FR3143628A1 - Isolat de proteine vegetale extrait et ameliore via souche microbienne - Google Patents
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Abstract
L’invention concerne un procédé d’extraction de protéines végétales comprenant les étapes suivantes : 1. la mise en suspension d’une farine végétale dans un solvant préférentiellement aqueux, de sorte à obtenir une suspension de farine végétale ; 2a. l’ajout d’une souche dans la suspension de farine végétale de l’étape 1, 2b. l’incubation de la suspension ensemencée de l’étape 2a de sorte à ce que la souche acidifie la suspension ensemencée jusqu’à formation d’un précipitat protéique ; 3. Séparation du précipitat protéique obtenu à l’issue de l’étape 2b ; ainsi qu’un isolat de protéines végétales susceptible d’être obtenu par le procédé de l’invention.
Description
L’invention relève du domaine des protéines végétales, en particulier des isolats protéiques de légumineuses, encore plus particulièrement des isolats protéiques de pois.
Les besoins quotidiens humains en protéines sont compris entre 12 et 20% de la ration alimentaire. Ces protéines sont fournies aussi bien par des produits d'origine animale (viandes, poissons, œufs, produits laitiers) que par des produits d’origine végétale (céréales, légumineuses, algues).
Cependant, dans les pays industrialisés, les apports en protéines sont majoritairement sous la forme de protéines d'origine animale. Or, de nombreuses études démontrent qu'une consommation excessive de protéines d'origine animale au détriment des protéines végétales est une des causes d'augmentation de cancers et maladies cardio-vasculaires.
Par ailleurs, les protéines animales présentent beaucoup de désavantages, tant sur le plan de leur potentiel allergène, concernant notamment les protéines issues du lait ou des œufs, que sur le plan environnemental en relation avec les méfaits de l'élevage intensif.
Ainsi, il existe une demande croissante des industriels pour des composés d'origine végétale possédant des propriétés nutritionnelles et fonctionnelles intéressantes sans pour autant présenter les inconvénients de composés d'origine animale.
Le soja a été, et reste, la première alternative végétale aux protéines animales. L’utilisation du soja possède néanmoins des désavantages certains. La graine de soja est plus que fréquemment d’origine OGM et l’obtention de sa protéine passe par une étape de déshuilage utilisant du solvant.
Depuis les années 70, les légumineuses à graines, dont en particulier le pois, se sont fortement développé en Europe, majoritairement en France, comme ressource protéique alternative aux protéines animales à destination de l’alimentation animale et humaine. Le pois contient environ 27 % en poids de matières protéiques. Le terme « pois » est ici considéré dans son acception la plus large et inclut en particulier toutes les variétés sauvages de « pois lisse » (« smooth pea »), et toutes les variétés mutantes de « pois lisse » et de « pois ridé » (« wrinkled pea »), et ce quelles que soient les utilisations auxquelles on destine généralement lesdites variétés (alimentation humaine, nutrition animale et/ou autres utilisations). Ces graines sont non-OGM et ne nécessitent pas de déhuilage solvanté.
La protéine de pois, majoritairement de la globuline de pois, est extraite et valorisée industriellement depuis bon nombre d’années. Plusieurs procédés existent que l’on peut catégoriser en deux grandes familles : les procédés dits « par voie sèche » et les procédés dits « par voie humide ». Les premiers consistent en la réduction granulométrique des graines de légumineuses en farine suivi par une séparation granulométrique à l’aide d’un courant d’air ascendant, procédé communément appelé turbo-séparation. Ces procédés conduisent à l’obtention de concentrats protéiques dont la richesse en protéines ne dépasse pas 60%-70%. Ces procédés ne sont pas à considérer dans le cadre de la présente invention qui s’inscrit dans le domaine des isolats dont la concentration protéique est supérieure à ces teneurs.
Concernant la seconde famille de procédés dits « par voie humide », on peut citer, comme exemple de procédé d’extraction de la protéine de pois, le brevet EP 1 400 537. Dans ce procédé, la graine est broyée en absence d’eau (procédé dit de « broyage à sec ») afin d’obtenir une farine. Cette farine sera ensuite mise en suspension dans de l’eau afin d’en extraire la protéine par précipitation. La précipitation est réalisée en ajustant le pH isoélectrique et/ou en chauffant le milieu.
De tels procédés ont plusieurs désavantages. Le premier réside dans l’utilisation de réactifs acidobasiques qui sont onéreux, nécessitent des investissements pour leur stockage et leur mise en œuvre. Ces derniers sont aussi dangereux pour l’être humain en ce que leur contact sans protections adéquates provoque des lésions importantes. Le second consiste en l’obtention d’un isolat dont l’intégrité moléculaire est affectée, ainsi que le profil organoleptique. Il est ainsi bien connu qu’un chauffage sous conditions acide va modifier de manière potentiellement importante les molécules protéiques et provoquer l’apparition de composés organovolatils issus de la dégradation lipidique. De tels composés sont par exemple l’hexanal ou le methanethiol.
Il est donc courant et fortement travaillé actuellement dans le domaine des améliorations de ces procédés remplaçant cette étape de précipitation isoélectrique avec ou sans chauffage, voire d’ajout d’étapes de procédé supplémentaires pour pallier ces effets indésirables. La première solution impose hélas l’investissement dans des techniques de filtration membranaires qui sont couteuses et lourdes à opérer du fait du colmatage important du média filtrant. Les secondes solutions sont également beaucoup de limitations ne serait ce que du fait de l’implémentation d’étapes nouvelles à un procédé déjà complexe. On peut citer en particulier la fermentation des graines de légumineuses au préalable du procédé d’extraction cœur du brevet EP 3 071 046. Si le résultat final obtenu est intéressant, le procédé implique une fermentation lourde de plus de 24h et la génération d’eaux résiduelles excessives qu’il faudra traiter.
Une voie alternative récente consiste en l’utilisation de souches bactériennes afin de remplacer les réactifs acidobasiques lors de l’étape de précipitation, décrit dans l’article Emkani et al., 2021 (Emkani et al., Foods, 10, 549, 2021 : « Pea Protein Extraction Assisted by Lactic Fermentation: Impact on Protein Profile and Thermal Properties »). Si ce procédé semble intéressant, il possède également deux désavantages : l’hydrolyse voire la consommation de la protéine par la souche, et le temps de fermentation d’environ 5h à 6h difficilement compatible avec un procédé industriel.
Il est du mérite de la demanderesse d’avoir travaillé dans ce domaine et d’avoir découvert un ensemble de souches réalisant une acidification rapide et sans hydrolyse, c’est-à-dire sans consommation de la protéine, ainsi que d’avoir développé le procédé l’utilisant dans le but d’obtenir un isolat protéique dont les caractéristiques fonctionnelles et organoleptiques sont optimisées à un niveau jamais encore atteint. De surcroit, les souches et le procédé selon l’invention les utilisant permettent d’obtenir un isolat de protéines végétales dont les performances organoleptiques sont d’un intérêt certain pour l’industrie agroalimentaire.
L’invention sera mieux comprise dans la partie descriptive de la présente demande qui va suivre.
La présente invention concerne un procédé d’extraction de protéines végétales comprenant les étapes suivantes :
1. la mise en suspension d’une farine végétale dans un solvant préférentiellement aqueux, de sorte à obtenir une suspension de farine végétale ;
2a. l’ajout d’une souche dans la suspension de farine végétale de l’étape 1, la souche étant sélectionnée dans le groupe constitué parLactobacillus Fermentum, Lactobacillus Salivarius, Lactobacillus Delbrueckii subsp Jakobsenii, Lactobacillus Mucosae, Streptococcus Salivarius, et Enterococcus Lactis; la souche étant préférentiellement une souche deLactobacillus Fermentum; encore plus préférentiellement la souche déposée auprès de la CNM sous le numéro CNCM I-5802, de sorte à former une suspension ensemencée ;
2b. l’incubation de la suspension ensemencée de l’étape 2a de sorte à ce que la souche acidifie la suspension ensemencée jusqu’à formation d’un précipitat protéique ;
3. Séparation du précipitat protéique obtenu à l’issue de l’étape 2b.
2a. l’ajout d’une souche dans la suspension de farine végétale de l’étape 1, la souche étant sélectionnée dans le groupe constitué parLactobacillus Fermentum, Lactobacillus Salivarius, Lactobacillus Delbrueckii subsp Jakobsenii, Lactobacillus Mucosae, Streptococcus Salivarius, et Enterococcus Lactis; la souche étant préférentiellement une souche deLactobacillus Fermentum; encore plus préférentiellement la souche déposée auprès de la CNM sous le numéro CNCM I-5802, de sorte à former une suspension ensemencée ;
2b. l’incubation de la suspension ensemencée de l’étape 2a de sorte à ce que la souche acidifie la suspension ensemencée jusqu’à formation d’un précipitat protéique ;
3. Séparation du précipitat protéique obtenu à l’issue de l’étape 2b.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que la farine végétale de l’étape 1 est sous la forme d’une poudre végétale contenant une quantité de protéine supérieure à 1% en poids, préférentiellement comprise entre 15% et 30% en poids, par rapport au poids de poudre.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que caractérisé en ce que la farine végétale de l’étape 1 est un isolat ou un concentrat, préférentiellement un isolat dont la teneur en protéines est supérieure à 80% en poids sec sur matière sèche d’isolat.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que la farine végétale de l’étape 1 est une farine de légumineuse, préférentiellement en ce que la farine végétale est une farine de légumineuse sélectionnée dans le groupe constitué par le pois et la féverole, plus préférentiellement en ce que la farine végétale est une farine de pois.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention est caractérisé ce que la température d’incubation de la suspension de l’étape 2b est comprise entre 30°C et 50°C, préférentiellement entre 35°C et 45°C.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que le pH de la suspension de farine végétal de l’étape 1 est rectifié de sorte à être compris entre 6,5 et 7,5 ; préférentiellement de sorte à être égal à 7,0 , avant la mise en œuvre de l’étape 2a.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que l’ajout de souche de l’étape 2a est réalisé de sorte à obtenir une suspension ensemencée présentant une concentration de souche comprise entre 0,1.109et 1.109Colonies Formant Unité (CFU) par millilitre de suspension de farine végétale.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que l’incubation de l’étape 2b est menée jusqu’à ce la suspension ensemencée présente un pH compris entre 4 et 5, préférentiellement un pH de 5,0.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que ce que si à l’issue de l’étape 2b, le pH de la suspension ensemencée n’est pas compris entre 4 et 5, l’étape 2b comprend en fin d’étape 2b une sous-étape 2b’ d’acidification de la suspension ensemencée par ajout d’acide, de sorte à ce que la suspension ensemencée obtenue à l’issue de l’étape 2b présente un pH compris entre 4 et 5, de préférence compris entre 5 et 4,5.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que l’étape 2b comprend en fin d’étape 2b une sous-étape 2b’’ de chauffage additionnel pour augmenter le rendement de floculation, consistant à porter la suspension de farine végétale de l’étape 2b à une température comprise entre 45° et 85°C.
Dans un mode de réalisation, le procédé selon l’invention est caractérisé en ce que caractérisé en ce que l’étape 3 comprend les étapes suivantes :
3a. la rectification du pH de la suspension ensemencée obtenue à l’issue de l’étape 2b à un pH compris entre 6 et 9, préférentiellement un pH de 7, préférentiellement par ajout de soude ou de chaux dans ladite suspension ;
3b. le traitement thermique de la suspension de l’étape 3a entre 100°C et 160°C pendant 0,1 à 1s, et
3c. le séchage de la suspension de farine végétale de l’étape 3b jusqu’à obtenir un isolat de farine végétale présentant une matière sèche supérieure à 95% à l’aide d’un atomiseur.
3b. le traitement thermique de la suspension de l’étape 3a entre 100°C et 160°C pendant 0,1 à 1s, et
3c. le séchage de la suspension de farine végétale de l’étape 3b jusqu’à obtenir un isolat de farine végétale présentant une matière sèche supérieure à 95% à l’aide d’un atomiseur.
L’invention concerne également un isolat de protéines végétales susceptible d’être obtenu par le procédé de l’invention.
Dans un mode de réalisation, l’isolat de protéines végétales selon l’invention est caractérisé en ce que son degré d’hydrolyse (ou DH) est inférieur à 10%, préférentiellement inférieur à 5.
Dans un mode de réalisation, l’isolat de protéines végétales est caractérisé en ce que teneur en methanethiol est réduite de plus de 25%, préférentiellement de plus de 50%, par rapport à un isolat obtenu par acidification d’une suspension de farine végétale uniquement par ajout d’acide chlorhydrique.
Dans un mode de réalisation, l’isolat de protéines végétales est caractérisé en ce que sa teneur en protéines comprise entre 80% et 95% en poids, préférentiellement entre 82% et 92% en poids, préférentiellement entre 84% et 90% en poids, préférentiellement entre 84% et 88% en poids, par rapport au poids de matière sèche totale de l’isolat.
L’invention concerne également l’utilisation de l’isolat selon l’invention ou obtenu selon le procédé de l’invention pour des applications industrielles comprenant les applications alimentaires, nutraceutiques, pharmaceutiques.
L’invention concerne également une souche microbienne déposée auprès de la CNCM sous le numéro CNCM I-5802.
L’invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée ci-dessous
La présente invention concerne la souche microbienne déposée auprès de la CNCM sous le numéro CNCM I-5802.
Cette souche particulière a été identifiée comme appartenant au groupe Lactobacillus Fermentum. Comme il sera démontré dans la partie exemple, celle-ci se démarque de manière exceptionnelle en permettant une acidification d’un milieu contenant des protéines végétales, préférentiellement de pois, à la fois rapide et performante.
La souche CNCM I-5802 sera principalement utilisée pour les procédés d’extraction de protéines végétales mais également pour tout autre activité nécessitant une acidification rapide avec une hydrolyse protéique réduite voire inexistante. Ces applications seront passés en revue précisément et de manière non exhaustive plus loin dans la présente description.
La présente invention concerne donc un procédé d’extraction de protéines végétales comprenant les étapes suivantes :
1. la mise en suspension d’une farine végétale dans un solvant préférentiellement aqueux, de sorte à obtenir une suspension de farine végétale ;
2a. l’ajout d’une souche dans la suspension de farine végétale de l’étape 1, la souche étant sélectionnée dans le groupe constitué par Lactobacillus Fermentum, Lactobacillus Salivarius, Lactobacillus Delbrueckii subsp Jakobsenii, Lactobacillus Mucosae, Streptococcus Salivarius, et Enterococcus Lactis ; la souche étant préférentiellement une souche de Lactobacillus Fermentum ; encore plus préférentiellement la souche déposée auprès de la CNCM sous le numéro CNCM I-5802, de sorte à former une suspension ensemencée ;
2b. l’incubation de la suspension ensemencée de l’étape 2a de sorte à ce que la souche acidifie la suspension ensemencée jusqu’à formation d’un précipitat protéique ;
3. Séparation du précipitat protéique obtenu à l’issue de l’étape 2b.
1. la mise en suspension d’une farine végétale dans un solvant préférentiellement aqueux, de sorte à obtenir une suspension de farine végétale ;
2a. l’ajout d’une souche dans la suspension de farine végétale de l’étape 1, la souche étant sélectionnée dans le groupe constitué par Lactobacillus Fermentum, Lactobacillus Salivarius, Lactobacillus Delbrueckii subsp Jakobsenii, Lactobacillus Mucosae, Streptococcus Salivarius, et Enterococcus Lactis ; la souche étant préférentiellement une souche de Lactobacillus Fermentum ; encore plus préférentiellement la souche déposée auprès de la CNCM sous le numéro CNCM I-5802, de sorte à former une suspension ensemencée ;
2b. l’incubation de la suspension ensemencée de l’étape 2a de sorte à ce que la souche acidifie la suspension ensemencée jusqu’à formation d’un précipitat protéique ;
3. Séparation du précipitat protéique obtenu à l’issue de l’étape 2b.
La première étape du procédé consiste donc en la mise en œuvre d’une farine végétale.
Par « farine végétale » on entend au sens de l’invention toute poudre d’origine végétale contenant une quantité de protéine supérieure à 1%, préférentiellement comprise entre 15% et 30% en poids, par rapport au poids de poudre.
En particulier, on entendra au sens de l’invention la farine obtenue par broyage des graines végétales. Ces graines pourront subir un prétraitement tels qu’un nettoyage, un tamisage, un chauffage thermique, une étape de trempe ou de blanchiment, de tamisage (séparation des graines des cailloux par exemple). De manière préférée, si un blanchiment est effectué, le barème du traitement thermique sera de 3 minutes à 80°C.
Les graines végétales consistent en la structure contenant et protégeant l'embryon végétal. Elle est souvent contenue dans un fruit qui permet sa dissémination ou protégée par une enveloppe externe souvent appelée coque. Celles-ci seront particulièrement sélectionnées dans la liste contenant les légumineuses, les céréales.
Par « légumineuse », on entend au sens de la présente invention la famille de plantes dicotylédones de l'ordre des Fabales. C'est l'une des plus importantes familles de plantes à fleurs, la troisième après les Orchidaceae et les Asteraceae par le nombre d'espèces. Elle compte environ 765 genres regroupant plus de 19 500 espèces. Plusieurs légumineuses sont d'importantes plantes cultivées parmi lesquelles les haricots, les pois, la féverole, le lupin, le haricot, le pois chiche, l'arachide, la lentille cultivée, la luzerne cultivée, différents trèfles, les fèves, le caroubier, la réglisse.
De manière préférée, les légumineuses sont sélectionnées parmi la liste constituée du pois et de la féverole, encore plus préférentiellement du pois.
Le terme « pois » étant ici considéré dans son acception la plus large et incluant en particulier toutes les variétés de « pois lisse » (« smooth pea ») et « de pois ridés » (« wrinkled pea »), et toutes les variétés mutantes de « pois lisse » et de « pois ridé » et ce, quelles que soient les utilisations auxquelles on destine généralement lesdites variétés (alimentation humaine, nutrition animale et/ou autres utilisations). Le terme « pois » dans la présente demande inclut les variétés de pois appartenant au genrePisumet plus particulièrement aux espècessativumetaestivum. Lesdites variétés mutantes sont notamment celles dénommées « mutants r », « mutants rb », « mutants rug 3 », « mutants rug 4 », « mutants rug 5 » et « mutants lam » tels que décrits dans l’article de C-L HEYDLEY et al. intitulé « Developing novel pea starches » Proceedings of the Symposium of the Industrial Biochemistry and Biotechnology Group of the Biochemical Society, 1996, pp. 77-87.
Le terme « féverole » s’entend ici par le groupe des plantes annuelles de l'espèceVicia faba, appartenant au groupe des légumineuses de la famille des Fabaceae, sous-famille des Faboideae, tribu des Fabeae. On distingue les variétés Minor et Major. Dans la présente invention, les variétés sauvages et celles obtenues par génie génétique ou sélection variétales sont toutes d’excellentes sources.
La farine végétale va donc être préférentiellement réduite en poudre de granulométrie plus fine. Toutes techniques bien connues de l’art antérieur sera compatible avec le procédé selon l’invention. On peut citer par exemple les moulins à couteaux. Un exemple particulier et particulièrement approprié d’un tel moulin à couteaux est par exemple le SM300 commercialisé par la société Retsch® ou un moulin à pierre par exemple commercialisé par la société Alma®.
La farine ainsi obtenue est mise en suspension dans un solvant. Ce solvant ne vise pas à solubiliser complétement l’intégralité de la même matière sèche, même si ce cas est tout à fait concevable. Dans un mode préféré, les conditions de mise en suspension de la farine sont adaptées pour insolubiliser les composés non protéiques afin de les éliminer et ainsi pré-enrichir la solution en protéines.
De manière préférée, le solvant est de l’eau. Celle-ci peut néanmoins être additivée, par exemple avec des composés permettant de faciliter la solubilisation.
De manière préférée, le pH du solvant aqueux est ajusté entre 8 et 10, préférentiellement 9. Tout réactif basique tel que la soude, la chaux, est envisageable, mais la potasse est préférée. La température est préférentiellement ajustée entre 2°C et 30°C, préférentiellement entre 10°C et 30°C, préférentiellement entre 15°C et 25°C, encore plus préférentiellement à 20°C. Cette température est régulée tout au long de la réaction d’extraction.
La farine est délayée dans le solvant préférentiellement aqueux afin d’obtenir une suspension comprise entre 5% et 25%, préférentiellement entre 5% et 15%, préférentiellement entre 7% et 13%, encore plus préférentiellement entre 9% et 11%, le plus préféré étant 10%, le pourcentage étant exprimé en poids de poudre par poids total de suspension eau/poudre. La suspension est agitée à l’aide de tout appareillage bien connu de l’Homme du métier, par exemple une cuve équipée d’un agitateur, équipé de pales, d’hélices marines, ou de tout équipement permettant une agitation efficace. Le temps d’extraction, préférentiellement sous agitation, est compris entre 5 et 25 minutes, préférentiellement entre 10 et 20 minutes, encore plus préférentiellement 15 minutes.
De manière préférée, la suspension est ensuite centrifugée afin d’éliminer les composés non protéiques insolubles comme par exemples l’amidon et/ou les fibres internes appelées aussi pulpe dans le cas des légumineuses.
Dans un mode alternatif, la farine de graines végétales est une matière riche en protéines. Par « matière riche en protéine » on entend toute matière sous forme de poudre, floc contenant au moins 25% de protéines en poids sec sur matière sèche. On peut citer de manière non limitative les concentrats, les isolats, les graines. De préférence, la matière riche en protéine est sous forme de poudre.
De manière préférée, la matière riche en protéines de pois utilisée pour l’étape 1 est un isolat, c’est-à-dire que sa teneur en protéines est supérieure à 80% en poids sec sur matière sèche. L’utilisation de concentrats (teneur protéique comprise entre 50% et 80% en poids sec sur matière sèche) voire de farine (teneur protéique inférieure à 50% en poids sec sur matière sèche) peut également être envisagée mais l’isolat est préféré.
L’obtention de matière riche en protéines de pois est aisée avec les procédés classiques de l’art bien connus de l’homme du métier. On citera par exemple les procédés décrits dans les demandes de brevet EP 1 909 593 ou FR 2018052261 de la demanderesse. Le principe de base de ces procédés (mise en suspension de farine de pois dans de l’eau par broyage humide ou sec, élimination des parties insolubles telles qu’amidon et fibres internes par centrifugation, précipitation isoélectrique de la protéine d’intérêt) est classique désormais et propose très aisément une protéine adaptée.
Quel que soit le procédé mis en œuvre pour obtenir la suspension de protéines végétales (par ex. simplement en ajoutant de l’eau à un isolat de protéine de pois ou bien en partant de la farine de pois et en éliminant fibres internes et amidon), la matière sèche finale de ladite suspension (aussi appelée « extrait brut ») sera préférentiellement comprise entre 3% et 9%, ce qui inclut donc les valeurs 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% et 9%. Le pourcentage s’exprime en grammes de matière sèche pour 100 grammes de poids total de la suspension protéique.
La seconde étape du procédé selon l’invention comprend au moins :
2a. l’ajout d’une souche dans la suspension de farine végétale de l’étape 1, la souche étant sélectionnée dans le groupe constitué parLactobacillus Fermentum,Lactobacillus Salivarius,Lactobacillus Delbrueckii subsp Jakobsenii,Lactobacillus Mucosae,Streptococcus Salivarius, etEnterococcus Lactis; la souche étant préférentiellement une souche deLactobacillus Fermentum; encore plus préférentiellement la souche déposée auprès de la CNM sous le numéro CNCM I-5802, de sorte à former une suspension ensemencée,
2b. l’incubation de la suspension ensemencée de l’étape 2a de sorte à ce que la souche acidifie la suspension ensemencée jusqu’à formation d’un précipitat protéique.
2b. l’incubation de la suspension ensemencée de l’étape 2a de sorte à ce que la souche acidifie la suspension ensemencée jusqu’à formation d’un précipitat protéique.
La deuxième étape consiste donc notamment en l’acidification du pH à l’aide d’une souche sélectionnée entreLactobacillus Fermentum,Lactobacillus Salivarius,Lactobacillus Delbrueckii subsp Jakobsenii,Lactobacillus Mucosae,Streptococcus Salivarius, etEnterococcus Lactis; préférentiellement d’une souche deLactobacillus Fermentum; encore plus préférentiellement de la souche CNCM I-5802.
De manière préférentielle, la température de la suspension de protéines est régulée entre 30°C et 50°C, préférentiellement entre 35°C et 45°C, incluant donc les valeurs de 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C et 45°C ;
De manière préférentielle, le pH de départ est rectifié entre 6,5 et 7,5 ; préférentiellement 7,0 ; ce qui inclue les valeurs de 6,5 ; 6,6 ; 6,7 ; 6,8 ; 6,9 ; 7,0 ; 7,1 ; 7,2 ; 7,3 ; 7,4 et 7,5. Pour ce faire, la Personne du Métier utilisera tout matériel et tout réactif bien connu.
La souche séléctionnée parmiLactobacillus Fermentum,Lactobacillus Salivarius,Lactobacillus Delbrueckii subsp Jakobsenii,Lactobacillus Mucosae,Streptococcus Salivarius, etEnterococcus Lactis; préfèrentiellementLactobacillus Fermentum; encore plus préférentiellement la souche CNCM I-5802 ; est ensuite de préférence introduite à une concentration comprise entre 0,1.109et 1.109CFU (signifiant Colonies Formant Unité) par millilitre de suspension.
De manière préférée, l’inoculat de la souche est préparé de la manière suivante, désignée ci-après « méthode de préparation d’inoculat A »):
- La souche est stockée sous forme de cryobille
- Ensemencement d’un Erlenmeyer de 2L avec 500 mL de milieu MRS avec 1 bille provenant d’un cryobille de la souche.
- Incubation de 18 à 24h dans un incubateur en anaérobie, sous une température de 37°C +/- 1°C et agitation de80 tr/min
- Transférer le contenu de l’Erlenmeyer dans un pot de centrifugation
- Centrifuger à 3000g pendant 10minutes
- Eliminer le surnageant
- Remettre en suspension le culot avec de l’eau physiologique
- Recommencer 2 fois les étapes de centrifugation / lavage
- Après la dernière centrifugation, reprendre le culot dans 10mL d’eau physiologique
- Conserver la suspension ainsi obtenue dans la glace ou à 4°C en attendant sa mise en œuvre
- Réalisation de la droite de corrélation entre D.O. 600nm et CFU/ml. On obtient celle-ci en réalisant plusieurs dilutions de raison 10 de la suspension bactérienne, puis en mesurant à la fois la D.O. 600nm et en réalisant le dénombrement en CFU/ml. Tracer la courbe CFU/ml = f( D.O. 600 nm). On peut ainsi obtenir par régression linéaire le coefficient de corrélation entre D.O. 600nm et le nombre de CFU/ml permettant de calculer l’un à partir de l’autre.
- Réaliser une mesure de D.O.600nm à l’aide d’un spectrophotomètre sur la suspension stockée à 4°C (Si besoin de diluer pour obtenir la mesure, les dilutions des suspensions cellulaires se feront dans le Tween 0,3% car la biomasse à tendance à coller sur les parois des tubes de dilution)
- Déterminer le volume d’inoculum à introduire dans un volume donné d’extrait brut protéique pour atteindre la concentration comprise entre 0,1.109et 1.109CFU (signifiant Colonies Formant Unité) par millilitre de suspension.
- La souche est stockée sous forme de cryobille
- Ensemencement d’un Erlenmeyer de 2L avec 500 mL de milieu MRS avec 1 bille provenant d’un cryobille de la souche.
- Incubation de 18 à 24h dans un incubateur en anaérobie, sous une température de 37°C +/- 1°C et agitation de80 tr/min
- Transférer le contenu de l’Erlenmeyer dans un pot de centrifugation
- Centrifuger à 3000g pendant 10minutes
- Eliminer le surnageant
- Remettre en suspension le culot avec de l’eau physiologique
- Recommencer 2 fois les étapes de centrifugation / lavage
- Après la dernière centrifugation, reprendre le culot dans 10mL d’eau physiologique
- Conserver la suspension ainsi obtenue dans la glace ou à 4°C en attendant sa mise en œuvre
- Réalisation de la droite de corrélation entre D.O. 600nm et CFU/ml. On obtient celle-ci en réalisant plusieurs dilutions de raison 10 de la suspension bactérienne, puis en mesurant à la fois la D.O. 600nm et en réalisant le dénombrement en CFU/ml. Tracer la courbe CFU/ml = f( D.O. 600 nm). On peut ainsi obtenir par régression linéaire le coefficient de corrélation entre D.O. 600nm et le nombre de CFU/ml permettant de calculer l’un à partir de l’autre.
- Réaliser une mesure de D.O.600nm à l’aide d’un spectrophotomètre sur la suspension stockée à 4°C (Si besoin de diluer pour obtenir la mesure, les dilutions des suspensions cellulaires se feront dans le Tween 0,3% car la biomasse à tendance à coller sur les parois des tubes de dilution)
- Déterminer le volume d’inoculum à introduire dans un volume donné d’extrait brut protéique pour atteindre la concentration comprise entre 0,1.109et 1.109CFU (signifiant Colonies Formant Unité) par millilitre de suspension.
De manière préférée et afin d’exemplifier, une suspension de la soucheLactobacillus fermentumCNCM I-5802 ayant une D.O 600nm de 1 correspond à une concentration de 3,0.108CFU/mL.
Après introduction de l’inoculum bactérien dans l’extrait brut protéique, une agitation est réalisée avec toute installation bien connue de la Personne du Métier incluant un axe d’agitation équipé d’hélice marine. La vitesse d’agitation est préférentiellement comprise entre 200 et 400 tr/min, préférentiellement 250 et 350 tr/min.
Le pH va rapidement s’acidifier. Un suivi de l’évolution du pH est réalisé avec une sonde adéquate. La vitesse maximale d’acidification (baptisée Vm) exprimée en unités de pH par min est typiquement comprise entre – 0,030 et -0,020 unités de pH/min, préférentiellement entre -0,027 et -0,022 UpH/min. Si le pH n’évolue pas (absence d’acidification) ou quand la vitesse d’acidification est inférieure à -0,020 unités de pH/min, il est possible d’ajouter une quantité supplémentaire de ferment afin de pallier une mauvaise capacité à celle-ci à acidifier.
Le pH cible est celui dit isoélectrique pour la protéine que l’on souhaite floculer. Par exemple, pour la fraction dite globuline du pois ce pH est de 5. Celui-ci est susceptible de varier selon la protéine ciblée. Par cette acidification naturelle, la protéine va donc floculer, coaguler.
De manière préférentielle, un ajout d’une quantité additionnelle d’acide permettant de finaliser l’acidification, par ex. pour acidifier de pH 5 à pH 4,5 peut être réalisé en fin d’étape 2b (sous-étape 2b’).
De manière préférentielle, un chauffage additionnel, de préférence en fin d’étape 2b est possible afin d’augmenter le rendement de floculation (sous-étape 2b’’). Par « floculation » on entend dans la présente invention l’insolubilisation d’une partie des protéines présentes en solution afin d’être extraites. « floculation » et « précipitation » peuvent être ici utilisés de manière interchangeable. La température de chauffage est comprise entre 45° et 85°C, incluant donc les valeurs de 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 50°C, 51°C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C, 60°C, 61 °C, 62°C, 63°C, 64°C, 65°C, 66°C, 67°C, 68°C, 69°C, 70°C, 71°C, 72°C, 73°C, 74°C, 75°C, 76°C, 77°C, 78°C, 79°C, 80°C, 81°C, 82°C, 83°C, 84°C et 85°C.
Quand le floc de protéines obtenu est de qualité et en quantité désirées, on va classiquement le séparer du reste de la suspension aqueuse, classiquement par décantation statique ou dynamique (centrifugueuse à assiette, décanteuses horizontales, …).
Le floc ainsi obtenu peut être mis en œuvre tel que ou subir une ou plusieurs étapes unitaires de procédé incluant des étapes unitaires de purification (par ex. par chromatographie, ultrafiltration), de concentration (e.g. évaporation, séchage), d’ajout de réactifs chimiques (par ex. pour ajuster le pH) / enzymatiques (par ex. protéases) et/ou de traitement thermique (e.g. pasteurisation, HTST, stérilisation).
Un exemple préféré de post traitement consiste en 1) une rectification à pH compris entre 6 et 9, préférentiellement 7 avec utilisation préférentielle de soude ou de chaux, 2) traitement thermique entre 100°C et 160°C pendant 0,1 à 1s et 3) séchage à un matière sèche supérieure à 90%, préfèrentiellement à 95% à l’aide d’un atomiseur.
La présente invention concerne également l’isolat de protéines végétales obtenu ou susceptible d’être obtenu par précipitation isoélectrique avec utilisation d’une souche sélectionnée entreLactobacillus Fermentum,Lactobacillus Salivarius,Lactobacillus Delbrueckii subsp Jakobsenii,Lactobacillus Mucosae,Streptococcus Salivarius, etEnterococcus Lactis; préférentiellement d’une souche deLactobacillus Fermentum; encore plus préférentiellement de la souche CNCM I-5802.
Cet isolat obtenu par précipitation isoélectrique obtenu à l’aide d’une acidification bactérienne se caractérise par rapport aux arts antérieurs dont particulièrement l’article Emkani et al., 2021 (Emkani et al., Foods, 10, 549, 2021) en ce que son degré d’hydrolyse est invarié. Sans être lié par une quelconque théorie, c’est la sélection des souches et leur mise en œuvre qui permet l’obtention de ce résultat unique et inégalé jusqu’ici à notre meilleure connaissance. L’absence de protéase, une présence avec une activité moindre et/ou une vitesse de métabolisme acidifiant combiné permettent l’obtention de ce résultat.
L’isolat de protéines végétales selon l’invention est de préférence caractérisé en ce que son degré d’hydrolyse (ou DH) est inférieur à 10%, préférentiellement inférieur à 5.
L’isolat selon l’invention présente de préférence un degré d’hydrolyse (ou DH) inférieur à 10%, préférentiellement inférieur à 5%, incluant le DH de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% et 1%.
Le degré d’hydrolyse peut être déterminé en mesurant la teneur en azote aminé libre par la méthode OPA divulguée dans l’article Nielsen et al., 2001 (Nielsen et al., Journal of Food Science, Volume66, Issue , Pages 642-646, 2001 « Improved Method for Determining Food Protein Degree of Hydrolysis ») par rapport à l’azote total mesuré par la méthode de DUMAS selon la norme ISO 16634-2:2016.
Le Test de mesure du degré d’hydrolyse décrit ci-après est particulièrement préféré. Son principe consiste à déterminer tout d’abord la teneur en azote aminé (fonctions NH2 libre) sur l’échantillon de protéines (préférentiellement avec le kit MEGAZYME (référence K-PANOPA)), puis de déterminer la teneur en azote protéique (azote total incluant donc les fonctions NH2 libres et engagées) de l’échantillon, et enfin de calculer le degré d’hydrolyse accessible via le ratio de ces deux mesures.
Détermination de la teneur en azote aminé :
Les groupes « azote aminé » des acides aminés libres de l’échantillon réagissent avec le N-acétyl-L-cystéine et l’Ophthaldialdéhyde (OPA) pour former des dérivés d’isoindole.
La quantité de dérivé d’isoindole formée au cours de cette réaction est stœchiométrique avec la quantité d’azote aminé libre. C’est le dérivé d’isoindole qui est mesuré par l’augmentation de l’absorbance à 340 nm.
Dans un bécher de 100 mL, on introduit une prise d’essai P*, exactement pesée, de l’échantillon à analyser. Cette prise d’essai sera de 0,5 à 5,0 g en fonction de la teneur en azote aminé de l’échantillon. On ajoute environ 50 mL d’eau distillée, on homogénéise et on transvase dans une fiole jaugée de 100 mL. On ajoute 5 mL de dodécyle sulfate de sodium (SDS) à 20% et on complète avec de l’eau distillée pour atteindre un volume de 100 mL. On agite pendant 15 minutes avec un agitateur magnétique à 1000 rpm. On prépare une solution n°1 en dissolvant un comprimé du flacon 1 du kit Megazyme dans 3 mL d’eau distillée et on agite jusqu'à dissolution complète. Il faut prévoir un comprimé par essai. La solution n°1 est préparée extemporanément.
On prépare un blanc, un standard et un échantillon directement dans les cuves du spectrophotomètre dans les conditions suivantes :
-blanc : introduire 3,00 ml de la solution n°1 et 50 μl d’eau distillée
-standard : introduire 3,00 ml de la solution n°1 et 50 μl du flacon 3 du kit Megazyme
-échantillon : introduire 3,00 ml de la solution n°1 et 50 μl de la préparation de l’échantillon.
On mélange le contenu de chaque cuve et on lit la mesure d’absorbance (A1) des solutions après 2 mn environ au spectrophotomètre à 340 nm (spectrophotomètre équipé de cuves de 1,0 cm de trajet optique, pouvant mesurer à une longueur d’onde de 340 nm, et vérifié selon le mode opératoire décrit dans le manuel technique du constructeur qui s’y rapporte).
On amorce ensuite les réactions immédiatement en ajoutant 100 μl de la solution n°2 qui correspond à la solution d’OPA du flacon 2 du kit Megazyme dans chaque cuve de spectrophotomètre.
On mélange le contenu de chaque cuve et on les place environ 20 minutes dans l’obscurité.
On lit ensuite la mesure d’absorbance A2 du blanc, du standard et de l’échantillon au spectrophotomètre à 340 nm.
La teneur en azote aminé libre, exprimée en pourcentage en poids par rapport au poids du produit, est donnée par la formule suivante :
La quantité de dérivé d’isoindole formée au cours de cette réaction est stœchiométrique avec la quantité d’azote aminé libre. C’est le dérivé d’isoindole qui est mesuré par l’augmentation de l’absorbance à 340 nm.
Dans un bécher de 100 mL, on introduit une prise d’essai P*, exactement pesée, de l’échantillon à analyser. Cette prise d’essai sera de 0,5 à 5,0 g en fonction de la teneur en azote aminé de l’échantillon. On ajoute environ 50 mL d’eau distillée, on homogénéise et on transvase dans une fiole jaugée de 100 mL. On ajoute 5 mL de dodécyle sulfate de sodium (SDS) à 20% et on complète avec de l’eau distillée pour atteindre un volume de 100 mL. On agite pendant 15 minutes avec un agitateur magnétique à 1000 rpm. On prépare une solution n°1 en dissolvant un comprimé du flacon 1 du kit Megazyme dans 3 mL d’eau distillée et on agite jusqu'à dissolution complète. Il faut prévoir un comprimé par essai. La solution n°1 est préparée extemporanément.
On prépare un blanc, un standard et un échantillon directement dans les cuves du spectrophotomètre dans les conditions suivantes :
-blanc : introduire 3,00 ml de la solution n°1 et 50 μl d’eau distillée
-standard : introduire 3,00 ml de la solution n°1 et 50 μl du flacon 3 du kit Megazyme
-échantillon : introduire 3,00 ml de la solution n°1 et 50 μl de la préparation de l’échantillon.
On mélange le contenu de chaque cuve et on lit la mesure d’absorbance (A1) des solutions après 2 mn environ au spectrophotomètre à 340 nm (spectrophotomètre équipé de cuves de 1,0 cm de trajet optique, pouvant mesurer à une longueur d’onde de 340 nm, et vérifié selon le mode opératoire décrit dans le manuel technique du constructeur qui s’y rapporte).
On amorce ensuite les réactions immédiatement en ajoutant 100 μl de la solution n°2 qui correspond à la solution d’OPA du flacon 2 du kit Megazyme dans chaque cuve de spectrophotomètre.
On mélange le contenu de chaque cuve et on les place environ 20 minutes dans l’obscurité.
On lit ensuite la mesure d’absorbance A2 du blanc, du standard et de l’échantillon au spectrophotomètre à 340 nm.
La teneur en azote aminé libre, exprimée en pourcentage en poids par rapport au poids du produit, est donnée par la formule suivante :
où :
ΔAech =Aech2 – Aech1
ΔAblc =Ablc2 – Ablc1
Aech2 = absorbance de l’échantillon après ajout de la solution n°2
Aech1 = asorbance de l’échantillon après ajout de la solution n°1
Ablc2 = absorbance du blanc après ajout de la solution n°2
Ablc1 = absorbance du blanc après ajout de la solution n°1
V = volume de la fiole
m = masse de la prise d’essai en g
6803 = coefficient d’extinction du dérivé d’isoindole à 340 nm (en L.mol-1.cm-1).
14,01 = masse molaire de l’azote (en g.mol-1)
3,15 = volume final dans la cuve (en mL)
0,05 = prise d’essai dans la cuve (en mL)
ΔAech =Aech2 – Aech1
ΔAblc =Ablc2 – Ablc1
Aech2 = absorbance de l’échantillon après ajout de la solution n°2
Aech1 = asorbance de l’échantillon après ajout de la solution n°1
Ablc2 = absorbance du blanc après ajout de la solution n°2
Ablc1 = absorbance du blanc après ajout de la solution n°1
V = volume de la fiole
m = masse de la prise d’essai en g
6803 = coefficient d’extinction du dérivé d’isoindole à 340 nm (en L.mol-1.cm-1).
14,01 = masse molaire de l’azote (en g.mol-1)
3,15 = volume final dans la cuve (en mL)
0,05 = prise d’essai dans la cuve (en mL)
Détermination de la teneur en azote protéique :
La teneur d’azote protéique est déterminée selon la méthode de DUMAS selon la norme ISO 16634 - 2016. Elle est exprimée en pourcentage en poids par rapport au poids du produit.
Calcul du degré d’hydrolyse :
Le degré d’hydrolyse (DH) est calculé avec la formule suivante:
Le degré d’hydrolyse (DH) est calculé avec la formule suivante:
L’isolat obtenu selon le procédé de l’invention est également caractérisé par une teneur en methanethiol réduite. Comme il sera exemplifié dans la présente demande, lors d’une acidification classique par ex. avec de l’acide chlorhydrique on observe la synthèse de ce composé issu de la dégradation des acides aminés soufrés. Sa présence de l’ordre du ppb suffit à donner une flaveur dite « œuf pourri » ou « hydrogène sulfuré » lorsque l’isolat est utilisé pour préparer des boissons prêtes à boire ou des bandes d’extrusions humides destinées à produire des analogues de viande. Sans être lié par une quelconque théorie, ces procédés en générant une chaleur importante vont provoquer une apparition importante de composés de dégradations issus du méthanethiol. Le procédé selon l’invention permet de préférence l’obtention d’un isolat dont la teneur en methanethiol est réduite de plus de 50%, préférentiellement de plus de 25%, les valeurs de réductions étant potentiellement de 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14% 13% 12%, 11% 10%, 9%, 8% 7%, 6%, 5%, 4% 3%, 2% ou 1%. Le procédé selon l’invention permet de préférence l’obtention d’un isolat dont la teneur en methanethiol est inférieure à 0,1 ppb, c’est-à-dire d’un isolat comprenant moins de 0,1 µg de methanethiol par kg d’isolat. Préférentiellement, le procédé selon l’invention permet l’obtention d’un isolat dont la teneur en methanethiol est inférieure à 0,01 ppb, c’est-à-dire d’un isolat comprenant moins de 0,01 µg de methanethiol par kg d’isolat. Plus préférentiellement encore, le procédé selon l’invention permet l’obtention d’un isolat dont la teneur en methanethiol est inférieure à 0,001 ppb, ou autrement dit dont la teneur est inférieur à 1 ppt (partie part trillion ; 1 ppt = 1 ng/kg, c’est-à-dire d’un isolat comprenant moins de 0,01 µg de methanethiol par kg d’isolat
L’isolat de protéines végétales selon l’invention est caractérisé en ce que sa teneur en protéines exprimées par rapport à sa matière sèche totale est de préférence comprise entre 80% et 95%, préférentiellement entre 82% et 92%, préférentiellement entre 84% et 90%, préférentiellement entre 84% et 88%.
Également, l’invention concerne l’application de l’isolat de protéines végétales obtenu avec utilisation de la souche CNCM I-5802 dans des formulations nutritionnelles en boissons laitières ou végétales, en laits fermentés de type yaourts (brassés, à la grecque, à boire) et en crèmes laitières ou végétales, desserts glacés ou sorbets.
Tout d’abord, l’invention concerne l’application de l’isolat selon l’invention en biscuits, muffins, pancakes, barres nutritionnelles (destinés à la nutrition spécialisée / minceur ou sportif), en pains ou pains sans gluten enrichis en protéines, en petites céréales obtenues par cuisson extrusion (« crisps ») hyperprotéinés, où l’on recherche plus particulièrement des solutions hyperprotéinées sans impact négatif sur le procédé de préparation ou la texture des préparations ou produits finis.
Au sens de l’invention, on entend par « formulations nutritionnelles en poudre », des formulations en poudre comprenant au moins, préférentiellement uniquement, une protéine de légumineuse, et en particulier de pois ou de féverolle, selon l’invention, qui sont reconstituables avec un liquide aqueux, et qui conviennent pour l'administration orale à un être humain.
L'expression « mélange à sec » tel qu'utilisé ici, sauf indication contraire, se réfère au mélange des composants ou des ingrédients pour former une poudre nutritionnelle de base ou, à l'addition d'un composant sec, en poudre ou granulé ou d'un ingrédient à base poudre pour former une formulation nutritionnelle en poudre.
Tous les pourcentages, parties et rapports, tel qu'utilisé ici, se rapportent au poids de la formulation totale, sauf indication contraire.
Les formulations alimentaires en poudre et les procédés de fabrication correspondant de la présente invention peuvent comprendre, consister ou consister essentiellement en les éléments essentiels de l'invention telle que décrite ici, ainsi que tout élément supplémentaire ou facultatif décrit ici ou autrement utiles dans les applications de la formulation nutritionnelle.
Les formulations nutritionnelles en poudre de la présente invention sont généralement sous la forme de compositions particulaires aptes à l'écoulement ou sensiblement fluides, ou au moins des compositions particulaires qui peuvent être facilement moulées et mesurées à l'aide d'une cuillère ou d'un autre dispositif similaire, dans lequel les compositions peuvent facilement être reconstitués par l'utilisateur prévu avec une solution aqueuse, typiquement de l'eau, pour former une formulation nutritionnelle liquide pour utilisation orale ou entérale immédiate. Dans ce contexte, l'utilisation « immédiatement » signifie généralement dans environ 48 heures, plus typiquement pendant environ 24 heures, de préférence juste après la reconstitution.
Les formulations alimentaires en poudre peuvent être formulées avec tous types et quantités de nutriments suffisantes de manière à former un complément alimentaire, ou une formulation nutritionnelle spécialisée destinée à être utilisée chez les personnes suivant un régime alimentaire particulier destiné à la diététique du sport et de la minceur.
Dans des exemples de réalisations, la formulation nutritionnelle en poudre peut être formulée pour une utilisation :
pour réparer les muscles après un effort intense, par exemple chez le sportif,
- pour assurer chez le sportif le maintien ou la construction de la masse musculaire, ou
- comme substitut de repas par des personnes désirant perdre du poids via un effet satiétogène.
pour réparer les muscles après un effort intense, par exemple chez le sportif,
- pour assurer chez le sportif le maintien ou la construction de la masse musculaire, ou
- comme substitut de repas par des personnes désirant perdre du poids via un effet satiétogène.
Les formulations alimentaires en poudre peuvent avoir une densité calorique adaptée aux besoins nutritionnels de l'utilisateur final, bien que dans la plupart des cas, les poudres reconstituées comprennent d'environ 350 à environ 400 kcal / 100 ml.
Les formulations alimentaires en poudre peuvent présenter un taux protéique adapté aux besoins nutritionnels de l'utilisateur final, bien que dans la plupart des cas, les poudres reconstituées comprennent d'environ 20 à environ 91 g de protéines / 100 g, y compris d'environ 40 à environ 65 g de protéines / 100g.
Ainsi, la formulation peut comprendre entre 20 et 95 % de protéines par rapport au poids total de la formulation, par exemple entre 20-90%, 30-80%, ou 40-60%.
Par exemple, l’isolat de protéines de légumineuses, préférentiellement de pois ou de féverolle, selon la présente invention peut représenter 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% ou 90-100% de la protéine totale de la formulation, ou une quelconque combinaison de ces gammes de pourcentages. 100% représentant le mode préférentiel ultime afin de maximiser l’effet de surexpression du FGF19.
Par ailleurs, les formulations alimentaires en poudre peuvent présenter un taux de matière grasse adapté aux besoins nutritionnels de l'utilisateur final, bien que dans la plupart des cas, les poudres reconstituées comprennent d'environ 0,5 à environ 13 g /100 g, y compris d'environ 3 à environ 7 g /100 g. Ainsi, la formulation peut comprendre entre 0 et 20 % de lipides par rapport au poids totale de la formulation, par exemple entre 0,5-15%, 1-10%, ou 3-7% (en particulier % en poids).
Les formulations nutritionnelles en poudre de la présente invention peuvent être emballées et scellées dans des conteneurs simples ou multi-usage, puis stockées dans des conditions ambiantes jusqu'à environ 36 mois ou plus, plus typiquement d'environ 12 à environ 24 mois.
Pour multi-utilisation des conteneurs, ils peuvent être ouverts et couverts pour une utilisation répétée par l'utilisateur final, à condition que le paquet recouvert soit ensuite stocké dans des conditions ambiantes (par exemple, éviter les températures extrêmes) et les contenus utilisés dans environ un mois ou deux.
Les domaines d’applications des formulations nutritionnelles selon l’invention sont notamment :
- la nutrition diététique (sport, minceur),
- la nutrition clinique (sous forme de boisson, de crème dessert ou de poche entérale),
- les produits laitiers (sous forme de yaourts, boissons laitières, crèmes laitières, desserts glacés ou sorbets).
- les produits de biscuiterie, produits de pâtisserie, produits de panification et produits céréaliers hyperprotéinés.
- la nutrition diététique (sport, minceur),
- la nutrition clinique (sous forme de boisson, de crème dessert ou de poche entérale),
- les produits laitiers (sous forme de yaourts, boissons laitières, crèmes laitières, desserts glacés ou sorbets).
- les produits de biscuiterie, produits de pâtisserie, produits de panification et produits céréaliers hyperprotéinés.
Dans le domaine du sport, il est connu que les protéines participent à l'entretien et à la croissance du muscle. L’apport en protéines est également important pour les athlètes qui pratiquent la musculation ou le renforcement musculaire.
Ces protéines doivent être équilibrées en termes de profil en acide aminés et doivent respecter les recommandations de la FAO/WHO. Leur digestibilité est un facteur important allant d’une rapide digestibilité à une plus lente digestibilité en fonction du moment de l’apport en protéines.
Les boissons protéinées ou hyperprotéinées prêtes à boire permettent alors de faire bénéficier l’organisme d'un apport protéique de choix, les calories en moins.
Ces boissons hyperprotéinées doivent :
- être riches en protéines, pauvres en glucides et en graisses ;
- avoir bon goût ;
- être conçues pour aider à perdre du poids, en stimulant la perte de graisse et en aidant à la récupération musculaire ;
- être satiétogènes ;
- permettre de faire face aux fringales, sans sucres ni graisses ajoutées ;
- présenter un contenu équilibré en acides aminés essentiels, en fibres, en vitamines et minéraux ;
- être hypocaloriques.
- être riches en protéines, pauvres en glucides et en graisses ;
- avoir bon goût ;
- être conçues pour aider à perdre du poids, en stimulant la perte de graisse et en aidant à la récupération musculaire ;
- être satiétogènes ;
- permettre de faire face aux fringales, sans sucres ni graisses ajoutées ;
- présenter un contenu équilibré en acides aminés essentiels, en fibres, en vitamines et minéraux ;
- être hypocaloriques.
Ces boissons prêtes-à-boire peuvent être avantageusement préparées avec les isolats de protéines de légumineuses, préférentiellement de féveroles ou de pois, conformément à l’invention. Elles peuvent être d’ailleurs utilisées comme seule source de protéines, de manière préférée car maximisant l’effet de surexpression du FGF19.
Par exemple, les boissons végétales alternatives au lait de vache, contiennent en moyenne de 4,5 à 11 g de protéines pour 100 ml de boisson, de préférence de l’ordre de 7 g de protéines pour 100 ml, et sont très pauvres en fibres (de l’ordre de 0,5 à 1 g pour 100 ml).
Ainsi, la boisson peut comprendre entre 1 et 20 % de protéines par rapport au poids totale de la boisson, par exemple entre 3-15%, ou 6-8%.
Par exemple, l’isolat de protéines de pois selon la présente invention peut représenter 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% ou 90-100% de la protéine totale, ou une quelconque combinaison de ces gammes de pourcentages. De préférence, il représente au moins 52 %. Notamment, l’apport en protéines de pois est compris entre 52 et 100 % de l’apport en protéines totales.
Pour les boissons prêtes à boire, l’apport en protéines de pois peut aller de 0 à 100%, de préférence de 0,01 ou 0,1 à 100 %. Par exemple, l’isolat de protéines de pois selon la présente invention peut représenter 0,1-10%, 10-20%, 20-30%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% ou 90-100% de la protéine totale, ou une quelconque combinaison de ces gammes de pourcentages.
Dans le domaine des boissons « minceur », i.e. destinées à être utilisées dans des régimes hypocaloriques ou destinées à la perte de poids, comme mentionné précédemment, ces boissons protéinées ou enrichies en protéines ne sont pas uniquement efficaces pour une prise rapide de muscles. Ce type de boisson est également très avantageux dans le cadre d'un régime minceur basé sur la consommation de protéines.
Il est connu que les boissons minceurs sont idéales pour aider à la perte de poids. Elles permettent plus particulièrement de :
- procurer un effet de satiété
- protéger les muscles et de tonifier le corps, évitant la reprise de poids.
- procurer un effet de satiété
- protéger les muscles et de tonifier le corps, évitant la reprise de poids.
Comme pour les boissons « sport », ces boissons minceurs présentent :
- un contenu équilibré en acides aminés essentiels, en fibres, en vitamines et minéraux
- un contenu réduit en sucres, en matières grasses et en calories.
- un contenu équilibré en acides aminés essentiels, en fibres, en vitamines et minéraux
- un contenu réduit en sucres, en matières grasses et en calories.
C’est ainsi que les boissons protéinées sont en effet d'une grande efficacité pour perdre rapidement quelques kilos. Ces préparations riches en protéines réduisent ou stoppent simplement la sensation de faim chez la personne qui en consomme. En prenant par exemple une telle boisson, l'utilisateur peut réduire de manière considérable la quantité de nourriture à consommer, et permettre une perte de pois rapide (dans le cadre d’un processus de substitut de repas pour contrôle du poids, ou substitut de la ration journalière totale pour contrôle du poids).
En nutrition clinique, il est connu que la nutrition entérale est une solution thérapeutique de nutrition par sonde qui est utilisée lorsque le tube digestif est fonctionnel et accessible mais lorsque le patient ne peut s’alimenter normalement ou encore dans les cas de dénutrition sévère.
Cette technique permet d’apporter directement les nutriments dans le tube digestif. Elle remplace, de manière totale ou partielle, l’alimentation orale traditionnelle par des formules nutritives « complètes » apportant l’ensemble des nutriments nécessaires à l’organisme.
Ces formules sont généralement conditionnées dans des poches souples (en PVC) et administrées au moyen de sondes naso-gastriques ou, gastrostomies, naso-jéjunale, naso-duodénale, jéjunostomie.
Ces mélanges nutritionnels sont composés de protéines, lipides, glucides, vitamines et minéraux avec ou sans fibres.
On distingue plusieurs catégories : les mélanges polymériques (standards) et les mélanges semi-élémentaires («prédigérés»), ces derniers étant indiqués dans des cas bien spécifiques (syndrome du grêle court, insuffisance pancréatique exocrine, etc.) :
- Mélanges polymériques
- hypocaloriques (0,5 – 0,75 kcal /ml), normo ou hyperprotéinés, avec ou sans fibres
- isocaloriques (1 kcal / ml), normo ou hyperprotéinés, avec ou sans fibres
- hypercaloriques (1,25 -1,5 kcal / ml) normo ou hyperprotéinés, avec ou sans fibres
- formules spécifiques (troubles du métabolisme glycémique, insuffisance respiratoire).
- Mélanges polymériques
- hypocaloriques (0,5 – 0,75 kcal /ml), normo ou hyperprotéinés, avec ou sans fibres
- isocaloriques (1 kcal / ml), normo ou hyperprotéinés, avec ou sans fibres
- hypercaloriques (1,25 -1,5 kcal / ml) normo ou hyperprotéinés, avec ou sans fibres
- formules spécifiques (troubles du métabolisme glycémique, insuffisance respiratoire).
Les semi-élémentaires sont des mélanges iso ou hypercaloriques normo ou hyperprotéinés, à base de peptides et de triglycérides à chaînes moyennes.
Les isolats de protéines de pois, comme source de protéines, par leurs propriétés fonctionnelles sont particulièrement bien adaptés à cet usage.
Par ailleurs, ils permettent de préserver les mêmes propriétés que les protéines de lait, et ce pour un coût moindre.
L’invention sera mieux comprise avec les exemples suivants qui n’ont pour but que de mieux faire comprendre celle-ci. Ceux-ci n’ont aucune portée limitative.
Exemple 1 :
Procédé selon l’invention
partant d’une farine de pois
Délayage de 2 kg (exprimé en masse commerciale) de farine de pois lisse jaune (85% de matière sèche et 28% de protéine N6,25 en poids sec) avec de l’eau déminéralisée (20°C). La suspension obtenue est homogénéisée pendant 30 minutes à l’aide d’un agitateur de paillasse de marque RAYNERI équipé d’une turbine de dispersion. La suspension ainsi obtenue est centrifugée à 1000g pendant 5 minutes dans une centrifugeuse labo BECKMAN. On récupère environ 7 kg de surnageant à 7% de matière sèche (MS) après élimination du culot contenant la partie insoluble majoritairement un mélange fibres/amidon. Le surnageant ainsi obtenu est appelé « extrait brut » est normalisé en rectifiant sa matière sèche à 6%.
Cet ensemble d’étape menant à l’extrait brut est désigné ci-après « tête de procédé ».
L’acidification de l’extrait brut est ensuite réalisée selon le protocole suivant :
Préculture
- Souche : CNCM I-5802
- Inoculum : 1 cryobille
- Milieu : MRS broth (Man Rogosa Sharpe), prêt à l’emploi, Sigma ref.69966
- Incubation pendant 24h à 37°C
- La biomasse obtenue est concentrée, lavée 3 fois avec de l’eau physiologique à 4°C
- On calcule la quantité à ajouter à 900ml d’extrait brut à 6% MS pour obtenir une concentration cellulaire de 109CFU/mL selon la méthode de préparation d’inoculat A décrite ci-avant (DO=1 <-> 3.108CFU/mL)
Culture:
- Fermenteur de 2L DasGip®.
- Volume réactionnel : 900mL d’extrait brut à 4°C
- L’agitation est régulée à 300 rpm, la température 40°C
- Rectification du pH à 7 afin de le normaliser avant ensemencement
- Ensemencement du fermenteur avec la quantité de préculture permettant d’obtenir la concentration cellulaire de 109CFU/mL calculée en fin d’étape de préculture.
- Suivi de l’évolution du pH à l’aide du pH mètre du Dasgip® (acidification naturelle de l’extrait par la souche)
- On réalise un témoin en parallèle dans les mêmes conditions mais sans souche introduite afin de contrôler l’absence d’un contaminant non désiré perturbant le procédé
Préculture
- Souche : CNCM I-5802
- Inoculum : 1 cryobille
- Milieu : MRS broth (Man Rogosa Sharpe), prêt à l’emploi, Sigma ref.69966
- Incubation pendant 24h à 37°C
- La biomasse obtenue est concentrée, lavée 3 fois avec de l’eau physiologique à 4°C
- On calcule la quantité à ajouter à 900ml d’extrait brut à 6% MS pour obtenir une concentration cellulaire de 109CFU/mL selon la méthode de préparation d’inoculat A décrite ci-avant (DO=1 <-> 3.108CFU/mL)
Culture:
- Fermenteur de 2L DasGip®.
- Volume réactionnel : 900mL d’extrait brut à 4°C
- L’agitation est régulée à 300 rpm, la température 40°C
- Rectification du pH à 7 afin de le normaliser avant ensemencement
- Ensemencement du fermenteur avec la quantité de préculture permettant d’obtenir la concentration cellulaire de 109CFU/mL calculée en fin d’étape de préculture.
- Suivi de l’évolution du pH à l’aide du pH mètre du Dasgip® (acidification naturelle de l’extrait par la souche)
- On réalise un témoin en parallèle dans les mêmes conditions mais sans souche introduite afin de contrôler l’absence d’un contaminant non désiré perturbant le procédé
Les paramètres de la réaction d’acidification sont les suivants :
- Témoin :
- Le témoin est resté à pH 7 sans s’acidifier ce qui valide l’absence de contaminant
- En présence de la souche :
- Le temps d’acidification pour atteindre pH 5 était de 110 min
- La Vm (ou Vitesse moyenne d’acidification) était de 2 unités de pH acidifiée en 110min soit -0,018 U.pH/min (exprimée Unités de pH par min, le signe ‘-‘ exprimant une acidification)
-La VM (ou Vitesse Maximum d’acidification) était de -0,027 U.pH/min relevée à 42 min de réaction à un pH de 6,24.
- Témoin :
- Le témoin est resté à pH 7 sans s’acidifier ce qui valide l’absence de contaminant
- En présence de la souche :
- Le temps d’acidification pour atteindre pH 5 était de 110 min
- La Vm (ou Vitesse moyenne d’acidification) était de 2 unités de pH acidifiée en 110min soit -0,018 U.pH/min (exprimée Unités de pH par min, le signe ‘-‘ exprimant une acidification)
-La VM (ou Vitesse Maximum d’acidification) était de -0,027 U.pH/min relevée à 42 min de réaction à un pH de 6,24.
On note que le temps de fermentation est très court comparé à l’enseignement de Emkani et al., 2021 (Emkani et al., Foods, 10, 549, 2021) qui décrit un temps de fermentation entre 350 et 500 min selon les souches, soit plus de 3 fois plus long qu’avec la souche CNCM I-5802.
La suspension en fin d’acidification est centrifugée à 1000g pendant 5 min sous 6°C. Le surnageant (qui peut être conservé pour analyse) est éliminé et remplacé par une même quantité d’eau déminéralisée stérile. On agite la suspension ainsi obtenue pour l’homogénéiser et rectifier le pH à 7. Après 15 min d’agitation et contrôle visuel de la bonne homogénéité, la suspension est lyophilisée pour analyse sous la référence « Exemple 1 selon l’invention »
Exemple 2
:
Répétabilité de l’
E
xemple 1
:
Le principe est ici de reproduire à partir de la même farine de pois, trois fois le même procédé que celui décrit dans l’Exemple 1.
Les paramètres de la réaction d’acidification sont résumés dans le Tableau 1 suivant :
| Temps pour atteindre | Vm (vitesse moyenne en U.pH/min) | VM (vitesse moyenne en U.pH/min) | tM (temps de réaction de la VM en min) | pHM (pH de la VM) | |
| pH 5 (en min) | |||||
| Exemple 2.1 | 69 | -0,029 | -0,025 | 33 | 5,75 |
| Exemple 2.2 | 74 | -0,027 | -0,024 | 34 | 5,82 |
| Exemple 2.3 | 67 | -0,030 | -0,026 | 35 | 5,70 |
Les suspensions en fin d’acidification sont centrifugées à 1000g pendant 5 min sous 6°C. Le surnageant (qui peut être conservé pour analyse) est éliminé et remplacé par une même quantité d’eau déminéralisée stérile. On agite la suspension ainsi obtenue pour l’homogénéiser et rectifier le pH à 7. Après 15 min d’agitation et contrôle visuel de la bonne homogénéité, la suspension est lyophilisée pour analyse sous la référence « Exemple 2.1/2.2./2.3 selon l’invention ».
Exemple 3 -
Procédé selon l’invention partant d’un isolat de pois
Le procédé peut être appliquée sur un isolat de protéine de pois (p.ex. le Nutralys® F85M de la société Roquette) ce qui permet de simplifier la tête de procédé de l’Exemple 1. On réalise juste une suspension titrant 6% de matière sèche avec l’isolat de protéine de pois et de l’eau potable.
L’acidification de la suspension est ensuite réalisée selon le protocole suivant :
Préculture
- Souche : CNCM I-5802
- Inoculum : 1 cryobille
- Milieu : MRS broth (Man Rogosa Sharpe), prêt à l’emploi, Sigma ref.69966
- Incubation pendant 24h à 37°C
- La biomasse obtenue est concentrée, lavée 3 fois avec de l’eau physiologique à 4°C
- On calcule la quantité à ajouter à 900ml d’extrait brut à 6% pour obtenir une concentration cellulaire de 109CFU/mL selon la méthode de préparation d’inoculat décrite ci-avant A (DO=1 <-> 3.10p8CFU/mL)
Culture:
- Fermenteur de 2L DasGip®.
- Volume réactionnel : 900mL d’extrait brut à 4°C
- L’agitation est régulée à 300rpm, la température 40°C
- Rectification du pH à 7 sans régulation (acidification naturelle réalisée par la souche).
- Suivi de l’évolution du pH à l’aide du pH mètre du Dasgip®
- On réalise un témoin en parallèle dans les mêmes conditions mais sans souche introduite afin de contrôler l’absence d’un contaminant non désiré perturbant le procédé
Préculture
- Souche : CNCM I-5802
- Inoculum : 1 cryobille
- Milieu : MRS broth (Man Rogosa Sharpe), prêt à l’emploi, Sigma ref.69966
- Incubation pendant 24h à 37°C
- La biomasse obtenue est concentrée, lavée 3 fois avec de l’eau physiologique à 4°C
- On calcule la quantité à ajouter à 900ml d’extrait brut à 6% pour obtenir une concentration cellulaire de 109CFU/mL selon la méthode de préparation d’inoculat décrite ci-avant A (DO=1 <-> 3.10p8CFU/mL)
Culture:
- Fermenteur de 2L DasGip®.
- Volume réactionnel : 900mL d’extrait brut à 4°C
- L’agitation est régulée à 300rpm, la température 40°C
- Rectification du pH à 7 sans régulation (acidification naturelle réalisée par la souche).
- Suivi de l’évolution du pH à l’aide du pH mètre du Dasgip®
- On réalise un témoin en parallèle dans les mêmes conditions mais sans souche introduite afin de contrôler l’absence d’un contaminant non désiré perturbant le procédé
Exemple
4
:
Procédé
hors invention
– acidification avec de l’acide chlorhydrique :
Ce procédé est réalisé afin de générer un floc protéique représentant celui obtenu par le procédé classique de l’art antérieur.
La tête du procédé est la même que celle de l’Exemple 1 afin de générer un extrait brut titrant 6% de M.S.
L’acidification est réalisée sous agitation en visant pH 5 avec HCl 1N. La température appliquée est de 60°C et est maintenue ainsi pendant 10 minutes.
La suspension en fin d’acidification est centrifugée à 1000g pendant 5 min sous 6°C. Le surnageant (qui peut être conservé pour analyse) est éliminé et remplacé par une même quantité d’eau déminéralisée stérile. On agite la suspension ainsi obtenue pour l’homogénéiser et rectifier le pH à 7. Après 15 min d’agitation et contrôle visuel de la bonne homogénéité, la suspension est lyophilisée pour analyse sous la référence « Exemple 4 hors invention – acidification HCl»
Exemple
5
:
Procédé hors invention – acidification avec souches ne permettant pas de réaliser et/ou obtenir
l’invention :
Le but est ici de démontrer l’importance des souches utilisées. Le protocole est quasi identique à celui décrit dans l’Exemple 1.
Délayage de 2 kg (exprimé en masse commerciale) de farine de pois lisse jaune (85% de matière sèche et 28% de protéine N6,25 en poids sec) avec de l’eau déminéralisée (20°C). La suspension obtenue est homogénéisée pendant 30 minutes à l’aide d’un agitateur de paillasse de marque RAYNERI équipé d’une turbine de dispersion. La suspension ainsi obtenue est centrifugée à 1000g pendant 5 minutes dans une centrifugeuse labo BECKMAN. On récupère environ 7 kg de surnageant à 7% de matière après élimination du culot contenant la partie insoluble majoritairement un mélange fibres/amidon. Le surnageant ainsi obtenu est appelé « extrait brut » est normalisé en rectifiant sa matière sèche à 6%.
L’acidification de l’extrait brut est ensuite réalisée selon le protocole suivant :
Préculture
- Souche : plusieurs souches sont comparées, la liste sera présentée dans le tableau ci-dessous
- Inoculum : 1 cryobille
- Milieu : MRS broth (Man Rogosa Sharpe), prêt à l’emploi, Sigma ref.69966
- Incubation pendant 24h à 37°C
- La biomasse obtenue est concentrée, lavée 3 fois avec de l’eau physiologique à 4°C
- On calcule la quantité à ajouter à 900ml d’extrait brut à 6% pour obtenir une concentration cellulaire de 109CFU/mL selon la méthode de préparation d’inoculat A décrite ci-avant (DO=1 <-> 3.10p8 CFU/mL)
Culture:
- Fermenteur de 2L DasGip®.
- Volume réactionnel : 900mL d’extrait brut à 4°C
- L’agitation est régulée à 300rpm, la température 40°C
- Rectification du pH à 7 sans régulation (acidification naturelle réalisée par la souche).
- Suivi de l’évolution du pH à l’aide du pH mêtre du Dasgip®
- On réalise un témoin en parallèle dans les mêmes conditions mais sans souche introduite afin de contrôler l’absence d’un contaminant non désiré perturbant le procédé.
Préculture
- Souche : plusieurs souches sont comparées, la liste sera présentée dans le tableau ci-dessous
- Inoculum : 1 cryobille
- Milieu : MRS broth (Man Rogosa Sharpe), prêt à l’emploi, Sigma ref.69966
- Incubation pendant 24h à 37°C
- La biomasse obtenue est concentrée, lavée 3 fois avec de l’eau physiologique à 4°C
- On calcule la quantité à ajouter à 900ml d’extrait brut à 6% pour obtenir une concentration cellulaire de 109CFU/mL selon la méthode de préparation d’inoculat A décrite ci-avant (DO=1 <-> 3.10p8 CFU/mL)
Culture:
- Fermenteur de 2L DasGip®.
- Volume réactionnel : 900mL d’extrait brut à 4°C
- L’agitation est régulée à 300rpm, la température 40°C
- Rectification du pH à 7 sans régulation (acidification naturelle réalisée par la souche).
- Suivi de l’évolution du pH à l’aide du pH mêtre du Dasgip®
- On réalise un témoin en parallèle dans les mêmes conditions mais sans souche introduite afin de contrôler l’absence d’un contaminant non désiré perturbant le procédé.
Les paramètres de la réaction d’acidification sont les suivants sont les suivants :
| Temps pour atteindre pH 5 (en min) | Vm | VM | tm | pHm | |
| (en U.pH/min) | (en U.pH/min) | (min) | (U.pH) | ||
| Exemple 1 | 110 | -0,018 | -0,027 | 42 | 6,24 |
| Enterococcus Lactis | 122 | -0,016 | -0,018 | 76 | 5,32 |
| Lactobacillus Delbruckeii subsp Jakobsenii | 100 | -0,020 | -0,022 | 74 | 5,23 |
| Lactobacillus Mucosae | 90 | -0,022 | -0,026 | 23 | 5,89 |
| Lactobacillus salivarius | 67 | -0,030 | -0,034 | 34 | 5,40 |
| Streprtococcus salivarius | 82 | -0,024 | -0,024 | 5,18 | |
| Bifido adolescentis | 363 | -0,006 | -0,008 | 213 | 6,02 |
| Lactobacillus gasseri | 333 | -0,006 | -0,008 | 199 | 5,91 |
| Lactobacillus leichmannii (delbrueckii) | 295 | -0,007 | -0,012 | 177 | 6 |
| Lactobacillus mucosae | 228 | -0,009 | -0,014 | 117 | 5,82 |
| Lactobacillus rhamnosus | 210 | -0,010 | -0,014 | 121 | 5,8 |
Il est clair que seules les souches recommandées pour réaliser l’invention (en gras) permettent d’obtenir une acidification à pH 5 dans un temps inférieur à 130 min. Ceci est un avantage indéniable pour un procédé industriel.
Pour compléter ce tableau, on réalise plusieurs analyses dont l’analyse des composés organovolatils par CPG/MS (dont le méthanethiol) ainsi qu’une mesure du degré d’hydrolyse.
On réalise aussi un bilan massique de récupération du floc protéique obtenu à l’aide des souches recommandées pour l’invention (en gras). Celui-ci est calculé à partir 1) de la quantité de matière sèche mise en œuvre dans l’extrait brut et 2) la quantité de matière sèche obtenue dans le floc. Le ratio des deux (2/1) permet d’obtenir un rendement d’extraction. On se compare l’exemple 4 (acidification avec HCL). Le tableau 3 ci-dessous synthétise les résultats :
Sd pour déviation standard ou « standard deviation » en anglais.
| Rendement | |
| (%, sd=+/- 0,02) | |
| Exemple 4 (hors invention - HCl) | 56 |
| Exemple 1 (Invention) | 63 |
| Enterococcus Lactis | 61 |
| Lactobacillus Delbruckeii subsp Jakobsenii | 66 |
| Lactobacillus Mucosae | 63 |
| Lactobacillus salivarius | 62 |
| Streprtococcus salivarius | 62 |
Exemple 6 :
Validation à l’échelle
pré-
pilote industrielle de l’invention
Pour faciliter la mise en œuvre de ces essais mais aussi assurer une comparaison stricte des scenarios, la matière première choisie est produite en produite selon un même mode opératoire que la tête de procédé décrite à l’Exemple 1, puis atomisée afin de la stabiliser.
Tableau 4 : Caractéristiques physico-chimiques de l’extrait brut atomisé
| % poudre | % sec | |
| Humidité (g/100g) | 3,5 | 100 |
| Protéines (Nx6,25) (g/100g) | 57,8 | 59,9 |
| Lipides (g/100g) | 4,5 | 4,7 |
| Glucides (/diff.) (g/100g) | 27,2 | 28,2 |
| Cendres (g/100g) | 7 | 7,3 |
| Sodium (g/100g) | < 0,1 | < 0,1 |
| Potassium (g/100g) | 2,4 | 2,5 |
| Calcium (g/100g) | 0,1 | 0,1 |
| Magnésium (g/100g) | 0,2 | 0,2 |
| Phosphate (g/100g) | 0,5 | 0,5 |
| Chloride (g/100g) | 0,3 | 0,3 |
| pH (en solution à 10%) | 6,5 | - |
| Degré d'hydrolyse (%) | 7,3 | - |
| Glucose (g/100g) | 1,8 | 1,9 |
| Fructose (g/100g) | 0,5 | 0,5 |
| Saccharose (g/100g) | 6,9 | 7,2 |
| Raffinose (g/100g) | 1,1 | 1,1 |
| Stachyose (g/100g) | 7,1 | 7,4 |
| Melibiose (g/100g) | 0,1 | 0,1 |
| Manninotriose (g/100g) | 0,1 | 0,1 |
| Verbascose (g/100g) | 6,3 | 6,5 |
Quatre essais comparatifs et leur prototypes associés sont décrits Tableau 5. Ils ont été conduits selon le déroulement suivant :
- Réhydratation de l’extrait brut atomisé à 6% de M.S.
- Acidification dans un fermenteur de 20l Biolaffite :
. Pour les trois essais « fermentation », le procédé réactionnel est celui décrit au paragraphe 130 mais adapté à un volume de 20 litres.
. Pour le témoin « HCl », introduction d’HCl afin de rectifier le pH à 5
- Les différentes acidifications sont suivies d’une étape de chauffage destinée à précipiter les protéines encore potentiellement en solution :
. Continu : zone tubulaire d’échange avec comme paramètres : préchauffage 35°C. chambrage 74°C pdt 10 secondes – refroidissement 65°C
Batch : cuve réactionnelle dont chauffage et agitation sont régulées – 60°C – 30 min
- Post-traitement du moût :
. Centrifugation 4000G
. Récupération du sédiment
. Redispersion avec de l’eau pour suspension 15% MS
. Rectification pH7
. Traitement HTST (préchauffe 50°C / chauffe 130°C 2s / flash 75°C)
. Atomisation (T°C entrée air = 200°C / T°C sortie air = 90°C)
- Réhydratation de l’extrait brut atomisé à 6% de M.S.
- Acidification dans un fermenteur de 20l Biolaffite :
. Pour les trois essais « fermentation », le procédé réactionnel est celui décrit au paragraphe 130 mais adapté à un volume de 20 litres.
. Pour le témoin « HCl », introduction d’HCl afin de rectifier le pH à 5
- Les différentes acidifications sont suivies d’une étape de chauffage destinée à précipiter les protéines encore potentiellement en solution :
. Continu : zone tubulaire d’échange avec comme paramètres : préchauffage 35°C. chambrage 74°C pdt 10 secondes – refroidissement 65°C
Batch : cuve réactionnelle dont chauffage et agitation sont régulées – 60°C – 30 min
- Post-traitement du moût :
. Centrifugation 4000G
. Récupération du sédiment
. Redispersion avec de l’eau pour suspension 15% MS
. Rectification pH7
. Traitement HTST (préchauffe 50°C / chauffe 130°C 2s / flash 75°C)
. Atomisation (T°C entrée air = 200°C / T°C sortie air = 90°C)
Le Tableau 5 ci-dessous résume les différents essais :
| Description du procédé | Thermo-floculation | ||||
| Mode d’Acidification | Mode de chauffe | ||||
| Fermen-tation | Acidifi-cation (HCL) | Pasteuri-sation continue | Pasteuri-sation batch | ||
| Exemple 6.1 | Acidification selon l’invention | + | - | - | - |
| Exemple 6.2 | Acidification selon l’invention associée à une pasteurisation en continu | + | - | + | - |
| Exemple 6.3 | Témoin : Acidification par injection d’HCL associée à pasteurisation en continu |
- | + | + | - |
| Exemple 6.4 | Acidification selon l’invention par fermentation associée à pasteurisation en lot (en anglais « batch ») | + | - | - | + |
L’idée ici est de valider que le procédé selon l’invention fonctionne à un stade pré-pilote de 20 litres et l’effet d’une combinaison avec un chauffage permettant d’augmenter le rendement de précipitation.
On pratique des analyses biochimiques et physicochimiques qui sont résumées dans le Tableau 6 ci-dessous :
| NUTRALYS S85F | Exemple 6.1 | Exemple 6.2 | Exemple 6.3 | Exemple 6.4 | ||||||
| Isolat commercial | Fermenta-tion sans past | Fermenta-tion | Témoin | Fermenta-tion past+ lot | ||||||
| % poudre | % sec | % poudre | % sec | % poudre | % sec | % poudre | % sec | % poudre | % sec | |
| Humidité (g/100g) | 7 | 100 | 5,6 | 100 | 5,2 | 100 | 5,1 | 100 | 4,3 | 100 |
| Protéines (Nx6,25) (g/100g) | 80 | 86 | 79,3 | 84 | 79,9 | 84,3 | 81,7 | 86,1 | 80,9 | 84,5 |
| Glucides (g/100g) | 3,2 | 3,4 | 1,5 | 1,6 | 2,8 | 3 | - | - | - | - |
| Cendres (g/100g) | 3,9 | 4,2 | 5,4 | 5,7 | 5,7 | 6 | 3,8 | 4 | 4,6 | 4,8 |
| pH (en solution à 10%) | 7 | - | 6,9 | - | 7 | - | 6,6 | - | 6,5 | - |
| Degré d'hydrolyse (%) | 4,6 | - | 4,6 | - | 4,3 | - | 4,3 | - | 4,4 | - |
| Solubilité (%) pH 4 | 15 | - | 18,1 | - | 16,1 | - | 25 | - | 15,8 | - |
| Solubilité (%) pH 7 | 60 | - | 52,4 | - | 42,2 | - | 72 | - | 36,2 | - |
| Glucose (g/100g) | < 0.1 | < 0.1 | < 0.1 | < 0.1 | < 0.1 | < 0.1 | ||||
| Fructose (g/100g) | < 0.1 | < 0.1 | < 0.1 | < 0.1 | < 0.1 | < 0.1 | ||||
| Saccharose (g/100g) | 0,8 | 0,9 | < 0.1 | < 0.1 | < 0.1 | < 0.1 | ||||
| Raffinose (g/100g) | < 0.1 | < 0.1 | < 0.1 | < 0.1 | < 0.1 | < 0.1 | ||||
| Stachyose (g/100g) | 0,4 | 0,4 | < 0.1 | < 0.1 | < 0.1 | < 0.1 | ||||
| Melibiose (g/100g) | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 1,5 | 1,6 | ||||
| Manninotriose (g/100g) | < 0.1 | < 0.1 | < 0.1 | < 0,1 | < 0.1 | < 0,1 | ||||
| Verbascose (g/100g) | 0,9 | 1 | 1,3 | 1,4 | 1,3 | 1,4 |
Il est intéressant comparativement à l’article de Emkani et al, 2021 (Emkani et al., Foods, 10, 549, 2021) de constater qu’en pratiquant le procédé selon l’invention, le degré d’hydrolyse est inchangé. Il n’y a donc pas d’hydrolyse et le produit est ainsi intact, inchangé de ce point de vue à l’opposé de Emkani et al, 2021 (Emkani et al., Foods, 10, 549, 2021). Ce point est particulièrement important lorsque des étapes additionnelles d’extrusion sont réalisées. En effet, une étape d’extrusion réalisée sur une protéine hydrolysée fonctionne moins bien.
Exemple
5
:
Caractérisation
de la composition organovolatile des échantillons générés :
Une analyse est réalisée par CPG/MS sur plusieurs échantillons générés ci-dessus afin de déterminer les différents composés organovolatils.
On compare les « Echantillons 1 » (selon l’invention) et « Echantillons 4 » (témoin art antérieur – acidification HCl). Les résultats sont présentés dans le Tableau 7 :
On compare les « Echantillons 1 » (selon l’invention) et « Echantillons 4 » (témoin art antérieur – acidification HCl). Les résultats sont présentés dans le Tableau 7 :
| % dans l'échantillon avec souche par rapport à l'échantillon témoin | |
| ethylacetate | 300 |
| methylacetate | 120 |
| propanal-2-methyl | 40 |
| 2-methylbutanal | 25 |
| 3-methylbutan-1-ol | 25 |
| benzaldehyde | 22 |
| hexylacetate | 20 |
| 2-butanone | 18 |
| heptan-2-one | 18 |
| hewan-1-ol | 17 |
| 2-pentanone | 15 |
| 3-methylbutanal | 14 |
| pentanal | 13 |
| 4-propylbenzaldehyde | 12 |
| Pentanal, 2-methyl- | 11 |
| ethylpropanoate | 10 |
| 2-pentylfuran | 9 |
| methanethiol | 9 |
| octanal | 8 |
| nonanal | 7 |
| 3-methylbutylacetate | 7 |
| 2,5-dimethylfuran | 7 |
| hexanal | 6 |
| heptanal | 6 |
| 2-ethylfuran | 6 |
| butanal | 4 |
| methyldisulfanylmethane | 3 |
On s’aperçoit aisément que le procédé selon l’invention réduit au moins de 75% l’ensemble des composés organovolatils à l’exception du methylacetate (dont la teneur est inchangée) et l’ethylacetate (dont la concentration est triplée) en comparaison à l’art antérieur. En particulier, la teneur en methanethiol est réduite (environ 15% de la valeur de l’art antérieur). Le methanethiol est un composé qui a une concentration assez faible, de l’ordre du ppb, génère des flaveurs soufrées dans des produits alimentaires tels que des boissons prêtes à boire ou des extrudats humides de protéines.
Claims (17)
- Procédé d’extraction de protéines végétales comprenant les étapes suivantes :
1. la mise en suspension d’une farine végétale dans un solvant préférentiellement aqueux, de sorte à obtenir une suspension de farine végétale ;
2a. l’ajout d’une souche dans la suspension de farine végétale de l’étape 1, la souche étant sélectionnée dans le groupe constitué parLactobacillus Fermentum, Lactobacillus Salivarius, Lactobacillus Delbrueckii subsp Jakobsenii, Lactobacillus Mucosae, Streptococcus Salivarius, et Enterococcus Lactis; la souche deLactobacillusétant préférentiellement une souche deLactobacillus Fermentum; encore plus préférentiellement la souche déposée auprès de la CNCM sous le numéro CNCM I-5802, de sorte à former une suspension ensemencée ;
2b. l’incubation de la suspension ensemencée de l’étape 2a de sorte à ce que la souche acidifie la suspension ensemencée jusqu’à formation d’un précipitat protéique ;
3. Séparation du précipitat protéique obtenu à l’issue de l’étape 2b. - Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la farine végétale de l’étape 1 est sous la forme d’une poudre végétale contenant une quantité de protéine supérieure à 1% en poids, préférentiellement comprise entre 15% et 30% en poids, par rapport au poids de poudre.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que la farine végétale de l’étape 1 est un isolat ou un concentrat, préférentiellement un isolat dont la teneur en protéines est supérieure à 80% en poids sec sur matière sèche d’isolat.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la farine végétale de l’étape 1 est une farine de légumineuse, préférentiellement en ce que la farine végétale est une farine de légumineuse sélectionnée dans le groupe constitué par le pois et la féverole, plus préférentiellement en ce que la farine végétale est une farine de pois.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que la température d’incubation de la suspension de l’étape 2b est comprise entre 30°C et 50°C, préférentiellement entre 35°C et 45°C.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le pH de la suspension de farine végétal de l’étape 1 est rectifié de sorte à être compris entre 6,5 et 7,5 ; préférentiellement de sorte à être égal à 7,0 , avant la mise en œuvre de l’étape 2a.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que l’ajout de souche de l’étape 2a est réalisé de sorte à obtenir une suspension ensemencée présentant une concentration de souche duditLactobacilluscomprise entre 0,1.109et 1.109Colonies Formant Unité (CFU) par millilitre de suspension de farine végétale.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que l’incubation de l’étape 2b est menée jusqu’à ce la suspension ensemencée présente un pH compris entre 4 et 5, préférentiellement un pH de 5,0.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que si à l’issue de l’étape 2b, le pH de la suspension ensemencée n’est pas compris entre 4 et 5, l’étape 2b comprend en fin d’étape 2b une sous-étape 2b’ d’acidification de la suspension ensemencée par ajout d’acide, de sorte à ce que la suspension ensemencée obtenue à l’issue de l’étape 2b présente un pH compris entre 4 et 5, de préférence compris entre 5 et 4,5.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisé en ce que l’étape 2b comprend en fin d’étape 2b une sous-étape 2b’’ de chauffage additionnel pour augmenter le rendement de floculation, consistant à porter la suspension de farine végétale de l’étape 2b à une température comprise entre 45° et 85°C.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que l’étape 3 comprend les étapes suivantes :
3a. la rectification du pH de la suspension ensemencée obtenue à l’issue de l’étape 2b à un pH compris entre 6 et 9, préférentiellement un pH de 7, préférentiellement par ajout de soude ou de chaux dans ladite suspension ;
3b. le traitement thermique de la suspension de l’étape 3a entre 100°C et 160°C pendant 0,1 à 1s, et
3c. le séchage de la suspension de farine végétale de l’étape 3b jusqu’à obtenir un isolat de farine végétale présentant une matière sèche supérieure à 95% à l’aide d’un atomiseur. - Isolat de protéines végétales susceptible d’être obtenu par le procédé de l’une quelconque des revendications 1 à 11.
- Isolat de protéines végétales selon la revendication 12 caractérisé en ce que son degré d’hydrolyse (ou DH) est inférieur à 10%, préférentiellement inférieur à 5.
- Isolat de protéines végétales selon l’une quelconque des revendications 12 ou 13 caractérisé en ce que teneur en methanethiol est réduite de plus de 25%, préférentiellement de plus de 50%, par rapport à un isolat obtenu par acidification d’une suspension de farine végétale uniquement par ajout d’acide chlorhydrique.
- Isolat de protéines végétales selon l’une quelconque des revendications 12 à 14 caractérisé en ce que sa teneur en protéines comprise entre 80% et 95% en poids, préférentiellement entre 82% et 92% en poids, préférentiellement entre 84% et 90% en poids, préférentiellement entre 84% et 88% en poids, par rapport au poids de matière sèche totale de l’isolat.
- Utilisation de l’isolat selon l’une quelconque des revendications 12 à 15 ou obtenu selon l’une quelconque des revendications 1 à 11 pour des applications industrielles comprenant les applications alimentaires, nutraceutiques, pharmaceutiques.
- Souche microbienne déposée auprès de la CNCM sous le numéro CNCM I-5802.
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2022
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-
2023
- 2023-12-14 WO PCT/EP2023/025526 patent/WO2024125824A2/fr unknown
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2024125824A2 (fr) | 2024-06-20 |
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