CN105884740B - 一种检测次氯酸的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测次氯酸的荧光探针及其制备方法和应用，该荧光探针结构式如下：其中，结构式中的R为H或羟基。本发明的荧光探针对次氯酸检测的灵敏度高，对组织损伤小且穿透力强，能清晰地用于活体成像。本发明的荧光探针制备方法是，将占吨酮或占吨酮衍生物与劳森试剂反应得到目标产物，即为检测次氯酸的荧光探针。本发明合成方法简单，适于工业化生产。

Description

一种检测次氯酸的荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种荧光探针，特别涉及一种灵敏度高、响应迅速、比率型的双光子荧光探针，其合成方法及其在检测细胞内次氯酸的应用，属于检测技术领域。

背景技术

作为生物体内最为重要的一种活性氧，次氯酸是一种不稳定的弱酸，在水溶液中能被电离成次氯酸根和氢离子，在日常生活中，常被用作漂白剂、消毒剂和除臭剂等。

在生物体细胞内，次氯酸通常是在髓过氧化物酶(MPO)的催化作用下由过氧化氢和氯离子反应产生的，能够与蛋白、DNA、RNA、脂肪酸和胆固醇等多种生物分子发生反应，参与众多生理、病理过程，对于维持细胞内氧化还原平衡状态起着至关重要的作用。次氯酸在先天性宿主防御及炎症反应中有重要意义，在生理状态下发挥抗微生物效应，起到保护机体的作用。研究表明，次氯酸还是天然的适应性免疫佐剂。然而，在特定的条件下，假如MPO催化产生的次氯酸过量，超过局部抗氧化剂的防御反应时，将导致氧化应激和氧化性组织损伤。已证实，过量次氯酸引起的氧化应激与一系列的疾病有关，如：关节炎，白血病，肾炎，小血管炎，肿瘤及动脉粥样硬化等。因此，能够及时有效地检测生物体内及环境中次氯酸浓度的变化是一项重大课题，具有重要的意义。

目前，次氯酸的检测技术有荧光法、电化学法、比色法、生物及化学发光法等。荧光法由于其灵敏度高、选择性好、原位检测等优点受到了越来越多的关注。

近年来，用于检测次氯酸的几种代表性的荧光探针有：在BODIPY的母体结构中引入甲硫基合成的荧光探针(T.I.Kim,S.Park,Y.Choi et al,A BODIPY-based probe forthe selective detection of hypochlorous acid in living cells[J].Chemistry-AnAsian Journal,2011,6,1358-1361)，但是该探针与次氯酸的反应时间很长；以氢化荧光素及罗丹明为母体的荧光探针(Y.Zhou,J.Y.Li,K.H.Chu et al.Fluorescence turn-ondetection of hypochlorous acid via HClO-promoted dihydrofluorescein-etheroxidation and its application in vivo[J].Chemical Communications,2012,48,4677-4679)，该探针不是比率型。另外，文献报道的一种PET效应的荧光探针(H.Zhu,J.L.Fan,J.Y.Wang,H.Y.Mu et al.An“Enhanced PET”-based Fluorescent Probe withUltrasensitivity for imaging Basal and Elesclomol-Induced HClO in CancerCells.J.Am.Chem.Soc.2014,136(37),12820-12823)灵敏度较高，但不具有双光子和比率性质。总体来讲，以上探针都不能兼具灵敏度高、快速响应、比率及双光子的性质。

发明内容

为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种检测次氯酸的荧光探针及其制备方法和应用，该探针具有灵敏度高、快速响应、比率型及双光子的性质，并应用到生物体成像中。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种检测次氯酸的荧光探针，其结构式如下：

其中，结构式中的R为H或羟基。

本发明的荧光探针对次氯酸检测的灵敏度高，对组织损伤小且穿透力强，能清晰地用于活体成像。

优选的，结构式中的R为羟基。能够形成比率型探针，具有双光子性质，能够快速响应。

一种检测次氯酸的荧光探针的制备方法，将占吨酮或占吨酮衍生物与劳森试剂反应得到目标产物，即为检测次氯酸的荧光探针。

本发明合成方法简单，适于工业化生产。

其反应过程如下：

其中，结构式中的R为H或羟基。

优选的，所述占吨酮衍生物为3-羟基-9H-占吨-9-酮。能够使合成的探针中具有羟基，形成比率型探针。

优选的，其反应步骤为，将占吨酮或占吨酮衍生物与劳森试剂溶解在溶剂中，加热反应后得到目标产物，即为检测次氯酸的荧光探针。

进一步优选的，加热温度至70-80℃，反应时间为1.5-2.5h。该条件下得到的产品产率和纯度更高。

进一步优选的，所述溶剂为无水甲苯。

进一步优选的，所述占吨酮或占吨酮衍生物、劳森试剂和溶剂的用量比例为0.17-0.19:0.2-0.21:4-5，(g:g:mL)。

优选的，所述目标产物的纯化方法为色谱分离。

进一步优选的，所述色谱分离的洗脱剂是二氯甲烷和甲醇的体积比为20-25:1的混合液。进一步提高产品的纯度。

一种上述检测次氯酸的荧光探针在检测次氯酸中的应用。

一种检测次氯酸的方法，其步骤为：

(1)将上述检测次氯酸的荧光探针溶解在生理盐水、缓冲液或培养液中，配制成储备液储存待用；

(2)加入含有细胞组织的适当缓冲液中进行测试。

一种检测活细胞内次氯酸的方法，其步骤为：

(1)将含有上述检测次氯酸的荧光探针的缓冲溶液1-5μM加入培养好的细胞放于培养箱中孵育10-20分钟；

(2)将细胞用生理PBS缓冲液洗去多余的探针，然后进行双光子共聚焦显微成像，如果是检测内源性的物质，则是直接进行双光子共聚焦成像，如果是外加检测物的，则是加入检测物后，再次孵育10-15分钟，进行成像。

与现有技术相比，本发明的优点是：

1.本发明的荧光探针具有双光子性质，穿透力强，损伤小，干扰小，能用于活体组织中的检测。

2.本发明的荧光探针灵敏度高，可以检测到细胞、活体内内源性的次氯酸。

3.本发明合成荧光探针的方法简单，选择性好。

附图说明

图1(a)-(b)是本发明的荧光探针P的荧光强度和次氯酸浓度变化的关系；横坐标为波长(nm)，图1(a)为纵坐标为468nm的荧光强度，图1(b)为纵坐标为672nm处的荧光强度；

图2是本发明的荧光探针P的荧光强度和次氯酸浓度的工作曲线；横坐标为次氯酸浓度，纵坐标为468nm和672nm处的荧光强度的比值；

图3是本发明的荧光探针P相对于生物体内常见的活性小分子的选择性实验；

图4是本发明的荧光探针P对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)外源性次氯酸的双光子-比率共聚焦显微成像；a为400-500nm处的细胞成像图，b为600-700nm处的细胞成像图，c为比率图，d为叠加图；

图5是本发明的探针P对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)内源性次氯酸的双光子-比率共聚焦显微成像，a为探针空白比率叠加图，b为PMA刺激的比率叠加图，c为PMA刺激后再清除的比率叠加图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

(1)3-羟基-9H-占吨-9-酮(182mg)、劳森试剂(200mg)溶解在无水甲苯(4mL)中，75℃回流1.5h，过滤，旋干，用色谱柱进行分离(洗脱剂V_二氯甲烷：V_甲醇＝25:1)，旋干，得红褐色固体(P)。

核磁及质谱表征：

¹HNMR(400MHz,DMSO):δ＝6.70(s,1H),6.89-6.91(d,J＝8Hz,1H),7.43(s，1H)，7.57-7.59(d,J＝8Hz,1H),7.81(s,1H),8.50-8.52(d,J＝8Hz,1H),8.64-8.65(d,J＝4Hz,1H)。

HRMS(ESI^-):m/z calcd for[M-H]＝227.0161，,Found 227.0153.

实施例2

(1)3-羟基-9H-占吨-9-酮(190mg)、劳森试剂(200mg)溶解在无水甲苯(5mL)中，75℃回流1.5h，过滤，旋干，用色谱柱进行分离(洗脱剂V_二氯甲烷：V_甲醇＝25:1)，旋干，得红褐色固体(P)。

核磁及质谱表征：

¹HNMR(400MHz,DMSO):δ＝6.70(s,1H),6.89-6.91(d,J＝8Hz,1H),7.43(s，1H)，7.57-7.59(d,J＝8Hz,1H),7.81(s,1H),8.50-8.52(d,J＝8Hz,1H),8.64-8.65(d,J＝4Hz,1H)。

HRMS(ESI^-):m/z calcd for[M-H]＝227.0161，,Found 227.0153.

实施例3

本实施例与实施例1相同，不同之处在于，将3-羟基-9H-占吨-9-酮改为占吨酮。

效果试验：

1.分别用1.0μM实施例1的探针P对0,15,30,45,60,75,100nM的HClO进行荧光响应测试，得到探针P的荧光强度和次氯酸浓度变化的关系。实验条件：激发/发射波长分别为360/468nm，450/672nm，50mM PBS/CH₃OH(pH 7.4,50:1,v/v)，室温下快速反应。横坐标为波长(nm)，纵坐标分别为468和672nm处的荧光强度。探针激发波长为360nm时，发射波长为468nm，激发波长为450nm时，发射波长为672nm，测试结果显示如图1(a)-(b)，在468nm处荧光随着次氯酸浓度增大逐渐增强，672nm处荧光随着次氯酸浓度增大几乎不变，说明本探针可以用于次氯酸的比率检测。

2.本发明实施例1的探针P在两个发射处的荧光强度比值和次氯酸浓度的工作曲线。横坐标为次氯酸浓度，纵坐标为468nm和672nm处的荧光强度的比值。测试结果显示如图2，说明在次氯酸浓度为0-100nm的范围内，探针荧光强度的比值与次氯酸浓度之间有较好的 线性关系。

3.本发明实例1的探针P对生物体内其它活性小分子的响应情况，如图3所示，其中次氯酸浓度为10μΜ，GSH、Cys的浓度为5mM，其余待测物浓度均为200μM。测试结果，说明该探针对次氯酸具有较好的选择性。

4.本发明实施例1的探针P对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)外源性次氯酸的双光子-比率共聚焦显微成像。

小鼠巨噬细胞(RAW264.7)由高糖的DMEM培养液培养，成像前，细胞贴壁于盖玻片上，然后加入10μMHClO孵育10分钟，再加入1μM探针的PBS缓冲液，然后进行双光子共聚焦显微成像。测试结果显示如图4，图4a为400-500nm处细胞成像图，能观察到明显的荧光，图4b为600-700nm处细胞成像图，图4c为图4a和图4b的比率图，图4d为叠加图。细胞在整个实验过程中保持良好的细胞活性。

5.本发明实施例1的探针P对人小鼠巨噬细胞(RAW264.7)内源性次氯酸的双光子-比率共聚焦显微成像。

测试结果显示如图5，图5a是未经刺激的小鼠巨噬细胞(RAW264.7)与1μM探针孵育20分钟的比率叠加图，能观察到较弱的荧光，图5b是以1uMPMA刺激细胞30分钟后，再与1μM探针孵育细胞20分钟的比率叠加图，能观察到荧光明显增强，图5c是以1uMPMA刺激细胞30分钟后，然后以5mM ABAH清除细胞内次氯酸一个小时后，再与1μM探针孵育20分钟的比率叠加图，与图5b相比，能观察到荧光明显变弱。细胞在整个实验过程中保持良好的细胞活性。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种检测次氯酸的荧光探针，其特征在于，其结构式如下：

其中，结构式中的R为羟基。

2.一种权利要求1所述的检测次氯酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，将占吨酮衍生物与劳森试剂反应得到目标产物，即为检测次氯酸的荧光探针，所述占吨酮衍生物为3-羟基-9H-占吨-9-酮。

3.如权利要求2所述的一种检测次氯酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，其反应步骤为，将占吨酮衍生物与劳森试剂溶解在溶剂中，加热反应后得到目标产物，即为检测次氯酸的荧光探针。

4.如权利要求3所述的一种检测次氯酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，加热温度至70-80℃，反应时间为1.5-2.5h；所述溶剂为无水甲苯。

5.如权利要求3所述的一种检测次氯酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述占吨酮衍生物、劳森试剂和溶剂的用量比例为0.17-0.19:0.2-0.21:4-5，g:g:mL。

6.如权利要求2所述的一种检测次氯酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述目标产物的纯化方法为色谱分离；

所述色谱分离的洗脱剂是二氯甲烷和甲醇的体积比为20-25:1的混合液。

7.权利要求1所述的化合物在制备检测次氯酸的荧光探针中的用途。

8.一种检测次氯酸的方法，其特征在于，其步骤为：

(1)将权利要求1所述的检测次氯酸的荧光探针溶解在生理盐水、缓冲液或培养液中，配制成储备液储存待用；

(2)加入含有细胞组织的适当缓冲液中进行测试。

9.一种检测活细胞内次氯酸的方法，其特征在于，其步骤为：

(1)将含有权利要求1所述的检测次氯酸的荧光探针的缓冲溶液1-5μM加入培养好的细胞放于培养箱中孵育10-20分钟；

(2)将细胞用生理PBS缓冲液洗去多余的探针，然后进行双光子共聚焦显微成像，如果是检测内源性的物质，则是直接进行双光子共聚焦成像，如果是外加检测物的，则是加入检测物后，再次孵育10-15分钟，进行成像。