CN105838686A - 具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶 - Google Patents

具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶 Download PDF

Info

Publication number
CN105838686A
CN105838686A CN201610316709.1A CN201610316709A CN105838686A CN 105838686 A CN105838686 A CN 105838686A CN 201610316709 A CN201610316709 A CN 201610316709A CN 105838686 A CN105838686 A CN 105838686A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fitted together
urate oxidase
pig
sequence
amino acids
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610316709.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105838686B (zh
Inventor
陈建华
谢光蓉
李苗苗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Pharmaceutical University
Original Assignee
China Pharmaceutical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Pharmaceutical University filed Critical China Pharmaceutical University
Priority to CN201610316709.1A priority Critical patent/CN105838686B/zh
Publication of CN105838686A publication Critical patent/CN105838686A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105838686B publication Critical patent/CN105838686B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12N9/0048—Uricase (1.7.3.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)
    • C12Y107/03—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12Y107/03003—Factor-independent urate hydroxylase (1.7.3.3), i.e. uricase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶，编码它们的DNA序列，含有该DNA序列的表达载体，含有该表达载体的宿主细胞，以及采用该宿主细胞制备人猪嵌合尿酸氧化酶的方法。该人猪嵌合尿酸氧化酶的序列是将SEQ ID NO：1所示序列进行若干位点氨基酸残基替换所得的重组氨基酸残基序列。与现有技术相比，本发明的人猪嵌合尿酸氧化酶有着更高的催化活性，具有制备低免疫原性甚至无免疫原性降尿酸药物或药物组合物的良好前景。

Description

具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶
技术领域
本发明涉及一种具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶，属于生物技术领域。
背景技术
痛风和高尿酸血症是目前危害人类健康的常见疾病；据统计，高尿酸血症的发病率已经达到了人群的10％。痛风是由于血尿酸水平过高而造成尿酸盐结晶在关节中沉积而导致的一种急性关节炎。目前控制痛风的药物主要是别嘌呤醇和丙磺舒类药物。由于这两类药物均需要长期服用，加之该类药物都存在明显的肝肾毒性以及过敏反应，尤其是别嘌呤醇，可以引起严重的剥脱性皮炎，甚至会危及患者的生命。这些因素导致目前对这类疾病的控制并不理想，进而造成患者痛风石的形成和肾功能的障碍。目前，高尿酸血症已被列为心血管疾病的独立风险因素。因此，寻找有效的治疗手段势在必行。
在动物体内，其尿酸的水平仅为人类的1/10。因此，痛风和高尿酸血症也被认为是人类独有的疾病。动物体内尿酸水平低的原因是由于其体内存在尿酸酶，能够把尿酸进一步分解为极易溶解的尿囊素。通过对比发现，人类的基因组中也存在尿酸酶基因，但是在人类进化的过程中，由于该基因的突变，造成其不能表达有功能的蛋白质，从而成为假基因。由此可见，尿酸酶是治疗痛风与高尿酸血症的理想药物。
具有活性的尿酸酶是四聚体蛋白，由4个相同的亚基组成，每个亚基分子量在34kD左右、且由301－304个氨基酸残基组成。在溶液中，尿酸酶发挥酶活性的最适pH为8.0(BayolA etal.BiophysChem.1995.54：229－235.)。在目前所知的所有来源的尿酸酶中，比活性最高的来源于黄曲霉，为27IU/mg；其次是来源于枯草芽胞杆菌，它的比活性保持在13IU/mg(HuangS H，Wu T K.Eur J Biochem.2004.271：517－523.)。另外，来源于豆类植物的尿酸酶，其活性只有2－6IU/mg；来源于哺乳动物的尿酸酶，经过重组表达后，猪的尿酸酶活性可以达到5IU/mg，狒狒的尿酸酶酶活性只有1IU/mg(Michael H，SusanJ.K.2006.US7056713B1)，而人源尿酸酶无活性。
在药物研究中，微生物尿酸酶的高活性和哺乳动物尿酸酶的低免疫原性，使得这两大来源的尿酸酶成了目前开发应用重组尿酸酶的研究热点。但黄曲霉来源的尿酸酶与推测出的人源尿酸酶的同源性不足40％(Lee C C，Wu X，Gibbs R A，Cook R G，Muzny D M，CaskeyC T.Science.1988.239：1288－1291.)，人体易产生抗黄曲霉来源尿酸酶抗体，黄曲霉来源尿酸酶的功效迅速减弱，同时引发严重过敏性反应，无法用于长期治疗。20多年前，黄曲霉尿酸酶(Uricozyme)在法国和意大利批准。本世纪初，黄曲霉来源尿酸酶基因的酵母基因工程菌表达的尿酸酶(Rasburicase)在美国和欧盟批准。由于这两种尿酸酶的基因均来自于黄曲霉，有很强的免疫原性，Uricozyme和Rasburicase出现严重过敏反应的比例达5％以上，并且还有近半数的患者出现发热，恶心呕吐等不良反应。
目前在美国用于临床的尿酸酶(Pegloticase)是经过PEG化修饰的猪和狒狒的重组尿酸酶嵌合蛋白，商品名为KRYSTEXXA。虽然该尿酸酶来源于哺乳动物(猪和狒狒)，但由于与人类的差异造成的过敏反应，加之PEG化的影响，其免疫原性仍然较强。每两周一次静脉注射KRYSTEXXA的患者中92％产生了抗pegloticase的抗体，42％的患者产生了抗PEG抗体；输液反应的发生率达到26％。尽管如此，美国FDA于2010年批准了该药上市。由此可见该类药物有着巨大的市场需求。
发明人曾于2014年2月11日申请了申请号为201410048071.9、申请公布号为CN103834623A、名称为《具有催化活性的人源尿酸氧化酶》的中国发明专利申请，其中对人尿酸氧化酶进行具体位点氨基酸残基替换、或者进行外显子位点氨基酸残基替换，并最终获得了具有催化活性的人源尿酸氧化酶。此后，发明人将研究重点转向获得具有更高催化活性的人源尿酸氧化酶。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的问题，提供一种具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶，与发明人之前的成果相比，具备更高的催化活性。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
一种具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶，其特征是，该酶的序列是将SEQ IDNO：1所示序列进行若干位点氨基酸残基替换所得的重组氨基酸残基序列；所述若干位点氨基酸残基替换由1－3个外显子替换、以及0至2个定点替换组成；
所述外显子替换选自：
第84至122位氨基酸残基序列替换为SEQ ID NO：2的第84至122位氨基酸残基序列；
第149至211位氨基酸残基序列替换为SEQ ID NO：2的第149至211位氨基酸残基序列；
第212至252位氨基酸残基序列替换为SEQ ID NO：2的第212至252位氨基酸残基序列；
所述定点替换选自：
第24位谷氨酸替换为天冬氨酸；
第83位谷氨酸替换为甘氨酸。
优选地，所述若干位点氨基酸残基替换由3个外显子替换和1－2个定点替换组成。
优选地，所述若干位点氨基酸残基替换由3个外显子替换和2个定点替换组成。
优选地，所述重组氨基酸残基序列为SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：5之一。
本发明还提供：
上述人猪嵌合尿酸氧化酶用于制备降尿酸药物或药物组合物的用途。
含有上述人猪嵌合尿酸氧化酶的药物组合物。
编码上述人猪嵌合尿酸氧化酶的基因序列。
含有上述基因序列的表达载体。
含有上述表达载体的宿主细胞。
制备前文所述人猪嵌合尿酸氧化酶的方法，包括：采用前文所述的宿主细胞表达所述人猪嵌合尿酸氧化酶，然后经分离、纯化后获得人猪嵌合尿酸氧化酶成品。
与现有技术相比，本发明的人猪嵌合尿酸氧化酶有着更高的催化活性，具有制备低免疫原性甚至无免疫原性降尿酸药物或药物组合物的良好前景。
附图说明
图1为猪尿酸酶中24位氨基酸的结构分析示意图。
图2为猪尿酸酶中83位氨基酸的结构分析示意图。
图3为人猪嵌合尿酸氧化酶分离纯化电泳图。泳道1：人猪嵌合尿酸氧化酶的菌液；泳道2：人猪嵌合尿酸氧化酶菌液在超声破碎后的上清；泳道3：人猪嵌合尿酸氧化酶在盐析后以缓冲溶液复溶的溶液；泳道4：人猪嵌合尿酸氧化酶在层析前的溶液；泳道5：人猪嵌合尿酸氧化酶在层析后的溶液。
具体实施方式
1.本发明的主要技术成果
发明人应用生物信息学技术，对14种不同生物来源(人、黑猩猩、猩猩、大猩猩、长臂猿、狒狒、猕猴、食蟹猴、夜猴、家兔、小鼠、狗、牛、猪)的尿酸氧化酶氨基酸序列进行了比对，鉴别出错意突变位点主要分布在人尿酸酶基因的3号、5号、6号外显子区域内。哺乳动物猪尿酸酶氨基酸与人源尿酸酶氨基酸同源性在88％以上，活性区域高度一致。利用外显子替换技术，在不具有尿酸酶活性的人尿酸酶氨基酸序列中，通过外显子替换技术引入部分影响酶催化活性的猪源尿酸酶氨基酸序列，最终获得具有尿酸酶活性的人猪嵌合尿酸酶，且提高了与推导出的无活性人源尿酸酶氨基酸序列的同源性，从而实现降低人体中免疫原性的目的。
将人的尿酸酶基因3、5、6号外显子与猪尿酸酶基因的相应外显子替换，得到有活性的人猪嵌合尿酸酶，该嵌合蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：3)与人源尿酸酶氨基酸序列同源性可以提高至90％以上。
如本领域技术人员所知，在研制重组蛋白质药物中需尽量克服蛋白的物理和化学不稳定性。尿酸酶蛋白的高疏水性等生物物理性质决定了相对高浓度的蛋白质溶液(＞5mg/ml)处于非生理条件下(如高温或弱酸性pH值)时会加速其交联和聚集(即较差的物理稳定性和不利于制备成生物制品的特性)。运用生物信息学技术对重组的尿酸酶进行了序列比对、同源模建，分析关键氨基酸残基对其结构造成的影响，从而再对关键氨基酸残基进行定点突变，进而改善其活性和稳定性。
发明人经进一步研究发现，在本发明前述的重组人猪嵌合尿酸酶氨基酸序列的基础上，经过2个氨基酸(24位和83位)的定点突变，不仅提高了原蛋白的酶活性，还增强或改善了嵌合蛋白的理化性质(减少了疏水介导的聚集，提高了与溶剂的相容性，增加了体外热稳定性，延长了体内代谢半衰期，等等)。该人猪嵌合尿酸氧化酶氨基酸序列为SEQ ID NO：5，其中3、5、6号外显子来源于猪尿酸酶氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其余外显子来源于人尿酸酶氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，且24位和83位氨基酸定点突变。
需要说明的是，第1至10位氨基酸残基对应于1号外显子，第11至83位氨基酸残基对应于2号外显子，第84至122位氨基酸残基对应于3号外显子，第123至148位氨基酸残基对应于4号外显子，第149至211位氨基酸残基对应于5号外显子，第212至252位氨基酸残基对应于6号外显子，第253至280位氨基酸残基对应于7号外显子，第281至305位氨基酸残基对应于8号外显子。
由图1中分析可知，在猪尿酸酶中的24位氨基酸，天冬氨酸(D)可与相邻亚基的K291、Y289形成氢键(或通过水分子)，谷氨酸(E)则由于与V47形成氢键，远离相邻亚基的K291、Y289，不利于二聚体稳定位于β1折叠中的柔性部位，可能对β1延伸方向存在影响，因此在此位点，天冬氨酸(D)能提高3－5－6人猪嵌合尿酸酶的酶活性和稳定性。
由图2分析可知，在猪尿酸酶中的83位氨基酸，(1)83位氨基酸位于α螺旋2、α螺旋3两个螺旋之间的回转处，甘氨酸(G)有利于消除由附近氨基酸残基造成的空间位阻，而谷氨酸(E)能增加空间位阻，影响柔韧性。(2)谷氨酸(E)为酸性氨基酸，可能与附近的K85，K47等存在作用力，影响螺旋定位。(3)活性位点Thr68和Asp69位于α螺旋2的另一侧，而α螺旋2的空间定位并不牢固，E83可能会不利于与两者的空间定位，进而影响酶活性。
用于编码本发明前述人猪嵌合尿酸氧化酶的多核苷酸序列可用本领域技术人员熟知的DNA重组、PCR等各种技术来获得，但不局限于本发明较佳实施方案中采用的两轮重叠延伸PCR法以及Strantagene的quick change中描述的定点突变方法。
将上述多核苷酸与相应表达载体进行有效连接后，转化或转导入宿主细胞中表达。上述载体可以通过附加体或整合到宿主染色体的形式在宿主生物中进行复制。在适当的启动子控制下，人猪嵌合尿酸氧化酶可以在哺乳动物细胞、昆虫、酵母、细菌或其它细胞中表达。优选大肠杆菌作为宿主细胞表达本发明的多核苷酸。其他适用的微生物宿主包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)、沙雷氏菌属(Serratia)、假单胞菌属(Pseudomonas)和葡萄球菌属(Staphylococcus)等。也可以在这些原核宿主中制备表达载体，也可具有众多公知启动子中的任一种，如乳糖启动子系统、色氨酸启动子系统、β内酰胺酶启动子系统或噬菌体λ或T7来源的启动子系统。通常这些启动子会控制表达，且具有核糖体结合位点序列等，以便起始和完成转录及翻译。
同时，酵母或真菌等其它微生物也可用于表达。优选的酵母宿主为毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)以及嗜甲醇毕赤酵母(Pichia angusta)。真菌宿主包括黑曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)及裂褶菌(Schizophyllumcommune)，也可选择使用其他真菌。
此外，哺乳动物细胞培养也可用于表达生产本发明的人猪嵌合尿酸氧化酶。优选的细胞包括：CHO细胞系、多种COS细胞系、NSO细胞、叙利亚地鼠(Syrian Hamster)卵巢细胞系、Hela细胞或人胎肾细胞系(即HEK293、HEK293EBNA)。
可以通过公知的方法将含有目的多核苷酸序列(如人猪嵌合尿酸氧化酶的编码序列以及表达控制序列)的载体转移到宿主细胞内，所采用的方法取决于细胞宿主的类型。例如，对原核细胞通常采用氯化钙转染法，而对于其他细胞宿主可以使用磷酸钙处理或电穿孔法。
如前所述的本发明人猪嵌合尿酸氧化酶可以从宿主细胞内部或外部(如培养基)分离得到，且纯化为高纯度的均一蛋白。此种蛋白分离纯化的方法不限于任何特定方法。事实上，可用任何本领域已公知的方法，例如柱层析法、过滤法、超滤法、盐析法、等电点沉淀法、透析法等。对于层析，例如亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、反相层析、吸附层析等都可以应用。这些层析可用液相层析如HPLC和FPLC来操作。可采用通用的蛋白检测方法检测蛋白浓度和纯度，例如HPLC法、SDS－聚丙烯酰胺电泳法、等电点电泳法、BCA法、Lowry法、Western Blot法等。因此，本发明可提供高纯度重组的尿酸酶嵌合蛋白及其突变体蛋白。
2.下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；试剂和材料，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1人猪嵌合尿酸氧化酶H1－2P3H4P5－6H7－8－24突变体DNA的构建及其在大肠杆菌BL21中重组表达。
以H1－2P3H4P5－6H7－8蛋白(Seq ID No：3)的DNA序列为原始模板，用重叠延伸PCR法突变制备含有目标突变的DNA。
制备H1－2P3H4P5－6H7－8－24片段的过程如下。
第一阶段PCR：模板序列为H1－2P3H4P5－6H7－8蛋白的DNA序列，引物为表1中引物1和引物4，PCR反应体系和方法均采用PCR反应试剂盒(TAKARA，大连)，按商家的说明书设置。
PCR条件为：95℃30s，55℃30s，72℃20s，共30个循环，第一个循环95℃变性5min，最后一个循环72℃延伸10min，最终获得产物H1－2P3H4P5－6H7－8－24上片段。
第二阶段PCR：模板序列同第一阶段PCR，引物为表1中引物2和引物3。
PCR条件为：95℃30s，55℃30s，72℃100s，共30个循环，第一个循环95℃变性5min，最后一个循环72℃延伸10min，最终获得产物H1－2P3H4P5－6H7－8－24下片段。
第三阶段PCR：模板为H1－2P3H4P5－6H7－8－24上片段和H1－2P3H4P5－6H7－8－24下片段的1∶1混合溶液，引物为表1中引物1和引物2，按上述PCR条件扩增获得产物H1－2P3H4P5－6H7－8－24片段，其编码的人猪嵌合尿酸氧化酶序列为SEQ ID No：4。
将H1－2P3H4P5－6H7－8－24片段和pET－22b(+)同时使用Nde I和Hind III进行双酶切，回收酶切片段，使用T4－DNA连接酶连接两个酶切片段，使用《分子克隆》(卢圣栋编)中所述的标准方法将连接混合物转入大肠杆菌表达宿主菌BL21。
在含有AMP抗性的LB平板上进行转化反应，经过12－16h小时的生长，挑取单克隆转化菌落，在AMP+的LB液体培养基过夜培养，进行菌落PCR初步筛选出阳性克隆，经测序确定含有H1－2P3H4P5－6H7－8－24DNA的阳性重组质粒中的尿酸氧化酶序列与理论完全一致。
使用大肠杆菌BL21(DE3)、BL21 Star(DE3)或BL21 Star(DE3)plysS、表达人猪嵌合尿酸氧化酶蛋白。这些菌株仅是许多适用于表达嵌合蛋白中的一些，它们可以分别通过商业渠道自Novagen，Invitrogen及Stratagen获得。利用转化体在含有AMP的LB平板上的生长能力可将其鉴别出来。
将上述经过测序正确的BL21表达重组菌，按照1％的甘油管接种量接入LB培养基装液量为30ml的250ml的三角瓶中，且培养基中含有100μg/ml的AMP。于37℃，220rpm摇床中培养至OD600约为1.7时，加入终浓度为0.2μM的IPTG进行尿酸酶的诱导表达，诱导6h后收集菌体，离心得到湿菌体，并以SDS－PAGE监测。
实施例2人猪嵌合尿酸氧化酶H1－2P3H4P5－6H7－8－24－83突变体DNA的构建及其在大肠杆菌中重组表达。
以H1－2P3H4P5－6H7－8－24蛋白DNA序列为原始模板，用重叠延伸PCR法突变制备含有目标突变的DNA。
制备H1－2P3H4P5－6H7－8－24－83的具体过程如下。
第一阶段PCR：模板序列为实施例1所得H1－2P3H4P5－6H7－8－24片段，引物为表1中引物1和引物6，PCR反应体系和方法均采用PCR反应试剂盒(TAKARA，大连)，按商家的说明书设置。
PCR条件为：95℃30s，55℃30s，72℃33s，共30个循环，第一个循环95℃变性5min，最后一个循环72℃延伸10min，最终获得产物H1－2P3H4P5－6H7－8－24－83上片段。
第二阶段PCR：模板序列同第一阶段PCR，引物为表1中引物2和引物5。
PCR条件为：95℃30s，55℃30s，72℃90s，共30个循环，第一个循环95℃变性5min，最后一个循环72℃延伸10min，最终获得产物H1－2P3H4P5－6H7－8－24－83下片段。
第三阶段PCR：模板为H1－2P3H4P5－6H7－8－24－83上片段和H1－2P3H4P5－6H7－8－24－83下片段的1∶1混合溶液，引物为表1中引物1和引物2，按上述PCR条件扩增得到产物H1－ 2P3H4P5－6H7－8－24－83突变体DNA，其编码的人猪嵌合尿酸氧化酶序列为SEQ ID No：5。
将含所得DNA序列用Nde I和BamH I进行双酶切，连接、转化、筛选、表达方法同实施例1。
各引物序列见表1。
表1各实施例所用引物序列
实施例3人猪嵌合尿酸氧化酶的纯化。
将实施例1、2培养的发酵液以4000rpm、20min离心，收集菌体，菌体再用pH8.6的0.05M Tris－Hcl缓冲液按1g菌体10ml体积的比例重悬，离心，洗涤两遍。取菌体，每1g菌体补入10ml缓冲液(pH8.6 Tris－Hcl)悬浮菌体，搅拌均匀并冷冻过夜，然后37℃水浴中迅速解冻，如此反复冻融4次。将上述菌体悬液融化后，超声(功率60％、40min、超声5s、间隙5s)，注意超声破壁时温度保持在10度以下；待破菌完全后，8000r/min，4℃离心30min，分别取上清、沉淀进行SDS－PAGE电泳分析和酶活性测定。
取破壁菌体悬液离心后的沉淀，每克沉淀以150ml缓冲液(0.1M Na2C03－NaHC03、pH 10.3)溶解，在4℃中搅拌使沉淀溶解，然后以8000r/min，离心30min，取上清和沉淀分别进行SDS－PAGE电泳分析和酶活性测定。
将溶解后蛋白溶液在4℃，以8000r/min离心30min，弃沉淀，取上清即为尿酸酶粗酶溶液。先将10％的硫酸铵加入到尿酸酶粗酶溶液，4℃放置过夜。4℃，12000r/min离心15min，收集沉淀，缓冲液(0.1M Na2C03－NaHC03、pH 10.3)溶解，即得蛋白样品溶液。SDS－PAGE电泳分析，以分级沉淀的方式确认最优盐析浓度。
Q Sepharose F.F阴离子填料装柱(1.2×20cm)，用pH10.3 0.1M碳酸盐缓冲液平衡过夜，流速为1.0ml/min。将所得蛋白溶液上样，流速为0.5ml/min；上样完毕后用pH10.30.1M碳酸盐缓冲液冲洗柱子至基线，然后用pH10.3 0.1M碳酸盐缓冲液+0.5M NaCl梯度洗脱，最后用pH10.3 0.1M碳酸盐缓冲液+2.0M NaCl洗脱，洗脱流速为0.5ml/min。整个洗脱过程用部分收集器收集流出液，每试管3ml，紫外280nm检测蛋白流出情况，并用SDS－PAGE电泳分析纯化效果，最后合并目的蛋白峰(所得即为高纯度人猪嵌合尿酸氧化酶)，BCA法测定蛋白含量，此时进行SDS－PAGE和HPLC检测纯度，均可达到95％以上。
上述过程中，针对实施例2样品纯化时进行的SDS－PAGE电泳分析结果如图3所示。
实施例4各尿酸氧化酶的活性检测。
尿酸氧化酶的活性测定：尿酸氧化酶催化尿酸降解，尿酸在293nm处具有特征吸收峰，但是尿酸降解后的产物在此波长无吸收峰，因此可以根据293nm处吸光值的减少量来确定尿酸被尿酸氧化酶降解的量，然后使用尿酸的摩尔消光系数算出尿酸浓度，根据尿酸浓度的变化可以计算出尿酸氧化酶的活性。将紫外分光光度计波长调至293nm处，预热30min，使用硼酸－硼酸钠缓冲液作为空白调零，取3ml于37℃预热30min的60μM的尿酸溶液加入石英比色皿中，补加0.5ml的上述粗酶液快速混匀，开始计时，每1min记一次吸光值读数，测量5min内293nm吸光度的变化值。
在37℃、pH8.5时，每分钟转化1μmol尿酸为尿囊素的酶量定义为一个国际单位(IU)。按照如下公式计算尿酸酶活性。
U = ( A 0 - A ) / s × V t × d f 11.254 × V e
上式中：U＝尿酸酶活力单位；A0为反应初始时的OD293吸光值，A为反应5min后OD293的吸光值；Vt＝反应液总体积(ml)；df＝稀释倍数；11.254为尿酸在293nm波长下的微摩尔消光系数；Ve＝酶液体积(ml)。
各尿酸酶蛋白按实施例3方法分离纯化后比活计算结果如下表所示，
尿酸酶蛋白 酶比活(IU/mg)
PUOX(猪尿酸酶) 4.53
SEQ ID NO：3 1.27
SEQ ID NO：4(实施例1最终所得蛋白) 1.88
SEQ ID NO：5(实施例2最终所得蛋白) 6.21
注1：PUOX(猪尿酸酶)的酶活数据获得过程为：采用与实施例1相同的方法获得猪尿酸氧化酶基因的DNA，并进行双酶切、酶连、转化、筛选、表达、发酵后，按实施例3方法纯化，检测纯化所得蛋白的酶活数据。
注2：SEQ ID NO：3的酶活数据获得过程为：采用与实施例1相同的方法获得SEQ IDNO：3的DNA，并进行双酶切、酶连、转化、筛选、表达、发酵后，按实施例3方法纯化，检测纯化所得蛋白的酶活数据。
由以上结果可知，SEQ ID NO：3所示人猪嵌合尿酸氧化酶、SEQ ID NO：4所示人猪嵌合尿酸氧化酶、SEQ ID NO：5所示人猪嵌合尿酸氧化酶都是具有催化活性的尿酸氧化酶，其中以SEQ ID NO：5所示人猪嵌合尿酸氧化酶的活性最为突出。而且，SEQ ID NO：5所示人猪嵌合尿酸氧化酶的酶活数据是猪尿酸酶的接近1.4倍，明显高于发明人之前申请的发明(申请号201410048071.9)中酶活最高的E24A－M112I－I115H－H119R－C141V－Q145V－Q151I－K208D－I214A－M219L－S222F－L232S－T233A－C240Y尿酸酶(该尿酸酶的酶活数据是猪尿酸酶的约1.1倍)，这一优势在进行本研究之前是无法预料的。
本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶，其特征是，该酶的序列是将SEQIDNO：1所示序列进行若干位点氨基酸残基替换所得的重组氨基酸残基序列；所述若干位点氨基酸残基替换由1－3个外显子替换、以及0至2个定点替换组成；
所述外显子替换选自：
第84至122位氨基酸残基序列替换为SEQIDNO：2的第84至122位氨基酸残基序列；
第149至211位氨基酸残基序列替换为SEQIDNO：2的第149至211位氨基酸残基序列；
第212至252位氨基酸残基序列替换为SEQIDNO：2的第212至252位氨基酸残基序列；
所述定点替换选自：
第24位谷氨酸替换为天冬氨酸；
第83位谷氨酸替换为甘氨酸。
2.根据权利要求1所述具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶，其特征是，所述若干位点氨基酸残基替换由3个外显子替换和1－2个定点替换组成。
3.根据权利要求1所述具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶，其特征是，所述若干位点氨基酸残基替换由3个外显子替换和2个定点替换组成。
4.根据权利要求1所述具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶，其特征是，所述重组氨基酸残基序列为SEQIDNO：3至SEQIDNO：5之一。
5.权利要求1至4任一项所述人猪嵌合尿酸氧化酶用于制备降尿酸药物或药物组合物的用途。
6.含有权利要求1至4任一项所述人猪嵌合尿酸氧化酶的药物组合物。
7.编码权利要求1至4任一项所述人猪嵌合尿酸氧化酶的基因序列。
8.含有权利要求7所述基因序列的表达载体。
9.含有权利要求8所述表达载体的宿主细胞。
10.制备权利要求1至4任一项所述人猪嵌合尿酸氧化酶的方法，其特征是，包括以下步骤：采用权利要求9所述的宿主细胞表达所述人猪嵌合尿酸氧化酶，然后经分离、纯化后获得人猪嵌合尿酸氧化酶成品。
CN201610316709.1A 2016-05-13 2016-05-13 具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶 Active CN105838686B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610316709.1A CN105838686B (zh) 2016-05-13 2016-05-13 具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610316709.1A CN105838686B (zh) 2016-05-13 2016-05-13 具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105838686A true CN105838686A (zh) 2016-08-10
CN105838686B CN105838686B (zh) 2019-10-08

Family

ID=56591826

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610316709.1A Active CN105838686B (zh) 2016-05-13 2016-05-13 具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105838686B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109223707A (zh) * 2018-09-13 2019-01-18 中国药科大学 一种尿酸酶外用凝胶制剂、其制备方法及用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011050599A1 (zh) * 2009-10-27 2011-05-05 重庆富进生物医药有限公司 人源化重组尿酸酶及其突变体
CN103834623A (zh) * 2014-02-11 2014-06-04 中国药科大学 具有催化活性的人源尿酸氧化酶

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011050599A1 (zh) * 2009-10-27 2011-05-05 重庆富进生物医药有限公司 人源化重组尿酸酶及其突变体
CN103834623A (zh) * 2014-02-11 2014-06-04 中国药科大学 具有催化活性的人源尿酸氧化酶

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACTIVITYJING CHEN,ET AL: "DNA shuffling of uricase gene leads to a more "human like"chimeric uricase with increased uricolytic activity", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES》 *
GUANGRONG XIE，ET AL: "Development of Therapeutic Chimeric Uricase by Exon Replacement/Restoration and Site-Directed Mutagenesis", 《INT. J. MOL. SCI.》 *
谢光蓉，ET AL: "人尿酸氧化酶进化机制研究", 《药物生物技术》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109223707A (zh) * 2018-09-13 2019-01-18 中国药科大学 一种尿酸酶外用凝胶制剂、其制备方法及用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN105838686B (zh) 2019-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mymrikov et al. Heterooligomeric complexes of human small heat shock proteins
Saarinen et al. Crystal structure of thioredoxin-2 from Anabaena
CN107345225B (zh) 一种具有高转糖苷活性的β-半乳糖苷酶组合突变体及其制备方法和应用
WO2016019726A1 (zh) 低免疫原性抗TNF-α全人源单抗及其应用
US20190136219A1 (en) Genetically Engineered Arginine Deiminase Modified by Site-Directed Mutagenesis
Kaiser et al. Structural and functional investigation of a putative archaeal selenocysteine synthase
CN103834623B (zh) 具有催化活性的人源尿酸氧化酶
CN105062987B (zh) 重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白及其制备方法
Jo An intrinsically disordered peptide tag that confers an unusual solubility to aggregation-prone proteins
CN111500555B (zh) 壳聚糖酶OUC-CsnCA及其应用
CN109706137B (zh) 一种通过增加二硫键提高肝素酶i热稳定性的突变体及制备方法
Lyukmanova et al. N-terminal fusion tags for effective production of G-protein-coupled receptors in bacterial cell-free systems
WO2018136572A1 (en) Expression construct and method for producing proteins of interest
CN112500472B (zh) 一种猫ω干扰素突变体及其制备方法和应用
JP2017108740A (ja) 改変型ｍｅｓｏ−ジアミノピメリン酸脱水素酵素
CN1312183C (zh) 一种肝素酶i融合蛋白及其编码基因与表达方法
CN105838686A (zh) 具有催化活性的人猪嵌合尿酸氧化酶
Hoedemaeker et al. A single chain Fv fragment of P-glycoprotein-specific monoclonal antibody C219: design, expression, and crystal structure at 2.4 Å resolution
CN109384852A (zh) 重组Martentoxin的制备、表征及应用
CN113186215B (zh) 一种来源于拟杆菌的高活性、热稳定性肝素酶i及其应用
CN104630168A (zh) 一种重组人猪嵌合尿酸酶的构建和表达
Bagchi Unusual nature of long non-coding RNAs coding for “unusual peptides”
CN112662640A (zh) 一种具有催化活性的尿酸氧化酶
CN107254472A (zh) 人表皮生长因子hEGF基因优化序列及其制备方法和应用
CN103282490B (zh) 在酵母中产生肠激酶的组合物和方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant