Jun)、cAMP响应元件-结合蛋白/CREB、GATA转录因子和NFkappaB、SP1、C/EBP、FOXO、SMAD转录因子蛋白，
其中所述预后或预测和/或检测进一步基于步骤(vi)中确定的活化状态。
通常，鉴于关于用于分层(癌症)患者的方法的上述步骤和实施方案，这样的方法的优选实施方案变得明显。
通过应用本发明的方法、特别是根据本文所述的优选实施方案的方法，可能使得可靠预测(癌症)患者将发展对特定治疗剂的耐受性的可能性，或者确定这样的耐受性是否已经存在。
本发明的一个进一步方面涉及试剂盒，其包含以下组分：
- 针对ER家族的成员的表位的第一抗体，所述成员是转录因子复合物的部分，和
- 针对选自TAFs、TBP、POLII、TFII、p300、CREB和CBP的蛋白的表位的第二抗体，其中所述蛋白是与ER家族的上述成员相同的转录因子复合物的部分。
优选地，这样的试剂盒用于如本文所述的根据本发明的方法、优选如优选如本文所述的方法中。本发明因此还涉及这样的试剂盒在根据本发明的方法中的特定用途，和，（分别地）用于根据本发明的方法中的这样的试剂盒。
在本发明的上下文中，还公开了第一和第二抗体，和（如果适用），一种或多种其它任选组分(如分别上文或下文描述)在制备根据本发明的试剂盒中的用途，优选地用于根据本发明的方法中。
优选地，通过偶联至特定寡序列的两种第二抗体，或通过将寡序列直接偶联至第一抗体，根据方案开发和进行PLA测定。
当然，根据这样的试剂盒的预期用途，可以采用针对进一步/其它蛋白的进一步/其它表位的进一步/其它抗体(在这方面，参见，具体而言，上述步骤(ii)至(vi)，其中提到抗体的进一步目标)。
优选地，(A)上述试剂盒的第一和第二抗体各自用DNA寡核苷酸标记，或(B)所述试剂盒额外包含分别针对第一和第二抗体的第三和第四抗体，且所述第三和第四抗体用DNA寡核苷酸标记。
根据本发明的试剂盒也可以包含进一步组分，诸如环形成寡核苷酸，酶，诸如分别允许连接和滚环扩增的连接酶和聚合酶。此外，可将洗涤缓冲液和互补寡核苷酸形式的亮场或荧光探针添加至这样的试剂盒。还可以将显微镜载片、盖玻片和封固介质添加至这样的试剂盒。这样的试剂盒中的任何缓冲液可以含有DAPI或任何其它核染料以显现细胞核。在这样的试剂盒的另一个实施方案中，可添加含有荧光探针和寡核苷酸探针两者的(第一)抗体。这样的抗体将自身发荧光，且可同时是PLA应用中的伴侣。
用这样的试剂盒，可以安全和可重复的方式进行本发明的方法。
关于本发明，可以使用用于进行根据本发明的方法的自动化设备，即，(a)用于实施包括任何所需的孵育和洗涤步骤的染色测定，(b)用于通过样品的发光和在数字文件中存储图像而获取图像，或(c)用于处理和分析染色样品的数字图像。
为了使用这样的自动化设备，改进结果的可靠性和可重复性，能够实现样品载片染色结果的数字化，使得可以自动化方式借助计算机算法解释染色测定。它还加速大量样品的处理。
对于(靶向)疗法选择，重要的是，鉴定癌症患者的肿瘤组织样品中的多种信号传导途径是否在相同癌细胞或在代表多个癌细胞克隆的不同细胞中有活性，或者例如癌细胞中的一种途径，和肿瘤相关的成纤维细胞或免疫细胞(例如巨噬细胞)或肿瘤组织中存在的其它细胞类型中的另一种途径。这也可以是预后相关的，例如组织中的非依赖性Wnt阳性克隆可以表明转移的倾向。
目前围绕合成致死疗法(意指靶向癌细胞中的不同信号传导途径(或其它相关目标)的药物的组合)的发展，仅当两种目标存在于同一细胞时，而不是当一种目标存在于一种癌细胞克隆中且另一目标存在于另一种癌细胞克隆或组织中的其它细胞类型中时，这些疗法对于细胞是致死的。
本发明的上述方面和其它方面将从下文描述的实施方案和具体地随附专利权利要求变得更加显而易见，并且将参考下文描述的实施方案和具体地随附专利权利要求进行阐述。从属权利要求中定义本发明的优选实施方案。应当理解的是，权利要求1、8和9的方法、权利要求10的试剂盒和权利要求11至13的试剂盒的用途具有如从属权利要求中定义和如本文定义的类似和/或相同的优选实施方案或（分别地）步骤和特征。
附图简述
在下图中：
图1图示显示可能的ER-途径。具体而言，该图显示ER本身可以是多组分转录因子复合物的部分，其中该复合物的所有蛋白都是如本文所述的本发明的方法的潜在目标。还清楚的是，经由PI3K，可以形成另一种涉及NFkappaB的转录因子复合物。
图2示例性显示举例说明根据本发明的优选方法的结果选择合适疗法的流程图。
图3至6显示针对ER和p300的IHC和PLA测定的结果(在这方面，参见下面，实施例3)。
实施方案的详述
如上所述，本发明的方法允许在蛋白水平可靠测定某些途径的活性。具体而言，通过使用邻近连接测定法，可以确定所述途径在组织样品的哪些细胞中是有活性的。在这方面，也可能提供关于组织样品(如上所述)、优选组织载片中具有各自活化的途径的癌细胞的百分比的证据。此外，本文描述的方法使得能够预测，是否某些(激素)疗法将是有效的，是否预期或可能发展对(激素)疗法的耐受性，使得可以根据发现何种途径是有活性的而选择匹配疗法。
优选的是，对体外组织样品、优选组织切片进行根据本发明(如上所述)的方法。
根据本发明的方法可以有利地与进一步通常使用的分层技术组合。可以对获得自癌症患者的相同组织样品或对获得自癌症患者的不同组织样品进行这样的额外分层测试。此外，这样的额外分层可以在根据本发明的测试之前、同时或之后进行。例如，这样的额外测试可以通过使用IHC染色来进行。
就可以与本发明(如本文所述)的方法中使用的邻近连接测定法结合使用的抗体而言，应当指出的是，可以利用携带不同颜色通道中的不同标记物的不同抗体，以便可以对同一样品并行进行多于一种途径的测试。此外，可以合适地用不同颜色通道中的标记物标记某些抗体，例如抗ER抗体，以便例如可以用相同抗体进行IHC和PLA染色。
如上所述，特别优选的方法 - 根据本发明的一个方面 - 包括以下步骤：
(i) 通过应用邻近连接测定法以检测(癌症)患者的组织样品中ER家族的至少一个成员(所述至少一个成员是转录因子复合物的部分)和至少一种选自TAFs、TBP、POLII、TFII、p300、CREB和CBP的蛋白(其中所述至少一种蛋白是相同转录因子复合物的部分)的存在而确定ER和/或PR信号传导途径的活化状态。
上面描述根据本发明的方法的进一步优选的实施方案和特征。本发明的示例性特别优选的方法 - 根据本发明的一个方面 - 包括以下步骤：
(i) 通过应用邻近连接测定法以检测(癌症)患者的组织样品中ER家族的至少一个成员、优选ER二聚体(所述至少一个成员是转录因子复合物的部分)和至少一种选自TAFs、TBP、POLII、TFII、p300、CREB和CBP、优选p300的蛋白(其中所述至少一种蛋白是相同转录因子复合物的部分)的存在而确定ER和/或PR信号传导途径的活化状态，且
(v) 通过应用邻近连接测定法以通过测量PBK/Akt的磷酸化状态而检测(癌症)患者的相同组织样品中的活性PKB/Akt蛋白而确定PI3K途径的活化状态，
优选地，其中所述患者是癌症患者，更优选地乳腺癌患者，优选地ER和/或PR阳性和HER2阴性乳腺癌患者，且分别地，所述组织样品是来自乳腺癌患者、优选来自ER和/或PR阳性和HER2阴性乳腺癌患者的肿瘤组织样品。
通过采用这样的方法，在辅助设置中用四种不同的治疗选择可能有基本上四种不同的测试结果(在所有情况下，分开决定额外的化学疗法和放射疗法)：
1. 含有ER的转录因子复合物(步骤(i))：阳性
pAkt (步骤(v))：阴性
→ 治疗选择：“内分泌治疗”。
2. 含有ER的转录因子复合物(步骤(i))：阳性
pAkt (步骤(v))：阳性
→ 治疗选择：“内分泌治疗”和PI3K途径的(潜在新)抑制剂。
3. 含有ER的转录因子复合物(步骤(i))：阴性
pAkt (步骤(v))：阴性
→ 无内分泌治疗，无PI3K途径药物(可能例外的是pAkt下游的PI3K途径抑制剂，诸如TORC1和/或TORC2抑制剂)。
4. 含有ER的转录因子复合物(步骤(i))：阴性
pAkt (步骤(v))：阳性
→ PI3K途径的(潜在新)抑制剂。
必须指出的是，分析本文提及的途径中的两种、三种、多种或所有的活性(在这方面，具体地参见如上所述的步骤(ii)至(ⅵ))、优选通过使用相同的组织样品，在本发明的范围之内。这允许改进选择用于相应(癌症)患者的合适治疗。
例如，根据基于本文所述的方法进行的测试的结果，用于(激素)治疗的合适的治疗剂和/或，例如，合适的PI3K途径抑制剂可以选自目前批准的药物(由例如，FDA、CFDA、EMA等批准)或临床试验中的药物(对于解决PI3K途径的药物，参见例如图2)或公众尚且未知的未来药物。
如上所述，图1图示显示可能的ER-途径。具体而言，该图显示ER本身可以是多组分转录因子复合物的部分，其中该复合物的所有蛋白都是如本文所述的本发明的方法的潜在目标。在图1中，参考数字具有以下含义：
1 雌激素
2 雌激素受体
3 生长因子
4 基因表达
5 抗细胞凋亡
6 血管舒张
7 二聚化
8 核。
如上所述，图2示例性显示举例说明根据本发明的优选方法的结果选择合适疗法的流程图。在图2中，参考数字具有以下含义：
1 抗体
3 ATP-竞争性抑制剂
5 ATP-竞争性抑制剂
7 ATP-竞争性抑制剂
9 ATP-竞争性和变构性抑制剂
11 ATP-竞争性和FKBP12-介导的抑制剂
51 以下药物的干预/作用模式的可能位置(泛-Pi3K)：
BKM120(Novartis)
XL-147(Exelixis)
PX-866(Oncothyreon)
GDC-0941 (Genentech)
CH51327909 (Chugai Pharma)
53 以下药物的干预/作用模式的可能位置(P110δ-特异性)：
CAL-101(Calistoga)
55 以下药物的干预/作用模式的可能位置(P110α-特异性)：
BYL719(Novartis)
GDC-0032(Genentech)
INK-1117(Intellikine)
71 以下药物的干预/作用模式的可能位置(PI3K/mTOR)：
PKI-587(Pfizer)
BEZ235(Novartis)
BGT226(Novartis)
PF-4691502 (Pfizer)
GDC-0980(Pfizer)
XL-765(Exelixis)
SF1126(Sernafor)
GSK1059615 (GSK)
73 以下药物的干预/作用模式的可能位置(TORC1/2)：
INK-128(Intellikine)
OSI-027(Wyeth/Pfitzer)
AZD-8055(Astrazeneca)
91 以下药物的干预/作用模式的可能位置(Akt)：
AZD5363(Astrazeneca)
GDC-0068(Genentech)
GSK690693 (GSK)
VQD002(Vloquest)
111 以下药物的干预/作用模式的可能位置：(TORC1):
Everolimus/RAD001 (Novartis)
Temsirolimus/CCI-779 (Wyeth/Pfitzer)
Ridaforolimus/AP-23575 (Merck/Ariad)。
如上所述，本发明可以通过使用自动化设备来进行，所述自动化设备用于进行根据本发明的方法，即，分别如上所述，(a)用于分层患者，优选癌症患者，用于评价疗法对于所述患者的适用性，(b)用于患者、优选癌症患者的疾病、优选癌症的结果的预后，或(c)用于预测和/或检测患者、优选癌症患者针对(激素)疗法的疗法耐受性。
优选地，由此进行所述方法，使得读出值是荧光。
通常，本文关于本发明的方法描述的测试可以手动进行，但也可能使用自动化设备，诸如例如Ventana (Roche)的基准，由此增强可重复性。
实施例
实施例1：
确定在基质上离心的癌细胞系样品中的ER信号传导途径的活化状态的间接PLA测定法：
使用在不同物种(例如，小鼠和兔)中产生的两种抗体，例如针对雌激素-ER二聚体复合物上的表位的小鼠抗体(单克隆小鼠抗人雌激素受体α, 克隆1D5, Dako/目录号M7047)，和针对p300的兔抗体(抗-p300小鼠抗人mAb, 克隆NM-11, Millipore/目录号NA46-100UG或抗-p300 CT小鼠抗人mAb, 克隆RW 128, Millipore/目录号05-257)。
方案：
Figure 632865DEST_PATH_IMAGE001
Figure 455328DEST_PATH_IMAGE002
图像分析。(手动或软件辅助计数每个细胞或每个细胞区室的PLA点数。)。
实施例2：
检测Akt的磷酸化状态(=活化状态)的直接PLA测定法(待除了实施例1的测定法以外制备)：
使用两种抗体(可以来自相同物种：例如针对Akt1的小鼠抗体(F-8L, Santa CruzBiotech)和针对磷酸化-Akt的另一种小鼠抗体(18F3.H11, Abcam, ab105731))
方案：
Figure 253520DEST_PATH_IMAGE003
Figure 452420DEST_PATH_IMAGE004
实施例3：
3.1 针对ER+ (MCF7)和ER- (SKBR3)细胞系两者中的ER和p300的IHC测定：
首先在ER+ (MCF7)和ER- (SKBR3)细胞系两者中进行针对ER和p300的IHC测定。
分析清楚地显示，ER和p300两者均以不同的浓度存在于MCF7细胞的核中。具体而言，在获得自染色的IHC测定的原始彩色图像中，许多细胞呈绿色，其表明ER的存在，许多细胞呈红色，其表明p300的存在，并且许多细胞呈淡黄色，其表明组合信号(参见图3，其显示基于获得自染色的IHC测定的原始彩色图像的灰度图像；参考标号“ER”、“p300”和“ER+p300”示例性指向表示为ER、p300或组合的细胞)。原始彩色图像中的色差(在图3中，降低至亮度差)表明，ER和p300两者的表达和/或存在在细胞间广泛变化。
相反，在SKBR3细胞中，仅可以发现p300。事实上，SKBR3细胞不显示ER通道中的任何信号，留下抗p300抗体呈红色的核(参见图4，其显示基于获得自染色的IHC测定的原始彩色图像的灰度图像；图像中可见的细胞在原始彩色图象中呈红色，表明仅p300的存在)。
3.2 针对ER+ (MCF7)和ER- (SKBR3)细胞系两者中的ER和p300的PLA：
在ER+ (MCF7)和ER- (SKBR3)细胞系两者中进行针对与p300组合的ER的PLA。
结果清楚地表明细胞核中两种因子存在于相同复合物中的位置。具体而言，在获得自染色的PLA的原始彩色图像中，对于MCF7细胞，大量红色点表明大量活性转录因子复合物(参见图5，其显示基于获得自MCF7细胞的染色的PLA的原始彩色图像的灰度图像；亮点在原始图像中呈红色，其表明活性转录因子复合物)。如从IHC测定预期，细胞间存在一些变化。还如预期，SKBR3细胞显示几乎没有任何活性转录因子复合物(参见图6，其显示基于获得自SKBR3细胞的染色的PLA的原始彩色图像的灰度图像)。
当针对ER和辅因子-CREB进行PLA时，产生类似的数据(数据未显示)。
尽管已经在附图和前面描述中举例说明和额外描述了本发明，但这样的举例说明和描述应当被认为是说明性或示例性的，而非限制性的；本发明不限于所公开的实施方案。
在请求保护的发明中，从附图、公开内容和随附权利要求的研究，本领域技术人员可以理解和实现对公开的实施方案的其它变型。
在权利要求中，词语“包含”不排除其它要素或步骤，且不定冠词“一个/种(a)”或“一个/种(an)”不排除多个/种。互相不同的从属权利要求中记载测试方法的唯一事实不表明不能有利地使用这些方法的组合。

Claims (11)

1.针对ER家族成员的第一抗体和针对选自TAFs、TBP、POLII、TFII、p300、CREB和CBP的蛋白的第二抗体在制备用于评价疗法对患者的适用性的患者分层方法的试剂盒中的用途，其中所述患者是乳腺癌患者，所述疗法针对信号传导途径，其中所述方法包括以下步骤：
(i) 通过应用邻近连接测定法以检测所述患者的组织样品中ER家族的至少一个成员和选自TAFs、TBP、POLII、TFII、p300、CREB和CBP的至少一种蛋白的存在而确定ER和/或PR信号传导途径的活化状态，所述至少一个成员是转录因子复合物的部分，其中所述至少一种蛋白是相同转录因子复合物的部分，
其中所述分层基于步骤(i)中确定的活化状态，且所述疗法的适用性基于所述分层进行评价，
其中如果至少一个ER家族成员与选自TAFs、TBP、POLII、TFII、p300、CREB和CBP的至少一种蛋白密切邻近位于核中，则确定步骤(i)的信号传导途径是有活性的，和
(v) 通过应用原位染色测定法以通过测量PBK/Akt的磷酸化状态而检测所述患者的相同或不同的组织样品中的活性PKB/Akt蛋白而确定PI3K途径的活化状态，
其中所述分层进一步基于步骤(v)中确定的活化状态，所述患者被分层为适合于内分泌治疗。
2.权利要求1的用途，其中所述ER家族的至少一个成员是ER二聚体。
3.权利要求1的用途，其中所述方法额外包括以下步骤：
(ii) 通过应用原位染色测定法以检测所述患者的相同或不同的组织样品中所述ER家族的至少一个成员和选自c-Fos、c-Jun (AP1)、SP1、CREB、GATA-转录因子、NFkappaB家族、c/EBP蛋白、FOXO、SMAD转录因子蛋白的至少一种蛋白的存在而确定不同于步骤(i)中评价的信号传导途径的信号传导途径的活化状态，
其中所述分层进一步基于步骤(ii)中确定的活化状态。
4.权利要求1的用途，其中所述方法额外包括以下步骤：
(iii) 确定所述患者的组织样品中所述ER家族的至少一个成员在丝氨酸305的磷酸化状态，
其中所述分层进一步基于步骤(iii)中确定的磷酸化状态。
5.权利要求1的用途，其中所述方法额外包括以下步骤：
(iv) 通过应用原位染色测定法确定一种或多种信号传导途径的活化状态，所述信号传导途径不同于步骤(i)评价的信号传导途径，并且选自Wnt途径、hedgehog (HH)途径、NFkappaB、Notch途径、TGFbeta、FGF、VEGF、EMT途径、其它核受体途径如AR、RAR、PPAR、糖皮质激素、VitD途径和生长因子途径如胰岛素GF和EGF，其中使用所述患者的相同或不同的组织样品，
其中所述分层进一步基于步骤(iv)中确定的活化状态。
6.权利要求1的用途，其中所述方法额外包括以下步骤：
(vi) 应用原位染色测定法以检测所述患者的相同或不同的组织样品中所述ER家族的至少一个成员和预期存在于任何ERE(雌激素响应元件)半位点或任何非ERE位点的至少一种组分的存在，和/或其中所述至少一种组分选自AP1、cAMP响应元件-结合蛋白/CREB、GATA转录因子、NFkappaB、SP1、C/EBP、FOXO和SMAD转录因子蛋白，
其中所述分层进一步基于步骤(iv)中的检测。
7.针对ER家族成员的第一抗体和针对选自TAFs、TBP、POLII、TFII、p300、CREB和CBP的蛋白的第二抗体在制备用于患者的疾病的结果预后的方法的试剂盒中的用途，所述方法包括进行上面权利要求1至6中任一项中详述的方法，其中所述预后基于确定的活化状态。
8.针对ER家族成员的第一抗体和针对选自TAFs、TBP、POLII、TFII、p300、CREB和CBP的蛋白的第二抗体在制备用于预测和/或检测患者对疗法的疗法耐受性的方法的试剂盒中的用途，所述方法包括进行上面权利要求1至6中任一项中详述的方法，其中所述预测和/或检测基于确定的活化状态。
9.针对转录因子或分别地转录因子复合物或分别地作为转录因子复合物的部分的受体的表位的第一抗体和针对相应共活化剂蛋白的表位的第二抗体在制备用于如权利要求1中所述的方法的试剂盒中的用途，所述试剂盒包含以下组分：
- 针对转录因子或分别地转录因子复合物或分别地作为转录因子复合物的部分的受体的表位的第一抗体，和
- 针对相应共活化剂蛋白的表位的第二抗体，其中，如果适用，所述共活化剂蛋白是相同转录因子复合物的部分。
10.针对转录因子或分别地转录因子复合物或分别地作为转录因子复合物的部分的受体的表位的第一抗体和针对相应共活化剂蛋白的表位的第二抗体在制备用于如权利要求7中所述的方法的试剂盒中的用途，所述试剂盒包含以下组分：
- 针对转录因子或分别地转录因子复合物或分别地作为转录因子复合物的部分的受体的表位的第一抗体，和
- 针对相应共活化剂蛋白的表位的第二抗体，其中，如果适用，所述共活化剂蛋白是相同转录因子复合物的部分。
11.针对转录因子或分别地转录因子复合物或分别地作为转录因子复合物的部分的受体的表位的第一抗体和针对相应共活化剂蛋白的表位的第二抗体在制备用于如权利要求8中所述的方法的试剂盒中的用途，所述试剂盒包含以下组分：
- 针对转录因子或分别地转录因子复合物或分别地作为转录因子复合物的部分的受体的表位的第一抗体，和
- 针对相应共活化剂蛋白的表位的第二抗体，其中，如果适用，所述共活化剂蛋白是相同转录因子复合物的部分。
CN201580005565.1A 2014-01-22 2015-01-21 改进的用于评价疗法适用性的患者分层 Active CN105917231B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14152183 2014-01-22
EP14152183.1 2014-01-22
PCT/EP2015/051051 WO2015110440A1 (en) 2014-01-22 2015-01-21 Improved stratification of patients for assessing the suitability of a therapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105917231A CN105917231A (zh) 2016-08-31
CN105917231B true CN105917231B (zh) 2021-05-11

Family

ID=49999759

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580005565.1A Active CN105917231B (zh) 2014-01-22 2015-01-21 改进的用于评价疗法适用性的患者分层

Country Status (7)

Country Link
US (1) US11199546B2 (zh)
EP (1) EP3097421B1 (zh)
JP (1) JP6700186B2 (zh)
CN (1) CN105917231B (zh)
BR (1) BR112016016675B1 (zh)
RU (1) RU2711452C2 (zh)
WO (1) WO2015110440A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2019100441A (ru) * 2016-06-13 2020-07-14 Конинклейке Филипс Н.В. Способ логического вывода об активности транскрипционного фактора пути сигнальной трансдукции у субъекта

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9708676D0 (en) * 1997-04-30 1997-06-18 Imp Cancer Res Tech Chemical compounds
AU4674600A (en) * 1999-04-30 2000-11-17 North Shore Long Island Jewish Health System Estrogen signalling pathway regulators and uses thereof
DE19936618A1 (de) 1999-08-04 2001-03-15 Monotec Gmbh Diagnostisches Kit und dessen Verwendung
US20080108091A1 (en) * 2006-08-07 2008-05-08 Hennessy Bryan T Proteomic Patterns of Cancer Prognostic and Predictive Signatures
WO2009089521A2 (en) 2008-01-10 2009-07-16 Nuvera Biosciences, Inc. Predictors for evaluating response to cancer therapy
WO2010006291A1 (en) 2008-07-10 2010-01-14 Nodality, Inc. Methods for diagnosis, prognosis and treatment
US8597885B2 (en) 2009-01-28 2013-12-03 University Of Notre Dame Accelerated progression relapse test
DE102009034665A1 (de) 2009-07-24 2011-01-27 Neumayer Tekfor Holding Gmbh Befestigungsvorrichtung und Befestigungssystem
JP5808349B2 (ja) * 2010-03-01 2015-11-10 カリス ライフ サイエンシズ スウィッツァーランド ホールディングスゲーエムベーハー セラノーシスのためのバイオマーカー
KR101864855B1 (ko) * 2010-03-31 2018-07-13 지피돈 디아그노스틱스 게엠베하 내분비 치료 중 유방암 재발 예측 방법
WO2014016401A1 (en) * 2012-07-27 2014-01-30 Centre Leon Berard DETECTION OF THE ERα/SRC/PI3K COMPLEX AS PREDICTIVE MARKER IN BREAST CANCER

Also Published As

Publication number Publication date
EP3097421B1 (en) 2019-11-13
US20160334405A1 (en) 2016-11-17
RU2711452C2 (ru) 2020-01-17
RU2016133965A3 (zh) 2018-09-27
US11199546B2 (en) 2021-12-14
BR112016016675A2 (zh) 2017-08-08
RU2016133965A (ru) 2018-02-28
JP6700186B2 (ja) 2020-05-27
BR112016016675B1 (pt) 2024-01-16
EP3097421A1 (en) 2016-11-30
JP2017508137A (ja) 2017-03-23
CN105917231A (zh) 2016-08-31
WO2015110440A1 (en) 2015-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
He et al. A review on methods for diagnosis of breast cancer cells and tissues
Ross et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti–HER-2 therapy and personalized medicine
De Mattos-Arruda et al. Circulating tumour cells and cell-free DNA as tools for managing breast cancer
Hanna et al. Chromogenic in-situ hybridization: a viable alternative to fluorescence in-situ hybridization in the HER2 testing algorithm
Kraus et al. Semi-quantitative immunohistochemical assay versus oncotype DX® qRT-PCR assay for estrogen and progesterone receptors: an independent quality assurance study
Noske et al. Comparison of different approaches for assessment of HER2 expression on protein and mRNA level: prediction of chemotherapy response in the neoadjuvant GeparTrio trial (NCT00544765)
Inda et al. Estrogen receptor pathway activity score to predict clinical response or resistance to neoadjuvant endocrine therapy in primary breast cancer
Nuciforo et al. Quantification of HER family receptors in breast cancer
Qian et al. Heregulin and HER3 are prognostic biomarkers in oropharyngeal squamous cell carcinoma
WO2007035842A2 (en) Comprehensive diagnostic testing procedures for personalized anticancer chemotherapy (pac)
Pfitzner et al. Clinical relevance and concordance of HER2 status in local and central testing—an analysis of 1581 HER2-positive breast carcinomas over 12 years
Wasserman et al. High concordance of a closed-system, RT-qPCR breast cancer assay for HER2 mRNA, compared to clinically determined immunohistochemistry, fluorescence in situ hybridization, and quantitative immunofluorescence
Ross Update on HER2 testing for breast and upper gastrointestinal tract cancers
Pesta et al. May CTC technologies promote better cancer management?
Wang et al. Detection of circulating tumor cells in patients with breast cancer using the quantitative RT-PCR assay for monitoring of therapy efficacy
Kim et al. Prognostic significance of high expression of ER-beta in surgically treated ER-positive breast cancer following endocrine therapy
Meng et al. Expression of human epidermal growth factor receptor-2 in resected rectal cancer
Słodkowska et al. Digital pathology in personalized cancer therapy
CN105917231B (zh) 改进的用于评价疗法适用性的患者分层
Zhou et al. The diagnostic and clinical significance of TFE3 immunohistochemical nuclear expression in solitary fibrous tumour
JP7453284B2 (ja) 癌のバイオマーカーとしてのｐｄ－ｅｃｇｆ
Okazaki et al. Predictive markers for efficacy of everolimus plus exemestane in patients with luminal HER2-negative metastatic breast cancer
Van Rooijen et al. Limited human epidermal growth factor receptor 2 discordance in metastatic breast cancer patients treated with trastuzumab, a population based study
Słodkowska et al. Digital pathology in personalized cancer therapy
Zhong et al. Diagnostic and therapeutic ERβ, HER2, BRCA biomakers in the histological subtypes of lung adenocarcinoma according to the IASLC/ATS/ERS classification

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant