RU2711452C2 - Усовершенствованная стратификация пациентов для оценки пригодности терапии - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к медицине и касается способа стратификации пациента для оценки пригодности терапии для пациента, страдающего злокачественной опухолью, причем терапия направлена против каскада передачи сигнала, включающего стадию (i) определения состояния активации каскада передачи сигнала ER и/или PR для обнаружения в образце ткани пациента присутствия по меньшей мере одного представителя семейства ER и/или PR, причем указанный по меньшей мере один представитель является частью комплекса факторов транскрипции, и по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из TAF, TBP, POLII, TFII, p300, CREP и CBP, где по меньшей мере один белок является частью того же комплекса факторов транскрипции, где, если сигнальный путь стадии (i) определяют как являющийся активным, пациента стратифицируют как подходящего для эндокринного лечения. Группа изобретений также касается применения набора в указанном способе, причем набор содержит первое антитело, направленное против эпитопа представителя семейства ER и/или PR, и второе антитело, направленное против эпитопа белка, выбранного из группы, состоящей из TAF, TBP, POLII, TFII, p300, CREP и CBP. Группа изобретений обеспечивает стратификацию пациента для оценки пригодности терапии для пациента, страдающего злокачественной опухолью. 6 н. и 7 з.п. ф-лы, 3 пр., 6 ил.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение, главным образом, относится к усовершенствованному способу стратификации пациента, предпочтительно пациента со злокачественной опухолью, для оценки пригодности терапии, такой как направленная терапия, для пациента, где терапия предпочтительно направлена на каскад передачи сигнала рецепторов эстрогена (ER) и/или рецепторов прогестерона (PR) (другие подходящие каскады описаны в настоящем описании ниже). Кроме того, настоящее изобретение относится к способу прогнозирования исхода заболевания, предпочтительно злокачественной опухоли, у пациента, предпочтительно пациента со злокачественной опухолью, и к способу предсказания и/или обнаружения резистентности к терапии у пациента, предпочтительно, пациента со злокачественной опухолью. Более того, изобретение относится к новому набору и к его соответствующим применениям.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В статье "Biological determinants of endocrine resistance in breast cancer", Musgrove et al., Nature Reviews Cancer, Том 9, стр.631-643 (2009), описаны каскады передачи сигнала клеток, ассоциированные с неуспехом эндокринной/гормональной терапии, нацеленной на действие эстрогена. Описанные в этой статье способы показать, являются ли активными определенные каскады, должны быть усовершенствованы для целей улучшения диагностики и предсказания ответа на терапию в области медицины.

В статье "Progesterone receptor assembly of a transcriptional complex along with activator protein 1, signal transducer and activator of transcription 3 and ErbB-2 governs breast cancer growth and predicts response to endocrine therapy", Díaz Flaqué et al., Breast Cancer Research, Том 15, Номер 6, стр.R118 (2013), описано исследование скоординированных быстрых и неклассических транскрипционных эффектов PR, контролирующих рост рака молочной железы и резистентность к эндокринной терапии.

В статье "Activation of rapid oestrogen signalling in aggressive human breast cancers", Poulard et al., EMBO Molecular Medicine, Том 4, Номер 11, стр. 1200-1213 (2012) описано обнаружение эндогенных взаимодействий ERα/PI3K и ERα/Src в клетках опухоли молочной железы человека.

Диссертация "The Akt/mTOR Pathway and Estrogen Receptor Phosphorylations - a crosstalk with potential to predict tamoxifen resistance in breast cancer", Linköping University Medical Dissertations, No. 1379 (2013), касается изучения биомаркеров, в дополнение к существующим маркерам, для определения оптимального лечения пациентов с первичным инвазивным раком молочной железы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Современные способы анализа окрашивания основываются на окрашивании на экспрессию одного белка (не (активный) фактор транскрипции или, соответственно, комплекс факторов транскрипции) в клетке или в конкретной области злокачественной клетки, например, таком как окрашивание ER в ядре клетки, о котором известно, что он ассоциирован с активацией каскада ER и с ответом на терапию, когда используют лекарственное средство, которое нацелено на каскад ER. Однако такое окрашивание одного белка не обеспечивает доказательства активного каскада. Например в случае ER один белок также может присутствовать в ядре, когда он не находится в активном комплексе факторов транскрипции, включающем ER.

Стандартное окрашивание патологии при раке молочной железы охватывает окрашивание ER, PR и HER2. ER и PR обычно считаются положительными, если более 1% (США) или 10% (ЕС) злокачественных клеток экспрессируют ядерный ER или PR, соответственно. Это используют в качестве показателя того, что эти каскады являются активными у соответствующих пациентов. Минимальный процент положительных злокачественных клеток, требуемых для положительного результата теста, варьируется между различными центрами. Этих пациентов считают кандидатами для гормональной терапии (против каскада ER). Положительных по ER пациентов лечат гормональной терапией (в неоадъювантных, адъювантных или метастатических условиях); однако 25-50% пациентов не отвечают или становятся резистентными к лечению. Таким образом, требуются анализы для улучшения прогнозирования ответа на терапию.

Такое общепринятое окрашивание ER также используют для прогностических целей. Однако, как оказалось, в положительной по ER группе многие пациенты имеют худший прогноз, чем первоначально прогнозировалось. Это требует усовершенствованных прогностических анализов.

В положительной по ER группе пациентов, которые не отвечают на терапию против каскада ER, как первичную, так и вторичную, описано множество биохимических механизмов резистентности, которые ассоциированы с другим запускающим каскадом передачи сигнала опухоли вместо каскада ER, например каскад HER2, каскад Wnt, каскад HH (hedgehog) и т.д. (детали, касающиеся резистентности, дополнительно описаны ниже). Требуются анализы, которые указывают на каскад(ы) резистентности у положительных по ER пациентов, резистентных к гормональной терапии.

Ввиду вышесказанного, основной задачей настоящего изобретения является предоставление усовершенствованного способа стратификации пациента, предпочтительно пациента со злокачественной опухолью, в частности, пациента с раком молочной железы или раком предстательной железы, особенно положительного по ER и/или PR и отрицательного по HER2 пациента с раком молочной железы, для оценки пригодности терапии, такой как гормональная терапия, для пациента, причем терапия предпочтительно направлена против каскада передачи сигнала ER и/или PR. Другие каскады передачи сигнала, которые могут быть рассмотрены применительно к настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются ими, каскад передачи сигнала рецепторов андрогенов (AR), каскад передачи сигнала рецепторов ретиноевой кислоты (RAR), каскады VitD и каскад передачи сигнала рецепторов, активируемых пролифератором пероксисом (PPAR). Следующие задачи настоящего изобретения касаются предоставления усовершенствованных способов прогнозирования исхода заболевания, предпочтительно злокачественной опухоли, у пациента, предпочтительно пациента со злокачественной опухолью, и предсказания и/или обнаружения резистентности к терапии у пациента, предпочтительно у пациента со злокачественной опухолью, к конкретной терапии. Дополнительные задачи, лежащие в основе настоящего изобретения, станут очевидными при изучении представленного ниже описания и, в частности, прилагаемой формулы изобретения.

Основная задача настоящего изобретения достигается с помощью способа стратификации пациента, предпочтительно пациента со злокачественной опухолью, для оценки пригодности терапии, предпочтительно гормональной терапии, для пациента, причем терапия предпочтительно направлена на каскад передачи сигнала рецепторов эстрогена (ER) и/или рецепторов прогестерона (PR), включающего стадию

(i) определение состояния активации каскада передачи сигнала ER и/или PR с использованием анализа близкого лигирования для обнаружения в образце ткани, предпочтительно в образце опухолевой ткани, более предпочтительно, в биоптате пациента, присутствия по меньшей мере одного представителя семейства ER, причем указанный по меньшей мере один представитель является частью комплекса факторов транскрипции, и по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из TAF, TBP, POLII, TFII, p300, CREP1 и CBP, где по меньшей мере один белок является частью того же комплекса факторов транскрипции,

где стратификация основана на состоянии активации, определенном на стадии (i), и на основании стратификации оценивают пригодность терапии.

Предпочтительные варианты осуществления такого способа описаны в формуле изобретения и в настоящем описании ниже.

Что касается ER (см. выше), существует две различных формы ER, обычно называемых α и β, каждая из которых кодируется отдельным геном (ESR1 и ESR2, соответственно). Активированные гормоном рецепторы эстрогенов формируют димеры и, поскольку две формы коэкспрессируются во многих типах клеток, рецепторы могут образовывать гомодимеры ERα (αα) или ERβ (ββ), или гетеродимеры ERαβ (αβ). Таким образом, по меньшей мере один представитель семейства ER предпочтительно выбран из группы, состоящей из ERα, ERβ, для формирования либо ERαα (гомодимер), ERββ (гомодимер) и ERαβ (гетеродимер), либо гетеродимера с другим фактором транскрипции, например, таким как представитель семейства AP1 (Fos, Jun) или NFkappaB, или CREB, где для целей настоящего изобретения по меньшей мере один представитель предпочтительно представляет собой белок ER.

Как упоминалось выше, указанный по меньшей мере один представитель семейства ER, предпочтительно обнаруживаемый способом по настоящему изобретению, является частью комплекса факторов транскрипции. Термин "комплекс факторов транскрипции" означает комплекс, содержащий или состоящий из по меньшей мере двух факторов транскрипции или, соответственно, белков. Например, такой комплекс факторов транскрипции может состоять из одного или нескольких гомо- и/или гетеродимеров, предпочтительно мономера или димера ER, и/или одного или нескольких, предпочтительно двух или более, белков, выбранных из определенной выше группы (например, p300).

Состояние активности каскада PR может быть определено аналогично способу, описанному выше. Существует два рецептора прогестерона, PR-A и PR-B, которые активируются связыванием лиганда прогестерона, который преобразует рецепторы в активные факторы транскрипции, которые аналогичны связывающимся с ER соактиваторам, таким как CREB/p300, и связываются со специфическими элементами ответа в промоторной области генов-мишеней, с которых продуцируется мРНК.

Способ в соответствии с настоящим изобретением (как описано в настоящем описании) является особенно пригодным для стратификации пациента со злокачественной опухолью, в частности, для стратификации пациента с раком молочной железы или раком предстательной железы, особенно пациента с положительным по ER и/или PR и отрицательным по HER2 раком молочной железы. В частности, способ в соответствии с настоящим изобретением можно преимущественно использовать для оценки пригодности гормональной терапии для пациента.

Злокачественная опухоль является ведущей причиной смерти по всему миру, и в 2006 году количество смертей от нее составило 7,6 миллиона (приблизительно 13% от всех смертей). Среди них, 458000 смертей предположительно были вызваны раком молочной железы. Рак молочной железы является наиболее распространенной злокачественной опухолью у женщин по всему миру (приблизительно 16% от всех злокачественных опухолей у женщин), однако также им могут страдать мужчины, хотя и значительно реже (у мужчин диагностируется только 1 на ~100 случаев рака молочной железы). Существует несколько различных форм рака молочной железы и, таким образом, они также требуют различных форм терапии. Традиционным способом лечения рака молочной железы является хирургическое удаление (первичной) опухоли, часто в комбинации с адъювантной химиотерапией и/или лучевой терапией. Лучшее понимание механизмов заболевания привело к смене парадигмы в сторону так называемых направленных способов терапии (также описываемых как персонализированные способы терапии, персонализированная медицина или прицельная медицина), в которых клетки не уничтожаются неселективно (вызывая тяжелые побочные эффекты), но в которых специфически атакуются клетки, содержащие дефект, ответственный за заболевание.

Наиболее ярким примером такого направленного лечения является Герцептин (также называемый Трастузумабом) от Genentech/Roche. Герцептин связывается с рецептором HER2 (также называемым HER2/neu или erbb2). Сверхэкспрессия HER2 приводит к гиперактивации клеточной передачи сигнала (наиболее значительно: каскад PI3K и каскад MAPK), что в конечном итоге приводит к аберрантному росту клеток.

Другим примером является лечение рака молочной железы, при котором определенный (>1-10%; см. выше) процент злокачественных клеток экспрессирует ER и/или PR. Эти рецепторы могут активировать, соответственно, каскад передачи сигнала ER и PR. Эти случаи лечат гормональной (или эндокринной) терапией. Эти способы терапии представляют собой блокирование продукции эстрогена или конкуренцию с эстрогеном за ограниченные участки связывания ER (например, таким аналогом эстрогена является Тамоксифен).

Для первоначальной диагностики (т.е. определения того, присутствует ли злокачественная опухоль) обычно проводят окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) биоптата или тонкого среза вызывающей подозрение ткани. Ткань включает либо свежезамороженную ткань, либо, более часто, фиксированную в формалине залитую парафином (FFPE) ткань.

Если диагностирована злокачественная опухоль, необходимо провести дополнительные тесты для определения того, какой тип направленной терапии (если он существует) может быть полезным для пациента. В текущих руководствах (например, руководство National comprehensive clinical network (NCCN) по лечению рака молочной железы) гистопатологическое тестирование присутствия/сверхэкспрессии упомянутых выше молекул рецепторов (HER2, ER, PR) описано в качестве дополнения. Эти тесты обычно проводят в форме иммуногистохимического (IHC) анализа, проводимого на срезах тканей из того же образца/блока ткани, что и при окрашивании H&E для постановки диагноза, но на другом тонком срезе этого образца. В качестве альтернативы, например, для HER2-IHC (или, если результат IHC является сомнительным), часто проводят гибридизацию in situ (ISH) для измерения амплификации гена HER2.

Затем в соответствии с этими тестами пациента стратифицируют как относящегося к одному из четырех следующих классов рака молочной железы:

(1) Положительный либо по ER, либо по PR (или по обоим из них) и отрицательный по HER2 → положительный по рецепторам гормонов рак молочной железы

(2) Отрицательный как по ER, так и по PR, но положительный по HER2 → положительный по HER2 рак молочной железы

(3) Положительный либо по ER, либо по PR (либо по обоим из них) и положительный по HER2 → положительный по рецепторам гормонов и положительный по HER2 рак молочной железы

(4) Отрицательный по всем рецепторам → так называемый тройной отрицательный рак молочной железы

(примечание: если либо ER, либо PR являются положительными, тогда его можно называть положительным по рецепторам гормонов (без упоминания того, какой из ER или PR подразумевается), поскольку это имеет (в настоящее время) одинаковое значение для лечения).

Хотя настоящее изобретение и не ограничивается пациентами с раком молочной железы, оно фокусируется - в соответствии с одним аспектом изобретения - на стратификации пациентов с раком молочной железы, особенно на пациентах с раком молочной железы, относящимся к классу (1) из описанных выше классов рака молочной железы (т.е. ER/PR+ и HER2-). Класс (1) является наиболее распространенным типом при раке молочной железы.

В зависимости от того, какой маркер определяется у пациента как положительный, т.е. в зависимости от того, какому из упомянутых выше классов рака молочной железы относится пациент, предпочтительными для выбора являются различные способы лечения. Независимо от этих маркеров, необходимо решить является ли необходимым применение химиотерапии и/или лучевой терапии. На основе упомянутых выше маркеров или, соответственно, классов, может быть принято решение, можно ли/следует ли применить один из способов направленной терапии:

(1): Если пациент имеет положительные результаты теста на экспрессию ER или PR, предпочтительной для выбора терапией является эндокринное лечение. Далее, тип лечения вновь зависит от гормонального статуса пациента, в первую очередь от того, находится ли пациент в предменопаузальном или постменопаузальном состоянии.

Если выбирают медикаментозный подход, существуют следующие возможности:

(i) использование селективных модуляторов рецепторов эстрогенов (SERM), которые действуют путем блокирования связывания эстрогена с рецепторами эстрогена в ткани молочной железы (действие антагониста при наличии действия агониста в других тканях); наиболее известный пример: Тамоксифен;

(ii) использование ингибиторов ароматазы (AI), которые препятствуют продуцированию эстрогена в организме ферментом ароматазой; примерами являются: Аримидекс (анастразол), Аромазин (экземестан), Фемара (лектрозол) и Фадрозол;

(iii) использование антагонистов рецепторов эстрогенов, которые действуют, подавляя рецепторы эстрогена; пример: Фулвестрант.

(2): Пациенты, положительные по HER2, могут получать HER2-специфическое лечение, которое включает либо антитела, специфичные к рецепторам HER2 (или семейства HER2), такие как Трастузумаб и Пертузумаб, либо ингибитор тирозинкиназы (TKI), такой как Лапатиниб, или их комбинацию.

(3): Если пациент является положительным как по HER2, так и по любому из рецепторов гормонов, выбирают комбинацию способов лечения, упомянутых в (1) и (2), поскольку осуществляют нацеливание на оба условия.

(4): Тестирование всех трех рецепторов имеет отрицательные результаты; это означает, что ни один из способов направленной терапии не применим, и необходимо выбирать альтернативные подходы, такие как химиотерапия.

Хотя была показана клиническая ценность IHC, она ограничивается тем фактом, что одно лишь присутствие белка не дает указаний на активность передачи сигнала. Обычно, чтобы иметь возможность указать, осуществляет ли белок активную передачу сигнала, необходим способ обнаружения его состояния фосфорилирования или того, образует ли он комплексы с другими белками.

Соответствующие взаимодействия, таким образом, среди прочих, осуществляются агрегатами множества белков, взаимодействие которых может указывать на активацию определенного каскада (комплексы факторов транскрипции). Их близость возможно является существенной информацией для идентификации запускающего опухоль каскада и, таким образом, лечения указанной опухоли. В каноническом каскаде ER, например, ER входит в ядро в качестве димера, который может быть обнаружен с использованием PLA. После вхождения в ядро образуется комплекс факторов транскрипции, вовлекающий множество факторов (см. фиг.1), любые два из которых могут служить в качестве основы (мишеней) для анализа PLA. Одно лишь присутствие ER или, например, общего кофактора p300 в ядре может быть незначительным, в то время их тесная близость указывает на образование полностью функционального комплекса факторов транскрипции и, таким образом, на активную транскрипцию набора генов.

В дополнение к вышесказанному, анализ близкого лигирования обеспечивает несколько дополнительных преимуществ, таких как обеспечение более легкого и более надежного анализа изображений и количественного определения по сравнению с IHC/IF. В частности, анализ близкого лигирования обеспечивает отдельные сигналы (точки), можно измерять единичные молекулярные взаимодействия (вследствие усиления сигнала in situ), достигается высокая чувствительность и существует меньше проблем с фоновыми сигналами/аутофлуоресценцией (сигнал может быть легче отделен от шума (точки против "размытости")). Более того, усовершенствованный и упрощенный анализ изображений облегчает автоматизированный анализ изображений и способствует более точному количественному определению.

Анализ близкого лигирования (см. Weibrecht et al, Expert Rev. Proteomics, 7(3), стр. 401-409 (2010); "Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox" (включенная в качестве ссылки), анимация способа может быть найдена здесь: http://www.youtube.com/watch?v=KbpUU7jQTF8&) представляет собой способ, который способен выявлять сорасположение двух белковых эпитопов. В способе используются два антитела, меченных ДНК-олигонуклеотидами. Необходимо, чтобы оба олигонуклеотида формировали замкнутое кольцо из двух вторичных ДНК-олигонуклеотидов, которые добавляют к образцу после нахождения антителами их эпитопов. После формирования замкнутой петли используют амплификацию по принципу "катящегося кольца" (RCA) для получения сотен копий кольцевого зонда. Позднее комплементарный зонд, меченный флуорофором, подвергают отжигу с продуктом RCA с получением очень яркого пятна в том месте, где два белка находятся вместе.

Например, применительно к настоящему изобретению можно использовать анализ близкого лигирования Duolink от Olink S.A., Швеция. Однако, другие возможности не исключаются.

Как указано выше, ключевой проблемой при лечении злокачественной опухоли является то, что большой процент пациентов с раком молочной железы, относящийся к классу (1) (как описано выше) не реагируют на способы лечения, описанные выше (антагонист ER, SERM или AI) или становятся резистентными после некоторого периода времени, причем такая резистентность часто опосредуется другими активирующимися каскадами. Например, одним путем для ускользания клеток от гормональной зависимости при ER+ раке молочной железы является гиперактивация каскада PI3K. Иными словами, в этих клетках более не каскад ER запускает злокачественную опухоль, а ему на смену приходит каскад PI3K, и терапия должна быть нацелена на него ER. Также путем к индукции резистентности к лекарственным средствам может быть переключение с ER-альфа на гетеродимер ER-альфа/ER-бета или гомодимер ER-бета. Существуют другие механизмы резистентности, и дополнительные примеры описаны ниже, в частности, применительно к предпочтительным вариантам осуществления способов в соответствии с настоящим изобретением (см., в частности, стадии (ii)-(vi), как дополнительно описано ниже).

Более того, (одно лишь) обнаружение сверхэкспрессии рецептора ER не является доказательством того, что передача сигнала ER является ответственной за прогрессирование заболевания. В этом отношении, явным недостатком современного подхода, как известно из уровня техники, является то, что современные диагностические тесты ER не могут определить, является ли каскад ER действительно активным в злокачественных клетках, в которых обнаруживается ER. Это повышает полезность правильной классификации пациентов с желаемой специфичностью в отношении соответствующего лечения.

Описанные выше проблемы или, соответственно, недостатки, решаются способом в соответствии с настоящим изобретением (как описано в настоящем описании), который, например, позволяет точное определение активности (канонического) каскада ER и, предпочтительно, также соответствующих каскадов "ускользания" или, соответственно, "резистентности" (в частности, как дополнительно описано ниже применительно к предпочтительным вариантам осуществления способа в соответствии с настоящим изобретением).

Авторы изобретения обнаружили, что с использованием описанного в настоящем описании способа по настоящему изобретению является возможным измерение истинного состояния активации типичных каскадов, таких как канонический каскад ER, на уровне белка в клетках в образце ткани, стандартным образом используемым для гистопатологической диагностики (в противоположность стандартно используемому способу, в котором присутствие в ядре белка ER отдельно считается указывающим на активацию каскада ER).

Кроме того, с использованием способа по настоящему изобретению (как описано в настоящем описании) является возможным получение информации в пространстве и об отдельных клетках из образца ткани, в то время как подходы, описанные Musgrove et al., усредняют сигнал по всему образцу. Например, получение пространственной информации на уровне единичных клеток является необходимым для определения того, в каких клетках ткани каскад ER активирован, например, для вычисления процента клеток с активированным каскадом. Например, путем комбинирования способа по изобретению с другими окрашиваниями биомаркеров тканей, является возможной идентификация того, какие биомаркеры активны вместе в одной клетке, что может быть важным для предпочтительной для выбора терапии. Для сравнения, это не является возможным, когда активность каскада устанавливают, исходя из РНК/ДНК, выделенной из среза ткани. Такие другие биомаркеры могут представлять собой, например, мутацию ДНК или сигнальный белок или фактор транскрипции другого каскада, которые могут сообщать резистентность к гормональной терапии, если они находятся в той же клетке.

Как указано выше, пациент (со злокачественной опухолью), стратифицированный, как описано в настоящем описании, предпочтительно представляет собой пациента с раком молочной железы или раком предстательной железы и, следовательно, образец ткани для применения согласно к способу по изобретению (как описано в настоящем описании), предпочтительно происходит от пациента с раком молочной железы или раком предстательной железы. Кроме того, предпочтительным является способ по настоящему изобретению, где пациент со злокачественной опухолью является пациентом с положительным по ER и/или PR и отрицательным по HER2 раком молочной железы и, следовательно, образец ткани взят от пациента с положительным по ER и/или PR и отрицательным по HER2 раком молочной железы.

Преимущественно способ по настоящему изобретению особенно пригоден не только для определения состояния активности каскада передачи сигнала ER и/или PR, но также для оценки потенциальных механизмов резистентности к гормональной терапии. В этом отношении является предпочтительным, чтобы способ по изобретению дополнительно включал стадию определения активности одного или нескольких каскадов или, соответственно, механизмов "ускользания" или "резистентности". Предпочтительные варианты осуществления и стадии таких способов описаны ниже.

Предпочтительно, способ по настоящему изобретению дополнительно включает по меньшей мере одну, т.е. одну, несколько или все из следующих стадий:

(ii) определение состояния активации каскада передачи сигнала, который отличается от каскада передачи сигнала, оцененного на стадии (i), с использованием способа окрашивания in situ, предпочтительно анализа близкого лигирования, для обнаружения в том же или в отличающемся образце ткани пациента (со злокачественной опухолью) присутствия по меньшей мере одного представителя семейства ER и по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из c-Fos, c-Jun (AP1), SP1, CREB, фактора транскрипции GATA, семейства NFkappaB, белков c/EBP, FOXO, белков-факторов транскрипции SMAD, предпочтительно где указанный по меньшей мере один представитель семейства ER и указанный по меньшей мере один белок являются частью одного и того же комплекса факторов транскрипции,

где стратификация далее основана на состоянии активации, определенном на стадии (ii),

(iii) определение состояния фосфорилирования по меньшей мере одного представителя семейства ER в положении серина 305 в образце ткани пациента (со злокачественной опухолью),

где стратификация далее основана на состоянии фосфорилирования, определенном на стадии (iii),

(iv) определение состояния активации одного или нескольких каскадов передачи сигнала, который отличается/отличаются от каскада передачи сигнала, оцененного на стадии (i), и выбран/выбраны из группы, состоящей из каскада PI3K, каскада Wnt, каскада HH, NFkappaB, каскада Notch, каскадов TGFbeta, FGF, VEGF, EMT, других каскадов ядерных рецепторов, таких как каскады AR, RAR, PPAR, глюкокортикоидов, VitD, с использованием анализа окрашивания in situ, предпочтительно анализа близкого лигирования, где используют тот же или отличающийся образец ткани пациента (со злокачественной опухолью),

где стратификация далее основана на состоянии активации, определенном на стадии (iv),

(v) определение состояния активации каскада PI3K с использованием анализа окрашивания in situ, предпочтительно анализа близкого лигирования, для обнаружения в том же или в отличающемся образце ткани пациента (со злокачественной опухолью) активного белка PKB/Akt путем количественного определения состояния фосфорилирования PBK/Akt, предпочтительно в положении треонина 308 и/или серина 473,

где стратификация далее основана на состоянии активации, определенном на стадии (v), и

(vi) применение анализа окрашивания in situ, предпочтительно анализа близкого лигирования, для обнаружения в том же или в отличающемся образце ткани пациента (со злокачественной опухолью) присутствия по меньшей мере одного представителя семейства ER и по меньшей мере одного компонента, предпочтительно фактора транскрипции, где ожидается, что по меньшей мере один компонент или, соответственно, фактор транскрипции присутствует в любом половинном участке ERE (элемент ответа на эстроген) или в любом не являющемся ERE участке и/или где по меньшей мере один компонент или, соответственно, фактор транскрипции выбран из группы, состоящей из AP1 (c-Fos, c-Jun), связывающего элемент ответа на cAMP белка/CREB, фактора транскрипции GATA, и белков-факторов транскрипции NFkappaB, SP1, C/EBP, FOXO, SMAD,

где стратификация далее основана на обнаружении на стадии (vi).

В зависимости от предполагаемого назначения способа согласно изобретению, как описано в настоящем описании, и/или, соответственно, в зависимости от типа пациента (со злокачественной опухолью), типа терапии, пригодность которой подлежит оценке, и/или каскада передачи сигнала, активация которого подлежит определению, стадию (iv) (как описано выше) также можно проводить вместо или, соответственно, в качестве стадии "(i)" (как описано выше).

Стадия (ii) основана на информации, что комплекс эстроген-ER может не только связываться прямо с отвечающими на эстроген элементами (ERE) в промоторных областях генов, но также он может выступать как кофактор в не являющихся ERE участках, взаимодействующих с другими ДНК-связывающими элементами, такими как Jun или c-Fos. (В этом отношении также см. стадию (vi), которая в основном относится к факторам транскрипции, предположительно присутствующим в любом не являющемся ERE участке или любом половинном участке ERE, например AP1.)

Другим возможным механизмом резистентности к гормональной терапии (например к лечению тамоксифеном), на который направлена описанная выше стадия (iii), является фосфорилирование серина в положении 305 ER (область между лигандом и ДНК-связывающим доменом). Определение состояния фосфорилирования ER предпочтительно проводят с использованием PLA. В этом отношении доступны специфичные к ER антитела, которые можно использовать, например антитело против ERαS305-P (доступное от Millipore/Upstate).

В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления изобретения способ по изобретению, кроме того, включает стадию определения состояния активации каскада PI3K, каскада Wnt и/или каскада HH (см. стадию (iv) выше). Эти каскады также могут влиять на потенциальную резистентность или, соответственно, могут указывать на такую резистентность. Для этих каскадов также можно определять специфические факторы транскрипции и предпочтительно можно их обнаруживать способом PLA. Каскад PI3K представляет особый интерес. Этот каскад предпочтительно тестируют в дополнение к каскаду, вовлекающему комплекс факторов транскрипции, включающий ER. Таким образом, способ по изобретению предпочтительно дополнительно включает стадию (v), как описано выше. Затем результат теста определяют положительный по pAkt или отрицательный по pAkt. Альтернативно, например, также можно определять факторы транскрипции каскада PI3K из класса FOXO.

Особенно предпочтительным является способ в соответствии с настоящим изобретением, где способ сфокусирован на определении состояния активации каскада ER посредством обнаружения комплекса факторов транскрипции, включающий ER и, кроме того, определения состояния активации каскада PI3K. Таким образом, способ по изобретению предпочтительно включает следующие стадии:

(i) определение состояния активации каскада передачи сигнала ER и/или PR с использованием анализа близкого лигирования для обнаружения в образце ткани пациента со злокачественной опухолью присутствия по меньшей мере одного представителя семейства ER, предпочтительно димера ER, причем указанный по меньшей мере один представитель является частью комплекса факторов транскрипции, и по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из TAF, TBP, POLII, TFII, p300, CREP1 и CBP, предпочтительно p300, где по меньшей мере один белок является частью того же комплекса факторов транскрипции, и

(v) определение состояния активации каскада PI3K с использованием анализа окрашивания in situ, предпочтительно анализа близкого лигирования, для определения в том же образце ткани пациента со злокачественной опухолью активного белка PKB/Akt посредством измерения состояния фосфорилирования PBK/Akt,

где стратификация основана на состоянии активации, определенном на стадии (i), и состоянии активации, определенном на стадии (v),

предпочтительно где (как упоминалось выше) пациент со злокачественной опухолью предпочтительно представляет собой пациента с раком молочной железы, особенно пациента с положительным по ER и/или PR и отрицательным по HER2 раком молочной железы и, соответственно, образец ткани предпочтительно взят от пациента с раком молочной железы, особенно от пациента с положительным по ER и/или PR и отрицательным по HER2 раком молочной железы.

Термин "образец ткани", как используют в рамках изобретения, предпочтительно относится к биоптату пациента (например, такому как биоптат, полученный посредством/из цитологии, биопсии жидкости, клеток крови, резецированной опухолевой ткани или тонкоигольной пункционной биопсии), более предпочтительно, образцу опухолевой ткани пациента, в частности, пациента со злокачественной опухолью. В случае, когда образец опухолевой ткани используют применительно к способу по настоящему изобретению, такой образец опухолевой ткани предпочтительно выбирают из группы, состоящей из свежезамороженного (FF) образца опухолевой ткани и фиксированного в формалине залитого парафином (FFPE) образца опухолевой ткани, и/или из группы, состоящей из тонкого среза резецированной опухоли, тонкого среза биоптата, уловленных циркулирующих опухолевых клеток (CTC) и тонкоигольных аспиратов. На этих образцах ткани способ согласно изобретению можно выполнять без труда и эффективно.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к способу прогнозирования исхода заболевания, предпочтительно злокачественной опухоли, у пациента, предпочтительно пациента со злокачественной опухолью, где способ включает определение состояния активации каскада передачи сигнала ER и/или PR с использованием анализа близкого лигирования, где способ включает по меньшей мере стадию (i), как определено выше, где прогноз основан на определенном состоянии активации.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу предсказания и/или обнаружения резистентности пациента, предпочтительно пациента со злокачественной опухолью, к терапии, такой как гормональная терапия, причем терапия предпочтительно направлена на каскад передачи сигнала ER и/или PR, где способ включает определение состояния активации каскада передачи сигнала ER и/или PR с использованием анализа близкого лигирования, где способ включает по меньшей мере стадию (i), как определено выше, где предсказание и/или обнаружение основаны на определенном состоянии активации.

Такие способы также могут включать одну, несколько или все из описанных выше дополнительных стадий (ii)-(vi). Особенно предпочтительно, такие способы, кроме того, включают одну или несколько из следующих стадий:

(ii) определение состояния активации каскада передачи сигнала, который отличается от каскада передачи сигнала, оцененного на стадии (i), с использованием анализа окрашивания in situ, предпочтительно анализа близкого лигирования, для обнаружения в том же или отличающемся образце ткани пациента (со злокачественной опухолью) присутствия по меньшей мере одного представителя семейства ER и по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из c-Fos, c-Jun (AP1), SP1, CREB, фактора транскрипции GATA, семейства NFkappaB, белков c/EBP, FOXO, белков-факторов транскрипции SMAD, предпочтительно где указанный по меньшей мере один представитель семейства ER и указанный по меньшей мере один белок являются частью одного и того же комплекса факторов транскрипции,

где прогноз, соответственно, предсказание и/или обнаружение далее основаны на состоянии активации, определенном на стадии (ii),

(iii) определение состояния фосфорилирования по меньшей мере одного представителя семейства ER на серине 305 в образце ткани пациента (со злокачественной опухолью),

где прогноз, соответственно, предсказание и/или обнаружение далее основаны на состоянии фосфорилирования, определенном на стадии (iii),

(iv) определение состояния активации одного или нескольких каскадов передачи сигнала, который отличается/отличаются от каскада передачи сигнала, оцененного на стадии (i) и выбран из группы, состоящей из каскада PI3K, каскада Wnt, каскада HH, NFkappaB, каскада Notch, каскадов TGF-бета, FGF, VEGF, EMT, других каскадов ядерных рецепторов, таких как каскады AR, RAR, PPAR, глюкокортикоидов, VitD, с использованием анализа окрашивания in situ, предпочтительно анализа близкого лигирования, где используют тот же или отличающийся образец ткани пациента (со злокачественной опухолью),

где прогноз, соответственно, предсказание и/или обнаружение далее основаны на состоянии активации, определенном на стадии (iv),

(v) определение состояния активации каскада PI3K с использованием анализа окрашивания in situ, предпочтительно анализа близкого лигирования, для обнаружения в том же или в отличающемся образце ткани пациента (со злокачественной опухолью) активного белка PKB/Akt посредством измерения состояния фосфорилирования PBK/Akt, предпочтительно на треонине 308 и/или серине 473, и

где прогноз, соответственно, предсказание и/или обнаружение далее основаны на состоянии активации, определенном на стадии (v),

(vi) применение анализа окрашивания in situ, предпочтительно анализа близкого лигирования, для обнаружения в том же или в отличающемся образце ткани пациента (со злокачественной опухолью) присутствия по меньшей мере одного представителя семейства ER и по меньшей мере одного компонента, предпочтительно фактора транскрипции, где ожидается, что по меньшей мере один компонент или, соответственно, фактор транскрипции будет присутствовать в любом половинном участке ERE (элемент ответа на эстроген) или в любом не являющемся ERE участке и/или где по меньшей мере один компонент или, соответственно, фактор транскрипции выбран из группы, состоящей из AP1 (c-Fos, c-Jun), связывающего элемент ответа на cAMP белка/CREB, фактора транскрипции GATA, и белков-факторов транскрипции NFkappaB, SP1, C/EBP, FOXO, SMAD,

где прогноз, соответственно, предсказание и/или обнаружение далее основаны на состоянии активации, определенном на стадии (vi).

Как правило, предпочтительные варианты осуществления таких способов станут очевидными ввиду описанных выше стадий и вариантов осуществления применительно к способу стратификации пациента (со злокачественной опухолью).

С использованием способов по настоящему изобретению, особенно способов согласно предпочтительным вариантам осуществления, описанным в настоящем описании, является возможным надежное предсказание вероятности того, что у пациентов (со злокачественной опухолью) будет развиваться резистентность к определенному терапевтическому средству, или определение, если такая резистентностью уже существует.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к набору, содержащему следующие компоненты:

- первое антитело, направленное против эпитопа представителя семейства ER, причем указанный представитель является частью комплекса факторов транскрипции, и

- второе антитело, направленное против эпитопа белка, выбранного из группы, состоящей из TAF, TBP, POLII, TFII, p300, CREP1 и CBP, где белок является частью того же комплекса факторов транскрипции, что и упомянутый выше представитель семейства ER.

Предпочтительно, такой набор используют в способе в соответствии с настоящим изобретением, как описано в настоящем описании, предпочтительно в способе как описано в настоящем описании в качестве предпочтительного. Настоящее изобретение, таким образом, также относится к специализированному применению такого набора в способе в соответствии с настоящим изобретением и, соответственно, к такому набору для применения в способе в соответствии с настоящим изобретением.

В контексте настоящего изобретения также описано применение первого и второго антител и, если этого применимо, одного или нескольких дополнительных необязательных компонентов (как соответственно описано выше или ниже) для изготовления набора в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно для применения в способе в соответствии с настоящим изобретением.

Предпочтительно, либо посредством двух вторичных антител, связанных со специфическими олигонуклеотидными последовательностями, либо посредством прямого связывания олигонуклеотидных последовательностей с первичными антителами, разрабатывают анализ PLA и выполняют в соответствии с протоколом.

Безусловно, в зависимости от предполагаемого применения такого набора можно использовать дополнительные/другие антитела, направленные против дополнительных/других эпитопов дополнительных/других белков (в этом отношении, см., в частности, описанные выше стадии (ii)-(vi), где упоминаются дополнительные мишени для антител).

Предпочтительно, (A) каждое из первого и второго антитела описанного выше набора метят ДНК-олигонуклеотидом, или (B) набор, кроме того, содержит третье и четвертое антитело, направленные против первого и второго антител, соответственно, и третье и четвертое антитело являются меченными ДНК-олигонуклеотидом.

Набор в соответствии с изобретением также может содержать дополнительные компоненты, такие как формирующие кольцо олигонуклеотиды, ферменты, такие как лигаза и полимераза, позволяющие лигирование и амплификацию по типу "катящегося кольца", соответственно. Более того, к такому набору могут быть добавлены промывочные буферы и зонды для светлопольной микроскопии или флуоресцентные зонды в форме комплементарных олигонуклеотидов. Также к такому набору могут быть добавлены предметные стекла микроскопа, покровные стекла и заливочная среда. Любой буфер в таком наборе может содержать DAPI или любой другой ядерный краситель для визуализации клеточного ядра. В другом варианте осуществления такого набора может быть добавлено (первичное) антитело, которое содержит как флуоресцентный зонд, так и олигонуклеотидный зонд. Такое антитело может флюоресцировать само по себе или может быть в то же время партнером при применении в PLA.

С использованием такого набора способы по изобретению можно выполнять безопасным и воспроизводимым образом.

Применительно к настоящему изобретению можно использовать автоматизированное оборудование для выполнения способов согласно изобретению, т.е. (a) для проведения анализов окрашивания, включающих любые требуемые стадии инкубации и промывания, (b) для получения изображений путем освещения образца и хранения изображений в цифровом файле, или (c) для обработки и анализа цифровых изображений окрашенных образцов.

Применение такого автоматизированного оборудования повышает достоверность и воспроизводимость результатов, позволяет оцифровывание результатов окрашивания препарата образца, так что анализ с окрашиванием может интерпретироваться автоматически с использованием компьютерного алгоритма. Это также ускоряет обработку большего количества образцов.

Для предпочтительной для выбора (направленной) терапии является важной идентификация того, является ли множество каскадов передачи сигнала в образце опухолевой ткани пациента со злокачественной опухолью активными в одной и той же клетке злокачественной опухоли или в отличающихся клетках, соответствующих множеству клонов злокачественных клеток, или, например, один каскад в злокачественной клетке, а другой каскад в ассоциированной с опухолью фибробластной или иммунной клетке (например, макрофаг) или другом типе клеток, присутствующем в опухолевой ткани. Это также может иметь значение для прогноза, например, независимый положительный по Wnt клон в ткани может указывать на склонность к метастазированию.

Современные разработки в области синтетических вызывающих летальность терапевтических средств: означают комбинацию лекарственных средств, которые нацелены на различные каскады передачи сигнала (или другие соответствующие мишени) в злокачественных клетках, эти способы терапии являются летальными только для клетки, только если в одной и той же клетке присутствуют обе мишени, и не являются летальными, если одна мишень присутствует в одном клоне злокачественных клеток, а другая мишень присутствует в другом клоне злокачественных клеток или другом типа клеток в ткани.

Описанные выше аспекты и другие аспекты настоящего изобретения станут более понятными из и освещенными с помощью вариантов осуществления, описанных далее и, в частности, прилагаемой формуле изобретения. Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения определены в зависимых пунктах формулы изобретения. Должно быть понятно, что способы согласно п.п.1, 8 и 9 формулы изобретения, набор по п.10 формулы изобретения и применение набора по п.п.11-13, имеют сходные и/или идентичные предпочтительные варианты осуществления или, соответственно, стадии и признаки, как определено в зависимых пунктах формулы изобретения и как определено в настоящем описании.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На следующих чертежах:

На фиг.1 схематично показаны возможные каскады ER. В частности, на фиг. показано, что ER сам по себе может быть частью многокомпонентного комплекса факторов транскрипции, где все из белков этого комплекса являются потенциальными мишенями для способов по изобретению, как описано в настоящем описании. Также очевидно, что через PI3K может образовываться другой комплекс факторов транскрипции, который вовлекает NFkappaB.

На фиг.2 иллюстративно показана блок-схема, демонстрирующая выбор подходящей терапии в зависимости от результатов предпочтительного способа согласно изобретению.

На фиг.3-6 показаны результаты анализов IHC и PLA против ER и p300 (в этом отношении см. пример 3 ниже).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Как описано выше, способы по настоящему изобретению позволяют достоверное определение активности определенных каскадов на уровнях белков. В частности, с использованием анализа близкого лигирования может быть определено, в каких клетках образца ткани каскад является активным. В этом отношении также является возможным получение данных о проценте злокачественных клеток в образце ткани (как описано выше), предпочтительно в срезе ткани, который имеет соответствующий активированный каскад. Более того, способы, описанные в настоящем описании, позволяют предсказывать, будут ли определенные (гормональные) способы терапии эффективными, разовьется ли, предположительно или вероятно, резистентность к (гормональному) лечению, так чтобы можно было выбрать подходящую терапию в зависимости от того, для какого каскада обнаружено наличие активности.

Является предпочтительным, чтобы способы по изобретению (как описано выше) выполнялись на образцах тканей in vitro, предпочтительно на срезах тканей.

Способы согласно изобретению можно преимущественно комбинировать с другими обычно используемыми способами стратификации. Такие дополнительные тесты для стратификации можно проводить на том же образце ткани или на другом образце ткани, полученном от пациента со злокачественной опухолью. Более того, такую дополнительную стратификацию можно проводить перед тестированием в соответствии с изобретением, в то же время или позднее. Например, такое дополнительное тестирование можно проводить с использованием IHC-окрашивания.

Что касается антител, которые можно использовать применительно к анализу(ам) близкого лигирования, используемому в способе по изобретению (как описано в настоящем описании), следует отметить, что можно использовать различные антитела, которые содержат различные метки в различных цветовых каналах, так что в одном образце можно параллельно проводить тестирование более чем одного каскада. Более того, может быть пригодным мечение определенных антител, например антител против ER, метками в различных цветовых каналах, так чтобы, например, IHC-окрашивание и PLA можно было проводить одними и теми же антителами.

Как описано выше, особенно предпочтительные способы - согласно одному аспекту настоящего изобретения - включают следующую стадию:

(i) определение состояния активации каскада передачи сигнала ER и/или PR с использованием анализа близкого лигирования для обнаружения в образце ткани пациента (со злокачественной опухолью) присутствия по меньшей мере одного представителя семейства ER, причем указанный по меньшей мере один представитель является частью комплекса факторов транскрипции, и по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из TAF, TBP, POLII, TFII, p300, CREP1 и CBP, где по меньшей мере один белок является частью того же комплекса факторов транскрипции.

Следующие предпочтительные варианты осуществления и признаки способов в соответствии с настоящим изобретением описаны выше. Иллюстративные особенно предпочтительные способы по изобретению - согласно одному аспекту настоящего изобретения - включают следующие стадии:

(i) определение состояния активации каскада передачи сигнала ER и/или PR с использованием анализа близкого лигирования для обнаружения в образце ткани пациента (со злокачественной опухолью) присутствия по меньшей мере одного представителя семейства ER, предпочтительно димера ER, причем указанный по меньшей мере один представитель является частью комплекса факторов транскрипции, и по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из TAF, TBP, POLII, TFII, p300, CREP1 и CBP, предпочтительно p300, где по меньшей мере один белок является частью того же комплекса факторов транскрипции, и

(v) определение состояния активации каскада PI3K с использованием анализа близкого лигирования для обнаружения в том же образце ткани пациента (со злокачественной опухолью) активного белка PKB/Akt посредством измерения состояния фосфорилирования PBK/Akt,

предпочтительно где пациент представляет собой пациента со злокачественной опухолью, более предпочтительно пациента с раком молочной железы, предпочтительно пациента с положительным по ER и/или PR и отрицательным по HER2 раком молочной железы и, соответственно, образец ткани представляет собой образец опухолевой ткани от пациента с раком молочной железы, предпочтительно от пациента с положительным по ER и/или PR и отрицательным по HER2 раком молочной железы.

C использованием таких способов в основном возможно четыре различных результата теста с четырьмя различными вариантами лечения в адъювантных условиях (во всех случаях решение о дополнительной химиотерапии и лучевой терапии принимается отдельно):

1. ER, содержащий комплекс факторов транскрипции (стадия (i)): положительный pAkt (стадия (v)): отрицательный → выбор лечения: "эндокринное лечение".

2. ER, содержащий комплекс факторов транскрипции (стадия (i)): положительный pAkt (стадия (v)): положительный → выбор лечения: "эндокринное лечение" и (потенциально новые) ингибиторы каскада PI3K.

3. ER, содержащий комплекс факторов транскрипции (стадия (i)): отрицательный pAkt (стадия (v)): отрицательный → без эндокринного лечения, без лекарственных средств против каскада PI3K (потенциально за исключением ингибиторов каскада PI3K ниже pAkt, таких как ингибиторы TORC1 и/или TORC2).

4. Содержащий ER комплекс факторов транскрипции (стадия (i)): отрицательный pAkt (стадия (v)): положительный → (потенциально новые) ингибиторы каскада PI3K.

Следует отметить, что в объем настоящего изобретения входит анализ активности двух, трех, более или всех из упомянутых в настоящем описании каскадов (в этом отношении см., в частности, стадии (ii)-(vi), как описано выше), предпочтительно с использованием одного и того же образца ткани. Это позволяет усовершенствованный выбор подходящего лечения для соответствующего пациента (со злокачественной опухолью).

Например, в зависимости от исхода тестирований, проведенных на основе описанных в настоящем описании способов, могут быть выбраны подходящие терапевтические средства для (гормонального) лечения и/или, например, подходящие ингибиторы каскада PI3K, из одобренных в настоящее время лекарственных средств (например, одобренных FDA, CFDA, EMA и т.д.) или из лекарственных средств в клинических испытаниях (см., например, фиг.2 для лекарственных средств, направленных на каскад PI3K) или будущих лекарственных средств, еще не известных в обществе.

Как описано выше, на фиг.1 схематично показаны возможные каскады ER. В частности, на фиг. показано, что ER сам по себе может быть частью многокомпонентного комплекса факторов транскрипции, где все из белков этого комплекса являются потенциальными мишенями для способов по изобретению, как описано в настоящем описании. На фиг.1 ссылочные позиции имеют следующее значение:

1	Эстроген
2	Рецептор эстрогена
3	Факторы роста
4	Экспрессия гена
5	Антиапоптотическое действие
6	Расширение сосудов
7	Димеризация
8	Ядро

Как описано выше, на фиг.2 иллюстративно показана блок-схема, иллюстрирующая выбор подходящей терапии в зависимости от результатов предпочтительного способа согласно изобретению. На фиг.2 ссылочные позиции имеют следующее значение:

1	Антитела
3	Конкурентные ингибиторы ATP
5	Конкурентные ингибиторы ATP
7	Конкурентные ингибиторы ATP
9	Конкурентные и аллостерические ингибиторы ATP
11	Конкурентные и опосредуемые FKBP12 ингибиторы ATP
51	Возможное положение(я) вмешательства/способа действия следующих лекарственных средств (общие Pi3K): BKM120 (Novartis) XL-147 (Exelixis) PX-866 (Oncothyreon) GDC-0941 (Genentech) CH51327909 (Chugai Pharma)
53	Возможное положение(я) вмешательства/способа действия следующих лекарственных средств (специфичные к P110δ): CAL-101 (Calistoga)
55	Возможное положение(я) вмешательства/способа действия следующих лекарственных средств (специфичные к P110α): BYL719 (Novartis) GDC-0032 (Genentech) INK-1117 (Intellikine)
71	Возможное положение(я) вмешательства/способа действия следующих лекарственных средств (PI3K/mTOR): PKI-587 (Pfizer) BEZ235 (Novartis) BGT226 (Novartis) PF-4691502 (Pfizer) GDC-0980 (Pfizer) XL-765 (Exelixis) SF1126 (Sernafor) GSK1059615 (GSK)
73	Возможное положение(я) вмешательства/способа действия следующих лекарственных средств (TORC1/2): INK-128 (Intellikine) OSI-027 (Wyeth/Pfitzer) AZD-8055 (Astrazeneca)
91	Возможное положение(я) вмешательства/способа действия следующих лекарственных средств (Akt): AZD5363 (Astrazeneca) GDC-0068 (Genentech) GSK690693 (GSK) VQD002 (Vloquest)
111	Возможное положение(я) вмешательства/способа действия следующих лекарственных средств (TORC1): Эверолимус/RAD001 (Novartis) Темсиролимус/CCI-779 (Wyeth/Pfitzer) Ридафоролимус/AP-23575 (Merck/Ariad)

Как описано выше, настоящее изобретение можно осуществлять с использованием автоматического оборудования для выполнения способов согласно изобретению, т.е. (a) для стратификации пациента, предпочтительно пациента со злокачественной опухолью, для оценки пригодности терапии для пациента, (b) для прогноза исхода заболевания, предпочтительно злокачественной опухоли, у пациента, предпочтительно пациента со злокачественной опухолью, или (c) для предсказания и/или обнаружения резистентности пациента, предпочтительно пациента со злокачественной опухолью, к (гормональной) терапии, как соответственно описано выше.

Предпочтительно, способы, таким образом, выполняют так, чтобы считываемыми данными была флуоресценция.

Как правило, тесты, описанные в настоящем описании в отношении способов по настоящему изобретению, можно выполнять вручную, однако также можно использовать автоматическое оборудование, например, такое как эталонная марка Ventana (Roche), тем самым повышая воспроизводимость.

ПРИМЕРЫ

Пример 1:

Непрямой анализ PLA для определения статуса активации каскада передачи сигнала ER в образцах злокачественной клеточной линии, осажденных на субстрат центрифугированием:

Используют два антитела, индуцированных в различных видах (например, мышь и кролик), например, антитело мыши против эпитопа на комплексе эстроген-димер ER (моноклональное антитело мыши против рецептора эстрогена α, клон 1D5, Dako/каталожный номер #M7047) и антитело кролика против p300 (mAb мыши против p300 человека, клон NM-11, Millipore/каталожный номер #NA46-100UG или mAb мыши против p300 CT человека, клон RW 128, Millipore/каталожный номер #05-257).

Протокол:

Депарафинизация: 3×10 мин ксилол, 5 мин 100% EtOH, кратковременно 100% EtOH и 70% EtOH, водопроводная вода	40 мин
Извлечение антигена (оптимальная обработка будет устанавливаться для каждого нового антитела): 20-45 мин 95°C, pH6 или pH9, охлаждение до к.т., 10-20 мин	45 мин
Промывание 1-2x в PBS
Блокирование блокирующим раствором из набора PLA: 1 капля на 1 см2, инкубация в течение 30 мин, 37°C, с увлажнением	30 мин
Капельное добавление блокирующего раствора (не промывать)
Инкубация с 2 немеченными первичными антителами из другого вида (например, мыши и кролика), разбавленного в 0,1% BSA/PBS, в течение 60 мин, к.т.	60 мин
Промывание 2×5 мин в промывочном буфере A	10 мин
Инкубация с 2 зондами PLA: например PLUS-меченное антитело против антител мыши и MINUS-меченное антитело против антител кролика в соотношении 1:5 в разбавителе для антител (AD), в течение 1 ч, 37°C, в темноте, с увлажнением	60 мин
Промывание 2×5 мин в промывочном буфере A (=10 мМ Tris/150 мМ NaCl/0,05% Tween20)	10 мин
Инкубация со смесью для лигирования 1:5 в MQ и 1:40 лигазой в течение 30 мин, 37°C, в темноте, с увлажнением	30 мин
Промывание 2×2 мин в промывочном буфере A	4 мин
Инкубация со смесью для амплификации 1:5 в MQ и 1:80 полимеразой в течение 100 мин, 37°C, в темноте, с увлажнением (также сюда включен флуоресцентный зонд)	100 мин
Промывание 2×10 мин в 1x промывочном буфере B (=200 мМ Tris/100 мМ NaCl)	20 мин
Промывание в течение 1 мин в 0,01× промывочном буфере B (=2 мМ Tris/1 мМ NaCl)	1 мин
Оставление предметного стекла для высыхания на воздухе при к.т. в темноте	10 мин
Заливка заливочной средой Duolink II, ожидание по меньшей мере 15 мин перед визуализацией	15 мин
Анализ изображений. (Количество точек PLA на клетку или на компартмент клетки подсчитывают либо вручную, либо с помощью программного обеспечения.)

Пример 2:

Прямой анализ PLA для обнаружения состояния фосфорилирования (= состояние активации) Akt (для проведения в дополнение к анализу согласно примеру 1):

Используют два антитела (могут быть из одного вида: например антитело мыши против Akt1 (F-8L, Santa Cruz Biotech) и другое антитело мыши против фосфо-Akt (18F3.H11, Abcam, ab105731))

Протокол:

Депарафинизация: 3×10 мин ксилол, 5 мин 100% EtOH, кратковременно 100% EtOH и 70% EtOH, водопроводная вода	40
Извлечение антигена (оптимальная обработка будет устанавливаться для каждого нового антитела): 20-45 мин 95°C, pH6 или pH9, охлаждение до к.т., 10-20 мин	45
Промывание 1-2x в PBS
Блокирование блокирующим раствором из набора PLA: 1 капля на 1 см2, инкубация в течение 30 мин, 37°C, с увлажнением	30
Капельное добавление блокирующего раствора (не промывать)
Инкубация с 2 первичными антителами (могут быть из одного и того же или из различных видов), конъюгированными с 2 зондами PLA (олигонуклеотиды PLUS и MINUS) в буфере PBS/0,1% BSA/1:20 реагент для анализа, в течение 1 ч, к.т., в темноте, с увлажнением	60
Промывание 2×5 мин в промывочном буфере A (=10 мМ Tris/150 мМ NaCl/0,05% Tween20)	10
Инкубация со смесью для лигирования 1:5 в MQ и 1:40 лигазой в течение 30 мин, 37°C, в темноте, с увлажнением	30
Промывание 2×2 мин в промывочном буфере A	4
Инкубация со смесью для амплификации 1:5 в MQ и 1:80 полимеразой в течение 100 мин, 37°C, в темноте, с увлажнением (также сюда включен флуоресцентный зонд)	100
Промывание 2×10 мин в 1× промывочном буфере B (=200 мМ Tris/100 мМ NaCl)	20

Пример 3:

3.1 IHC-анализы для ER и p300 в клеточных линиях как ER+ (MCF7), так и ER- (SKBR3):

IHC-анализы для ER и p300 сначала проводили в клеточных линиях как ER+ (MCF7), так и ER- (SKBR3).

Анализы отчетливо показали, что как ER, так и p300 присутствуют в ядре клеток MCF7 в различных концентрациях. В частности, в исходных цветных изображениях, полученных в анализе IHC-окрашивания, ряд клеток окрашивался зеленоватым цветом, что указывает на присутствие ER, ряд клеток окрашивался красноватым цветом, что указывает на присутствие p300, и ряд клеток окрашивался желтоватым цветом, что указывает на объединенный сигнал (см. фиг.3, на которой показано изображение в оттенках серого, которое основано на первоначальном цветом изображении, полученном в анализе окрашивания IHC; ссылочные позиции "ER", "p300", и "ER+p300" иллюстративно указывают на клетки как на ER, p300 или комбинированные). Отличия в цвете от первоначальных изображений (на фиг.3 сводится к различиям в яркости) указывают на то, что экспрессия и/или присутствие как ER, так и p300 широко варьируются среди клеток.

В клетках SKBR3, напротив, можно было обнаружить только p300. В действительности, клетки SKBR3 не демонстрируют никакого сигнала в канале ER, сохраняя ядра окрашенными красноватым цветом антителом против p300 (см. фиг.4, на которой показано изображение в оттенках серого, которое основано на первоначальном цветном изображении, полученном в анализе окрашивания IHC; клетки, видимые на этом изображении, окрашены красноватым цветом на первоначальных цветных изображениях, что указывает на присутствие только p300).

3.2 PLA против ER и p300 в клеточных линиях как ER+ (MCF7), так и ER- (SKBR3):

PLA против ER в комбинации с p300 проводили на клеточных линиях как ER+ (MCF7), так и ER- (SKBR3).

Результаты отчетливо показали положения ядер клеток, где оба фактора присутствуют в одном и том же комплексе. В частности, на первоначальных цветных изображениях, полученных в результате PLA с окрашиванием, высокие количества активных комплексов факторов транскрипции указаны для клеток MCF7 высоким количеством окрашенных красноватым цветом точек (см фиг.5, на которой показано изображение в оттенках серого, которое основано на первоначальном цветном изображении, полученном в результате PLA с окрашиванием для клеток MCF7; яркие пятна окрашены красноватым цветом на первоначальных изображениях, что указывает на активные комплексы факторов транскрипции). Как и ожидалось из анализа IHC, существует некоторое варьирование среди клеток. Как также ожидалось, клетки SKBR3 практически не демонстрируют никаких активных комплексов факторов транскрипции (см. фиг.6, на которой показано изображение в оттенках серого, которое основано на первоначальном цветном изображении, полученном в результате PLA с окрашиванием для клеток SKBR3).

Сходные данные получены при проведении PLA против ER и CREB с кофакторами (данные не представлены).

Хотя изобретение проиллюстрировано и дополнительно описано на чертежах и предшествующем описании, такие иллюстрации и описание следуют считать иллюстративными или типовыми, но они являются не ограничивающими; изобретение не ограничивается описанными вариантами осуществления.

Другие вариации описанных вариантов осуществления могут быть понятны и могут быть осуществлены специалистами в данной области при применении на практике заявленного изобретения, из изучения чертежей, описания и прилагаемой формулы изобретения.

В формуле изобретения слово "содержащий" не исключает других элементов или стадий, и форма единственного числа не исключает множественности. Один лишь факт, что способы тестирования приведены во взаимно различающихся зависимых пунктах формулы изобретения, не указывает на то, что комбинация этих способов не может использоваться для достижения преимущества.

Claims (36)

1. Способ стратификации пациента для оценки пригодности терапии для пациента, страдающего положительной по ER и/или PR и отрицательной по HER2 злокачественной опухолью, причем терапия направлена против каскада передачи сигнала, включающий следующую стадию:

i) определение состояния активации каскада передачи сигнала ER и/или PR с использованием анализа близкого лигирования для обнаружения в образце ткани пациента присутствия по меньшей мере одного представителя семейства ER и/или PR, причем указанный по меньшей мере один представитель является частью комплекса факторов транскрипции, и по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из TAF, TBP, POLII, TFII, p300, CREP и CBP, где по меньшей мере один белок является частью того же комплекса факторов транскрипции,

где стратификация основана на состоянии активации, определенном на стадии (i), и на основании стратификации оценивают пригодность терапии,

где каскад передачи сигнала стадии (i) определяют как являющийся активным, если по меньшей мере один представитель семейства ER и/или PR расположен в ядре вблизи по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из TAFs, TBP, POLII, TFII, p300, CREB и CBP, где, если сигнальный путь стадии (i) определяют как являющийся активным, пациента стратифицируют как подходящего для эндокринного лечения.

2. Способ по п.1, где по меньшей мере один представитель семейства ER представляет собой димер ER.

3. Способ по п.1, дополнительно включающий следующую стадию:

(ii) определение состояния активации каскада передачи сигнала, который отличается от каскада передачи сигнала, оцененного на стадии (i), с использованием способа окрашивания in situ для обнаружения в том же или в отличающемся образце ткани пациента присутствия по меньшей мере одного представителя семейства ER и по меньшей мере одного белка, выбранного из группы, состоящей из c-Fos, c-Jun (AP1), SP1, CREB, фактора транскрипции GATA, семейства NFkappaB, белков c/EBP, FOXO, белков-факторов транскрипции SMAD,

где стратификация далее основана на состоянии активации, определенном на стадии (ii).

4. Способ по п.1, дополнительно включающий следующую стадию:

(iii) определение состояния фосфорилирования по меньшей мере одного представителя семейства ER в положении серина 305 в образце ткани пациента,

где стратификация далее основана на состоянии фосфорилирования, определенном на стадии (iii).

5. Способ по п.1, дополнительно включающий следующую стадию:

(iv) определение состояния активации одного или нескольких каскадов передачи сигнала, который отличается/отличаются от каскада передачи сигнала, оцененного на стадии (i), и выбран/выбраны из группы, состоящей из каскада PI3K, каскада Wnt, каскада hedgehog (HH), NFkappaB, каскада Notch, каскадов TGFbeta, FGF, VEGF, EMT, других каскадов ядерных рецепторов, таких как каскады AR, RAR, PPAR, глюкокортикоидов, VitD, и каскадов факторов роста, таких как инсулин-GF и EGF, с использованием анализа окрашивания in situ, где используют тот же или отличающийся образец ткани пациента,

где стратификация далее основана на состоянии активации, определенном на стадии (iv).

6. Способ по п.1, дополнительно включающий следующую стадию:

(v) определение состояния активации каскада PI3K с использованием анализа окрашивания in situ для обнаружения в том же или в отличающемся образце ткани пациента активного белка PKB/Akt путем количественного определения состояния фосфорилирования PBK/Akt,

где стратификация далее основана на состоянии активации, определенном на стадии (v).

7. Способ по п.6, в котором

если сигнальный путь стадии (i) определяют как являющийся активным, а сигнальный путь стадии (v) определяют как являющийся неактивным, пациента стратифицируют как подходящего для эндокринного лечения,

если сигнальный путь стадии (i) определяют как являющийся активным и сигнальный путь стадии (v) определяют как являющийся активным, пациента стратифицируют как подходящего для эндокринного лечения и ингибиторов пути PI3K,

если сигнальный путь стадии (i) определяют как являющийся неактивным и сигнальный путь стадии (v) определяют как являющийся неактивным, пациента стратифицируют как не подходящего для эндокринного лечения и не подходящего для лекарственных средств, воздействующих на путь PI3K, за исключением ингибиторов PI3K ниже по ходу от pAkt, и

если сигнальный путь стадии (i) определяют как являющийся неактивным, а сигнальный путь стадии (v) определяют как являющийся активным, пациента стратифицируют как подходящего для ингибиторов пути PI3K.

8. Способ по п.1, дополнительно включающий следующую стадию:

(vi) применение анализа окрашивания in situ для обнаружения в том же или в отличающемся образце ткани пациента присутствия по меньшей мере одного представителя семейства ER и по меньшей мере одного компонента, который, как ожидается, присутствует в любом половинном участке ERE (элемент ответа на эстроген) или в любом не являющемся ERE участке, и/или где по меньшей мере один компонент выбран из группы, состоящей из AP1, связывающего элемент ответа на cAMP белка/CREB, фактора транскрипции GATA, и белков-факторов транскрипции NFkappaB, SP1, C/EBP, FOXO, SMAD,

где стратификация далее основана на обнаружении на стадии (vi).

9. Способ прогнозирования исхода заболевания у пациента, причем способ включает выполнение способа, подробно описанного выше в любом из пп.1-8, где прогноз основан на определенном состоянии активации.

10. Способ предсказания и/или обнаружения резистентности пациента к терапии, причем способ включает выполнение способа, подробно описанного выше в любом из пп.1-8, где предсказание и/или обнаружение основаны на определенном состоянии активации.

11. Применение набора в способе по п.1, причем указанный набор содержит следующие компоненты:

- первое антитело, направленное против эпитопа представителя семейства ER и/или PR, причем указанный представитель является частью комплекса факторов транскрипции, и

- второе антитело, направленное против эпитопа белка, выбранного из группы, состоящей из TAF, TBP, POLII, TFII, p300, CREP и CBP, где указанный белок является частью того же комплекса факторов транскрипции, что и упомянутый выше представитель семейства ER и/или PR.

12. Применение набора в способе по п.9, причем указанный набор содержит следующие компоненты:

- первое антитело, направленное против эпитопа представителя семейства ER и/или PR, причем указанный представитель является частью комплекса факторов транскрипции, и

- второе антитело, направленное против эпитопа белка, выбранного из группы, состоящей из TAF, TBP, POLII, TFII, p300, CREP и CBP, где указанный белок является частью того же комплекса факторов транскрипции, что и упомянутый выше представитель семейства ER и/или PR.

13. Применение набора в способе по п.10, причем указанный набор содержит следующие компоненты:

- первое антитело, направленное против эпитопа представителя семейства ER и/или PR, причем указанный представитель является частью комплекса факторов транскрипции, и

- второе антитело, направленное против эпитопа белка, выбранного из группы, состоящей из TAF, TBP, POLII, TFII, p300, CREP и CBP, где указанный белок является частью того же комплекса факторов транскрипции, что и упомянутый выше представитель семейства ER и/или PR.

Images