CN105891175B - 检测血小板α7nAChR活性的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

检测血小板α7nAChR活性的方法及其应用。检测血小板α7nAChR阳离子通道的Ca²⁺内流和检测α7nAChR对血小板黏附和聚集的作用。通过与α7nAChR非活化状态相比，选择性活化α7nAChR能导致血小板的Ca²⁺内流增加，诱导血小板的黏附率和聚集率增加，以评价血小板的α7nAChR活性。

Description

检测血小板α7nAChR活性的方法及其应用

技术领域

本发明属于医学生物技术领域，具体涉及一种检测血小板α7胆碱能受体(α7nAChR)活性的方法及其应用。

背景技术

血小板(blood platelet)是哺乳动物血液中的有形成分之一，是从骨髓成熟的巨核细胞胞质裂解脱落下来的小块胞质。血小板具有特定的形态结构和生化组成，在血液中有较恒定的数量(人的血小板数为每立方毫米10～30万)。血小板只存在于哺乳动物血液中。没有细胞核结构，即没有染色体。血小板寿命约7～14天，每天约更新总量的1/10-20，衰老的血小板大多在脾脏中被清除。血小板的主要功能是参与凝血和止血过程。

血小板功能测定主要有血小板黏附、血小板聚集和释放功能的测定。一定量血液与一定表面积的异物接触后，即有相当数量的血小板粘附于异物表面，测定表面接触前后血小板数之差，可得出占血小板总数的百分率即血小板黏附率。聚集功能是指血小板与血小板之间的黏附，显示活化的血小板相互作用成团的特征，是血小板参与止血和血栓形成过程的重要因素之一。此外，二磷酸腺苷(ADP)、肾上腺素、凝血酶和胶原等都是血小板的致聚剂。不同的致聚剂引起的聚集过程表现有所不同。如ADP可直接引起血小板聚集，而聚集的血小板释放出ADP可以再次引起新的血小板聚集。从而可以出现两个聚集波。在富血小板血浆或全血中加入诱导剂连续搅拌能诱发血小板聚集。因此，聚集过程有两相：I相——血管壁损伤部位血小板黏附，通过损伤的组织或红细胞释放出ADP所致。特点是聚集发生迅速、可逆即聚集后的血小板又自行解聚；Ⅱ相——聚集是由血小板本身释放的ADP诱导聚集的缓慢过程，且不可逆。胶原本身不能直接引起血小板聚集，只能在诱导血小板释放ADP后引起血小板聚集。不同激动剂引起血小板活化的信号传递机制并不完全相同，但最终均可导致血小板胞质内钙离子(Ca²⁺)水平的改变。因此,Ca²⁺是血小板发挥正常生理功能的重要第二信使。α7亚型乙酰胆碱受体(α7nAChR)是一个配体门控的Ca²⁺通道受体。我们已确定血小板表达α7nAChR，但是α7nAChR活化是否影响血小板的Ca²⁺内流、血小板的活化、粘附和聚集功能仍然不清楚。

在中枢神经细胞，β-淀粉肽(Aβ)由淀粉样前体蛋白(APP)经β-分泌酶和γ-分泌酶裂解产生的含39-42个氨基酸的多肽，主要有Aβ_1-40和Aβ_1-42两种单体形式。脑内的Aβ水平升高，但是外周血Aβ不增加，甚至显著低于对照组。其关键因素是可溶性Aβ不易穿过血脑屏障才能进人外周血液。Aβ_1-42/1-40是否影响血小板的α7nAChR功能，血小板活化，血小板粘附和聚集功能迄今没有报道。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种高灵敏度和高特异性检测血小板α7nAChR活性的方法及其应用。

技术方案：检测血小板α7nAChR活性的方法，检测血小板α7nAChR阳离子通道的Ca²⁺内流和检测α7nAChR对血小板黏附和聚集的作用，通过与α7nAChR非活化状态相比，选择性活化α7nAChR导致血小板的Ca²⁺内流增加或血小板的黏附和聚集能力增强以反映血小板的α7nAChR活性。

检测血小板α7nAChR的Ca²⁺内流的具体步骤为：1)采用钙荧光指示剂孵育血小板，所述该荧光指示剂为单波长激发指示剂：Quin-1、Quin-2、Quin-3、Fluo-3；双波长激发指示剂：fura1、fura2、fura3；或，双波长发射指示剂：indo1；2)采用双波长显微荧光分光光度计、流式细胞仪、双波长荧光分光光度计等方法检测血小板内的游离Ca ²⁺水平；3)然后添加α7nAChR激动剂再次检测血小板的游离Ca ²⁺水平，所述激动剂为乙酰胆碱或DMXB；4)计算出α7nAChR活化后血小板Ca²⁺增加的幅值，从而反映血小板α7nAChR的活性。

检测α7nAChR对血小板黏附促进作用的方法为：1)采用玻璃瓶黏附法、玻璃珠柱法或玻璃滤器法检测血小板的黏附率；2)检测添加α7nAChR激动剂后血小板黏附率的改变，所述激动剂为乙酰胆碱或DMXB；3)计算出α7nAChR激动剂添加后血小板黏附率增加的幅值，从而反映血小板α7nAChR的活性。

检测α7nAChR对血小板聚集促进作用的具体步骤为：1)通过采用比浊法血小板聚集试验、电阻抗法全血血小板聚集试验、循环血小板聚集体检测、体外自发性血小板聚集检测或血小板功能分析仪-100检测血小板聚集率；2)检测血小板致聚剂二磷酸腺苷ADP、肾上腺素、凝血酶或胶原添加后血小板的聚集率；3)然后检测血小板致聚剂和α7nAChR激动剂联合添加时血小板的聚集率；4)计算出α7nAChR激动剂添加后血小板聚集率的增加，从而反映血小板α7nAChR的活性。

检测血小板α7nAChR的Ca²⁺内流的具体步骤为：Ca²⁺荧光探针负载，取富血小板血浆悬液进行离心，1000r/min，每次10分钟×3次，吸出上清液后吹打混匀；取50μL的细胞悬液，加入17μL的Fluo-2钙探针，放入36.5℃的水浴箱中温育40分钟；荧光双波长分光光度计测定[Ca²⁺]_i，Fura-2的荧光强度，测定用日立F-3000型荧光双波长分光光度计进行；测定条件为：激发光光栅5nm，发射光光栅10nm，测定温度为37±1℃；取1×10⁶个细胞负载Fura-2/AM的细胞悬液，加入到测量用荧光杯中，在上述测定条件下，以激发光波长300～450nm，发射光波长500nm进行扫描，检查荧光峰值达最高时的激发波长，判断细胞负载情况；以峰值在340nm左右处为最佳负载状态；测定最大荧光比值R_max和最小荧光比值R_min，加破膜剂Triton X-100，终浓度为0.1wt.％，使Fura-2和Ca²⁺结合达饱和时，测得的F₃₄₀/F₃₈₀为R_max；加入高浓度的Ca²⁺螯合剂EGTA，终浓度为5mM，pH8.5，以充分螯合Ca²⁺，使Fura-2游离，测得的F₃₄₀/F₃₈₀为R_min；[Ca²⁺]_i的计算，根据经典公式计算细胞内游离[Ca²⁺]_i的浓度，Fura-2/AM检测的[Ca²⁺]_i计算公式为：[Ca²⁺]_i＝K_d[(R-R_min)/(R_max-R)](F_min/F_max)，其中，K_d为Fura-2与Ca^{2 +}反应的解离常数，为224nM；R为各测定点F₃₄₀/F₃₈₀荧光强度比值；R_max、R_min分别为上述测定的最大和最小荧光比值；F_min、F_max分别代表Ca²⁺为零及饱和时，在380nm激发光下测得的Fura-2荧光强度F₃₈₀；添加α7nAChR激动剂乙酰胆碱0-10mM或DMXB 0-50μM，α7nAChR拮抗剂α-BTX 10μM或MLA 10μM吹打均匀，孵育1-10分钟，进行血小板内游离Ca离子浓度测定。

血小板黏附率的检测步骤为：吸出抗凝血1.5mL注入长颈玻璃瓶中插到底，再从中取血计算旋转前血小板数，两三次求平均数，作为旋转前血小板数。长颈瓶安插血小板黏附仪后，旋转15min，每分钟转3周，再从长颈瓶中取血，按照常规方法血小板计数两三次，求平均值为旋转后血小板数；血小板黏附率＝(旋转前血小板数-旋转后血小板数)/旋转前血小板数。

血小板聚集率的检测步骤为：用3.8％枸橼酸盐抗凝管取静脉血2mL，血:抗凝剂体积比为1:9，混匀后置入室温低速800r/min离心8分钟后，小心取出上层血浆即为富血小板血浆PRP；剩余血样再以3000r/min的速度离心10分钟，上层较为透明的液体即为贫血小板血浆PPP；取PRP 0.4mL和PPP 0.4mL分别加入血小板聚集仪专用两联样本杯内，以二磷酸腺苷ADP为血小板聚集诱导剂，ADP最终浓度为0.5μM；通过PRP与PPP透光率的比较，计算血小板聚集率，以反映血小板聚集功能，在2小时完成标本检测，血小板聚集功能以加诱导剂5分钟血小板聚集率表示。

上述检测血小板α7nAChR活性的方法，采用β-淀粉肽1-42片段(Aβ_1-42)抑制血小板α7nAChR的Ca²⁺内流，降低血小板的聚集能力。

上述方法在筛选阿尔茨海默病诊断药物中的应用。

有益效果：(1)本发明提供了一种检测血小板α7nAChR活性的方法，通过检测血小板α7nAChR的Ca²⁺内流和α7nAChR对血小板黏附和聚集作用可以反映血小板的α7nAChR功能活性；(2)Aβ_1-42能抑制血小板α7nAChR的Ca²⁺内流，可以降低血小板聚集。

附图说明

图1：人和小鼠的血小板表达α7nAChR的蛋白检测图。

图2：血小板α7nAChR的Ca²⁺内流检测结果图。图2-A为选择性α7nAChR激动剂ACh能剂量依赖地增加血小板内游离Ca²⁺([Ca²⁺]i)水平；图2-B为选择性α7nAChR激动剂DMXB也能显著地增加血小板[Ca²⁺]i水平；图2-C是α7nAChR拮抗剂能减少α7nAChR激动剂增加血小板的[Ca²⁺]i水平。

图3：α7nAChR活化促进血小板黏附和聚集的检测结果图。图3-A为α7nAChR激动剂增加血小板的黏附率；图3-B为α7nAChR激动剂提高血小板的聚集率。

图4：Aβ_1-42能抑制血小板α7nAChR的Ca²⁺内流和α7nAChR促进血小板聚集的检测结果图。图4-A为Aβ_1-42抑制α7nAChR激动剂增加血小板[Ca²⁺]i水平；图4-B为Aβ_1-42抑制α7nAChR激动剂增加血小板的聚集率。

图5：APPswe/PS1dE9(APP/PS1)转基因AD小鼠脑的Aβ_1-42水平增加，外周血中血小板的Aβ_1-42水平也增加的检测结果图。图5-A为8-10月龄APP/PS1小鼠海马和皮层的Aβ_1-42水平增加；图5-B显示APP/PS1小鼠血浆中Aβ_1-42水平没有改变；图5-C为8-10月龄APP/PS1小鼠血小板的Aβ_1-42水平增加；图5-D提示APP/PS1小鼠血小板的α7nAChR表达量没有改变。

图6：在APP/PS1小鼠，血小板α7nAChR的Ca²⁺内流减少和α7nAChR促进血小板聚集作用降低的检测结果图。图6-A显示在8-10月龄APP/PS1小鼠，α7nAChR激动剂增加血小板[Ca^{2 +}]i的作用降低；图6-B是8-10月龄APP/PS1小鼠的α7nAChR激动剂增加血小板聚集率的作用减弱。

具体实施方式

以下结合附图和实施例进一步说明(1)检测血小板α7nAChR的Ca²⁺内流和α7nAChR调节血小板黏附和聚集可以作为评价血小板α7nAChR功能活性的指标；(2)体外实验显示Aβ_1-42对血小板的α7nAChR活性有抑制作用；(3)在体实验发现中枢神经系统Aβ_1-42/1-40浓度增加能引起外周血中血小板的α7nAChR活性降低。

实施例1 人和小鼠的血小板表达α7nAChR

<实验主要材料>

ICR小鼠(雄性和雌性各10只)，体重25～30克，购自江苏省实验动物中心。用3.8％枸橼酸盐抗凝管抽取人肘静脉或小鼠的内眦取血2mL(血:抗凝剂体积比为1:9)，混匀后置入室温低速800r/min离心8分钟后，小心取出上层血浆即为富血小板血浆(PRP)。剩余血样再以3000r/min的速度离心10分钟，上层较为透明的液体即为贫血小板血浆(PPP)。

<实验操作>

蛋白免疫印记(Western Blot)检测。WB检测标本准备：血浆中加入RIPA蛋白裂解液(主要包括磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、PMSF等成分)，超声匀浆，冰中静置30分钟，4℃离心(12000rpm)15分钟，取上清。用BCA法测蛋白浓度，标本分装，在-70℃保存。小鼠海马组织置于离心管中，加入RIPA蛋白裂解液，用超声粉碎仪进行裂解后，4℃离心(12000rpm)15分钟，取上清。BCA法测定蛋白浓度，上清液置于-80℃保存。将检测样本与上样缓冲液混合，100℃加热5分钟，混匀离心后取上清加入制作好的SDS-PAGE胶，恒压100V进行蛋白电泳。而后将胶转至PVDF膜、封闭，之后分别加小鼠单克隆抗α7nAChR一抗，4℃孵育过夜。用Blot-buffer洗5分钟×3次，再与HRP标记的二抗室温反应2小时。Blot-buffer洗5分钟×3次，ECL化学发光显色，化学发光成像系统曝光条带、拍照、存档。之后将PVDF膜用抗体洗脱液洗5分钟×3次，重新封闭后分别加actin一抗及相应二抗，再次显色曝光。用图像分析软件ImageJ(NIH Image，美国)进行灰度值分析，计算目的蛋白的灰度值与actin的比值，确定α7nAChR的相对含量。

<实验结果>

Western Blot检测结果显示，人和小鼠的血小板都表达α7nAChR蛋白(图-1)。为了确定检测的条带是α7nAChR特异性的，(1)用脑的海马组织作为阳性对照(b)；(2)采用贫血小板血浆作为阴性对照(c)；(3)采用血清标本作为阴性对照(d)。“*”表示P<0.05(与海马组织相比)；“##表示”P<0.01(与富血小板血浆相比)。

实施例2 血小板α7nAChR的Ca²⁺内流。

<实验主要材料>

同实施例1。

选择性α7nAChR激动剂乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)，α7nAChR拮抗剂α-BGT(α-bungarotoxin)、MLA(methyl-lycaconitine)从Sigma公司购买，选择性α7nAChR激动剂3-(2,4-dimethoxybenzylidene)-anabaseine(DMXB，又称GTS-21)由日本大昭制药公司提供。

<实验操作>

血小板内游离Ca²⁺([Ca²⁺]i)浓度测定：Ca²⁺荧光探针负载，取富血小板血浆悬液进行离心，1000r/min，每次10分钟×3次，吸出上清液后吹打混匀。取50μL的细胞悬液，加入17μL的Fluo-2钙探针，放入36.5℃的水浴箱中温育40分钟。荧光双波长分光光度计测定[Ca^{2 +}]_i，Fura-2的荧光强度测定用日立F-3000型荧光双波长分光光度计进行。测定条件为：激发光光栅5nm，发射光光栅10nm，测定温度为(37±1)℃。取一定量(1×10⁶个细胞)负载Fura-2/AM的细胞悬液，加入到测量用荧光杯中，在上述测定条件下，以激发光波长300～450nm，发射光波长500nm进行扫描，检查荧光峰值达最高时的激发波长，判断细胞负载情况。以峰值在340nm左右处为最佳负载状态。

测定最大荧光比值(R_max)和最小荧光比值(R_min)。加破膜剂Triton X-100(终浓度为0.1wt.％)，使Fura-2和Ca²⁺结合达饱和时，测得的F₃₄₀/F₃₈₀为R_max。加入高浓度的Ca²⁺螯合剂EGTA(终浓度为5mM,pH8.5)，以充分螯合Ca²⁺，使Fura-2游离，测得的F₃₄₀/F₃₈₀为R_min。[Ca^{2 +}]_i的计算，根据经典公式计算细胞内游离Ca²⁺([Ca²⁺]_i)的浓度。Fura-2/AM检测的[Ca²⁺]_i计算公式为：[Ca²⁺]_i＝K_d[(R-R_min)/(R_max-R)](F_min/F_max)。其中，K_d为Fura-2与Ca²⁺反应的解离常数，为224nM；R为各测定点F₃₄₀/F₃₈₀荧光强度比值；R_max、R_min分别为上述测定的最大和最小荧光比值。F_min、F_max分别代表Ca²⁺为零及饱和时，在380nm激发光下测得的Fura-2荧光强度(F₃₈₀)。实际计算由日立F-3000钙测定系统钙定量软件自动求出。

添加α7nAChR激动剂乙酰胆碱(ACh：0-10mM)或DMXB(0-50μM)，α7nAChR拮抗剂α-BTX(10μM)或MLA(10μM)吹打均匀，孵育1-10分钟，进行血小板内游离Ca离子浓度测定。在图2中A和B显示的结果是用没有加α7nAChR激动剂标本的结果(％)进行了标准化。在图2中C显示的结果是用单纯加ACh(5mM)或DMXB(5μM)标本的结果(％)进行了所有数据的标准化。

<实验结果>

当细胞外液Ca²⁺浓度是2mM时，选择性α7nAChR激动剂ACh能剂量依赖地增加血小板内游离Ca²⁺([Ca²⁺]i)水平(图2-A)。ACh增加血小板[Ca²⁺]i的最大剂量是5mM。**/*表示P<0.01和P<0.05。同样，另一个选择性α7nAChR激动剂DMXB也能显著地增加血小板[Ca²⁺]i水平(图2-B)。其作用的最大剂量为10μM。**表示P<0.01。

在没有α7nAChR激动剂处理的标本，虽然α7nAChR拮抗剂α-BTX(10μM)或MLA(10μM)添加能减少血小板的[Ca²⁺]i水平(图2-C)，但是没有统计学差异。在α7nAChR激动剂处理的标本，α7nAChR拮抗剂α-BTX或MLA处理能完全阻断ACh(5mM)诱导的血小板[Ca²⁺]i增加。**表示P<0.01(与细胞外液Ca²⁺浓度＝0时相比)；##表示P<0.01(与没有加ACh时相比)；++表示P<0.01(与加ACh时相比)。这些结果提示，α7nAChR活化能增加血小板的[Ca²⁺]i水平。

实施例3 α7nAChR活化能促进血小板的黏附和聚集。

<实验主要材料>

同实施例1和实施例2。

<实验操作>

血小板黏附实验方法：吸出抗凝血1.5mL注入长颈玻璃瓶中插到底，再从中取血计算旋转前血小板数，两三次求平均数，作为旋转前血小板数。长颈瓶安插血小板黏附仪后，旋转15min，每分钟转3周，再从长颈瓶中取血，按照常规方法血小板计数两三次，求平均值为旋转后血小板数。(旋转前血小板数-旋转后血小板数)/旋转前血小板数＝血小板黏附率。正常值：20-40％。

血小板聚集率采用比浊法测定：用3.8wt.％枸橼酸盐抗凝管取静脉血2mL(血:抗凝剂体积比为1:9)，混匀后置入室温低速800r/min离心8分钟后，小心取出上层血浆即为富血小板血浆(PRP)。剩余血样再以3000r/min的速度离心10分钟，上层较为透明的液体即为贫血小板血浆(PPP)。取PRP(0.4mL)和PPP(0.4mL)分别加入血小板聚集仪(北京普利生公司LBY—NJ4型)专用两联样本杯内，以二磷酸腺苷(ADP)为血小板聚集诱导剂(ADP最终浓度为0.5μM)。通过PRP与PPP透光率的比较，计算血小板聚集率，以反映血小板聚集功能。在2小时完成标本检测。血小板聚集功能以加诱导剂5分钟血小板聚集率表示。正常值为20-40％。在图中显示的结果是用单纯加乙酰胆碱ACh(5mM)或DMXB(5μM)标本的结果(％)进行了所有数据的标准化。

<实验结果>

血小板的黏附率(图3-A)和二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集率(图3-B)。α7nAChR拮抗剂α-BTX(10μM)或MLA(10μM)处理不能减少血小板的黏附率和聚集率。与对照组水平相比，选择性α7nAChR激动剂ACh(5mM)或DMXB(5μM)添加能显著地增加血小板的黏附率和聚集率。此外，α7nAChR拮抗剂α-BGT或MLA预处理能阻止ACh和DMXB促进血小板的黏附和聚集。图3-A和图3-B中，**/*表示P<0.01和P<0.05(与没有加ACh或DMXB的对照组相比)；##表示P<0.01(与加ACh时相比)；++表示P<0.01(与加DMXB时相比)。这些结果提示，α7nAChR活化能促进血小板的黏附和聚集。

实施例4 Aβ_1-42能抑制血小板的α7nAChR活性。

<实验主要材料>

同实施例1-3。

Aβ_1-42从Sigma公司购买。将Aβ_1-42肽段1mg溶于0.33mL无菌双蒸水中，浓度为3mmol/L，封口膜封好后，置于37℃水浴箱中孵育4天，使其成为聚集态。使用前用生理盐水稀释到终浓度。

<实验操作>

血小板内Ca²⁺测定：同实施例2。

血小板聚集率测定：同实施例3。

在图中显示的结果是用不加α7nAChR激动剂标本的结果(％)进行了所有数据的标准化。

<实验结果>

与对照组相比，选择性α7nAChR激动剂ACh(1mM)或DMXB(5μM)能增加血小板[Ca²⁺]i水平(图4-A)和血小板的聚集率(图4-B)。与α7nAChR拮抗剂MLA的作用相同，Aβ_1-42(50μM)处理血小板5-10分钟能明显抑制ACh和DMXB增加血小板[Ca²⁺]i水平和血小板的聚集率。但是，Aβ_1-42(50M)处理不影响α7nAChR不活化状态的血小板[Ca²⁺]i和血小板聚集率。图4-A和图4-B中，**/*表示P<0.01和P<0.05(与没有加ACh或DMXB的对照组相比)；##/#表示P<0.01和P<0.05(与加ACh相比)；++/+表示P<0.01和P<0.05(与加DMXB相比)。这些结果提示，Aβ_1-42能抑制血小板的α7nAChR活性。

实施例5 APP/PS1小鼠脑和血小板的Aβ_1-42浓度增加，而外周血没有改变。

<实验主要材料>

APPswe/PS1dE9双转基因型小鼠(以下简称，APP/PS1小鼠)从Jackson实验室(BarHarbor,ME,USA)购得，运用Jackson实验室推荐的PCR方法进行基因型鉴定。

<实验操作>

小鼠用水合氯醛(100mg/kg)腹腔麻醉后快速断头取脑，镜下分离两侧海马局部组织。小鼠海马和皮层组织置于离心管中，加入RIPA蛋白裂解液，超声粉碎仪裂解后低温高速离心15分钟(12000rpm，4℃)，取上清液，BCA法测定蛋白浓度，上清液置于-80℃保存。

Aβ_1-42蛋白采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)测定：试剂盒由比利时Innogenetics公司提供。用包被缓冲液稀释特异性抗体至最适浓度(1～10μg/mL)，每凹孔加0.3mL，4℃过夜。移去包被液，用洗涤缓冲液(含0.05wt.％吐温-20)洗3次，每次5分钟。加入0.2mL用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37℃作用2小时。移去包被液，用洗涤缓冲液(含0.05wt.％吐温-20)洗3次，每次5分钟。加入0.2mL用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液，37℃作用2小时。用洗涤缓冲液洗3次。加入0.2mL底物溶液于每个凹孔(OPD或OT)，室温作用30分钟(另作一空白对照，0.4mL底物加0.1mL终止剂)。加终止剂(2M H₂SO₄或2M柠檬酸0.05mL)。用酶标比色计测定(OPD用492nm)OD值。根据标准管浓度及吸光度建立标准曲线，并根据各孔的吸光度计算Aβ_1-42蛋白浓度。在图中显示的结果是用野生型小鼠标本的结果(％)进行了所有数据的标准化。

<实验结果>

与野生型小鼠相比，8-10月龄APP/PS1小鼠海马和皮层的Aβ_1-42浓度增加近3倍(图5-A)。与野生型小鼠相比，8-10月龄APP/PS1小鼠血浆的Aβ_1-42浓度没有改变(图5-B)，但血小板的Aβ_1-42浓度增加18％(图5-C)。与野生型小鼠相比，8-10月龄APP/PS1小鼠血小板的α7nAChR表达水平也没有明显差异(图5-D)。图5-A和图5-C中，**/*表示P<0.01和P<0.05(与野生型小鼠相比)。这些结果提示，外周血的Aβ_1-42浓度没有增加，但是血小板流入脑内可以与Aβ_1-42结合。

实施例6 APP/PS1小鼠血小板的α7nAChR活性降低。

<实验主要材料>

同实施例5。

<实验操作>

细胞内Ca²⁺测定：同实施例2。

血小板聚集率测定：同实施例3。

在图中显示的结果是用α7nAChR激动剂处理野生型小鼠标本的结果(％)进行了所有数据的标准化。

<实验结果>

以10月龄野生型小鼠α7nAChR激动剂DMXB(5μM)增加血小板[Ca²⁺]i水平(图6-A)和血小板聚集率作为100％。在8-10月龄APP/PS1小鼠，DMXB增加血小板[Ca²⁺]i水平和血小板聚集率的作用明显降低。同样，α7nAChR拮抗剂MLA处理10月龄野生型小鼠也能抑制DMXB增加血小板[Ca²⁺]i水平和血小板聚集率(图6-B)。结合实施例4和实施例5的结果进一步提示，Aβ_1-42浓度增加可以引起血小板α7nAChR活性减弱。图6-A和图6-B中，**/*表示P<0.01和P<0.05(与野生型小鼠相比)。这些结果提示，检测血小板α7nAChR活性可以间接地反映脑脊液的Aβ_1-42水平。

Claims (5)

1.检测血小板α7nAChR活性的方法，其特征在于检测α7nAChR对血小板黏附和聚集的作用，通过与α7nAChR非活化状态相比，利用激动剂乙酰胆碱或DMXB选择性活化α7nAChR导致血小板的黏附和聚集能力增强以反映血小板的α7nAChR活性。

2.根据权利要求1所述检测血小板α7nAChR活性的方法，其特征在于检测α7nAChR对血小板黏附促进作用的方法为：1）采用玻璃瓶黏附法、玻璃珠柱法或玻璃滤器法检测血小板的黏附率；2）检测添加α7nAChR激动剂后血小板黏附率的改变，所述激动剂为乙酰胆碱或DMXB；3）计算出α7nAChR激动剂添加后血小板黏附率增加的幅值，从而反映血小板α7nAChR的活性。

3.根据权利要求2所述检测血小板α7nAChR活性的方法，其特征在于检测α7nAChR对血小板聚集促进作用的具体步骤为： 1）通过采用比浊法血小板聚集试验、电阻抗法全血血小板聚集试验、循环血小板聚集体检测、体外自发性血小板聚集检测或血小板功能分析仪-100检测血小板聚集率；2）检测血小板致聚剂二磷酸腺苷ADP、肾上腺素、凝血酶或胶原添加后血小板的聚集率；3）然后检测血小板致聚剂和α7nAChR激动剂联合添加时血小板的聚集率；所述激动剂为乙酰胆碱或DMXB ；4）计算出α7nAChR激动剂添加后血小板聚集率的增加，从而反映血小板α7nAChR的活性。

4.根据权利要求2所述检测血小板α7nAChR活性的方法，其特征在于血小板黏附率的检测步骤为：吸出抗凝血1.5mL注入长颈玻璃瓶中插到底，再从中取血获取旋转前血小板数，进行两或三次计数，求平均数，作为旋转前血小板数；长颈瓶安插血小板黏附仪后，旋转15min，每分钟转3周，再从长颈瓶中取血，按照常规方法血小板计数两或三次，求平均值为旋转后血小板数；血小板黏附率= (旋转前血小板数-旋转后血小板数)/旋转前血小板数。

5.根据权利要求3所述检测血小板α7nAChR活性的方法，其特征在于血小板聚集率的检测步骤为：用3.8％枸橼酸盐抗凝管取静脉血2mL，血:抗凝剂体积比为1:9，混匀后置入室温低速800r/min离心8分钟后，小心取出上层血浆即为富血小板血浆PRP；剩余血样再以3000r/min的速度离心10 分钟，上层较为透明的液体即为贫血小板血浆 PPP；取PRP 0.4mL和PPP 0.4mL分别加入血小板聚集仪专用两联样本杯内，以二磷酸腺苷ADP为血小板聚集诱导剂，ADP最终浓度为0.5μM；通过PRP与PPP透光率的比较，计算血小板聚集率，以反映血小板聚集功能，在2小时完成标本检测，血小板聚集功能以加诱导剂5分钟血小板聚集率表示。