CN105828633B - 用于提取豌豆蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于提取和纯化豌豆蛋白的方法，包括以下步骤：(a)提供包含豌豆蛋白的含水组合物；(b)从包含豌豆蛋白的所述含水组合物中分离所述豌豆蛋白；(c)作为具有pH在4.0至5.8范围内的含水浆料得到所述分离的豌豆蛋白；以及(d)使所述具有pH在4.0至5.8范围内的含水浆料经历至少75℃的温度。本文还描述了豌豆蛋白组合物和包含所述豌豆蛋白组合物的食品或饲料产品。
Description
技术领域
本发明涉及用于提取和纯化蛋白的方法。具体地，本发明涉及豌豆蛋白的提取。本发明进一步涉及通过以上方法可得到的豌豆蛋白，以及包含这种豌豆蛋白的食品或饲料产品。本发明还涉及这种豌豆蛋白在食品或饲料工业中的用途。
背景技术
来自植物来源的蛋白分离物代表食品或饲料中的动物蛋白的有价值的替换品或补充品。例如在食品中，添加植物蛋白往往可以以较低的成本有效地取代动物蛋白。此外，传统包含动物蛋白的许多产品，特别是乳制品可能是食品过敏的主要原因。
豆科(Leguminosae)是引人注目的，因为它们中的大多数在称为根瘤的结构中含有共生的固氮细菌。这种布置意味着根瘤是豆科的氮来源，使它们相对富含植物蛋白。所有的蛋白包含含氮的氨基酸。因此氮是生产蛋白的必要成分。因此，豆科是植物蛋白的最好来源之一。豆科，如豌豆 (Pisum sativum)除了含有高蛋白含量之外，可容易获得并含有特别良好平衡的氨基酸组成，这些代表该蛋白来源是动物蛋白的有价值的替换品。
提供植物蛋白的主要挑战围绕蛋白的组成和纯度，并包括涉及以下的方面：例如提取、分馏(fractionation)、和分离前后的处理。在分离植物蛋白以及以或多或少纯的形式获得植物蛋白时，所有先前的操作对分离的植物蛋白的质量具有很大影响。例如，蛋白分离物或提取物中杂质的类型和量决定它的最终价值。这种杂质包括例如碳水化合物。虽然一般而言，碳水化合物是最终的蛋白分离物中不希望的杂质，但是一些其他杂质如维生素或矿物质可能不都是不期望的，或甚至可能对蛋白分离物的营养和/ 或物理化学方面是有益的。除了影响蛋白分离物或提取物的最终组成，提取和/或纯化过程可以极大地影响蛋白分离物的物理化学或功能性质。具体地，蛋白溶解度、粘度、乳化能力、颜色、味道、或气味在很大程度上受到所使用的技术的影响。
从以上可以了解，得到具有特定的期望性质的高质量蛋白分离物可能是麻烦的，且往往包括多次昂贵和/或耗时的操作。鉴于此，仍然需要改善从植物的蛋白分离，特别是豆科，如豌豆。
因此本发明的一个目的是克服或缓解现有技术的缺点中的至少一个，或提供有用的替代选择。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了用于提取豌豆蛋白的方法。用于提取豌豆蛋白的方法包括以下步骤：
(a)提供包含豌豆蛋白的含水组合物；
(b)从包含豌豆蛋白的所述含水组合物中分离所述豌豆蛋白；
(c)作为具有pH在4.0至5.8范围内的含水浆料得到所述分离的豌豆蛋白；
(d)使具有pH在4.0至5.8范围内的所述含水浆料经历至少75℃的温度。
根据所述方法的一个实施方式，豌豆蛋白的提取包括提供豌豆蛋白，使其经历等电沉淀，随后热处理蛋白沉淀。
根据本发明的第二方面，提供了通过根据本发明的第一方面的方法可得到的或得到的豌豆蛋白。
根据本发明的第三方面，提供了豌豆蛋白组合物，其基于组合物的总的干物质，包含至少60wt％的蛋白，其中，如对基于含水组合物的总重量包含3wt％的所述豌豆蛋白组合物的含水组合物测量的，所述豌豆蛋白组合物具有在pH 7.0下至多15％的氮溶解指数。
根据本发明的第四方面，提供了可食用的组合物，优选食品或饲料产品，其包含根据本发明的第二方面的豌豆蛋白、或根据本发明的第三方面的豌豆蛋白组合物、或通过根据本发明的第一方面的方法得到的豌豆蛋白。
第五方面，本发明提供了根据本发明的第二方面的豌豆蛋白、或根据本发明的第三方面的豌豆蛋白组合物、或通过根据本发明的第一方面的方法得到的豌豆蛋白在食品或饲料产品，优选地在烘焙和糖果食品中的用途。
第六方面，本发明提供了根据本发明的第二方面的豌豆蛋白、或根据本发明的第三方面的豌豆蛋白组合物、或通过根据本发明的第一方面的方法得到的豌豆蛋白用于净化饮料或饮品，优选地葡萄酒或果汁的用途。
本发明人意外发现当使包含豌豆蛋白的含水组合物经历如蛋白沉淀的分离步骤，之后使分离的蛋白经历热处理时，可以得到具有特定功能的、物理化学的和感官的特征的豌豆蛋白。
具体地，出乎意料地发现根据本文所描述的本发明的方法允许得到豌豆蛋白、豌豆蛋白组合物、或豌豆蛋白提取物或浓缩物，其除了别的之外，与不是根据本文所描述的本发明的方法得到的豌豆蛋白提取物相比，具有较低的灰分含量、较高的密度(堆积密度或振实密度两者)、较好的流动性、较好的润湿性、较低的溶解度、较低的粘度、和较低的凝胶强度。
本发明的豌豆蛋白组合物具有低亲水性，其在具有较低的水可获得性的应用中是令人感兴趣的。
本文所描述的根据本发明的豌豆蛋白和豌豆蛋白组合物的特定特征具体地使这种豌豆蛋白和豌豆蛋白组合物特别适合用于食品或饲料工业，特别是烘焙或糖果食品，如饼干、面包、华夫饼干、蛋糕、法奇软糖、挤出的谷物、和棒等。意外发现本文所描述的根据本发明的豌豆蛋白和豌豆蛋白组合物可以用于以上烘焙和糖果产品，并允许在制备这些食品期间添加较少的水，同时保持或甚至改善这种食品的质量(如质地或味道)或保质期且不损害例如用于制备烘焙产品的面团的可加工性。在制备具体的烘焙食品中使用较少的水的另一优势在于有助于在烘焙这种食品期间水的蒸发，这不仅是更加成本有效的，而且有益地影响(烘焙的)食品的整体质量。另外，可以延长包含本文所描述的根据本发明的豌豆蛋白和豌豆蛋白组合物的食品的保存时间。本文所描述的根据本发明的豌豆蛋白和豌豆蛋白组合物还特别适用于取代例如食品中的动物蛋白，如牛奶蛋白，还有取代食品中的其他植物蛋白，具体是致敏的植物蛋白如小麦蛋白。例如，本文所描述的根据本发明的豌豆蛋白和豌豆蛋白组合物可以用于部分或完全取代糖果食品如法奇软糖或法奇软糖棒中的牛奶蛋白，对于其已经意外观察到用根据本发明的蛋白可以得到较软的质地。
进一步出乎意料地发现本文所描述的根据本发明的豌豆蛋白和豌豆蛋白组合物特别适合用于净化或精制液体，例如饮料或饮品，如葡萄酒、啤酒、或果汁。在不希望受理论约束的情况下，假设本文所描述的根据本发明的豌豆蛋白和豌豆蛋白组合物特别低的溶解度可能是蛋白的净化和精制能力的原因，特别是与降低液体的浊度相关联。
独立和从属权利要求阐述了本发明的具体的和优选的特征。视情况，可以将从属权利要求的特征与独立权利要求或其他从属权利要求的特征结合。因此通过引用还明确地将所附权利要求包括在说明书中。
附图说明
图1示意性地表示根据本发明的一个实施方式的提取过程。
图2表示绘制每种提取物(A)至(D)在pH 6下的凝胶强度的曲线图。
图3表示绘制作为每种提取物(A)至(D)的pH的函数的氮溶解指数的曲线图。
图4表示绘制作为每种提取物(A)至(D)的pH的函数表示的粘度曲线的曲线图。
图5表示绘制作为每种提取物E至G的pH的函数表示的氮溶解指数曲线的曲线图。
图6表示绘制在4℃下温育96h之后包含鞣酸类物(tannins)的不同溶液的浊度的曲线图。
图7表示绘制作为在4℃下温育时间的函数的包含鞣酸类物的不同溶液的浊度的曲线图。
图8表示绘制在4℃下温育96h之后包含SiO2的不同溶液的浊度的曲线图。
图9表示绘制作为在4℃下温育时间的函数的包含SiO2的不同溶液的浊度的曲线图。
图10表示绘制在4℃下温育96h之后的不同溶液的浊度的曲线图。
图11表示绘制在4℃下温育96h之后的不同豌豆蛋白溶液的浊度的曲线图。
图12表示绘制用豌豆蛋白提取物制备的不同面团的发酵指数的曲线图。
图13表示绘制实施例5中制备的面包的面包体积的曲线图。
图14表示绘制实施例5中制备的面包的面包屑硬度的曲线图。
图15表示绘制作为实施例5中制备的棒的保质期(shelf life)的函数的棒硬度的曲线图。
图16表示绘制作为每种提取物H和I的pH的函数的氮溶解指数曲线的曲线图。
图17表示作为用发酵乳酸杆菌LMG 6902、发酵乳酸杆菌LMG 18026、卷曲乳酸杆菌LMG 12005或嗜酸乳酸杆菌LMG 8151发酵的豌豆的发酵时间的函数的以％计的糖/干物质的浓度的曲线图。
图18表示绘制作为发酵时间的函数的用发酵乳酸杆菌LMG 6902、发酵乳酸杆菌LMG 18026、卷曲乳酸杆菌LMG 12005或嗜酸乳酸杆菌LMG 8151发酵的去皮豌豆的pH(7A)和水溶液(汁液)的pH(7B)的曲线图。
图19表示绘制作为发酵时间的函数的用发酵乳酸杆菌LMG 6902、发酵乳酸杆菌LMG 18026、卷曲乳酸杆菌LMG 12005或嗜酸乳酸杆菌LMG 8151发酵的去皮豌豆的酸度(8A)和水溶液(汁液)的酸度(8B)的曲线图。
图20表示绘制作为发酵时间的函数的水溶液(汁液)的乳酸菌(发酵乳酸杆菌LMG6902、发酵乳酸杆菌LMG 18026、卷曲乳酸杆菌LMG 12005或嗜酸乳酸杆菌LMG 8151)浓度的曲线图。
具体实施方式
在描述本发明的方法之前，应当理解的是本发明不限于描述的具体方法、组分、产品或组合，当然这些方法、组分、产品和组合本身可以改变。还应当理解的是本文使用的术语不旨在是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限定。
如本文所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括单数和复数指示物。
本文所使用的术语“包含(comprising)”、“包括(comprises)”和“由……组成(comprised of)”与“包含(including)”、“包括(includes)”或“含 (containing)”、“含有(contains)”同义，且是包括性的或开放的，且不排除另外的、非列举的成员、要素或方法步骤。应当了解的是本文所使用的术语“包含(comprising)”、“包括(comprises)”和“由……组成(comprised of)”包括术语“由……组成(consisting of)”、“由……组成(consists)”和“由……组成(consists of)”以及术语“基本由……组成(consisting essentiallyof)”、“基本由……组成(consists essentially)”和“基本由……组成(consistsessentially of)”。
通过端点列举的数值范围包括包含在相应范围内的所有数值和分数 (fraction)以及列举的端点。
本文所使用的术语“约”或“大约”当涉及可测值如参数、量、时间段等时，意在包括从指定值及其+/-20％或更小、优选+/-10％或更小、更优选+/-5％或更小、以及仍更优选+/-1％的偏差，这种偏差范围适用于进行公开的发明。应当理解的是修饰语“约”或“大约”涉及的值本身也是确切地，并优选地被公开。
而术语“一个或多个”或“至少一个”，如一组成员中的一个或多个或至少一个成员本身是清楚的，通过进一步举例，术语尤其包括所述成员中的任一个的引用，或所述成员中的任何两个或更多个，如例如所述成员中任何≥3、≥4、≥5、≥6或≥7等以及最高达所有所述成员的引用。
因此，在本说明书中引用的所有参考文献通过引用整体结合于此。具体地，通过引用结合本文专门提及的所有参考文献的教导。
除非另外限定，否则用于公开本发明的所有术语(包括技术和科学术语)都具有与本发明所属本领域技术人员通常理解的相同含义。通过进一步指导，包括术语定义以更好地了解本发明的教导。
在以下段落中，更详细地限定了本发明的不同方面。所限定的每个方面可以与任何其他一个或多个方面结合，除非明确地指示相反。具体地，指示为优选或有利的任何特征可以与指示为优选或有利的任何其他一个或多个特征相结合。
贯穿本说明书提及“一种实施方式”或“一个实施方式”是指与实施方式结合描述的具体特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方式中。因而，在本说明书的多个位置出现的短语“在一种实施方式中”或“在一个实施方式中”不一定全都涉及相同的实施方式，但是可以涉及相同的实施方式。此外，如本领域技术人员从本公开中可以清楚的，在一个或多个实施方式中，可以以任何合适的方式组合具体特征、结构或特性。此外，如本领域技术人员将要理解的，虽然本文所描述的一些实施方式包括一些但不包括其他实施方式包括的其他特征，不同实施方式的特征的组合意在在本发明的范围内，并形成不同的实施方式。例如，在所附权利要求中，可以以任何组合使用要求保护的实施方式中的任一项。
在本发明以下详细的描述中，参考形成其一部分的附图，其中仅通过说明的方式示出可以实践本发明的特定实施方式。应当理解的是可以利用其他实施方式，且在不背离本发明的范围的情况下可以作出结构或逻辑上的改变。因此以下详细的描述不具有限制意义，且通过所附权利要求限定本发明的范围。
为此，具体地通过以下方面和实施方式和数个陈述1至68中的一个或多个中的任一项或任何组合获取本发明。
1.用于提取豌豆蛋白的方法，包括以下步骤：
(a)提供包含豌豆蛋白的含水组合物；
(b)优选地使用沉淀、絮凝、过滤、和/或色谱法，从包含豌豆蛋白的所述含水组合物中分离所述豌豆蛋白；
(c)作为具有pH在4.0至5.8范围内的含水浆料得到所述分离的豌豆蛋白；
(d)使具有pH在4.0至5.8范围内的所述含水浆料经历至少75℃的温度。
优选地，步骤(c)中包含豌豆蛋白的含水浆料具有至多45％，优选至多40％，优选至多35％，优选至多30％，优选至多25％的干物质，以及在一个实施方式中，可以通过用水稀释将干物质调节到该程度。
2.根据陈述1的方法，其中，步骤(d)包括在75℃至210℃范围内，优选85℃至160℃范围内，例如90℃至150℃的温度下使所述含水浆料经历热处理。
3.根据陈述1或2的方法，其中，步骤(d)包括使所述含水浆料经历热处理至少0.01秒，优选0.01秒至20分钟范围内，优选10秒至 10分钟范围内的时间。
4.根据陈述1至3中任一项的方法，其中，步骤(d)包括使所述含水浆料经历以下的热处理：在115℃至210℃范围内的温度下持续15 s至0.01s范围内的时间；在95℃至115℃范围内的温度下持续5min 至15s范围内的时间；在75℃至95℃范围内的温度下持续15min至5min范围内的时间；在75℃至110℃范围内的温度下持续10min 至2min范围内的时间；在80℃至100℃范围内的温度下持续8min 至5min范围内的时间；或在130℃至150℃范围内的温度下持续 8s至1s范围内的时间。
5.根据陈述1至4中任一项的方法，其中，当温度升高时，在步骤(d) 中使具有pH在4.0至5.8范围内的所述含水浆料经历至少75℃的温度的时间减少。
6.根据陈述1至5中任一项的方法，其中，所述步骤(b)包括浓缩所述豌豆蛋白。
7.根据陈述1至6中任一项的方法，其中，所述步骤(b)包括沉淀、絮凝、过滤、和/或色谱法步骤中的至少一种。
8.根据陈述1至7中任一项的方法，其中，步骤(b)包括等电沉淀。
9.根据陈述1至8中任一项的方法，其中，步骤(b)包括将包含豌豆蛋白的所述含水组合物的pH调节至4.0至5.8范围内，优选4.5至 5.5范围内的值。
10.根据陈述1至9中任一项的方法，其中，步骤(c)包括将含水浆料的pH调节或保持在4.0至5.8的范围内。
11.根据陈述1至10中任一项的方法，其中，步骤(a)中包含豌豆蛋白的所述含水组合物具有至少6.0，优选6.0至9.0范围内，优选6.5 至8.5范围内的pH。
12.根据陈述1至11中任一项的方法，其中，将步骤(a)中包含豌豆蛋白的所述含水组合物的pH调节到至少6.0，优选地6.0至9.0的范围内，优选地6.5至8.5的范围内。
13.根据陈述1至12中任一项的方法，其中，在步骤(a)之前，优选地在乳酸菌存在下，使包含豌豆，优选地包含去皮豌豆的含水组合物经历发酵。
14.根据陈述13的方法，其中，在一种或多种乳酸杆菌存在下进行所述发酵。
15.根据陈述1至14中任一项的方法，其中，在步骤(b)之前或期间，使包含豌豆蛋白的所述含水组合物或所述豌豆蛋白经历热处理，优选地经历至少30℃，例如至少40℃，例如至多80℃，例如至少50℃且至多80℃，例如至少53℃且至多78℃，例如至少54℃且至多75℃的温度。
16.根据陈述1至15中任一项的方法，其中，在步骤(b)之前或期间，使包含豌豆蛋白的所述含水组合物或所述豌豆蛋白经历巴氏杀菌。
17.根据陈述1至16中任一项的方法，进一步包括步骤(d)之后干燥所述含水浆料的步骤，优选喷雾干燥，优选地得到如在室温下对悬浮于90g水中的10g豌豆蛋白组合物测量的，具有pH在4.0至5.8 范围内的豌豆蛋白组合物。
18.通过根据陈述1至17中任一项的方法可得到的豌豆蛋白。
19.豌豆蛋白组合物，其基于组合物的总的干物质，包含至少60wt％的蛋白，其中，如基于含水组合物的总重量，对包含3wt％的所述豌豆蛋白组合物的含水组合物测量的，所述豌豆蛋白组合物具有在pH 7.0下至多15％的氮溶解指数(NSI)，以及优选地至多11％，优选至多10％，优选至多9％，优选至多8％的NSI。优选地，基于组合物的总重量，豌豆蛋白组合物具有至少90％的干物质。
使用LECO分析仪确定选择样品的氮含量(原子wt.％)。使用的技术是经典的杜马斯法(Dumas method)，其使用热导检测(TCD)：在1200℃下在氧中燃烧称重的样品。经由燃烧催化剂、洗涤器和通过用还原铜填充的管，用氦载气扫除燃烧产物(包含N2和NOx)。铜除去过量的氧并将 NOx还原为N2。然后用TCD测量N2。
20.根据陈述19的豌豆蛋白组合物，其中，如在室温下对悬浮于90g 水中的10g豌豆蛋白组合物测量的，所述组合物具有4.0至5.8范围内的pH。
21.包含根据陈述18的豌豆蛋白或根据陈述19或20中任一项的豌豆蛋白组合物的可食用的组合物，优选食品或饲料产品。
22.根据陈述18的豌豆蛋白或根据陈述19或20中任一项的豌豆蛋白组合物在食品或饲料产品，优选地在烘焙食品和糖果食品，如饼干、面包、华夫饼干、蛋糕、法奇软糖、基础的谷物、和棒等中的用途。
23.根据陈述18的豌豆蛋白或根据陈述19或20中任一项的豌豆蛋白组合物用于净化饮品和/或饮料，优选葡萄酒、果汁、啤酒的用途。
24.根据陈述13或14的方法，其中，所述发酵之后，研磨所述豌豆。
25.根据陈述1至17、和24中任一项的方法，其中，在步骤(a)之前，所述方法包括以下步骤：
-提供豌豆，优选去皮豌豆，
-可选地研磨所述豌豆；以及
-水合所述豌豆，或所述可选地研磨的豌豆；
26.根据陈述1至17、24和25中任一项的方法，其中，在步骤(a)之前，所述方法包括以下步骤：
(a1)优选地在一种或多种乳酸菌存在下，使包含豌豆的含水组合物经历发酵；
(b1)研磨所述豌豆；从而得到研磨的豌豆；
(c1)分馏所述研磨的豌豆以得到包含至少一种蛋白的馏分，也称为包含豌豆蛋白的含水组合物。
27.根据陈述13、14、24、或26中任一项的方法，其中，使步骤(a1) 中的所述豌豆经历发酵直到如在室温下对已经研磨并悬浮于9g水中的1g所述豌豆测量的，所述豌豆的pH是至多5.5，优选至多5.0，更优选在pH 3.5至pH 5.0的范围内。
28.根据陈述13、14、24、或26和27中任一项的方法，其中，使步骤 (a1)中的所述豌豆经历发酵直到如在室温下对已经研磨并悬浮于 9g水中的1g所述豌豆测量的，所述豌豆的pH降低至少1pH单位，优选至少1.5pH单位。
29.根据陈述13、14、24、或26至28中任一项的方法，其中，步骤(a1) 包括将干豌豆和/或去皮豌豆添加到水溶液中，优选地基于干豌豆的总重量，添加具有80％至95％范围内的干物质含量的干豌豆。
30.根据陈述13、14、24、或26至29中任一项的方法，其中，基于豌豆的总重量，步骤(a1)之后和步骤(b1)之前的所述豌豆具有35％至60％范围内的干物质含量。
31.根据陈述13、14、24、或26至30中任一项的方法，其中，基于豌豆的总重量，步骤(a1)包括发酵所述豌豆直到它们具有35％至60％范围内的干物质含量。
32.根据陈述13、14、24、或26至31中任一项的方法，其中，使步骤 (a1)中的所述豌豆经历发酵至少3h，优选至少3h且至多24h。
33.根据陈述13、14、24、或26至32中任一项的方法，其中，使步骤 (a1)中的所述豌豆在30℃至50℃范围内，优选35℃至45℃范围内的温度下经历发酵。
34.根据陈述13、14、24、或26至33中任一项的方法，其中，步骤(a1) 包括在乳酸菌存在下，优选地在一种或多种乳酸杆菌存在下，发酵所述豌豆。
35.根据陈述13、14、24、或26至34中任一项的方法，其中，在每
ml包含豌豆的所述含水组合物至少102cfu至至多1010cfu乳酸菌的存在下，使步骤(a1)中的所述豌豆经历发酵。
36.根据陈述13、14、24、或26至35中任一项的方法，其中，在步骤 (c1)中分馏所述研磨的豌豆包括从豌豆的剩余部分中分离包含在豌豆中的至少一部分蛋白，优选地基于所述馏分的总的干物质，包含至少50wt％蛋白的馏分中。
37.根据陈述26至36中任一项的方法，其中，在步骤(c1)中分馏所述研磨的豌豆包括将研磨的豌豆的pH调节至至少6，优选至少7的 pH，最优选至少8且至多9的pH。可以使用任何合适的碱如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙进行这种pH调节。优选地，对包含具有至多45％、优选至多40％、优选至多35％、优选至多30％、优选至多25％的干物质的研磨的豌豆的含水组合物进行这种pH调节。在一个实施方式中，通过相应地添加水将研磨的豌豆的干物质含量调节到以上列举的干物质含量。
38.根据陈述26至37中任一项的方法，其中，在步骤(c1)中分馏所述研磨的豌豆包括使所述研磨的豌豆经历一个或多个分离步骤，优选一个或多个倾析步骤，优选一个或多个离心倾析步骤。
39.根据陈述13、14、24、或26至38中任一项的方法，其中，步骤(a1) 包括使去皮的豌豆与水溶液接触。
40.根据陈述13、14、24、或26至39中任一项的方法，其中，步骤(a1) 包括使干燥的去皮豌豆与水溶液接触，优选基于干燥的去皮豌豆的总重量，具有80％至95％范围内的干物质含量的干燥的去皮豌豆。
41.根据陈述13、14、24、或26至40中任一项的方法，其中，步骤(a1) 包括发酵所述豌豆直到它们具有基于豌豆的总重量，40％至60％范围内的干物质含量。
42.根据陈述13、14、24、或26至41中任一项的方法，其中，步骤(a1) 之后和步骤(b1)之前的所述豌豆具有基于豌豆的总重量，40％至 50％范围内的干物质含量。
43.根据陈述13、14、24、或26至42中任一项的方法，其中，在研磨步骤(b1)之前、期间和/或之后，添加水溶液，优选水，优选地以得到包含研磨的豌豆的含水组合物，基于组合物的总重量，所述组合物包含15％至35％的干物质，优选地包含15％至35％，优选18％至33％，例如20％至30％，如至少20％，例如至少21％，例如至少22％，例如至少23％，例如至少24％，例如至少25％、26％、27％、 28％、29％，例如至多30％，例如至多35％。
44.根据陈述13、14、24、或26至43中任一项的方法，其中，使步骤 (a1)中的所述豌豆经历发酵至多24h，例如至多20h，例如至多 18h，例如至多12h，例如至多10h。
45.根据陈述13、14、24、或26至44中任一项的方法，其中，在步骤 (a1)结束时，所述豌豆具有每g豌豆25至250mEq OH-范围内的酸度。
46.根据陈述13、14、24、或26至45中任一项的方法，其中，在步骤 (c1)中分馏所述研磨的豌豆包括将包含研磨的豌豆的含水组合物的pH调节至至少6，优选至少7，优选至少8的pH，最优选至少 7.5且至多9的pH，优选至少7.5且至多8.5的pH，和从所述研磨的豌豆中分离包含蛋白的馏分。优选地，对包含具有至多45％、优选至多40％、优选至多35％、优选至多30％、优选至多25％的干物质的研磨的豌豆的含水组合物进行这种pH调节。在一个实施方式中，通过相应地添加水将研磨的豌豆的干物质含量调节到以上列举的干物质含量。
47.根据陈述46的方法，其中，使包含所述至少一种蛋白的馏分经历至少30℃，例如至少40℃，例如至少50℃，例如至少55℃，例如至多80℃，例如至少50℃且至多80℃，例如至少53℃且至多78℃，例如至少54℃且至多75℃的温度。
48.根据陈述13、14、24、或26至47中任一项的方法，其中，步骤(a1) 中包含豌豆的所述含水组合物包含水溶液，优选水。
49.根据陈述13、14、24、或26至48中任一项的方法，其中，步骤(a) 中包含豌豆的所述含水组合物中的豌豆的量优选地在每m3包含豌豆的含水组合物150至500kg豌豆的范围内。
50.根据陈述13、14、24、或26至49中任一项的方法，其中，已经研磨所述组合物之后，如对包含豌豆的含水组合物测量的，包含豌豆的所述含水组合物在步骤(a1)的发酵之前或开始时具有至少6，例如至少6.2，例如至少6.4的pH。
51.根据陈述1至17、或24至50中任一项的方法，其中，在步骤(b) 之前，使包含豌豆蛋白的所述含水组合物经历至少30℃，例如至少 55℃，例如至多80℃，例如至少50℃且至多80℃，例如至少55℃且至多78℃的温度。
52.根据陈述13、14、24、或26至51中任一项的方法，其中，所述乳酸菌选自包含乳酸杆菌、明串球菌、片球菌、链球菌、气球菌、肉杆菌、肠球菌、酒球菌、芽孢乳酸杆菌、四联球菌、漫游球菌、和 Weisella、以及它们的组合的组。
53.根据陈述13、14、24、或26至52中任一项的方法，其中，乳酸菌是乳酸杆菌，最优选地是选自包含发酵乳酸杆菌、卷曲乳酸杆菌、面包乳酸杆菌、粘膜乳酸杆菌、Lactobacillus pontis、嗜酸乳酸杆菌、植物乳酸杆菌、瑞士乳酸杆菌、布氏乳酸杆菌、德式乳酸杆菌和干酪乳酸杆菌以及它们的混合物的组。
54.根据陈述13、14、24、或26至53中任一项的方法，其中，乳酸菌选自包含发酵乳酸杆菌、卷曲乳酸杆菌、面包乳酸杆菌、粘膜乳酸杆菌、Lactobacillus pontis、和它们的混合物的组。
55.根据陈述13、14、24、或26至54中任一项的方法，其中，乳酸菌选自包含发酵乳酸杆菌、卷曲乳酸杆菌、面包乳酸杆菌、粘膜乳酸杆菌、Lactobacillus pontis、和它们的混合物的组。
56.根据陈述13、14、24、或26至55中任一项的方法，其中，所述乳酸菌是发酵乳酸杆菌、或卷曲乳酸杆菌。
57.根据陈述13、14、24、或26至53中任一项的方法，其中，所述乳酸菌是发酵乳酸杆菌、卷曲乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌、或植物乳酸杆菌。
58.根据陈述13、14、24、或26至53中任一项的方法，其中，所述乳酸菌是发酵乳酸杆菌、卷曲乳酸杆菌、或嗜酸乳酸杆菌。
59.根据陈述13、14、24、或26至58中任一项的方法，其中，如在室温下对已经用95g水研磨的5g干豌豆测量的，干豌豆在步骤(a1) 开始之前具有至少6.0的pH，优选6.0至7.0范围内(即发酵之前)，如例如至少6.0，例如至少6.1，例如至少6.2，例如至少6.3，例如至多6.9，例如至多7.0，优选6.25至6.75范围内的pH。
60.根据陈述13、14、24、或26至59中任一项的方法，其中，所述发酵是厌氧发酵。
61.根据陈述1至17、或24至60中任一项的方法，包括以下步骤：
(i1)优选地在一种或多种乳酸菌存在下，使包含豌豆的含水组合物经历发酵；
(ii1)在水存下在研磨所述豌豆；从而得到包含研磨的豌豆的含水组合物；
(iii1)优选地通过将所述含水组合物的pH调节到至少6的pH，分馏包含研磨的豌豆的所述含水组合物以得到包含豌豆蛋白的至少一种含水组合物。
可以使用任何合适的碱如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙进行这种pH 调节。优选地，对包含具有至多45％、优选至多40％、优选至多35％、优选至多30％、优选至多25％的干物质的研磨的豌豆的含水组合物进行这种 pH调节。在一个实施方式中，通过相应地添加水将研磨的豌豆的干物质含量调节到以上列举的干物质含量。
62.根据陈述1至17、或24至61中任一项的方法，包括以下步骤：
(i)研磨所述豌豆，优选干豌豆；
(ii)在水溶液存在下分馏所述研磨的豌豆以得到包含豌豆蛋白的至少一种含水组合物；
(iii)从包含豌豆蛋白的所述含水组合物中分离或浓缩所述豌豆蛋白；
(iv)作为具有pH在4.0至5.8范围内的含水浆料得到所述分离的或浓缩的豌豆蛋白；以及
(v)使具有pH在4.0至5.8范围内的所述含水浆料经历至少75℃的温度。
优选地，步骤(iv)中包含豌豆蛋白的含水浆料具有至多45％，优选至多40％，优选至多35％，优选至多30％，优选至多25％的干物质，以及在一个实施方式中，可以通过用水稀释将干物质调节到该程度。
63.根据陈述1至17、或24至62中任一项的方法，包括以下步骤：
(i)优选地在一种或多种乳酸菌存在下，使包含豌豆的含水组合物经历发酵；
(ii)研磨所述豌豆；
(iii)在水溶液存在下分馏所述研磨的豌豆以得到包含豌豆蛋白的至少一种含水组合物；
(iv)从包含豌豆蛋白的所述含水组合物中分离或浓缩所述豌豆蛋白；
(v)作为具有pH在4.0至5.8范围内的含水浆料得到所述分离的或浓缩的豌豆蛋白；以及
(vi)使具有pH在4.0至5.8范围内的所述含水浆料经历至少75℃的温度。
优选地，步骤(v)中包含豌豆蛋白的含水浆料具有至多45％，优选至多40％，优选至多35％，优选至多30％，优选至多25％的干物质，以及在一个实施方式中，可以通过用水稀释将干物质调节到该程度。
64.根据陈述26至63中任一项的方法，其中，所述发酵步骤包括分馏所述研磨的豌豆至基于所述馏分的总的干物质包含至少50wt％蛋白的馏分中。
65.根据陈述26至64中任一项的方法，其中，所述分馏步骤包括从豌豆的剩余部分中分离包含在豌豆中的至少一部分蛋白，优选地在基于所述馏分的总的干物质包含至少50wt％蛋白的馏分中。
66.根据陈述61至65中任一项的方法，其中，作为具有pH在4.0至 5.8范围内的含水浆料得到所述分离的或浓缩的豌豆蛋白包括将含水浆料的pH调节或保持在4.0至5.8的范围内。
67.通过根据陈述1至17、或24至66中任一项的方法可得到的豌豆蛋白组合物，基于组合物的总的干物质，包含至少60wt.％的蛋白，其中，如对基于含水组合物的总重量包含3wt％的所述豌豆蛋白组合物的含水组合物测量的，所述豌豆蛋白组合物具有在pH 7.0下至多 15％的氮溶解指数，以及优选地所述豌豆蛋白组合物具有至多11％，优选至多10％，优选至多9％，优选至多8％的NSI。
68.根据陈述19、20和67中任一项的豌豆蛋白组合物，其中，如在室温下对悬浮于90g水中的10g豌豆蛋白组合物测量的，所述组合物具有4.0至5.8范围内的pH。
在第一方面，本发明涉及用于提取豌豆蛋白的方法，包括以下步骤：
(a)提供包含豌豆蛋白的含水组合物；
(b)优选地使用沉淀、絮凝、过滤、和/或色谱法，从包含豌豆蛋白的所述含水组合物中分离或浓缩所述豌豆蛋白；
(c)作为pH在4.0至5.8范围内的含水浆料得到所述分离的或浓缩的豌豆蛋白；
(d)使pH在4.0至5.8范围内的所述含水浆料经历至少75℃的温度。
优选地，步骤(c)中包含豌豆蛋白的含水浆料具有至多45％，优选至多40％，优选至多35％，优选至多30％，优选至多25％的干物质，以及在一个实施方式中，可以通过用水稀释调节到该程度。
根据本发明，以上指出的根据本发明的方法的步骤(a)至(d)可以以及优选地以以下顺序进行，即步骤(a)随后是步骤(b)，随后是步骤 (c)，随后是步骤(d)。然而应当理解的是，在任何情况下在步骤(c) 中分离沉淀的蛋白之后进行步骤(d)中的热处理。
如本文所使用的，术语“豌豆”是指包含在豌豆(Pisum sativum)和它的亚种、变种或培养品种的豆荚中的圆形种子。优选地，豌豆是黄色豌豆，优选干燥的黄色豌豆，即，以干燥状态收获的黄色豌豆。本文所使用的“豌豆蛋白”因此是指包含在豌豆种子中的蛋白。
如本文所使用的，“提取豌豆蛋白”是指从豌豆的其他成分中释放和分离豌豆蛋白。根据本发明的某些实施方式提取豌豆蛋白可以包括分离或纯化豌豆蛋白。技术人员将要理解豌豆蛋白提取物不是全部由蛋白组成，且一定量的另外的组分(杂质)可以存在于豌豆蛋白提取物中，如脂质、糖类、矿物质等。
在本发明的一些实施方式中，豌豆蛋白、豌豆蛋白组合物、和豌豆蛋白提取物基于干物质，包含至少50wt％的蛋白(即，每100g总的干物质 50g蛋白)，优选至少75wt％的蛋白。在一些实施方式中，基于干物质，豌豆蛋白提取物包含至少50wt％至至多95wt％或99wt％的蛋白，如至少 75wt％至至多99wt％的蛋白。粗提取物一般包含比精制或纯化的提取物更低分数的蛋白。
如本文所使用的，术语“包含豌豆蛋白的含水组合物”或“包含豌豆蛋白的水溶液”是指包含水和豌豆蛋白的组合物或溶液。在一些实施方式中，这种溶液可以包含进一步的成分。
在一个实施方式中，在以上所描述的根据本发明的方法的步骤(a) 中的包含豌豆蛋白的含水组合物基于组合物的总重量包含至少1.0％的干物质，优选至少至少2.0％的干物质，更优选至少3.0％的干物质，如例如至少4.0％的干物质，如例如至少5.0％的干物质。
在另一个实施方式中，在以上所描述的根据本发明的方法的步骤(a) 中的包含豌豆蛋白的含水组合物包含1.0％至40％的干物质，优选2.0％至 30％的干物质，更优选3.0％至20％的干物质，更优选3.0％至15％的干物质，如3.0％至10％。
在一个实施方式中，包含蛋白馏分的干物质包含至少50wt％的豌豆蛋白，优选至少60wt％的豌豆蛋白，更优选至少65wt％的豌豆蛋白，如例如至少70wt％，如至少55wt％且至多80wt％，例如60wt％至80wt％，例如60wt％至78wt％。
在一个实施方式中，包含豌豆蛋白的含水组合物的pH具有以下pH 或调节为以下pH：至少6.0的pH，优选地将pH调节至至少6.5的pH，优选在pH 6.0至8.5的范围内，优选在pH6.5至8.5的范围内，优选在pH 7.0至8.5的范围内，优选pH 7.3至8.0，如例如至少pH 7.2，例如至少7.3、 7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0。为此，例如氢氧化钠或任何合适的碱可以用于将pH调节到期望水平。
在一些实施方式中，在以上所描述的根据本发明的方法的步骤(a) 中包含豌豆蛋白的含水组合物是包含研磨的豌豆的含水组合物。
如本文所使用的，术语“研磨”具有其在本领域的普通含义。通过进一步指导，本文所使用的研磨可以指在暴露于通过克服内部结合力来破坏 (trench)结构的机械力的情况下，粉碎固体物质(即豌豆)的过程。因而研磨使豌豆的自然结构解体。在一个优选的实施方式中，包含至少25％干物质的研磨的豌豆的研磨粒径具有至多300μm，优选至多250μm，例如至多200μm的D50，D50定义为按体积计百分之五十的颗粒具有小于 D50的大小的粒径；以及D50通过在Malvern型分析仪上的激光衍射分析测得。
例如，可以通过筛选或通过激光衍射分析测量D50。例如，可以有利地使用MalvernInstruments的激光衍射系统。可以通过Malvern型分析仪上的激光衍射分析测量粒径。可以在研磨豌豆并将其悬浮于具有25％干物质的水悬浮液中之后，通过Malvern型分析仪上的激光衍射分析测量粒径。合适的Malvern系统包括Malvern 2000、Malvern MasterSizer2000(如 Mastersizer S)、Malvern 2600和Malvern 3600系列。这些仪器连同它们的操作说明书满足或甚至超过ISO 13320标准内阐述的要求。Malvern MasterSizer(如Mastersizer S)也可以是有用的，因为它通过应用Mie理论，使用适当的光学装置，可以对于范围的较低端更精确地测量D50，例如低于8μm的平均粒径。
在某些实施方式中，研磨的豌豆是研磨的去皮豌豆，即，除去皮的豌豆。去皮的豌豆是除去了外种皮的豌豆。可以通过本领域已知的技术，如例如用脱皮机机械地进行去皮。应当理解的是当本文提及去皮豌豆时，在一些实施方式中，不是所有但是大多数的单个豌豆是去皮的，如优选地大于90％的豌豆是去皮的。
在一个实施方式中，研磨豌豆之前、期间、或之后，向豌豆中添加水溶液，优选水，如自来水、或处理的井水，优选饮用水，即适用于人类消耗的水。在进一步的实施方式中，向豌豆中添加一定量的水溶液使得所述组合物基于组合物的总重量包含15％至35％的干物质，优选地基于组合物的总重量包含15％至35％，优选20％至30％，如至少19％，如至少20％，如至少21％，如至少22％，例如至少23％，例如至少24％，例如至少25％，例如至少26％，例如至少27％，例如至少28％，例如至少29％，例如至多30％，例如至多35％的干物质。在一个优选的实施方式中，研磨过程是湿磨过程，从而在研磨之前或期间，向豌豆中添加水溶液。
技术人员将要理解如果包含豌豆蛋白的含水组合物是包含研磨的豌豆的含水组合物，那么豌豆的所有或基本上所有的成分包含在含水组合物中。
在一个优选的实施方式中，在本文所描述的根据本发明的方法的步骤 (a)中包含豌豆蛋白的含水组合物是指包含豌豆蛋白的馏分，优选地在研磨豌豆之后得到，以及更优选地在分馏所述研磨的豌豆之后得到。在一个实施方式中，以上描述的根据本发明的方法的步骤(c1)包括将所述研磨的豌豆分馏为包含基于所述馏分的总干物质至少50wt％蛋白的馏分。如本文所使用的，术语“分馏”是指将包含在豌豆中的至少一部分蛋白与豌豆的其余部分分离的方法。应当理解的是，当提及分馏步骤时，在一些实施方式中，将不是所有的，但是大部分的单独蛋白分离，如基于研磨的豌豆的总蛋白含量，优选地分离至少50wt％，优选至少60wt％的蛋白。
可以通过本领域已知的任何方式，如将研磨的豌豆分馏为蛋白馏分，实现步骤(a)中提供包含豌豆蛋白的含水组合物。将研磨的豌豆分馏为包含蛋白的馏分可以通过本领域已知的任何方式如添加合适的碱、或盐实现。
优选地，通过调节研磨的豌豆的pH分馏研磨的豌豆。优选地，通过升高包含研磨的豌豆的含水组合物的pH分馏研磨的豌豆。优选地，分馏步骤(c1)包括将研磨的豌豆的pH调节至pH至少6，优选至少7，最优选pH至少8且至多9。优选地，分馏步骤(c1)包括升高包含研磨的豌豆的含水组合物的pH。在一个优选的实施方式中，将组合物的pH调节至至少6，更优选至少7的pH。在另一个优选的实施方式中，将组合物的 pH调节至pH 6至pH 9，更优选地pH7至pH 9范围内的值，如至少7.0，例如至少7.1，例如至少7.2，例如至少7.3，例如至少7.4，例如至少7.5，例如至少7.6，例如至少7.7，例如至少7.8，例如至少7.9，例如至少8.0，例如至少8.1，例如至少8.2，例如至少8.3，例如至少8.4，例如至多8.5，例如至多8.6，例如至多8.7，例如至多8.8，例如至多8.9，例如至多9.0，最优选地在pH 7.5至pH 8.5范围内，最优选pH 8或约pH 8。优选地，对包含具有至多45％、优选至多40％、优选至多35％、优选至多30％、优选至多25％的干物质的研磨的豌豆的含水组合物进行这种pH调节。在一个实施方式中，通过相应地添加水将研磨的豌豆的干物质含量调节到以上列举的干物质含量。可以使用任何合适的碱如氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾等进行这种pH调节。在一个优选的实施方式中，通过添加氢氧化钠调节包含组合物的研磨的豌豆的pH。
在一个优选的实施方式中，在调节pH之后，通过倾析或通过使用水力旋流器，优选地通过倾析，优选离心倾析(即，通过倾析式离心机)从包含研磨的豌豆的含水组合物中将包含蛋白的馏分分离，其中，包含蛋白的馏分是上清液，且颗粒是包含除了别的之外，研磨的豌豆的其余含量和一些残留蛋白的馏分。在一个实施方式中，可以连续进行多于一个分馏步骤。例如，倾析之后，可以使颗粒悬浮于水溶液(优选地悬浮于优选具有与第一分馏步骤类似或更高的pH(优选pH 8.5或约pH 8.5)的水溶液中) 并使其经历倾析步骤，以重新得到上清液中其他的蛋白。
应当理解的是可以与研磨的豌豆的分馏同时进行研磨豌豆的过程，或在替换实施方式中，可以在分馏步骤之前进行研磨豌豆的过程。
应当理解的是包含蛋白的馏分还可以包含进一步的成分，尤其是通过分馏步骤变得可溶或保持可溶的那些。在一个优选的实施方式中，蛋白在包含蛋白的馏分中的浓度(基于干重)是至少50wt％，优选至少60wt％，如至少55wt％且至多80wt％，例如60wt％至80wt％，例如60wt％至78 wt％。
在一个实施方式中，基于组合物的总重量，包含蛋白的馏分包含至少 1.0％的干物质，优选至少2.0％的干物质，更优选至少3.0％的干物质，如例如至少4.0％的干物质，如例如至少5.0的％干物质。
在另一个实施方式中，包含蛋白的馏分包含1.0％至40％的干物质，优选2.0％至30％的干物质，更优选3.0％至20％的干物质，更优选3.0％至 15％的干物质，如3.0％至10％。
在一个实施方式中，包含蛋白的馏分的干物质包含至少50wt％的豌豆蛋白，优选至少60wt％的豌豆蛋白，更优选至少65wt％的豌豆蛋白，如例如至少70wt％，如至少55wt％且至多80wt％，或在60wt％和80wt％之间，或在60wt％和78wt％之间。
在一些实施方式中，在一个另外的步骤中，使包含蛋白的馏分(本文也称为包含豌豆蛋白的含水组合物)经历至少一次热处理，优选地使包含蛋白的所述馏分经历至少30℃，例如至少40℃，例如至少50℃的温度，例如使包含蛋白的所述馏分经历30℃至90℃范围内，更优选50℃至80℃范围内，更加优选55℃至75℃范围内，如例如55℃、60℃、65℃、70℃、或75℃的温度。在一个实施方式中，热处理是从50℃至60℃，例如从 55℃至65℃，例如从60℃至70℃，例如从65℃至75℃，例如从70℃至80℃。技术人员将理解这种热处理可以是巴氏杀菌。巴氏杀菌是本领域熟知的并可以包括在特定温度或温度范围热处理特定时间或时间范围。技术人员将理解通常当热处理的温度升高时，热处理的持续时间减少。
本方法的步骤(b)包括从包含豌豆蛋白的所述含水组合物(即从包含蛋白的所述馏分)中分离所述豌豆蛋白。如本文所使用的，术语“分离的”或“分离”可以指从包含蛋白的所述馏分中分离蛋白的过程。术语“浓缩”也可以与“分离”互换使用。相应地，在一个实施方式中，在以上所描述的根据本发明的方法的步骤(b)中，从包含豌豆蛋白的所述含水组合物中浓缩豌豆蛋白。优选地，可以使用沉淀、絮凝、过滤、和/或色谱法、或它们的组合进行所述分离或浓缩步骤。
在一个实施方式中，本发明涉及用于提取豌豆蛋白的方法，包括以下步骤：
(a)提供包含豌豆蛋白的含水组合物，其中，通过包括以下步骤的方法得到所述组合物：
(a1)研磨豌豆，优选去皮豌豆；
(b1)分馏所述研磨的豌豆以得到包含至少一种蛋白的馏分，从而形成包含豌豆蛋白的含水组合物；
(b)优选地使用沉淀、絮凝、过滤、和/或色谱法，从包含豌豆蛋白的所述含水组合物中分离或浓缩所述豌豆蛋白；
(c)作为具有pH在4.0至5.8范围内的含水浆料得到所述分离的或浓缩的豌豆蛋白；
(d)使具有pH在4.0至5.8范围内的所述含水浆料经历至少75℃的温度。
优选地，步骤(c)中包含豌豆蛋白的含水浆料具有至多45％，优选至多40％，优选至多35％，优选至多30％，优选至多25％的干物质，以及在一个实施方式中，可以通过用水稀释调节到该程度。
在一个实施方式中，可以使用沉淀、絮凝、过滤、和/或色谱法，进行从包含豌豆蛋白的所述含水组合物中分离或浓缩所述豌豆蛋白。
优选地，通过等电沉淀或通过超滤分离或浓缩蛋白。在一个优选的实施方式中，从所述组合物中分离或浓缩豌豆蛋白包括等电沉淀所述蛋白的至少一个步骤。优选地，将包含豌豆蛋白的组合物的pH调节至蛋白的等电点。如本文所使用的，术语“等电点”是指蛋白具有0、或基本为0的净离子电荷(即，正电荷和负电荷的和是0，或基本是0)的pH。应当了解的是单独蛋白的等电点可以改变，如本文所使用的，本文所使用的蛋白组合物的等电pH是指组合物中蛋白的整体电荷是0，或基本上0的组合物的pH。通过本领域已知的技术可以确定蛋白和蛋白组合物的等电pH。本文中，将等电pH确定为氮溶解指数最低处的pH。在一个优选的实施方式中，将包含蛋白的组合物的pH调节在4.0至5.8，优选4.5至5.5的范围内，如例如4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、 5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8。通过添加酸如硫酸、或氢氯酸可以完成pH调节。在等电点，大多数的蛋白沉淀或聚集。
在某些实施方式中，通过从不溶馏分中分离液体馏分完成沉淀的或聚集的蛋白的分离，不溶馏分包含沉淀的或聚集的豌豆蛋白。通过倾析，优选离心倾析可以完成沉淀的或聚集的蛋白的分离。在一个优选的实施方式中，基于沉淀的或聚集的蛋白的总重量，分离沉淀的或聚集的蛋白之后的干物质含量(基于重量)在20％至40％的范围内，如例如至少25％，例如至少26％，例如至少27％，例如至少28％，例如至少29％、30％、31％、 32％、33％、34％、或35％，优选至少27％且至多38％。例如通过将水溶液添加到沉淀的或聚集的蛋白可以进一步调节干物质含量，从而得到沉淀的蛋白、优选地水、优选地饮用水(即适用于人类消耗的水)的组合物。优选地，基于沉淀的蛋白的组合物的总重量，可以将干物质含量调节至在 10％至25％，优选15％至20％的范围内，如例如至少15％，例如至少16％，优选至少17％、18％、19％、20％。可选地，可以至少一次以上地重复分离蛋白的过程。优选地，仅进行一次浓缩蛋白的步骤。
在一个优选的实施方式中，将沉淀的或聚集的蛋白优选地重新悬浮于水溶液，优选地水，优选地饮用水，即适用于人类消耗的水中。干物质含量优选地在重新悬浮的蛋白组合物的10％至25％，优选15％至20％的范围内，如例如至少15％，例如至少16％、17％、18％、19％、20％。
在一个实施方式中，将包含重新组成的蛋白的组合物的pH调节(如果需要)或保持在4.0至5.8，优选pH 4.5至5.5的范围内，如例如pH 4.5、 4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5。为此，可以例如使用氢氧化钠或硫酸将pH调节到期望水平。相应地，在一个实施方式中，在以上所描述的方法的步骤(c)中作为具有pH在4.0至5.8范围内的含水浆料得到所述分离的或浓缩的豌豆蛋白包括将含水浆料的pH调节或保持在4.0至5.8的范围内，优选pH 4.5至5.5，如例如pH 4.5、4.6、4.7、4.8、 4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5。优选地，对包含具有至多45％、优选至多40％、优选至多35％、优选至多30％、优选至多25％的干物质的重新组成的蛋白的含水组合物进行这种pH调节。在一个实施方式中，通过相应地添加水将组合物的干物质含量调节到以上列举的干物质含量。
在本文所描述的根据本发明的方法的步骤(d)中，使具有pH在4.0 至5.8范围内的所述含水浆料在至少75℃的温度下经历热处理，优选地使含水浆料经历至少77℃，优选至少78℃，优选至少80℃，仍更优选至少85℃，仍更优选至少90℃，例如至少95℃，优选至多160℃，仍更优选至多210℃的温度。优选地使所述蛋白在75℃至210℃范围内，优选 85℃至160℃范围内，更优选90℃至150℃范围内的温度下经历热处理。通过一个或多个热交换器或通过直接或间接的蒸汽注射可以有利地实现热处理。在一个实施方式中，热处理的持续时间是至少0.01秒，优选地在 0.01秒至20min的范围内，优选地在10秒至10分钟的范围内。技术人员应当了解的是温度越高，热处理的持续时间越短。例如，热处理可以在 115℃至210℃范围内的温度下，持续0.01s至15s范围内的时间。可替换地，例如，热处理可以在95℃至115℃范围内的温度下，持续15s至 5min范围内的时间。可替换地，例如，热处理可以在75℃至95℃范围内的温度下，持续5min至15min范围内的时间。在一个优选的实施方式中，在75℃至110℃范围内的温度下，更加优选地在80℃至100℃范围内的温度下进行热处理，持续2min至10min范围内的时间，优选地持续 5min至8min范围内的时间。在另一个优选的实施方式中，在130℃至 150℃范围内的温度下进行热处理1s至8s范围内的时间。热处理之后，干燥之前，可以将包含蛋白的组合物保持在70℃至90℃范围内；优选 70℃至85℃范围内的温度下。
在一个实施方式中，在本文所描述的根据本发明的方法的步骤(d) 中，使具有pH在4.0至5.8范围内的所述含水浆料经历以下的热处理：在 115℃至210℃范围内的温度下持续15s至0.01s范围内的时间；在95℃至115℃范围内的温度下持续5min至15s范围内的时间；在75℃至95℃范围内的温度下持续15min至5min范围内的时间；在75℃至110℃范围内的温度下持续10min至2min范围内的时间；在80℃至100℃范围内的温度下持续8min至5min范围内的时间；或在130℃至150℃范围内的温度下持续8s至1s范围内的时间。优选地，当热处理的温度升高时，热处理的时间减少。
在一个实施方式中，在本文所描述的根据本发明的方法的步骤(d) 之后，可以使具有pH在4.0至5.8范围内的所述含水浆料经历至少75℃温度下的干燥。可以通过本领域的任何方式，如通过应用热空气、蒸发、冷冻干燥、接触干燥、蒸汽干燥、高频干燥(dielectricdrying)、滚筒干燥、快速干燥等完成干燥。在一个优选的实施方式中，通过喷雾干燥将具有pH 在4.0至5.8范围内的含水浆料在至少75℃的温度下干燥。可选地，可以通过本领域的已知技术使蛋白经历粒化。
在某些实施方式中，在本文所描述的根据本发明的方法的步骤(a) 中包含豌豆蛋白的含水组合物中的豌豆蛋白可以源自研磨的豌豆。在一个实施方式中，所述研磨的豌豆来自于已经水合的豌豆，或所述豌豆被干磨并水合。
在另一个实施方式中，在研磨之前已经发酵了所述研磨的豌豆。当在研磨之前使整个豌豆经历发酵时，有利地除去可能影响下游加工的发酵微生物、以及发酵副产物如乳酸、还有分泌的化合物如酶是容易的，并且以成本有效的方式在发酵之后从豌豆中分离。此外，没有预料到，当发酵整个豌豆时，豌豆的单糖、二糖、和/或寡糖含量，以及特别是单糖或二糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖和/或引起肠胃气胀的糖(flatulent sugar)如棉子糖、水苏糖、和毛蕊花糖(所有这些在豌豆内)极大地减少，当在一些实施方式中考虑限制发酵的持续时间时，甚至更出人意料。
如本文所使用的，术语“糖”或“游离糖”是指单糖、二糖、和/或由最高达10个单体单元组成的低聚糖。在一些实施方式中，当提及“总的糖”或“总的游离糖”时，这些包括单糖、二糖和/或由最高达10个单体单元组成的低聚糖的总和。在其他实施方式中，指定了糖的特定子集。
在一个实施方式中，优选地在一种或多种乳酸菌存在下，使包含豌豆的含水组合物经历发酵。优选地，发酵的豌豆是未研磨的豌豆(即整个豌豆)。然而，在一个实施方式中豌豆可以是裂开的(split)豌豆。在一个实施方式中，豌豆在收获和干燥时是圆形的。除去皮之后，可以手动或机械分开种子子叶中的自然裂缝(natural split)，得到“裂开的豌豆(split pea)”。
在经历发酵之前，可以将本文所使用的豌豆分选(sort)。例如，根据本发明可以从待使用的豌豆中除去石头或较大的植物材料还有损坏的豌豆。
在这种实施方式中(其中豌豆经历发酵)，将豌豆，优选干豌豆，优选去皮豌豆，如去皮的干豌豆悬浮于水溶液中。在一个优选的实施方式中，水溶液是水。在一个实施方式中，水可以是饮用水、或已经处理过以使其可饮用的井水。使用的水优选地是饮用水，即，适用于人类消耗的水。
在一些实施方式中，添加到水溶液以重新组成包含豌豆的含水组合物的豌豆的量优选地在每m3包含豌豆的含水组合物150至500kg豌豆的范围内，即，每150至500kg豌豆，添加水溶液直到达到1m3的最终体积。
在一个实施方式中，在发酵开始时，在已经研磨所述组合物之后，如对包含豌豆的含水组合物测量的，包含豌豆的含水组合物具有至少6.0，优选至少6.2，例如至少6.4的pH。
在一个优选的实施方式中，自然收获干燥的与含水组合物接触的豌豆，或在一个实施方式中豌豆可以是新鲜的豌豆。优选地，豌豆是干豌豆，并具有至少80％(即，每100g总重量的干豌豆至少80g的干物质)，更优选地至少85％，例如至少90％，例如至少95％，如例如80％至95％的范围内，例如85％至95％，例如90％至95％的干物质含量(基于重量)。
如本文所使用的，术语“发酵”具有其在本领域的普通含义。通过进一步指导，发酵是微生物学的代谢过程，包括使用酵母和/或细菌的糖至酸、和/或气体的转化。因此使包含豌豆的含水组合物经历本文所使用的发酵可以指在适用于细菌和/或酵母具有代谢活性的条件下，温育包含豌豆的含水组合物与细菌和/或酵母，优选乳酸菌。
如本文所使用的，“乳酸菌”是指革兰氏阳性、低GC、耐酸、通常非孢子生殖的、非呼吸的杆菌或球菌的群体(通过它们共同的新陈代谢和生理特性相关联，并产生作为糖类发酵的主要新陈代谢的最终产物的乳酸)。往往可以在植物和乳酸产品分解中发现这些细菌。如本文所使用的，乳酸菌可以是非致病的，在这个意义上当摄食时它们不会引起伤害或不会导致有害影响。优选地，本文所使用的乳酸菌是选自乳酸杆菌(Lactobacillus)、片球菌(Pediococcus)、乳球菌(Lactococcus)、明串球菌(Leuconostoc)、链球菌(Streptococcus)、气球菌(Aerococcus)、肉食杆菌(Carnobacterium)、肠球菌(Enterococcus)、酒球菌(Oenococcus)、芽孢乳酸杆菌 (Sporolactobacillus)、四联球菌(Tetragenococcus)、漫游球菌 (Vagococcus)、和Weisella、以及它们的组合的一种或多种菌属。最优选地，乳酸菌是乳酸杆菌(Lactobacillus sp)，最优选地选自由发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)、卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)、面包乳酸杆菌(Lactobacillus panis)、粘膜乳酸杆菌(Lactobacillus mucosae)、 Lactobacilluspontis、嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidphilus)、植物乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum)、瑞士乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)、布氏乳酸杆菌(Lactobacillusbuchneri)、德氏乳酸杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、和干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)、以及它们的混合物组成的组，例如选自由发酵乳酸杆菌、卷曲乳酸杆菌、面包乳酸杆菌、粘膜乳酸杆菌、Lactobacillus pontis、嗜酸乳酸杆菌和它们的混合物组成的组，例如选自由发酵乳酸杆菌、卷曲乳酸杆菌、面包乳酸杆菌、粘膜乳酸杆菌、Lactobacillus pontis、和它们的混合物组成的组，例如所述细菌是发酵乳酸杆菌、或卷曲乳酸杆菌。在一些实施方式中，发酵可以是自发发酵 (spontaneous fermentation)(即，其中没有有意添加发酵微生物，但是由豌豆上/中和/或环境中自然存在的微生物，优选地乳酸菌进行发酵)或可以是接种发酵(即，其中有意添加发酵微生物，优选乳酸菌)。通过转移一个发酵步骤的部分或所有含水馏分至有待开始的下一发酵，例如通过转移第一发酵体积的至少1/10至至少一个第二发酵步骤，也可以完成发酵。在一个优选的实施方式中，发酵是厌氧发酵(不是严格厌氧的)。在一个优选的实施方式中，所述发酵乳酸杆菌是发酵乳酸杆菌LMG 6902或LMG 18026。在一个优选的实施方式中，所述卷曲乳酸杆菌是卷曲乳酸杆菌LMG 12005。在一个优选的实施方式中，所述嗜酸乳酸杆菌是嗜酸乳酸杆菌LMG 8151。
在一个实施方式中，如实验部分所描述的，使包含豌豆的含水组合物经历发酵，直到如在室温下对已经研磨然后悬浮于9g水中的1g所述豌豆测量的，豌豆的pH是至多5.5，优选至多5.0，更优选在3.5至5的范围内。在一个实施方式中，如实验部分所描述的，使包含豌豆的含水组合物经历发酵，直到优选地如在室温下对已经研磨然后悬浮于9g水中的1g 所述豌豆测量的，豌豆的pH是在3.5至4.5的范围内，例如4.0至5.0，优选4.5至5.5，如例如至少3.5，例如至少3.75，例如至少4.0，例如至少 4.25，例如至少4.50，例如至少4.75，例如至多5.0，例如至多5.25，例如至多5.5。
在一个实施方式中，如实验部分所描述的，发酵之前，如在室温下对已经研磨然后悬浮于9g水中的1g所述干豌豆测量的，干豌豆具有至少 6.0，优选6.0至7.10范围内，如例如至少6.0，例如至少6.1，例如至少 6.2，例如至少6.3，例如6.4，例如6.5，例如6.6，例如6.7，例如6.8，例如6.9，例如7.10，优选在6.25至6.75的范围内的pH。
在一个实施方式中，如实验部分所描述的，使包含豌豆的含水组合物经历发酵，直到优选地如在室温下对已经研磨然后悬浮于9g水中的1g 所述豌豆测量的，豌豆的pH降低至少1pH单位，优选降低至少1.5pH 单位，如例如至少1，例如至少1.1，例如至少1.2，例如至少1.3，例如至少1.4，例如至少1.5，例如至少1.6，例如至少1.7，例如至少1.8，例如至少1.9，例如至少2，例如至少2.1，例如至少2.2，例如至少2.3，例如至少2.4，例如至少2.5，例如至少2.6，例如至少2.7，例如至少2.8，例如至少2.9，例如至少3pH单位。在另一个实施方式中，如实验部分所描述的，使包含豌豆的含水组合物经历发酵，直到优选地如在室温下对已经研磨然后悬浮于9g水中的1g所述豌豆测量的，豌豆的pH降低1pH单位至3pH单位，优选降低1.5pH单位至3pH单位，如例如降低1.5pH 单位至2.5pH单位，例如降低2.0pH单位至3.0pH单位。通过实例的方式，但不限于此，如实验部分所描述的，如在室温下对已经研磨然后悬浮于9g水中的1g所述豌豆测量的，在发酵开始，豌豆的pH可以是6.5，以及在发酵结束，豌豆的pH可以是5.0。
在一个实施方式中，使包含豌豆的含水组合物经历发酵持续至少3h，优选至少4h，更优选至少6h。在另一个实施方式中，使包含豌豆的含水组合物经历发酵持续3h至24h范围，优选4h至24h范围，更优选4h至 20h范围，如例如至少3h，例如至少4h，例如至少5h，例如至少6h，例如至少7h，例如至少8h，至少9h，约10h，约11h，约12h，约13h，约 14h，例如至多15h，例如至多16h，例如至多17h，例如至多18h，例如至多19h，例如至多20h，例如至多21h，例如至多22h，例如至多23h，例如至多24h。技术人员将要了解的是，鉴于发酵开始时微生物的不同量，例如自发发酵可能比由添加细菌进行的发酵耗时更长。
在一个实施方式中，在用于发酵微生物最佳的温度下，优选地在比发酵微生物最佳的温度最大5℃更高或更低的温度下，使包含豌豆的含水组合物经历发酵。用于本文限定的细菌和/或酵母的最佳温度是本领域已知的。通过进一步指导，且不限于此，本文限定的最佳温度是指生长最大化的温度。在进一步的实施方式中，在至少30℃，例如30℃至50℃范围内，优选35℃至45℃范围内的温度下使包含豌豆的含水组合物经历发酵。在另一个实施方式中，在30℃至40℃，35℃至45℃，或40℃至50℃范围内，优选40℃，或约40℃的温度下，使包含豌豆的含水组合物经历发酵。
在一个实施方式中，在优选地包含一种或多种乳酸菌的发酵微生物如细菌和/或酵母存在下，使包含豌豆的含水组合物经历发酵，更优选地，所述乳酸菌选自包含一种或多种乳酸杆菌的组。在一个实施方式中，在以上指定的微生物中的一种或多种，优选地乳酸菌存在下，以包含豌豆的所述含水组合物的102cfu/ml至1010cfu/ml范围内，如包含豌豆的所述含水组合物的至少104cfu/ml，例如至少105cfu/ml，例如至少106cfu/ml，例如至少107cfu/ml，例如至少108cfu/ml，例如至少109cfu/ml的浓度，进行发酵。“cfu”(菌落形成单位)是本领域熟知的并可以例如通过平皿计数确定。应当理解的是“cfu/ml”是指每ml包含豌豆(即，包括豌豆)的总含水组合物的cfu的量。
在另一个实施方式中，在优选地包含一种或多种乳酸菌，优选地包含一种或多种乳酸杆菌的发酵微生物存在下，使包含豌豆的含水组合物经历发酵，其中，以至少102cfu/ml包含豌豆的含水组合物的浓度添加微生物，优选乳酸菌。
在一个实施方式中，在发酵结束时和研磨步骤之前，基于发酵结束时，即已经从含水组合物中分离了豌豆之后的豌豆的总重量，豌豆具有35％至 60％，优选35％至％，例如40％至50％范围内，如例如至少40％，例如至少41％，至少42％，例如至少43％，例如至少44％，例如至少45％，例如至少46％，例如至少47％，约48％，约49％，例如至多50％，例如至多55％，例如至多60％的干物质含量(基于重量)。
在进一步的实施方式中，发酵豌豆，直到基于发酵结束时，即已经从含水组合物中分离了豌豆之后的豌豆的总重量，它们具有35％至60％，优选35％至55％，例如40％至50％范围内，如例如至少40％，例如至少41％，至少42％，例如至少43％，例如至少44％，例如至少45％，例如至少46％，例如至少47％，约48％，约49％，例如至多50％，例如至多55％，例如至多60％的干物质含量(基于重量)。在该实施方式中，发酵之前，或发酵开始时，豌豆优选地具有至少80％(即，每100g干豌豆的总重量至少 80g干物质)，更优选至少85％，例如至少90％，例如至少95％，如例如 80％至95％，例如85％至95％，例如90％至95％范围内的干物质含量(基于重量)。
在一个实施方式中，研磨已经经历发酵的豌豆。为此，在一个实施方式中，发酵之后可以从含水组合物中除去豌豆，然后使其经历研磨。优选地，发酵之后以及研磨之前洗涤或冲洗豌豆。可以通过水溶液，优选水，如水、或处理的井水，优选饮用水，即适用于人类消耗的水进行洗涤或冲洗。
在一个优选的实施方式中，用于从豌豆(Pisum sativum spp.)中提取豌豆蛋白的方法，包括以下步骤：
(i)提供豌豆；
(ii)研磨所述豌豆；
(iii)在水溶液存在下分馏所述研磨的豌豆以得到包含豌豆蛋白的至少一种含水组合物；
(iv)从包含豌豆蛋白的所述含水组合物中分离或浓缩所述豌豆蛋白；
(v)作为具有pH在4.0至5.8范围内的含水浆料得到所述分离的或浓缩的豌豆蛋白；以及
(vi)使具有pH在4.0至5.8范围内的所述含水浆料经历至少75℃的温度。
优选地，步骤(v)中包含豌豆蛋白的含水浆料具有至多45％，优选至多40％，优选至多35％，优选至多30％，优选至多25％的干物质，以及在一个实施方式中，可以通过用水稀释调节到该程度。
在一个优选的实施方式中，用于从豌豆(Pisum sativum spp.)中提取豌豆蛋白的方法，包括以下步骤：
(i)优选地在一种或多种乳酸菌存在下，使包含豌豆的含水组合物经历发酵；
(ii)研磨所述豌豆；
(iii)在水溶液存在下分馏所述研磨的豌豆以得到包含豌豆蛋白的至少一种含水组合物；
(iv)从包含豌豆蛋白的所述含水组合物中分离或浓缩所述豌豆蛋白；
(v)作为具有pH在4.0至5.8范围内的含水浆料得到所述分离的或浓缩的豌豆蛋白；以及
(vi)使具有pH在4.0至5.8范围内的所述含水浆料经历至少75℃的温度。
优选地，步骤(v)中包含豌豆蛋白的含水浆料具有至多45％，优选至多40％，优选至多35％，优选至多30％，优选至多25％的干物质，以及在一个实施方式中，可以通过用水稀释调节到该程度。
在一个优选的实施方式中，用于从豌豆((Pisum sativum spp.))中提取豌豆蛋白的方法，包括以下步骤：
(i1)提供包含豌豆蛋白的含水组合物；
(ii1)优选地通过将所述含水组合物的pH调节到4.0至5.8范围内的 pH，优选地使用等电沉淀从包含豌豆蛋白的所述含水组合物中分离或浓缩所述豌豆蛋白；
(iii1)作为具有pH在4.0至5.8范围内的含水浆料得到所述分离的或浓缩的豌豆蛋白；
(iv1)可选地将含水浆料的干物质含量调节到10％至25％范围内，优选15％至20％的值；
(v1)使具有pH在4.0至5.8范围内的所述含水浆料经历至少75℃的温度；
(vi1)干燥具有pH在4.0至5.8范围内的所述含水浆料，优选地得到如在室温下对悬浮于90g水中的10g豌豆蛋白组合物测量的，具有pH 在4.0至5.8范围内的豌豆蛋白组合物。
优选地，步骤(iii1)中包含豌豆蛋白的含水浆料具有至多45％，优选至多40％，优选至多35％，优选至多30％，优选至多25％的干物质，以及在一个实施方式中，可以通过用水稀释调节到该程度。
通过本文所描述的根据本发明的方法得到的豌豆蛋白与现有领域的豌豆蛋白相比，具有不同的特征，如不同的生物化学和/或感官特征、以及质量相关参数值上的区别。
相应地，在一个方面，本发明包括通过本文所描述的根据本发明的方法得到的或可得到的豌豆蛋白和豌豆蛋白组合物。
在进一步的方面，本发明涉及基于组合物的总的干物质包含至少60 wt％的蛋白的豌豆蛋白组合物，其中，如基于含水组合物的总重量，对包含3wt％的所述豌豆蛋白组合物的含水组合物测量的，所述豌豆蛋白组合物具有在pH 7.0下至多15％的氮溶解指数，以及优选地在pH 7.0下至多 11％，优选至多10％，优选至多9％，优选至多8％的NSI。在一个优选的实施方式中，通过本发明的方法得到所述组合物。
在进一步的方面，本发明涉及具有在pH 6下至多100g，优选至多75 g，更加优选至多50g的凝胶强度的豌豆蛋白组合物。在进一步的方面，本发明涉及具有在pH 6下10g至100g范围内，优选10g至75g范围内，更加优选10g至50g范围内的凝胶强度的豌豆蛋白。
在进一步的方面，本发明涉及基于组合物的总的干物质包含至少60 wt％的蛋白的豌豆蛋白组合物，其中，所述豌豆蛋白组合物具有如基于含水组合物的总重量，对包含3wt％的所述豌豆蛋白组合物的含水组合物测量的，在pH 7.0下至多15％的氮溶解指数，以及优选地在pH 7.0下至多 11％，优选至多10％，优选至多9％，优选至多8％的NSI，和在pH6下至多100g，优选至多75g，更加优选至多50g的凝胶强度。在进一步的方面，本发明涉及具有在pH 6下10g至100g范围内，优选10g至75g 范围内，更加优选10g至50g范围内的凝胶强度的豌豆蛋白。
在进一步的方面，本发明涉及具有表1指出的特征A至H中的一种或多种，优选全部的豌豆蛋白。
表1
在优选的实施方式中，豌豆蛋白具有表1的特征的以下组合中的任一种：A、B、C、D、E、F、G、H、A+B、A+C、A+D、A+E、A+F、A+G、 A+H、B+C、B+D、B+E、B+F、B+G、B+H、C+D、C+E、C+F、C+G、C+H、D+E、D+F、D+G、D+H、E+F、E+G、E+H、F+G、F+H、G+H、 A+B+C、A+B+D、A+B+E、A+B+F、A+B+G、A+B+H、A+C+D、A+C+E、 A+C+F、A+C+G、A+C+H、A+D+E、A+D+F、A+D+G、A+D+H、A+E+F、 A+E+G、A+E+H、A+F+G、A+F+H、A+G+H、B+C+D、B+C+E、B+C+F、 B+C+G、B+C+H、B+D+E、B+D+F、B+D+G、B+D+H、B+E+F、B+E+G、 B+E+H、B+F+G、B+F+H、B+G+H、C+D+E、C+D+F、C+D+G、C+D+H、 C+E+F、C+E+G、C+E+H、C+F+G、C+F+H、C+G+H、D+E+F、D+E+G、 D+E+H、D+F+G、D+F+H、D+G+H、E+F+G、E+F+H、E+G+H、F+G+H、 A+B+C+D、A+B+C+E、A+B+C+F、A+B+C+G、A+B+C+H、A+B+D+E、 A+B+D+F、A+B+D+G、A+B+D+H、A+B+E+F、A+B+E+G、A+B+E+H、 A+B+F+G、A+B+F+H、A+B+G+H、A+C+D+E、A+C+D+F、A+C+D+G、 A+C+D+H、A+C+E+F、A+C+E+G、A+C+E+H、A+C+F+G、A+C+F+H、 A+C+G+H、A+D+E+F、A+D+E+G、A+D+E+H、A+D+F+G、A+D+F+H、 A+D+G+H、A+E+F+G、A+E+F+H、A+E+G+H、A+F+G+H、B+C+D+E、 B+C+D+F、B+C+D+G、B+C+D+H、B+C+E+F、B+C+E+G、B+C+E+H、 B+C+F+G、B+C+F+H、B+C+G+H、B+D+E+F、B+D+E+G、B+D+E+H、 B+D+F+G、B+D+F+H、B+D+G+H、B+E+F+G、B+E+F+H、B+E+G+H、 B+F+G+H、C+D+E+F、C+D+E+G、C+D+E+H、C+D+F+G、C+D+F+H、 C+D+G+H、C+E+F+G、C+E+F+H、C+E+G+H、C+F+G+H、D+E+F+G、 D+E+F+H、D+E+G+H、D+F+G+H、E+F+G+H、A+B+C+D+E、A+B+C+D+F、 A+B+C+D+G、A+B+C+D+H、A+B+C+E+F、A+B+C+E+G、A+B+C+E+H、 A+B+C+F+G、A+B+C+F+H、A+B+C+G+H、A+B+D+E+F、A+B+D+E+G、 A+B+D+E+H、A+B+D+F+G、A+B+D+F+H、A+B+D+G+H、A+B+E+F+G、 A+B+E+F+H、A+B+E+G+H、A+B+F+G+H、A+C+D+E+F、A+C+D+E+G、 A+C+D+E+H、A+C+D+F+G、A+C+D+F+H、A+C+D+G+H、A+C+E+F+G、 A+C+E+F+H、A+C+E+G+H、A+C+F+G+H、A+D+E+F+G、A+D+E+F+H、 A+D+E+G+H、A+D+F+G+H、A+E+F+G+H、B+C+D+E+F、B+C+D+E+G、 B+C+D+E+H、B+C+D+F+G、B+C+D+F+H、B+C+D+G+H、B+C+E+F+G、 B+C+E+F+H、B+C+E+G+H、B+C+F+G+H、B+D+E+F+G、B+D+E+F+H、 B+D+E+G+H、B+D+F+G+H、B+E+F+G+H、C+D+E+F+G、C+D+E+F+H、C+D+E+G+H、C+D+F+G+H、C+E+F+G+H、D+E+F+G+H、A+B+C+D+E+F、 A+B+C+D+E+G、A+B+C+D+E+H、A+B+C+D+F+G、A+B+C+D+F+H、 A+B+C+D+G+H、A+B+C+E+F+G、A+B+C+E+F+H、A+B+C+E+G+H、 A+B+C+F+G+H、A+B+D+E+F+G、A+B+D+E+F+H、A+B+D+E+G+H、A+B+D+F+G+H、A+B+E+F+G+H、A+C+D+E+F+G、A+C+D+E+F+H、 A+C+D+E+G+H、A+C+D+F+G+H、A+C+E+F+G+H、A+D+E+F+G+H、 B+C+D+E+F+G、B+C+D+E+F+H、B+C+D+E+G+H、B+C+D+F+G+H、 B+C+E+F+G+H、B+D+E+F+G+H、C+D+E+F+G+H、A+B+C+D+E+F+G、 A+B+C+D+E+F+H、A+B+C+D+E+G+H、A+B+C+D+F+G+H、 A+B+C+E+F+G+H、A+B+D+E+F+G+H、A+C+D+E+F+G+H、 B+C+D+E+F+G+H、A+B+C+D+E+F+G+H。
技术人员将理解在一些实施方式中当提及“豌豆蛋白”时，实际上描述的是组合物，其主要但不是仅包含豌豆蛋白。残留杂质可以存在于这种组合物中。这些残留杂质可以包括例如矿物质、糖等。在一个优选的实施方式中，术语豌豆蛋白优选地是指包含至少60wt％蛋白(基于组合物的总的干物质)，优选至少75wt％蛋白，更优选至少80wt％蛋白的组合物。在另一个优选的实施方式中，术语豌豆蛋白是指包含(基于组合物的总的干物质)70wt％至98wt％的蛋白，优选70wt％至98wt％的蛋白，更优选 80wt％至98wt％的蛋白，更优选85wt％至98wt％，仍更优选88wt％至 98wt％蛋白的豌豆蛋白提取物或豌豆蛋白组合物。
在进一步的方面，本发明涉及包含通过本文所描述的根据本发明的方法得到的或可得到的豌豆蛋白的组合物。在一个优选的实施方式中，这种组合物是可食用的组合物。如本文所使用的，且如本领域技术人员将理解的，“可食用的”组合物是指适用于人类或动物消耗的组合物。优选地，所述组合物是食品或饲料，更优选地是烘焙食品、或糖果食品。在一个优选的实施方式中，所述食品是饼干、面包、蛋糕、华夫饼(waffle)、法奇软糖(fudge)、挤出的谷物、或棒。
相应地，在进一步的方面，本发明涉及如本文所描述的豌豆蛋白，具体是根据本文所描述的方法得到的或可得到的豌豆蛋白在食品或饲料产品中的用途。在一个优选的实施方式中，食品是烘焙食品或糖果食品。本文所描述的豌豆蛋白可以例如部分或完全取代食品或饲料产品中的其他蛋白，如例如动物来源的蛋白，如牛奶蛋白。本文所描述的豌豆蛋白的特别合适的应用可以例如用于制备烘焙食品或糖果产品的方法中。
在进一步的方面，本发明涉及本文所描述的豌豆蛋白，具体是根据本文所描述的方法得到的或可得到的豌豆蛋白用于净化或精制液体如例如饮料和饮品的用途。
如本文所使用的，术语“净化”和“精制(fining)”具有其在本领域的普通含义。通过进一步指导，且不限于此，术语“净化”是指例如通过添加精制剂(fining agent)从液体中除去(悬浮的)不溶物的方法。添加精制剂可以导致不溶物聚集，还有某些溶解物(例如蛋白)聚集使得形成较大颗粒，其可以被容易地除去(如通过过滤或离心)。在一个实施方式中，可以净化或精制的液体是饮品，即，适用于人类或动物消耗的液体。在一个特别优选的实施方式中，所述饮料是发酵的饮品，如酒精饮品，优选葡萄酒(包括但不限于红葡萄酒、白葡萄酒、玫瑰果酒、香槟酒、波尔图酒、雪利酒等)。本文还设想了根据本发明如本文所描述的豌豆蛋白在净化除葡萄酒之外的发酵饮料或饮品中的用途。
本发明的方面和实施方式进一步通过以下非限制性实施例支持。
实施例
实验方案
除非另外指出，否则在以下实施例中，如在本部分中所定义的测量所有参数。如在本部分中定义的参数的测量还代表在优选的实施方式中用于测量如以上详细说明的各个方面和实施方式指出的根据本发明的所述参数的方法。
对干豌豆或包含豌豆或研磨的豌豆的含水组合物的pH测量
用pH计WTW SERIES Inolab Termil 740测量pH。用pH 4.01(WTW pH 4.01Technical Buffer,Model STP4,Order n° 108706)和pH 7(WTW pH 7.00 TechnicalBuffer,Model STP7,Order n° 108708)的缓冲溶液校准装置。
当测量不包含豌豆的含水组合物的pH时，从发酵容器中直接取出水溶液样品。值稳定时，测量样品的pH。
当测量豌豆的pH时，从发酵容器中取出豌豆。在滤过器(strainer) 中排出豌豆中的水分，然后将其至于吸水纸上两分钟，以除去过量汁液。用混合器(Magic Bullet、Homeland Housewares)研磨豌豆一分钟。将1g 研磨的豌豆悬浮于9g去离子水中(水电导率<15μS)。然后用混合器再次研磨悬浮液。最后，当值稳定时，(在室温下)测量悬浮液的pH。
当测量干豌豆的pH时，用粉碎机(Kenwood)干研磨豌豆一分钟。将5g研磨的干豌豆悬浮于95g去离子水中(水电导率<15μS)。然后在搅拌板上将悬浮液均匀化1分钟。值稳定时，测量悬浮液的pH。
蛋白提取物粉末的pH测量
用pH计WTW pH/Cond 340i/SET测量pH。用pH 4.01(WTW pH 4.01 TechnicalBuffer,Model STP4,Order n° 108706)和pH 7(WTW pH 7.00 Technical Buffer,ModelSTP7,Order n° 108708)的缓冲溶液校准装置。在室温下将5.0g蛋白提取物粉末引入到100ml烧杯中，并用软化水配制到 50g(天平Ohaus ARC120，灵敏度0.01g，容量(capacity)3100g)。在搅拌板(Stuart US151)上以强度4搅拌悬浮液5分钟。当值稳定时，在搅拌下(在室温下)测量悬浮液的pH。
蛋白悬浮液的pH测量
用pH计WTW pH/Cond 340i/SET测量pH。用pH 4.01(WTW pH 4.01 TechnicalBuffer,Model STP4,Order n° 108706)和pH 7(WTW pH 7.00 Technical Buffer,ModelSTP7,Order n° 108708)的缓冲溶液校准装置。将 50ml的蛋白悬浮液置于100ml的烧杯中，不另外的稀释。当值稳定时， (在室温下)测量样品的pH。
食品的pH测量
用pH 4.01(WTW pH 4.01Technical Buffer,Model STP4,Order n° 108706)和pH7(WTW pH 7.00 Technical Buffer,Model STP7,Order n° 108708)的缓冲溶液校准pH计(Knick Portavo 902 PH)。在室温下通过将pH计(Knick Portavo 902 PH)的探针直接引入产品(液体食品、面糊、面团…)内测量pH。在固体食品的情况下，用软化水进行50％稀释，并分析溶液。稳定之后，记录pH值。
乳酸菌计数
用EPT Dilucups 9ml Led techno进行样品的稀释。
使用的介质是Merck Cat.N° 1.10661.0500的MRS琼脂(acc.to DE MAN、ROGOSA和SHARPE)。
用混合器(Magic Bullet、Homeland Housewares)研磨豌豆或豌豆悬浮液。
当分析不包含豌豆的含水组合物的样品时，直接从发酵容器中取出样品。铺板(plate)1ml样品。如果需要稀释，那么将1ml样品添加到dilucup (稀释杯)中，并重复该步骤直到达到恰当的稀释，然后铺板1ml稀释的样品。在45℃下温育皮氏培养皿48小时。
当分析豌豆样品时，从发酵容器中取出整个豌豆。在滤过器中排出豌豆中的水分，然后将其至于吸水纸上两分钟，以除去过量汁液。研磨豌豆一分钟。将研磨的豌豆悬浮在去离子水(电导率<15μS)中(在9g去离子水中1g豌豆)。然后用混合器研磨悬浮液。铺板1ml悬浮液。如果需要稀释，那么将1ml悬浮液添加到dilucup中，并重复该步骤直到达到恰当的稀释，然后铺板1ml稀释的样品。在45℃下温育皮氏培养皿48小时。
干物质确定
干燥之后作为剩余的残留物重力确定总的干物质。通过烘干蒸发样品中的水分。
在之前称重的干燥铝皿(精密天平Ohaus，容量410g，灵敏度0.001 g)中称重5g样品。将样品放置在103℃的烘箱中直到剩余的重量保持恒定(至少24h)。在干燥器中冷却样品1h，然后立即称重。结果以％表示(干物质(g)/100g样品)。
干物质(％)＝(m3-m1)/(m2-m1)×100
m1＝干燥铝皿的重量(g)
m2＝干燥之前铝皿与样品的重量(g)
m3＝干燥之后铝皿与样品的重量(g)
食品的干物质确定
在104℃下干燥5g样品一夜之后，一式两份地确定食品的干物质含量。
灰分确定
在高温马弗炉中加热之后，重力确定作为剩余残留物的灰分含量。通过烘干蒸发样品中的水分。
在之前称重的干燥瓷坩埚(精密天平Ohaus，容量410g，灵敏度0.001 g)中称重2g样品。将坩锅放置在550℃的马弗炉中24h。将坩锅放置在103℃的烘箱中1h，然后放置在干燥器中1h。冷却之后，称重坩埚。结果以％表示(灰分g/100g样品)。
灰分(％)＝(m3-m1)/(m2-m1)×100
m1＝坩锅的重量(g)
m2＝坩锅与样品的重量(g)
m3＝坩锅与灰分的重量(g)
通过杜马斯法(Dumas method)确定蛋白含量
用Leco在参考号502092下销售的EDTA校准装置(Leco FP2000)。称重用于实现校准的EDTA的量在0.08g至0.50g的范围内(0.08g、0.15 g、0.25g、0.35g、0.40g、0.50g)。在精密天平(Sartorius BP61S，容量61g，灵敏度0.1mg)上称重0.3g至1g样品，并将其放置在陶瓷的船形器皿(boat)中。将陶瓷的船形器皿自动放置在1200℃的烘箱中，其中，在受控的氧气流下样品在燃烧管中通过热解燃烧。氮化合物转化为N2和 NOx，而其他挥发性分解化合物通过吸附过滤器和一系列纯化试剂保留。所有的氮化合物还原成通过热导检测器定量确定的分子N。然后通过微处理器计算氮含量。
结果表示为蛋白的百分比(％N*6.25)：
％氮＝氮g/100g样品
％蛋白＝％氮×6.25
通过杜马斯法确定NSI样品中的氮含量
用甘氨酸15mg/ml(Merck在参考号1.04201.1000下销售的甘氨酸粉末)的溶液校准装置(Leco FP2000)。称重用于实现校准的甘氨酸溶液15 mg/ml的量在0.1g至1.8g的范围内(0.1g、0.4g、0.7g、1.1g、1.4g、 1.8g)。在精密天平(Sartorius BP61S，容量61g，灵敏度0.1mg)上称重 1g至1.8g样品，并将其放置在镍插入件(nickel insert)覆盖的陶瓷的船形器皿(boat)中。将陶瓷的船形器皿自动放置在1200℃的烘箱中，其中，在受控的氧气流下样品在燃烧管中通过热解燃烧。氮化合物转化为N2和 NOx，而其他挥发性分解化合物通过吸附过滤器和一系列纯化试剂保留。所有的氮化合物还原成通过热导检测器定量确定的分子N。然后通过微处理器计算氮含量。
结果表示为氮的百分比：
％氮＝氮g/100g样品
氮溶解指数(nitrogen solubility index)(NSI)的确定
将蛋白分散在软化水中之后，通过测量离心之后上清液中氮的百分比和起始悬浮液中氮的百分比之间的比率确定氮溶解指数。该方法用于具有 90至99％(基于重量)干物质含量的蛋白提取物粉末，并在干燥蛋白提取物之后的月内进行。在室温下进行该测量。
在室温下将9.0g样品引入到400ml烧杯中，并用软化水配制到300g (天平OhausARC120，灵敏度0.01g，容量3100g)。用勺子使悬浮液均匀化，然后在搅拌板(Stuart US151)上以强度4搅拌悬浮液5分钟。收集10ml起始悬浮液，并在蛋白分析仪Leco FP 2000上分析氮含量。将悬浮液分到两个150ml的烧杯中，升高一个烧杯中的pH并降低另一个烧杯中的pH。用HCl 1N或NaOH 1N将悬浮液的pH调节到pH 3.5、4.5、5.5、 6.5、7和8(pH计WTW pH/Cond 340i/SET)。对于每次pH调节，稳定时记录pH值，并将10ml悬浮液收集在10ml离心管中。以6000rpm(离心机ALC 4239 R)离心不同pH的悬浮液的等分试样(aliquot)15min。收集不同的上清液，并在蛋白分析仪Leco FP 2000上分析氮含量。对于每个测试的pH，根据以下表达式计算氮溶解指数：
％氮溶解指数＝％上清液中的氮/％起始溶液中的氮×100
确定包含蛋白的馏分的等电pH
在室温下将300g基于包含蛋白的馏分的总重量，包含具有1wt％蛋白含量的馏分的蛋白引入到400ml烧杯中。在搅拌板(Stuart US151)上以强度4搅拌悬浮液5分钟。收集10ml起始悬浮液，并在蛋白分析仪Leco FP 2000上分析氮含量。将悬浮液分到两个150ml的烧杯中，升高一个烧杯中的pH并降低另一个烧杯中的pH。用HCl 1N或NaOH 1N将悬浮液的pH调节到pH 3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75、5.0、5.25、5.5、5.75、 6.0、6.25、6.5、6.75、和7.0(pH计WTW pH/Cond 340i/SET)。对于每次 pH调节，稳定时记录pH值，并将10ml悬浮液收集在10ml离心管中。以6000rpm(离心机ALC 4239 R)离心不同pH的悬浮液的等分试样15min。收集不同的上清液，并在蛋白分析仪Leco FP 2000上分析氮含量。对于每个测试的pH，根据以下表达式计算氮溶解指数：
％氮溶解指数＝％上清液中的氮/％起始溶液中的氮×100
将等电pH确定为氮溶解指数最低处的pH。
糖确定
用离心机eppendorf Centrifuge 5417R以及用离心设备NANOSEP 100k OMEGA制备样品。
用混合器(Magic Bullet、Homeland Housewares)研磨豌豆或豌豆悬浮液。
当分析不包含豌豆的含水组合物的样品时，直接从发酵容器中取出样品。用去离子水(电导率<15μS)将样品稀释20倍(在19g去离子水中 1g豌豆汁液)。将0.5ml的这种稀释液放置在过滤eppendorf中并在14000 rpm下离心10分钟。然后将滤液用于糖分析。
当制备豌豆样品时，从发酵容器中取出整个豌豆。在滤过器中排出豌豆中的水分，然后将其至于吸水纸上两分钟，以除去过量汁液。研磨豌豆一分钟。将研磨的豌豆悬浮在去离子水(电导率<15μS)中(在9g去离子水中1g豌豆)。然后用混合器研磨悬浮液。
用去离子水(电导率<15μS)将悬浮液稀释8倍(在8g去离子水中 1g豌豆悬浮液)。将0.5ml的这种稀释液放置在过滤eppendorf中并在 14000rpm下离心10分钟。然后将滤液用于糖分析。
已经将具有chromeleon 6.80 SR11 Build 3161软件的Thermo scientific -Dionex ICS 5000色谱系统用于糖的分析。在40℃下通过Carbopac PA100 4mm*250mm(+保护)进行分离。用NaOH 40mM以1ml/min的流速进行洗脱。注射体积是10μL。将四倍脉冲检测用于PAD检测。对以下糖中的每种用适当的标准溶液范围进行校准：
在下表中给出了糖标准溶液的浓度(st1、2、3和4)(mg/l)。
| st1 | st2 | st3 | st4 | |
| 葡萄糖 | 15.3 | 45.8 | 5.2 | 30.5 |
| 果糖 | 3.3 | 7.4 | 1.1 | 5.5 |
| 蔗糖 | 99.9 | 200.5 | 50.1 | 150.0 |
| 棉子糖 | 15.3 | 45.1 | 5.0 | 30.6 |
| 水苏糖 | 75.0 | 159.7 | 40.0 | 119.7 |
| 毛蕊花糖 | 57.0 | 118.6 | 37.9 | 85.0 |
酸度测量
用pH计WTW SERIES Inolab Termil 740测量酸度。用pH 4.01(WTW pH 4.01Technical Buffer,Model STP4,Order n° 108706)和pH 7(WTW pH 7.00 TechnicalBuffer,Model STP7,Order n° 108708)的缓冲溶液校准装置。
用混合器(Magic Bullet、Homeland Housewares)研磨豌豆或豌豆悬浮液。
当测量“豌豆汁液”的酸度时，直接从发酵容器中取出样品(A)。称重样品(A)。缓慢添加1mol/L的氢氧化钠溶液(C)(n° 1.09137.1000 TitriPURR；密度＝d＝1.04kg/l)，直到在至少两分钟内样品的pH稳定在 pH 7。然后计算氢氧化钠(B)的质量。
酸度(mEq/kg)＝(B*(C/d)/A)*1000
当测量豌豆的酸度时，从发酵容器中取出整个豌豆。在滤过器中排出豌豆中的水分，然后将其至于吸水纸上两分钟，以除去过量汁液。研磨豌豆一分钟。将研磨的豌豆悬浮在去离子水(电导率<15μS)中(在9g去离子水中1g豌豆)。然后用混合器研磨悬浮液。得到豌豆悬浮液。
称重精确量的豌豆悬浮液(A’)。缓慢添加1mol/L的氢氧化钠溶液 (C’)(n°1.09137.1000TitriPURR；密度＝d＝1.04kg/l)，直到在至少两分钟内悬浮液的pH稳定在pH7。然后计算氢氧化钠(B’)的质量。
酸度(mEq/kg)＝(B’*(C’/d)/(A’/10))*1000
用粘度计Brookfield DVII确定粘度
用粘度计Brookfield DVII确定蛋白悬浮液的粘度是其对由圆筒形探针的转动施加的流动的抗性的量度。这种抗性导致固定至驱动系统的传感器的弹簧扭曲。以厘泊(cP)表示的粘度值与粘度计指示的扭矩的百分比以及根据使用的探针和它的转速的多重因素成比例。该方法用于具有90 至99％(基于重量)干物质含量的蛋白提取物粉末，并在干燥蛋白提取物之后的月内进行。在室温下进行该测量。
制备13.5％蛋白(基于重量)的悬浮液。称重(天平Ohaus ARC120，灵敏度0.01g，容量3100g)75g样品在250ml烧杯中，并称重必要量的软化水在1L塑料烧杯中，两者都是在室温下。使用80cm直径的溶解器 (Roth在参考号A322.1下销售的)，在700rpm的机械搅拌(IKA, EURO-ST.P CV)5分钟下将粉末悬浮于水中。在搅拌下测量悬浮液的pH (pH计WTWpH/Cond 340i/SET)。停止搅动3分钟，并用粘度计Brookfield DVII+Pro以50rpm速度在三个不同位置测量悬浮液的粘度。在SO1至SO7 之间选择用于测量的探针，使得扭矩的百分比在20％和80％之间。探针旋转4秒之后，记录粘度值。将悬浮液再次置于700rpm的机械搅拌下5分钟，期间用HCl 3N将pH调节到6.4。停止搅动3分钟，并以与之前相同的方式测量悬浮液的粘度。类似地，在700rpm下搅拌5min和3min的休息之后，在pH 6.2、6.0和5.8下测量悬浮液的粘度。
当13.5％蛋白的悬浮液的初始pH等于或低于5.8时，用NaOH 3N将 pH升高到pH7.5，反之用HCl 3N降低。
堆积密度和振实密度的确定
粉末的堆积密度(bulk density)是未振实的粉末样品的质量和它的体积(包括颗粒间的孔隙体积的贡献)的比率。通过机械振实包含粉末样品的量筒得到振实密度(tappeddensity)。堆积密度和振实密度以克/毫升 (g/ml)表示。该方法用于蛋白提取物粉末，以及在室温下进行测量。
称重60g粉末于250ml的量筒中(天平Ohaus ARC120，灵敏度0.01 g，容量3100g)。测量摇晃之前的粉末体积。如下计算堆积密度：
堆积密度＝m/V1
m＝蛋白提取物粉末的质量(以g表示)
V1＝未振实的粉末的体积(以ml表示)
称重60g粉末于250ml的量筒中(天平Ohaus ARC120，灵敏度0.01 g，容量3100g)。将量筒放置在沉淀器(settling apparatus)(Retsch)的中心并以60强度摇晃12分钟。测量摇晃之后的粉末体积。如下计算振实密度：
振实密度＝m/V2
m＝蛋白提取物粉末的质量(以g表示)
V2＝振实粉末的体积(以ml表示)
凝胶强度确定
通过凝胶对由质地分析仪引导的探针所施加的压缩的最大抗性确定凝胶强度。形成蛋白凝胶由制作蛋白悬浮液组成，该蛋白悬浮液经历了热处理，随后经历冷却。凝胶强度以g或N表示。该方法用于具有90至99％ (基于重量)干物质含量的蛋白提取物粉末，并在干燥蛋白提取物之后的月内进行。在室温下进行该测量。
制备13.5％蛋白(基于重量)的悬浮液。称重(天平Ohaus ARC120，灵敏度0.01g，容量3100g)75g样品在250ml烧杯中，并称重必要量的软化水在1L塑料烧杯中，两者都是在室温下。使用80cm直径的溶解器 (Roth在参考号A322.1下销售的)，在700rpm的机械搅拌(IKA, EURO-ST.P CV)下持续精确的10分钟，将粉末悬浮于水中。同时，根据悬浮液的初始pH用HCl 3N或NaOH 3N将悬浮液的pH调节到6.0(pH 计WTW pH/Cond 340i/SET)。将悬浮液倾倒入两个220ml的玻璃罐中，将其置于80℃的水浴中1h。在室温下在水浴中冷却玻璃罐10分钟，然后将其置于4℃的冷室中16h。将玻璃罐置于室温下15min以使其变为室温。用具有5kg的压缩载荷单元(Compression load cell)和锥形探针(P45C Cone 45° Perspex)的质地分析仪TA-XT2i(Stable Micro Systems,Ltd) 测量凝胶强度。凝胶强度是在穿透末端处记录的的最大力，以g表示。
-TA-XT2i设定：
o测量压缩的力-保持到时间
o测试前速度：2mm/s
o测试速度：1mm/s
o测试后速度：1mm/s
o穿透距离：35mm
o触发器类型：自动-3g
o时间10s
粉末流动性测量
通过测量对流动的抗性来表征粉末的流变行为。用Brabender Micro ViscoAmylograph(MVA)测量流动性。称重(天平Ohaus ARC120，灵敏度0.01g，容量3100g)20g样品在装置的测量碗中。使用冷却水浴在20℃下运行测量5min。将碗的转速设定至75rpm并将测量范围设定至70cmg。装置测量将碗的转速保持在75rpm所需要的力。结果对应于在测试最后分钟内记录的测量值的平均值并以Brabender单位(BU)表示。结果越低，粉末的自由流动性越高。
润湿性测定
将润湿性(wettablility)定义为当置于水表面上时所有粉末颗粒变湿所需的以秒计的时间。当粉末样品沉入水面以下或具有湿润的外观时，认为其被润湿。称重1g粉末样品于玻璃杯中。将室温的100ml软化水引入到250ml烧杯(高度9cm，直径7cm)中。将测试部分从玻璃杯倒入水的表面。记录从转移粉末开始到所有颗粒变湿的时间。结果以秒表示。
颜色测量
使用色度计(Chroma meter)CR5(Konica Minolta TA Sensing,Europe) 在20℃下测量L*a*b*坐标。L*指示从黑色到白色的0-100等级的亮度； a*，(+)红色或(-)绿色；以及b*，(+)黄色或(-)蓝色。
装置：
-色度计CR5(Konica Minolta TA Sensing Europe)。
-皮氏培养皿CR-A502
程序：样品制备
-用样品填充皮氏培养皿在均匀表面上分析。
方法
-将皮氏培养皿放置在装置的特定预留的地方并开始分析
结果
-通过色度计给出L*a*b*值(3次测量数据的平均值)
水活性
水活性是水在系统中的能量状态的量度。将其定义为物质中水的蒸汽压除以相同温度下纯水的蒸汽压；因此，纯蒸馏水具有精确为1的水活性。使用Rotronic HygroskopDT,Krautli进行水活性(aw)的确定。
用待表征的样品填充单元(cell)并将其放置在测量室(Rotronic Hygroskop DT,Krautli)中。稳定之后，记录水活性值。
对溶液中的蛋白的感官分析
由5成员的训练小组执行感官评价。基于6个特征(甜味、苦味、金属味、咸度、酸度、鲜味(umami)和涩味(astringency))的识别训练小组成员。基于4％离散度进行描述分析。讨论达成一致意见之后，选择用于表征溶液的外观、质地和滋味的最重要的描述项。
烘焙品的感官分析
由5成员的训练小组执行感官评价。基于6个特征(甜味、苦味、金属味、咸度、酸度、鲜味和涩味)的识别训练小组成员。对成品进行描述分析。讨论达成一致意见之后，选择用于表征产品的外观、质地和滋味的最重要的描述项。
烘箱中的铺展性：
通过用卡尺测量20个饼干的长度和宽度确定饼干的铺展性 (spreadability)。然后确定平均值并将其以mm表示。
饼干硬度：
将饼干硬度定义为通过刀破碎饼干所需的力。通过质地分析仪 Ta-XT2i评估饼干硬度。
装置：
-质地分析仪TA-XT2i(Stable Micro Systems,Ltd)
-压缩载荷元件(Compression load cell)，25kg
-具有刀的刀片组(Blade set with knife)(HDP/BSK)
程序：
-定位上十字头限制(position upper crosshead limit)，使得Warner Bratzler刀片在样品表面上1mm。
-TA-XT2i设定：
o测量压缩的力-返回开始
o测试前速度：3mm/s
o测试速度：2mm/s
o测试后速度：10mm/s
o穿透距离：5mm
o触发器类型：自动-3g
-穿透测试开始。通过质地分析仪记录结果并将其绘制为图。
结果
饼干硬度是测试期间记录的最大力(表示为“max力”)。由20个样品得到测试结果，并计算平均值。
饼干脆度
将饼干脆度定义为通过冲压机(punch)压缩饼干期间记录的峰数。如以下所描述的通过质地分析仪Ta-XT2i评估饼干脆度。
装置：
-质地分析仪TA-XT2i(Stable Micro Systems,Ltd)
-压缩载荷元件，25kg
-冲压机T1(9cm长度-0.5cm直径)
程序：
-定位上十字头限制，使得冲压机在样品表面上1mm。
-TA-XT2i设定：
o测量压缩的力-返回开始
o测试前速度：2mm/s
o测试速度：0.1mm/s
o测试后速度：5mm/s
o穿透距离：4mm
o触发器类型：自动-3g
-穿透测试开始。通过质地分析仪记录结果并将其绘制为图。
结果
饼干脆度是测试期间记录的峰数(表示为“脆度”)。由20个样品得到测试结果，并计算平均值。
发酵面团的发酵指数
该测试评价发酵期间面包面团发展的容量。
捏和之后，从捏合机中取出面团并放置10分钟。取出7个小块(loaves) (每个30g)并使其变圆成小球(手动)。成型之后，将它们放置在量杯中。记录初始高度(Vi)。将量杯放置在32℃/100％相对湿度的发酵箱中 35分钟。校对(proofing)结束时，从箱中除去杯子并记录校对之后的最终高度(Vf)。
-发酵指数(LI)是校对开始和结束之间的体积的差值：
LI＝(Vf-Vi)×3.14×r2(其中，r是量杯的半径)
面包屑硬度
在质地分析仪(TA XT2i,Stable Micro Systems,UK)中进行碎屑硬度。用36mm直径的圆柱形不锈钢探针，在1mm/s速度的十字头速度下最高达其原始高度的50％穿透(距离＝6mm)，压缩两个12.5mm厚的切片。装置：
-质地分析仪TA-XT2i(Stable Micro Systems,Ltd)
-压缩载荷元件，5kg
-探针P36R dia半径铝AACC
程序：
-定位上十字头限制，使得探针在样品表面上1mm。
-TA-XT2i设定：
o测量压缩的力-返回开始
o测试前速度：1mm/s
o测试速度：1.7mm/s
o测试后速度：10mm/s
o穿透距离：6mm
o触发器类型：自动-5g
-穿透测试开始。通过质地分析仪记录结果并将其绘制为图。
结果
-将面包屑硬度定义为2.21s之后的力(表示为以g计的“面包屑硬度”)
-由20个样品得到测试结果，并计算平均值。
面包体积
通过油菜籽置换法(AACC标准10-05)重复5次确定面包体积。计算平均的比体积(体积/重量)。
棒硬度
将棒硬度定义为冲压机压缩棒期间记录的最大力。如以下所描述的通过质地分析仪Ta-XT2i评估棒硬度。
装置：
-质地分析仪TA-XT2i(Stable Micro Systems,Ltd)
-压缩载荷元件，5kg
-冲压机52mm长度-5.7mm直径)
程序：
-定位上十字头限制，使得冲压机在样品表面上1mm。
-TA-XT2i设定：
测量压缩的力-返回开始
测试前速度：2mm/s
测试速度：0.5mm/s
测试后速度：5mm/s
穿透距离：10mm
触发器类型：自动-3g
-穿透测试开始。通过质地分析仪记录结果并将其绘制为图。
结果
-饼干硬度是测试期间记录的最大力(表示为“棒硬度”)。
-由12个样品得到测试结果，并计算平均值。
实施例1：根据本发明的一个实施方式用于提取豌豆蛋白的方法
按照图1示意性表示的实验方案进行该实施例。
步骤1-制备豌豆蛋白浓缩物：
筛选收获的干燥豌豆，本文称为“干豌豆”(具有约87.7％的干物质含量(基于重量))，并通过去石机的通道去石。随后，在脱壳机中将豌豆去皮。
接下来用乳酸菌(用发酵乳酸杆菌)使豌豆经历发酵。为此，以分批形式将豌豆浸泡在饮用水中。引用水是处理的井水使得根据欧洲指令 98/83/CE对人类消耗是安全的。在随后的批次中，将之前批次的一部分发酵介质(不包含豌豆的水相)用作接种物以完成随后的发酵。在每ml包含豌豆的含水组合物108cfu乳酸菌的存在下，使豌豆经历发酵。将每m3总体积的包含豌豆的含水组合物400kg豌豆放置在容器中。在不除气的情况下在40℃的温度下在密闭容器中厌氧地完成发酵，直到达到豌豆的4.2 的pH。发酵期间，以约20m3/小时再循环发酵容器中的水相。发酵豌豆持续约540min。发酵结束时，豌豆吸收了约它们发酵之前的初始质量的量的水，并具有约45％的干物质含量(基于重量)。
发酵之后，从发酵介质中除去豌豆。然后将豌豆放置在带孔的滚筒 (perforatedrotating drum)中，并洗涤以除去剩余的发酵介质。清洁之后，使豌豆经历湿磨。研磨期间，添加另外的饮用水使得最终的组合物具有约 25％的干物质含量(基于重量)。研磨步骤期间，通过添加氢氧化钠将pH 调节到约8.0。
研磨之后，使研磨的豌豆糊料经历离心倾析。包含蛋白和可溶杂质的上清液(本文也称为包含豌豆蛋白的含水组合物)具有约4％的干物质含量(基于重量)。
随后在板式热交换器中在75℃下使包含豌豆蛋白的含水组合物经历热处理15sec。
随后，通过等电沉淀浓缩豌豆蛋白。为此，用硫酸将包含豌豆蛋白的含水组合物的pH调节到4.7。通过离心倾析进行沉淀的/聚集的蛋白的分离。作为具有约25％(基于重量)的干物质含量的含水浆料得到产生的豌豆蛋白浓缩物。添加饮用水直到达到13％的干物质含量(基于重量)。
步骤2-由步骤1的浓缩物制备豌豆蛋白提取物：
接下来，用氢氧化钠将含水浆料的pH调节为pH 5.3。然后通过板式热交换器通过加热至约90℃使浆料经历热处理，并将含水浆料保持在约 90℃的温度下7min。
最后，喷雾干燥含水浆料。喷雾干燥器的入口温度是约190℃，以及出口温度是约72℃。
实施例2：酸化和热处理对豌豆蛋白提取物的性质的影响
步骤1-制备豌豆蛋白浓缩物：
筛选收获的干燥豌豆，本文称为“干豌豆”(具有约87％的干物质含量(基于重量))，并通过去石机的通道去石。随后，在脱壳机中将豌豆去皮。
接下来用乳酸菌(用发酵乳酸杆菌)使豌豆经历发酵。为此，以分批形式将豌豆浸泡在饮用水中。在随后的批次中，将之前批次的一部分发酵介质(不包含豌豆的水相)用作接种物以完成随后的发酵。在每ml包含豌豆的含水组合物108cfu乳酸菌的存在下，使豌豆经历发酵。将每m3总体积的包含豌豆的含水组合物400kg豌豆放置在容器中。在不除气的情况下在40℃的温度下在密闭容器中厌氧地完成发酵，直到达到豌豆的4.6 的pH。发酵期间，以约20m3/小时再循环发酵容器中的水相。发酵豌豆持续约480min。发酵结束时，豌豆吸收了约它们发酵之前的初始质量的量的水，并具有约47％的干物质含量(基于重量)。
发酵之后，从发酵介质中除去豌豆。然后将豌豆放置在带孔的滚筒中，并洗涤以除去剩余的发酵介质。清洁之后，使豌豆经历湿磨。研磨期间，添加另外的饮用水使得最终的组合物具有约27％的干物质含量(基于重量)。研磨步骤期间，通过添加氢氧化钠将pH调节到约8。
研磨之后，使研磨的豌豆糊料经历离心倾析。包含蛋白和可溶杂质的上清液(本文也称为包含豌豆蛋白的含水组合物)具有约4.5％的干物质含量(基于重量)。
随后在板式热交换器中在75℃下使包含豌豆蛋白的含水组合物经历热处理15sec。
随后，通过等电沉淀浓缩豌豆蛋白。为此，用硫酸将包含豌豆蛋白的含水组合物的pH调节到4.7。通过离心倾析进行沉淀的/聚集的蛋白的分离。作为具有约25％(基于重量)的干物质含量的含水浆料得到产生的豌豆蛋白浓缩物。
步骤2-由步骤1的浓缩物制备豌豆蛋白提取物。由上述的豌豆蛋白浓缩物开始，制备不同的豌豆蛋白提取物。
通过以下步骤得到提取物(A)：添加水之后将步骤1中得到的含水浆料的干物质含量调节到约15％(基于重量)；随后用氢氧化钠调节浆料的 pH直到达到约7.5的pH；以及在约98℃的温度下加热之后，将温度保持在约95℃约6.5分钟；然后喷雾干燥浆料以得到具有约95％(基于重量) 干物质含量的粉末。
通过以下步骤得到提取物(B)：将如步骤1所描述制备的含水浆料的干物质含量调节到约12.5％(基于重量)；以及在不调节pH(pH保持在 4.7)且没有随后的热处理的情况下喷雾干燥所述含水浆料。
通过以下步骤得到提取物(C)：将如步骤1所描述制备的含水浆料的干物质含量调节到约12.5％(基于重量)；随后在不调节pH(pH保持在 4.5)的情况下在约90℃的温度下热处理浆料约7分钟，然后喷雾干燥含水浆料以得到具有约95％(基于重量)干物质含量的粉末。
通过以下步骤得到提取物(D)：添加水之后将如步骤1所描述制备的含水浆料的干物质含量调节到约12.5％(基于重量)；随后用氢氧化钠调节浆料的pH直到达到约5.4的pH；以及随后在约90℃的温度下热处理约7分钟，然后喷雾干燥浆料以得到具有约95％(基于重量)干物质含量的粉末。
测量蛋白提取物(A)至(D)的凝胶强度、振实密度和堆积密度、流动性和润湿性。结果示于表2中。
图2显示了pH 6下的凝胶强度。
表2
作为pH的函数的每种提取物的氮溶解指数(NSI)在表3中给出并示于图3中。
表3
针对不同pH下每种提取物测量的粘度在表4中给出，以及粘度曲线示于图4中。
表4
实施例3：根据本发明的一个实施方式的提取物的表征
步骤1-制备豌豆蛋白浓缩物：
筛选收获的干燥豌豆，本文称为“干豌豆”(具有约87％的干物质含量(基于重量))，并通过去石机的通道去石。随后，在脱壳机中将豌豆去皮。
接下来用乳酸菌(用发酵乳酸杆菌)使豌豆经历发酵。为此，以分批形式将豌豆浸泡在饮用水中。在随后的批次中，将之前批次的一部分发酵介质(不包含豌豆的水相)用作接种物以完成随后的发酵。在每ml包含豌豆的含水组合物108cfu乳酸菌的存在下，使豌豆经历发酵。将每m3总体积的包含豌豆的含水组合物400kg豌豆放置在容器中。在不除气的情况下在约40℃的温度下在密闭容器中厌氧地完成发酵，直到达到豌豆的4.7 的pH。发酵期间，以约20m3/小时再循环发酵容器中的水相。发酵豌豆持续约430min。发酵结束时，豌豆吸收了约它们发酵之前的初始质量的量的水，并具有约47％的干物质含量(基于重量)。
发酵之后，从发酵介质中除去豌豆。然后将豌豆放置在带孔的滚筒中，并洗涤以除去剩余的发酵介质。清洁之后，使豌豆经历湿磨。研磨期间，添加另外的饮用水使得最终的组合物具有约25％的干物质含量(基于重量)。研磨步骤期间，通过添加氢氧化钠将pH调节到约8。
研磨之后，使研磨的豌豆糊料经历离心倾析。包含蛋白和可溶杂质的上清液(本文也称为包含豌豆蛋白的含水组合物)具有约4％的干物质含量(基于重量)。
随后在板式热交换器中在75℃下使包含豌豆蛋白的含水组合物经历热处理15sec。
随后，通过等电沉淀浓缩豌豆蛋白。为此，用硫酸将包含豌豆蛋白的含水组合物的pH调节到4.8。通过离心倾析进行沉淀的/聚集的蛋白的分离。作为具有约25％(基于重量)的干物质含量的含水浆料得到产生的豌豆蛋白浓缩物。
步骤2-制备豌豆蛋白提取物
通过以下步骤得到提取物(E)：添加水之后将步骤1中得到的含水浆料的干物质含量调节到约16％(基于重量)；随后用氢氧化钠调节浆料的 pH直到达到约7.4的pH；以及随后在约90℃的温度下热处理约7分钟；然后喷雾干燥浆料以得到具有约95％(基于重量)干物质含量的粉末。
提取物(F)如实施例1所描述的根据本发明制备豌豆蛋白浓缩物。
通过以下步骤得到提取物(G)：添加水之后将步骤1中得到的含水浆料的干物质含量调节到约16％(基于重量)；随后用氢氧化钠调节浆料的 pH直到达到约6.1的pH；以及随后在约98℃的温度下热处理浆料约7 分钟；然后喷雾干燥浆料以得到具有约95％(基于重量)干物质含量的粉末。
测量每种提取物的润湿性、流动性、振实密度和堆积密度。
结果在表5中给出。
表5
评估蛋白提取物E、F和G的颜色。结果示于表6中。
表6
测量每种提取物的pH和pH 6下的凝胶强度。结果示于表7中。
表7
作为pH的函数的每种提取物的氮溶解指数(NSI)在表8中给出并示于图5中。
表8
在不同pH下针对每种提取物测量的粘度在表9中给出。
表9
以4wt％分散在自来水中之后，确定每种提取物的感官特征，并在表 10中给出结果。
表10
实施例4：根据本发明的豌豆蛋白在葡萄酒精制(wine fining)中的用途
进行葡萄酒精制以降低浊度并改善亮度和味道。
将带正电荷的蛋白的溶液(pH<pHi)添加到葡萄酒(pH 2.8至4.0) 中。在带负电的葡萄酒颗粒的存在下，电荷被中和且稳定的亲水胶体变得不稳定的，导致它们沉淀。
常用于葡萄酒的精制的精制剂(fining agent)是明胶、卵白蛋白、酪蛋白、或植物蛋白。还经常使用精制助剂如氧化硅(二氧化硅)或鞣酸类。
在12°酒精溶液的两种不同浓度(5g/hl和10g/hl)、pH 3.2、4℃下，在鞣酸类或SiO2存下下评价不同类型的豌豆蛋白。搁置之后(1h至96h)，测量溶液的吸光度。
过程如下：在2L烧杯中，添加1750g水(＝1750ml)。用250ml的 96°乙醇填充容量瓶。将乙醇添加到水中并彻底混合。用HCl 1M(记录重量)将产生的溶液的pH调节到3.2。将鞣酸类或二氧化硅添加到溶液中，彻底混合。盖上溶液，并搁置1h。添加豌豆蛋白且其构成温育开始时间 (t＝0h)。然后将溶液存储在4℃。
取样：如下进行：用30ml溶液填充塑料注射器，在不搅拌溶液的情况下放进烧杯中部，用溶液填充用于测量吸光度的元件(cell，杯)。使用分光光度计记录420nm处的吸光度。然后使用0.45μm的Whatman过滤器过滤溶液。在420nm下测量滤液的吸光度。
使用以下等式测量浊度：
浊度＝过滤之前的吸光度–过滤之后的吸光度
1.用鞣酸类作为助剂的5和10g/hl的蛋白浓度
制备几份溶液。使用0.3ml/l浓度的鞣酸类。
Blanco T(也称为对照T)是用鞣酸类的阴性对照(没有任何精制剂)。鞣酸类是现成的溶液：来自Institut Oenologique de Champagne的溶液ST 由丹宁酸(CAS号:1401-55-4)和硫酸铜组成的溶液。
Perle T是用鞣酸类的阳性对照(也称为Perle)，并进一步包含作为精制剂的0.115g/hl Colle Perle(来自Institut Oenologique de Champagne的水解明胶)。
将实施例3制备的提取物E和F用作豌豆蛋白。
溶液A包含Blanco T溶液和来自提取物E的豌豆蛋白。
溶液B包含Blanco T溶液和来自提取物F的豌豆蛋白。
如以上所描述的测量4℃下不同温育时间之后溶液的浊度。结果示于表11和图7中。温育96之后溶液的浊度示于图6中。
表11
2.用SiO2作为助剂的5g/hl的蛋白浓度
使用0.6ml/l的SiO2。
Blanco S(也称为对照S)是用SiO2的阴性对照(没有任何精制剂)。
Perle S是用SiO2的阳性对照且包含0.115g/hl Colle Perle(InstitutOenologique de Champagne提供的水解明胶)。
将实施例3制备的提取物E和F用作豌豆蛋白。
溶液A1包含Blanco S溶液和来自提取物E的豌豆蛋白。
溶液B1包含Blanco S溶液和来自提取物F的豌豆蛋白。如以上所描述的测量4℃下不同温育时间之后溶液的浊度。结果示于表12和图9中。温育96之后溶液的浊度示于图8中。
表12
3.在5g/hl蛋白浓度下助剂的影响
表13和图10示出了与仅包含蛋白且不包含助剂(无)的溶液相比，在4℃下温育96h之后在1和2中测试的不同助剂的影响。
无：12°酒精溶液中5g/hl的豌豆蛋白，pH 3.2，4℃，如下制备：向 2L烧杯中添加1750g水(＝1750ml)。用250ml的96°乙醇填充容量瓶。将乙醇添加到水中并彻底混合。用HCl1M(记录重量)将产生的溶液的 pH调节到3.2。添加豌豆蛋白。然后将溶液存储在4℃。
表13
4.与其他豌豆蛋白(没有助剂)比较
溶液A2包含12°酒精溶液和来自提取物E的豌豆蛋白。
溶液B2包含12°酒精溶液和来自提取物F的豌豆蛋白。
溶液C1至F1包含12°酒精溶液和商业的豌豆蛋白。
表14中显示了不同的提取物。不同的温育时间之后测量溶液的浊度。表15和图11指出了对浊度的影响。
表14
| 编号 | 产物 | 批次 |
| A2 | 提取物E | |
| B2 | 根据本发明的提取物F | |
| C1 | Nutripea AD | 08/41.07.05 |
| D1 | Nutralys F85M | W272C |
| E1 | Nutralys F85F | W179E |
| F1 | Nutralys S85F | W037f |
表15
实施例5：包含根据本发明的豌豆蛋白的食品
评价多种食品中包含的豌豆蛋白。
1.饼干
制备用于饼干的面团。将如实施例3所制备的提取物E(不是根据本发明)和提取物F(根据本发明)用作豌豆蛋白。进行测试，以评价用提取物E制备的饼干面团的pH、和/或改变用提取物F和不同的酸度调整试剂和膨胀剂制备的面团的pH。
1a)如表16所示的制备面团。
表16
表17给出了对面团的分析。
表17
1b)如表18所示的制备面团。
制备面团(表18)，其中，减少添加到用提取物F制备的面团中的水的量，发现最好减少3％的水，并得到具有优异的质地和层压能力的面团。对于用提取物E制备的面团，不可以降低含水量，因为面团变得太硬。
表18
表19给出了对面团的分析。
表19
| 面团分析 | 试验3 | 试验4 |
| 面团pH | 7.3 | 6.3 |
| 面团硬度 | 160 | 171 |
使用试验3和4的面团制备饼干。在150℃的Eloma Backmaster烘箱中烘焙它们20分钟，并在包装之前在室温下冷却。用相应的面团试验3 (饼干A)和试验4(饼干B)制备的饼干的分析示于表20中。
表20
2.富含蛋白的面包
使用豌豆蛋白提取物F或实施例3中制备的豌豆蛋白提取物G制备面包。表21提供了面包配方。除了用根据本发明的豌豆蛋白(提取物F) 和不是根据本发明的豌豆蛋白(G)制备的相同面团，作出了一些适应调整(对于F在调节或不调节面团的pH的情况下降低含水量5％；以及对于G降低含水量)。
表21
使用的混合器是螺旋捏合机(型号Vema QR24)。捏和之后，从捏合机中取出面团并搁置10分钟。将面团分为500g的面团卷，首先将其制为圆形，然后手动拉伸。将面包放置在过油的金属罐中，并在发酵控制柜 (t°32℃)中存储1小时15分钟。
烘箱：在柜式烘箱(Salva Modular)中在200°下烘烤面包60分钟。烘烤结束之前20分钟，打开抽汽。然后将面包冷却至室温并包装在适当的包装中。
根据以上表21中的配方制备面团，并如表22指出的评价面团。
表22
观察到用豌豆蛋白提取物F制备的面团，当降低含水量时，面团粘性较小，具有良好的弹性，且更容易加工。对于用提取物G制备的面团，不可以降低含水量大于2％，否则面团变得太硬。
测量面团的发酵指数(leavening index)。表23和图12示出了相应面团的发酵指数。
表23
评价制备的面包的质量。结果示于表24中。测量的面包体积和面包屑硬度分别示于图13和14中。
表24
3.法奇软糖棒
使用实施例3中制备的提取物E和F制备法奇软糖棒(Fudge bar)。法奇软糖棒的配方示于表25中。
表25
制备棒的过程如下
-45℃水浴中溶化脂肪
-混合糖浆并添加脂肪
-在Hobart中混合粉末
-添加糖浆并搅拌几分钟直到得到均匀糊料
-将面团放置在塑料袋中并醒发，搁置一整夜
-切割棒并用巧克力涂覆它们
观察到包含根据本发明的提取物F的混合物(B)相比混合物(A) 需要较少的时间来均匀化，约2分钟更少。
随时间(月)测量相应法奇软糖棒的pH、Aw(水活性)、和硬度，并分别将结果示于表26、27和28中。还测量法奇软糖棒的硬度，并将结果示于图15中。
表26
| pH | A | B | B+调节pH |
| T0 | 6.19 | 5.83 | 6.26 |
| 月1(M1) | 6.11 | nd | nd |
| 月2(M2) | nd | 5.79 | nd |
| 月3(M3) | 6.34 | 5.89 | 6.13 |
| 月6(M6) | 6.27 | 5.52 | 6.05 |
| 月12(M12) | nd | nd | nd |
表27
| Aw | A | B | B+调节pH |
| T0 | 0.654 | 0.686 | 0.635 |
| M1 | 0.656 | 0.678 | 0.673 |
| M2 | 0.655 | 0.673 | 0.635 |
| M3 | 0.660 | 0.677 | 0.653 |
| M6 | 0.647 | 0.659 | 0.634 |
| M12 | nd | 0.666 | nd |
表28
| 硬度 | A | B | B+调节pH |
| T0 | 1106 | 290 | 883 |
| M1 | 1610 | 724 | 908 |
| M2 | 1853 | 849 | 1132 |
| M3 | 1929 | 865 | 1133 |
| M6 | 2228 | 873 | 1427 |
| M12 | 3284 | 1664 | 2532 |
表29示出了相应法奇软糖棒的感官分析。
表29
实施例6：根据本发明的一个实施方式的提取物的表征(没有发酵步骤)
步骤1-制备豌豆蛋白浓缩物：
筛选收获的干燥豌豆，本文称为“干豌豆”(具有约87％的干物质含量(基于重量))，并通过去石机的通道去石。随后，在脱壳机中将豌豆去皮。
干燥粉碎豌豆以得到豌豆粉。将饮用水添加到豌豆粉，使得最终组合物具有约25％(基于重量)的干物质含量。随后，通过添加氢氧化钠将 pH调节到约8。
pH调节之后，使豌豆糊料经历离心倾析。包含蛋白和可溶杂质的上清液(本文也称为包含豌豆蛋白的含水组合物)具有约4％的干物质含量 (基于重量)。
随后在板式热交换器中在75℃下使包含豌豆蛋白的含水组合物经历热处理15sec。
随后，通过等电沉淀浓缩豌豆蛋白。为此，用硫酸将包含豌豆蛋白的含水组合物的pH调节到4.8。通过离心倾析进行沉淀的/聚集的蛋白的分离。作为具有约25％(基于重量)的干物质含量的含水浆料得到产生的豌豆蛋白浓缩物。
步骤2-由步骤1的浓缩物制备豌豆蛋白提取物：
通过以下步骤得到提取物(H)：添加水之后将步骤1中得到的含水浆料的干物质含量调节到约18％(基于重量)；随后用氢氧化钠调节浆料的 pH直到达到约5.4的pH；以及随后在约85℃的温度下热处理约7分钟；然后喷雾干燥浆料以得到具有约95％(基于重量)干物质含量的粉末。
通过以下步骤得到提取物(I)：添加水之后将步骤1中得到的含水浆料的干物质含量调节到约17％(基于重量)；随后用氢氧化钠调节浆料的 pH直到达到约5.4的pH；随后通过在约140℃的温度下直接蒸汽注射约 4秒实现热处理；然后在90℃下喷雾干燥浆料以得到具有约96％(基于重量)干物质含量的粉末。
测量蛋白提取物(H)和(I)的凝胶强度、振实密度和堆积密度、流动性和润湿性。结果显示在表30中。
表30
作为pH的函数的两种提取物的氮溶解指数(nitrogen solubility index) (NSI)在表3中给出并示于图16中。
表31
在不同pH下针对两种提取物测量的粘度在表32中给出。
表32
实施例7：用不同乳酸杆菌菌株(发酵乳酸杆菌LMG 6902、发酵乳酸杆菌LMG18026、卷曲乳酸杆菌LMG 12005或嗜酸乳酸杆菌LMG 8151)发酵的豌豆的比较研究
筛选收获的干燥豌豆，本文称为“干豌豆”(具有约87％的干物质含量(基于干豌豆的总重量))，并通过去石机的通道去石。随后，在脱壳机中将豌豆去皮。
接下来用乳酸菌(发酵乳酸杆菌LMG 6902、发酵乳酸杆菌LMG 18026、卷曲乳酸杆菌LMG 12005或嗜酸乳酸杆菌LMG 8151)使豌豆经历发酵。为此，将2000g豌豆浸泡在容器中40℃温度下的3663g灭菌的软化水中。相同添加包含列举的菌株的发酵介质。该容器在恒温槽中并且添加泵以便以约250ml/min再循环水相。
对于发酵乳酸杆菌LMG 6902和发酵乳酸杆菌LMG 18026(两者都是从BCCM/LMGLaboratorium voor Microbiologie,Universiteit Gent(UGent) Belgium得到的)，如BCCM提供的程序中所描述的制备发酵介质(冻干的培养物的F109C Revival；推荐介质66)。然后将37ml发酵介质添加到容器中。
对于卷曲乳酸杆菌LMG 12005(50Bn)和嗜酸乳酸杆菌LMG 8151 (100Bn)(两者都是从THT s.a.Gembloux,Belgium得到的)，通过将37g 乳酸杆菌片直接放入容器中制备发酵介质。
在每ml包含豌豆的含水组合物约108cfu乳酸菌的存在下，使豌豆经历发酵。在不除气的情况下在约40℃的温度下在密闭容器中完成发酵。
图17-20分别示出了作为发酵时间的函数的糖含量、pH、酸度、和乳酸菌浓度的演变。
Claims (23)
1.一种用于提取豌豆蛋白和获得包含基于豌豆蛋白组合物的总的干物质的至少60wt％的蛋白的豌豆蛋白组合物的方法，其中，对基于含水组合物的总重量包含3wt％的所述豌豆蛋白组合物的含水组合物测量的，所述豌豆蛋白组合物具有在pH 7.0下小于15％的氮溶解指数，以及在pH 6.0下小于200cP的粘度，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含豌豆蛋白的含水组合物；
(b)从包含豌豆蛋白的所述含水组合物中分离所述豌豆蛋白；
(c)得到分离的豌豆蛋白，其为pH在4.0至5.8范围内的含水浆料并且包含基于所述豌豆蛋白组合物的总的干物质的至少60wt％的蛋白；以及
(d)使pH在4.0至5.8范围内的所述含水浆料经历以下的热处理：在115℃至210℃范围内的温度下持续15s至0.01s范围内的时间；在95℃至115℃范围内的温度下持续5min至15s范围内的时间；在75℃至95℃范围内的温度下持续15min至5min范围内的时间；在75℃至110℃范围内的温度下持续10min至2min范围内的时间；在80℃至100℃范围内的温度下持续8min至5min范围内的时间；或在130℃至150℃范围内的温度下持续8s至1s范围内的时间。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)中从所述含水组合物中分离豌豆蛋白包括浓缩所述豌豆蛋白。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)包括沉淀、絮凝、过滤、和/或色谱法步骤中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)包括等电沉淀。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)包括将包含豌豆蛋白的所述含水组合物的pH调节至4.0至5.8范围内的值。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤(b)包括将包含豌豆蛋白的所述含水组合物的pH调节至4.5至5.5范围内的值。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(c)包括将所述含水浆料的pH调节或保持至4.0至5.8范围内的值。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，步骤(c)包括将所述含水浆料的pH调节或保持至4.5至5.5范围内的值。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)中包含豌豆蛋白的所述含水组合物具有至少6的pH。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，步骤(a)中包含豌豆蛋白的所述含水组合物具有6.0至9.0范围内的pH。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，步骤(a)中包含豌豆蛋白的所述含水组合物具有6.5至8.5范围内的pH。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(a)之前，使包含豌豆的含水组合物经历发酵。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，在乳酸菌存在下进行所述发酵。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，在一种或多种乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)存在下进行所述发酵。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(b)之前或期间，使包含豌豆蛋白的所述含水组合物或所述豌豆蛋白经历热处理。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述热处理是巴氏杀菌。
17.通过根据权利要求1至16中任一项所述的方法能够得到的豌豆蛋白。
18.一种豌豆蛋白组合物，基于所述组合物的总的干物质，包含至少60wt％的蛋白，其中，对基于含水组合物的总重量包含3wt％的所述豌豆蛋白组合物的含水组合物测量的，所述豌豆蛋白组合物具有在pH7.0下小于15％的氮溶解指数，以及在pH 6.0下小于200cP的粘度。
19.根据权利要求18所述的豌豆蛋白组合物，其中，在室温下对悬浮于90g水中的10g豌豆蛋白组合物测量的，所述豌豆蛋白组合物具有4.0至5.8范围内的pH。
20.一种包含根据权利要求17所述的豌豆蛋白或根据权利要求18或19所述的豌豆蛋白组合物的可食用组合物。
21.根据权利要求20所述的可食用组合物，其中所述可食用组合物是食品或饲料产品。
22.根据权利要求17所述的豌豆蛋白或根据权利要求18或19所述的豌豆蛋白组合物在食品或饲料产品中的用途，或用于净化液体的用途。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述食品是烘焙和糖果食品。
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