CN105861440A - 一种动员骨髓造血干细胞的新型制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明现提供一种动员骨髓造血干细胞的新型制剂，包括DFO，DFO的剂量范围为1‑15mg/kg。优选DFO和BOP联合使用。本发明具有2个显著性优势，第一，动员周期短，仅需要1小时至数小时便可高效收集供者骨髓干细胞，第二，与传统方法相比，该方法无副作用，不会诱导血液细胞肿瘤等不良反应。

Description

一种动员骨髓造血干细胞的新型制剂
技术领域
本发明生物技术领域，具体涉及一种动员骨髓造血干细胞的新型制剂。
背景技术
造血干细胞是指尚未发育成熟的细胞，是所有血细胞和免疫细胞的起源，它不仅可以分化为红细胞、白细胞和血小板，还可跨系统分化为各种组织细胞，因此是多功能干细胞，医学上称其为“万用细胞”，也是人体的始祖细胞。
骨髓是存在于长骨 ( 如肱骨、股骨) 的骨髓腔和扁平骨( 如髂骨) 的稀松骨质间的网眼中，是一种海绵状的组织，能产生血细胞的骨髓略呈红色，称为红骨髓。人出生时，红骨髓充满全身骨髓腔，随着年龄增大，脂肪细胞增多，相当部分红骨髓被黄骨髓取代，最后几乎只有扁平骨骨髓腔中有红骨髓。此种变化可能是由于成人不需全部骨髓腔造血，部分骨髓腔造血已足够补充所需血细胞。当机体严重缺血时，部分黄骨髓可被红骨髓替代，骨髓的造血能力显著提高。
造血干细胞有两个重要特征：其一，高度的自我更新或自我复制能力；其二，可分化成所有类型的血细胞。造血干细胞采用不对称的分裂方式：由一个细胞分裂为两个细胞。其中一个细胞仍然保持干细胞的一切生物特性，从而保持身体内干细胞数量相对稳定，这就是干细胞自我更新。而另一个则进一步增殖分化为各类血细胞、前体细胞和成熟血细胞，释放到外周血中，执行各自任务，直至衰老死亡，这一过程是不停地进行着的。
近30年来，血细胞生成的研究发展很快，现已证明人类骨髓中存在造血多能干细胞，数量不到骨髓总细胞数的百分之一，它们具有高度自我更新的能力；并且能分化为各血细胞系统的祖细胞（如淋巴系干细胞、粒系干细胞），在大量分化，增殖为各种原始和成熟血细胞，最后，这些成熟的血细胞通过骨髓进入血液中，发挥各自的生理作用。人体造血干细胞由于存在的部位不同，产生不同效能。一部分存在于干细胞池，是人体造血细胞再生的储备库，以适应和满足各种状态下造血的需要：另一部分存在于增殖池，这些细胞不断增殖更新，以弥补因细胞衰老或丢失所致的血细胞不足，维持人体血流平衡。
大部分白血病，特别是急性髄系白血病(AML)以及慢性髄性白血病(CML)的发生，都直接或间接与造血干细胞异常相关。CML是最经典染色体易位导致造血干细胞恶变的一类常见白血病，其他多数急性髓系白血病由祖细胞直接恶变而来。造血干细胞最先获得染色体易位等主要的致病突变，但并不影响其分化为正常功能的成熟细胞的能力，当染色体易位的造血干细胞或者其分化下游的细胞获得第二次打击之后，就会引发白血病。
虽然根据文献报道和我们前期研究结果可知人类细胞集类刺激因子G-CSF在造血干细胞刺激中起关键作用，但是目前尚缺少一种有效的G-CSF动员制剂，仍缺乏可行的造血干细胞动员方法。
中国专利申请201310057178.5一种动员造血干细胞的制剂及其分离方法，采用了CoCl2和AMD3100动员骨髓间充质干细胞，但没有对动员骨髓造血干细胞动员的制剂或方法。
发明内容
本发明的目的主要是针对现有技术中的问题，现提供一种动员骨髓造血干细胞的制剂及其分离收集造血干细胞方法。
为实现本发明的目的，本发明提供了以下技术方案：
一种动员骨髓造血干细胞的新型制剂，所述动员骨髓造血干细胞的制剂包括DFO。
所述DFO的剂量范围为1-10mg/kg。
所述DFO和BOP联合使用。
所述DFO和AMD3100联合使用。
所述AMD3100的剂量为1-4mg/kg。
所述DFO和AMD3100以及BOP联合使用。
所述BOP的剂量为1-15mg/kg。
所述DFO、AMD3100以及BOP的剂量比为：1-3：1：1-4。
一种利用动员骨髓造血干细胞的制剂分离并收集造血干细胞的方法，利用所述的制剂促使造血干细胞动员进入外周血然后进行分离。
分离和收集造血干细胞的步骤如下：采取外周血，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用含有5-30%胎牛血清的DMEM培养基重悬，接种至培养瓶，培养3-8天后换液，第9-15天得到外周血造血干细胞。
本发明的优点在于：
1、经过试验证明，本发明的动员骨髓造血干细胞的制剂动员周期短，仅需要1小时至数小时便可高效收集供者骨髓干细胞；
2、与传统方法相比，该方法无副作用，不会诱导血液细胞肿瘤等不良反应。
具体实施方式
为了更详细地说明本发明，给出下述制备实例。但本发明的范围并不局限于此。
将DFO粉末用生理盐水配成浓度为10mg/ml的溶液，AMD3100用生理盐水配成1mg/ml的溶液，BOP晶体用生理盐水配制浓度为10mg/ml的溶液。然后用生理盐水配制不同溶液，其中所有分组都是以大鼠为实验对象，
DFO动员组：每天给予大鼠腹腔注射DFO溶液10mg/kg；
DFO联合AMD3100动员组：先给予DFO 10mg/kg/d*7d，第8天腹腔注射AMD3100 5mg/kg；
DFO联合BOP动员组：每天给予DFO10mg/kg/d*7d和BOF10mg/kg/d*7d；
DFO联合BOP以及AMD3100动员组：先给予DFO10mg/kg/d*7d和BOF10mg/kg/d*7d，第8天腹腔注射AMD3100 5mg/kg；
采集各组大鼠外周血，采用成纤维样细胞集落形成培养法(CFU-F法)检测各组外周血HSCs的数量，证实DFO、DFO联合AMD3100以及DFO联合BOP对HSCs的动员作用。
实施例1
1.试剂配制
DFO:称取100mgDFO粉末，加10ml生理盐水，配成10mg/ml的储存液，0.22μm滤器过滤后分装，-20℃保存。动物给药时将储存液用生理盐水稀释10倍将浓度调至4mg/ml。首先配制3mg/ml的DFO溶液，然后配制2mg/ml DFO和2mg/ml BOP的混合溶液。
(2)AMD3100:5g粉剂加5ml生理盐水，配成1mg/ml的溶液，0.22μm滤器过滤分装，-20℃保存。生理盐水稀释4倍至1.25mg/ml用于小鼠给药。
2.动物分组
(1)为检测DFO及DFO联合AMD3100对HSCs的动员作用，将大鼠分为6组，每组5只，分别为:①生理盐水组即NS组:每天给予大鼠腹腔注射生理盐水(与DFO同体积)，共7天；②DFO7d组:每天给予腹腔注射DFO溶液10mg/kg，共7天；③AMD3100组:第1-7天给予相应体积生理盐水，第8天腹腔注射AMD3100 5mg/kg，1小时后准时采集外周血；④DFO联合AMD3100组:先给予DFO 10mg/kg/d*7d，第8天腹腔注射AMD3100 5mg/kg；⑤DFO联合BOP组:每天给予DFO和BOP分别5mg/kg/d；⑥DFO、BOP联合AMD3100组:先给予DFO和BOP分别5mg/kg/d*7d，第8天腹腔注射AMD3100 5mg/kg；1小时后准时采集外周血。
3.大鼠外周血细胞提取
各处理组到达相应处理时间后，分别取外周血单个核细胞进行CFU-F法检测HSCs数量。
4.CFU-F法
将6ml外周血中所含MNCs用5ml含有20%FBS、1%青链霉素的LG-DMEM培养基重悬，接种于底面积为12.5cm2的塑料培养瓶中，置于37℃含5%C02孵箱培养。培养7天后换液，倒置显微镜下观察，于第10天时计数外周血CFU-Es。将呈成纤维细胞样形态、生长密集、>50个细胞的集落记为CFU-F。
一个HSCs贴壁即扩增形成一个CFU-F，基于此理论，CFU-F培养法己成为检测外周血HSCs数量的经典方法。CFU-F法检测结果发现:给予DFO10mg/kg/d*7d，大鼠外周血CFU-Fs数量较对照组显著增加。与生理盐水对照组相比，AMD3100组外周血中CFU-Fs数量并无明显增加。与单用DFO组相比，DFO联合AMD3100可以显著增加HSCs动员效率。本申请者研究发现:DFO10mg/kg给予7天可增加大鼠外周血HSCs的数量。DFO联合CXCR4抑制剂AMD3100可以增加HSCs动员效率。
组别 CFU-F细胞群比例（%） 外周血分离单个核细胞数量（106个/ml） 造血干细胞数量（104个/ml）
① 1.42±0.23 1.02±0.13 1.48±0.16
② 2.93±0.05 0.99±0.13 2.96±0.38
③ 1.09±0.04 1.45±0.09 1.59±0.08
④ 3.53±0.19 1.35±0.05 4.51±0.12
⑤ 3.42±0.12 1.29±0.05 3.85±0.15
⑥ 4.26±0.21 1.39±0.06 5.02±0.26
通过以上表格可以看出，AMD3100组外周血中CFU-Fs数量并无明显增加。与单用DFO组相比，DFO联合AMD3100可以显著增加HSCs动员效率。其中动AMD3100组外周血中CFU-Fs数量并无明显增加。与单用DFO组相比，DFO、BOP联合AMD3100组动员效果最好。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种动员骨髓造血干细胞的新型制剂，其特征在于：所述动员骨髓造血干细胞的制剂包括DFO。
2.根据权利要求1所述的动员骨髓造血干细胞的新型制剂，其特征在于：所述DFO的剂量范围为1-10mg/kg。
3.根据权利要求1所述的动员骨髓造血干细胞的新型制剂，其特征在于：所述DFO和BOP联合使用。
4.根据权利要求1所述的动员骨髓造血干细胞的新型制剂，其特征在于：所述DFO和AMD3100联合使用。
5.根据权利要求4所述的动员骨髓造血干细胞的新型制剂，其特征在于：所述AMD3100的剂量为1-4mg/kg。
6.根据权利要求4所述的动员骨髓造血干细胞的新型制剂，其特征在于：所述DFO和AMD3100以及BOP联合使用。
7.根据权利要求3或6任一项所述的动员骨髓造血干细胞的新型制剂，其特征在于：所述BOP的剂量为1-15mg/kg。
8.根据权利要求7所述的动员骨髓造血干细胞的新型制剂，其特征在于：所述DFO、AMD3100以及BOP的剂量比为：1-3：1：1-4。
9.一种利用权利要求1-8任一项所述的新型制剂分离并收集造血干细胞的方法，其特征在于：利用所述的制剂促使造血干细胞动员进入外周血然后进行分离。
10.根据权利要求9所述的分离并收集造血干细胞的方法，其特征在于：分离和收集造血干细胞的步骤如下：采取外周血，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用含有5-30%胎牛血清的DMEM培养基重悬，接种至培养瓶，培养3-8天后换液，第9-15天得到外周血造血干细胞。
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