CN105851485A - 一种液态复合益生菌制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种液态复合益生菌制剂及其制备方法。1000mL所述液态复合益生菌制剂包括如下重量的组分：黑糖2—5g、益生菌复合菌5.5—8.5g、氨基酸0.05—0.15g、复合微量元素0.12—0.22g、复合维生素0.06—0.12g、低聚木糖0.5—1g、低聚果糖0.5—1g、引酵剂0.01—0.02g，其余为水；所述益生菌复合菌为乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌三种菌按任意重量比的混合物。本发明利用微生物间的协同作用，发挥了群体的联合作用优势，很好的提高了菌体的稳定性，保持了生物活性，为调节动物生理活性发挥重要作用，而且制备工艺简单，有效的降低了成本，能够产生巨大的经济效益。

Description

一种液态复合益生菌制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种液态复合益生菌制剂及其制备方法。

背景技术

自20世纪以来，多种抗生素和激素等被广泛用作饲料添加剂，虽然在畜禽生产与疫病防治及促进动物生长等方面发挥了不可或缺的作用，但由于长期使用甚至滥用，使抗生素的使用存在越来越多的问题，主要表现在：药物残留和毒性；喂养的家畜中大量应用广谱抗生素造成细菌的耐药性快速增长；长期使用抗生素扰乱了畜禽体内微生物系统中微生物群落的微生态平衡，导致消化功能紊乱，引起各种消化道疾病；降低动物的免疫功能。为了克服这些弊端，世界各国的科研工作者不断努力以寻求和开发一种安全、无毒副作用、无残留，既能促进动物生长，又能防治畜禽疾病、替代抗生素的新型添加剂。

益生菌制剂以其无毒、无耐药性、无残留以及效果显著、成本低、能有效补充消化道内的有益微生物等诸多优点，已成为了理想的抗生素替代品而被广泛应用，尤其新生仔猪。一方面菌群通过竞争抑制病原菌，帮助仔猪建立正常的优势菌群，另一方面这些菌群所产生的乳酸及一些消化酶类可以调节胃肠道的pH值、提高饲料的消化率。此外，还能改善肠道微生态环境，调整肠道菌群格局，抑制有害微生物的繁殖，对预防畜禽腹泻有良好效果。益生菌能够在数量和种类上补充肠道内减少或缺乏的正常微生物，调整或维持肠道内微生物平衡，增强机体免疫功能，促进营养物质的消耗和吸收，从而达到防病治病的目地。

然而，目前国内生产的益生菌制剂尚存在较多的不足，如：(1)多采用固态发酵，使许多产品质量不稳定，产品污染(有时甚至在产品中检出大量霉菌)；有的虽采用液体发酵，却是所选发酵菌种单独液体发酵，增大生产成本；(2)菌株选择多采用单一菌种，或者多是乳酸杆菌与芽孢杆菌联合组成、乳酸杆菌属与酵母菌联合组成，致使代谢产物种类及数量均有限，所得到的发酵产品的活菌数量低，添加量一般较高等；(3)多以普通培养基培养益生菌，即模拟其生长环境的培养基，主要由酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖及少数金属盐类配制而成等配制而成，这种培养基与益生菌天然生长所需条件虽在很大程度上相似，但在微量营养因素及维生素的供应上不能满足要求，营养不均衡、不充分，存在不利于益生菌生长、繁殖和代谢的弊端，使得益生菌制品的发酵生产和应用效果受到限制，且培养基中加入价格昂贵的酵母膏、牛肉膏等营养物质，不但使生产成本提高，而且生产过程中菌种的延滞期较长，不利于生产；(4)为了提高抗性、改善产品外观及延长货架时间，一般采用低温真空干燥和/或微囊包被技术，但若使用全部包埋，无法完全发挥其在胃中的有益作用，而使用干燥的方式难以避免部分菌体的死亡和过程中的能耗，并且生产成本提高。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种液态复合益生菌制剂及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

1000mL所述液态复合益生菌制剂包括如下重量的组分：

黑糖2—5g、益生菌复合菌5.5—8.5g、氨基酸0.05—0.15g、复合微量元素0.12—0.22g、复合维生素0.06—0.12g、低聚木糖0.5—1g、低聚果糖0.5—1g、引酵剂0.01—0.02g，其余为水；所述益生菌复合菌为乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌三种菌按任意重量比的混合物。

优选地，所述益生菌复合菌中乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌的重量比为(87—90)：(5—6.5)：(5—6.5)。

优选地，所述乳酸菌为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum(菌种编号：CGMCC1.2158)、乳酸片球菌Pediococcus acidilactici(菌种编号：CGMCC 1.2696)、干酪乳杆菌Lactobacillus casei(菌种编号：CGMCC 1.29)中的至少一种；所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(菌种编号：CGMCC 7690)；所述酵母菌为酿酒酵母Saccharomycescerevisiase J—4(菌种编号：CGMCC 7765)。

上述所有益生菌菌株均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

优选地，所述氨基酸为赖氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸的混合物；氨基酸中赖氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸的重量百分比含量分别为25—35％、25—35％、35—45％；更优选地，所述氨基酸中赖氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸的重量百分比含量分别为30％、30％、40％。

优选地，所述复合微量元素为硫酸镁和FeSO₄·H₂O的混合物；复合微量元素中硫酸镁和FeSO₄·H₂O的重量百分比含量分别为75—80％、20—25％；更优选地，所述复合微量元素中硫酸镁和FeSO₄·H₂O的重量百分比含量分别为78％、22％。

优选地，所述复合维生素为维生素B₁、维生素B₂、维生素C、叶酸的混合物；复合维生素中维生素B₁、维生素B₂、维生素C、叶酸的重量百分比含量分别为25—35％、25—35％、25—35％、5—15％；更优选地，所述复合维生素中维生素B₁、维生素B₂、维生素C、叶酸的重量百分比含量分别为30％、30％、30％、10％。

优选地，所述的引酵剂为蛋氨酸。

制备1000mL上述液态复合益生菌制剂的方法包括如下步骤：

(1)将黑糖、氨基酸、复合微量元素、低聚木糖、低聚果糖、引酵剂按上述的比例混合，并用水定容至1000mL，以此作为培养基，灭菌备用；

(2)将复合维生素溶解并过滤除菌后，按权利要求1所述的比例添加到步骤(1)所述的培养基中；

(3)将乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌按上述的比例接种至添加有复合维生素的培养基中，得混合菌液；

(4)将混合菌液进行液体深层发酵，在30—35℃培养72小时，pH值降至4.0—6.0时将发酵产物进行无菌分装，即得液态复合益生菌制剂。

所得液态益生菌制剂呈棕黄色或红褐色液体，天然醇香，有少量沉淀，为菌体沉淀。味道酸甜，能显著促进动物食欲。常温下保存6个月，冷藏保存效果更好。

下面对本发明作进一步的说明：

植物乳杆菌在繁殖过程中能产出特有的乳酸杆菌素，乳酸杆菌素是一种生物型的防腐剂。此外，植物乳杆菌具有免疫调节作用，维持肠道内菌群平衡，促进营养物质吸收等。

乳酸片球菌能产酸，调节胃肠道菌群，维持肠道微生态平衡。在动物体内对病原微生物有拮抗作用，可竞争性地抑制病原微生物，增强动物机体的免疫机能，产生有益的代谢产物，激活酸性蛋白酶的活性，参与机体的新陈代谢，防止有害物质产生。

干酪乳杆菌作为益生菌的一种，能够耐受有机体的防御机制，其中包括口腔中的酶、胃液中低pH值和小肠的胆汁酸等。所以干酪乳杆菌进入机体后可以在肠道内大量存活，起到调节肠内菌群平衡、促进机体消化吸收等作用。同时，干酪乳杆菌具有降胆固醇、促进细胞分裂、产生抗体免疫，增强机体免疫及及预防疾病等功能。

枯草芽孢杆菌属于芽孢杆菌属的一种，为革兰氏阳性菌。枯草芽孢杆菌进入肠道内能迅速消耗游离氧，使肠腔内低氧，促进厌氧性有益菌生长，且能产生乳酸、枯草菌素和短杆菌肽等活性物质，有效抑制致病菌增殖；枯草芽孢杆菌还可合成淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶以及B族维生素等，促进你宿主动物对饲料养分的消化。

酵母是一类单细胞真菌，能生长在多糖、偏酸环境中，体内富含蛋白质和多种B族维生素，对动物有益生作用，可用于防治腹泻等疾病；酵母还可刺激刷状缘二糖酶活性，激活肠道粘膜的免疫功能。本发明使用的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)属于酵母目(Saccharomycetales)酵母科(Saccharomycetaceae)酿酒酵母属(Saccharomyces)。

低聚果糖和低聚木糖作为一种具有免疫活性的功能性低聚糖，来源广泛，无毒副作用，不能被单胃动物自身分泌的消化酶水解，但到达肠道后段，能被有益微生物利用从而促进肠道有益菌群生长和增殖，抑制有害微生物的生长，如低聚果糖可作为肠道有益菌如干酪乳杆菌的碳源，而肉毒梭菌、大肠杆菌等有害菌对其不能利用，而低聚木糖热酸稳定性好，具有添加量小、功效强等特性。另外，低聚果糖和低聚木糖还具有调节机体免疫系统，增强动物免疫力，改善肠道生理结构，促进营养物质消化等功能。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明利用黑糖为糖原，氨基酸为氮源，添加微量元素、维生素和低聚糖类，发酵产生液体复合益生菌制剂。黑糖具有诸多健康功效，可为细胞提供能量，补充营养，促进再生，经益生菌发酵后制备的菌剂酸甜适口。酵母菌作为好氧菌，在进入动物肠道后消耗氧气，制造厌氧环境，促进厌氧微生物(肠道有益微生物)生长发育，抑制好氧微生物(大肠杆菌等有害菌)；同时低聚糖可作为肠道有益菌如干酪乳杆菌的碳源，而肉毒梭菌、大肠杆菌等有害菌对其不能利用。因此，此活性益生菌制剂富含有益细菌如乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌，以及细菌的有益代谢产物如小肽、免疫多糖、维生素、未知生长因子等，能够刺激动物产生干扰素，提高免疫球蛋白和巨噬细胞活性，增强机体体液免疫和细胞免疫功能，防止疾病发生，同时低聚糖与益生菌同时使用，可延长饲用微生物的保存时间，增强饲用微生物到达后肠的成活率，促进外源有益微生物在肠内的定植和生长。

本发明是利用液体深层发酵技术，由于生产过程严格控制，有效解决了产品质量不稳定，有效活菌数不足，产品污染等问题；本发明采用多种益生菌混合发酵，无论是活菌或是代谢产物都更加丰富，对致病菌的抑制效果更佳，且可节约成本；本发明制备方法简单，原料使用大量的水，成本较低，易于工业化生产；获得的复合益生菌液可应用于猪和家禽养殖的直接饮用，对设备的要求低，有利于复合益生菌液在养殖业中的推广应用。

总之，液态复合益生菌制剂，利用微生物间的协同作用，发挥了群体的联合作用优势，很好的提高了菌体的稳定性，保持了生物活性，为调节动物生理活性发挥重要作用，而且制备工艺简单，有效的降低了成本，能够产生巨大的经济效益。

具体实施方式

实施例1

本实施例选用植物乳杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌三种菌种按95:5:5重量比混合接种发酵。制备方法：向发酵罐中加入黑糖5g、氨基酸0.1g、复合微量元素0.12g、低聚木糖0.5g、低聚果糖0.5g、引酵剂0.01g，用蒸馏水补至1000ml，以此做为培养基，121℃灭菌30分钟，冷却至室温。将复合维生素溶液采用0.22微米孔径的滤膜进行过滤除菌，除菌后的溶液加入0.08g到灭菌后的发酵罐中，其中各维生素重量百分比为：维生素B₁30％、维生素B₂30％、维生素C30％、叶酸10％。然后接入植物乳杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌三种菌种按95:5:5重量比混合种子液共1g，30～35℃培养72小时，pH值降至3.9左右时收获，装瓶。所得液态活性乳酸菌为棕黄色液体或红褐色，味酸，天然醇香，活菌含量≥10亿单位/ml。

实施例2

本实施例选用乳酸片球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌三种菌种按95:5:5重量比混合接种发酵。制备方法：向发酵罐中加入黑糖5g、氨基酸0.1g、复合微量元素0.12g、低聚木糖0.5g、低聚果糖0.5g、引酵剂0.01g，用蒸馏水补至1000ml，以此做为培养基，121℃灭菌30分钟，冷却至室温。将复合维生素溶液采用0.22微米孔径的滤膜进行过滤除菌，除菌后的溶液加入0.08g到灭菌后的发酵罐中，其中各维生素重量百分比为：维生素B₁30％、维生素B₂30％、维生素C30％、叶酸10％。然后接入乳酸片球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌三种菌种按95:5:5重量比混合种子液共1g，30～35℃培养72小时，pH值降至3.9左右时收获，装瓶。所得液态活性乳酸菌为棕黄色液体或红褐色，味酸，天然醇香，活菌含量≥10亿单位/ml。

实施例3

本实施例选用干酪乳杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌三种菌种按95:5:5重量比混合接种发酵。制备方法：向发酵罐中加入黑糖5g、氨基酸0.1g、复合微量元素0.12g、低聚木糖0.5g、低聚果糖0.5g、引酵剂0.01g，用蒸馏水补至1000ml，以此做为培养基，121℃灭菌30分钟，冷却至室温。将复合维生素溶液采用0.22微米孔径的滤膜进行过滤除菌，除菌后的溶液加入0.08g到灭菌后的发酵罐中，其中各维生素重量百分比为：维生素B₁30％、维生素B₂30％、维生素C30％、叶酸10％。然后接入干酪乳杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌三种菌种按95:5:5重量比混合种子液共1g，30～35℃培养72小时，pH值降至3.9左右时收获，装瓶。所得液态活性乳酸菌为棕黄色液体或红褐色，味酸，天然醇香，活菌含量≥10亿单位/ml。

实施例4

本实施例选用植物乳杆菌、干酪乳杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌四种菌种按45:45:5:5重量比混合接种发酵。制备方法：向发酵罐中加入黑糖5g、氨基酸0.1g、复合微量元素0.12g、低聚木糖0.5g、低聚果糖0.5g、引酵剂0.01g，用蒸馏水补至1000ml，以此做为培养基，121℃灭菌30分钟，冷却至室温。将复合维生素溶液采用0.22微米孔径的滤膜进行过滤除菌，除菌后的溶液加入0.08g到灭菌后的发酵罐中，其中各维生素重量百分比为：维生素B₁30％、维生素B₂30％、维生素C30％、叶酸10％。然后接入植物乳杆菌、干酪乳杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌四种菌种按45:45:5:5重量比混合种子液共1g，30～35℃培养72小时，pH值降至3.9左右时收获，装瓶。所得液态活性乳酸菌为棕黄色液体或红褐色，味酸，天然醇香，活菌含量≥10亿单位/ml。

实施例5

本实施例选用植物乳杆菌、乳酸片球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌四种菌种按45:45:5:5重量比混合接种发酵。制备方法：向发酵罐中加入黑糖5g、氨基酸0.1g、复合微量元素0.12g、低聚木糖0.5g、低聚果糖0.5g、引酵剂0.01g，用蒸馏水补至1000ml，以此做为培养基，121℃灭菌30分钟，冷却至室温。将复合维生素溶液采用0.22微米孔径的滤膜进行过滤除菌，除菌后的溶液加入0.08g到灭菌后的发酵罐中，其中各维生素重量百分比为：维生素B₁30％、维生素B₂30％、维生素C30％、叶酸10％。然后接入植物乳杆菌、乳酸片球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌四种菌种按45:45:5:5重量比混合种子液共1g，30～35℃培养72小时，pH值降至3.9左右时收获，装瓶。所得液态活性乳酸菌为棕黄色液体或红褐色，味酸，天然醇香，活菌含量≥10亿单位/ml。

实施例6

本实施例选用植物乳杆菌、乳酸片球菌、干酪乳杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌五种菌种按30:30:30:5:5重量比混合接种发酵。制备方法：向发酵罐中加入黑糖5g、氨基酸0.1g、复合微量元素0.12g、低聚木糖0.5g、低聚果糖0.5g、引酵剂0.01g，用蒸馏水补至1000ml，以此做为培养基，121℃灭菌30分钟，冷却至室温。将复合维生素溶液采用0.22微米孔径的滤膜进行过滤除菌，除菌后的溶液加入0.08g到灭菌后的发酵罐中，其中各维生素重量百分比为：维生素B₁30％、维生素B₂30％、维生素C30％、叶酸10％。然后接入植物乳杆菌、乳酸片球菌、干酪乳杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌五种菌种按30:30:30:5:5重量比混合种子液共1g，30～35℃培养72小时，pH值降至3.9左右时收获，装瓶。所得液态活性乳酸菌为棕黄色液体或红褐色，味酸，天然醇香，活菌含量≥10亿单位/ml。

实施例7以上实施例所得液态复合益生菌制剂的使用

所得液态复合益生菌制剂的使用方法，见表1：

表1

应用试验一：

试验时间：2015年8月1日至2015年9月1日，共31天。

实验地点：湖南常德津市旺森农业科技园实验猪场。

选取胎次、体况相近，健康状况良好，预产期相同或相近的妊娠母猪(杜洛克×长白×大约克)200头，随机分为2组，每组100个重复，每个重复1头母猪。对照组饲喂基础饲粮组，试验组饲喂基础饲粮+液态复合益生菌组，基础饲粮的组成相同，试验自母猪产前10天开始至产后21天结束，仔猪21日龄断奶。试验期间，每天每头按照以下剂量，通过独立加药系统进行投给饮用；母猪：产前10天至产后3天(共13天)，按200mL/(头·天)饮用；产后第4天开始至第21天(共18天)，按100mL/(头·天)饮用；仔猪：从出生至21天断奶(共20天)，按5mL/(头·天)饮用。

使用效果见表2—4。试验结果显示，饮用液态复合益生菌，试验组母猪平均窝产仔猪数显著高于对照组，提高4.90％；便秘率显著降低，试验组比对照组降低66.67％(P<0.05)，且在试验过程中观察到饮用液态复合益生菌的母猪其泌乳性能大大改善。试验组所产仔猪平均断奶重显著高于对照组，提高9.62％，且仔猪腹泻率比对照组降低72.00％(P<0.05)。试验组虽每千克增重成本增加0.11元，但显著提高了仔猪平均断奶重。俗话说，出生重多一两，断奶重多一斤，出栏重多十斤，因此，整体的经济效益得到了提高。因此，液态复合益生菌可显著改善母猪繁殖性能及其仔猪的生长性能，从而大大提高经济效益。

表2 液态复合益生菌对母猪繁殖性能和便秘率的影响

注：同列或数据无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)。

表3 液态复合益生菌对仔猪生产性能的影响

注：同列或数据无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)。

表4 液态复合益生菌对21日龄断奶仔猪经济效益的核算单位：元/kg

Claims (10)

1.一种液态复合益生菌制剂，其特征在于，1000mL所述液态复合益生菌制剂包括如下重量的组分：

黑糖2—5g、益生菌复合菌5.5—8.5g、氨基酸0.05—0.15g、复合微量元素0.12—0.22g、复合维生素0.06—0.12g、低聚木糖0.5—1g、低聚果糖0.5—1g、引酵剂0.01—0.02g，其余为水；所述益生菌复合菌为乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌三种菌按任意重量比的混合物。

2.如权利要求1所述的液态复合益生菌制剂，其特征在于，所述益生菌复合菌中乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌的重量比为(87—90)：(5—6.5)：(5—6.5)。

3.如权利要求1所述的液态复合益生菌制剂，其特征在于，所述乳酸菌为植物乳杆菌、乳酸片球菌、干酪乳杆菌中的至少一种；所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌；所述酵母菌为酿酒酵母。

4.如权利要求1所述的液态复合益生菌制剂，其特征在于，所述氨基酸为赖氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸的混合物；氨基酸中赖氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸的重量百分比含量分别为25—35％、25—35％、35—45％。

5.如权利要求4所述的液态复合益生菌制剂，其特征在于，所述氨基酸中赖氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸的重量百分比含量分别为30％、30％、40％。

6.如权利要求1所述的液态复合益生菌制剂，其特征在于，所述复合微量元素为硫酸镁和FeSO₄·H₂O的混合物；复合微量元素中硫酸镁和FeSO₄·H₂O的重量百分比含量分别为75—80％、20—25％。

7.如权利要求6所述的液态复合益生菌制剂，其特征在于，所述复合微量元素中硫酸镁和FeSO₄·H₂O的重量百分比含量分别为78％、22％。

8.如权利要求1所述的液态复合益生菌制剂，其特征在于，所述复合维生素为维生素B₁、维生素B₂、维生素C、叶酸的混合物；复合维生素中维生素B₁、维生素B₂、维生素C、叶酸的重量百分比含量分别为25—35％、25—35％、25—35％、5—15％。

9.如权利要求8所述的液态复合益生菌制剂，其特征在于，所述复合维生素中维生素B₁、维生素B₂、维生素C、叶酸的重量百分比含量分别为30％、30％、30％、10％。

10.如权利要求1至9任一项所述液态复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，制备1000mL所述液态复合益生菌制剂的方法包括如下步骤：

(1)将黑糖、氨基酸、复合微量元素、低聚木糖、低聚果糖、引酵剂按权利要求1所述的比例混合，并用水定容至1000mL，以此作为培养基，灭菌备用；

(2)将复合维生素溶解并过滤除菌后，按权利要求1所述的比例添加到步骤(1)所述的培养基中；

(3)将乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌按权利要求1所述的比例接种至添加有复合维生素的培养基中，得混合菌液；

(4)将混合菌液进行液体深层发酵，在30—35℃培养72小时，pH值降至4.0—6.0时将发酵产物进行无菌分装，即得液态复合益生菌制剂。