CN105820033A - 一种己烯雌酚人工抗原及其制备的抗体 - Google Patents

一种己烯雌酚人工抗原及其制备的抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN105820033A
CN105820033A CN201610247793.6A CN201610247793A CN105820033A CN 105820033 A CN105820033 A CN 105820033A CN 201610247793 A CN201610247793 A CN 201610247793A CN 105820033 A CN105820033 A CN 105820033A
Authority
CN
China
Prior art keywords
diethylstilbestrol
alkali
formula
antibody
compound shown
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610247793.6A
Other languages
English (en)
Inventor
霍峰
林晓莉
董艳峰
秦誉
覃丹凤
贾良曦
李宁
彭玮
于静泉
张巍
张治成
梅岩松
张磊
刘中成
梁代华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BEIJING WDWK BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Gushi Agricultural And Pastoral Group Co Ltd
Harbin Veterinary Drugs And Feeds Supervision Institute
Original Assignee
BEIJING WDWK BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Gushi Agricultural And Pastoral Group Co Ltd
Harbin Veterinary Drugs And Feeds Supervision Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BEIJING WDWK BIOTECHNOLOGY Co Ltd, Gushi Agricultural And Pastoral Group Co Ltd, Harbin Veterinary Drugs And Feeds Supervision Institute filed Critical BEIJING WDWK BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201610247793.6A priority Critical patent/CN105820033A/zh
Publication of CN105820033A publication Critical patent/CN105820033A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C51/00—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides
    • C07C51/09—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides from carboxylic acid esters or lactones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C59/00—Compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C59/40—Unsaturated compounds
    • C07C59/58—Unsaturated compounds containing ether groups, groups, groups, or groups
    • C07C59/64—Unsaturated compounds containing ether groups, groups, groups, or groups containing six-membered aromatic rings
    • C07C59/66—Unsaturated compounds containing ether groups, groups, groups, or groups containing six-membered aromatic rings the non-carboxylic part of the ether containing six-membered aromatic rings
    • C07C59/68—Unsaturated compounds containing ether groups, groups, groups, or groups containing six-membered aromatic rings the non-carboxylic part of the ether containing six-membered aromatic rings the oxygen atom of the ether group being bound to a non-condensed six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
    • C07C67/30—Preparation of carboxylic acid esters by modifying the acid moiety of the ester, such modification not being an introduction of an ester group
    • C07C67/31—Preparation of carboxylic acid esters by modifying the acid moiety of the ester, such modification not being an introduction of an ester group by introduction of functional groups containing oxygen only in singly bound form
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/77—Ovalbumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种己烯雌酚人工抗原及其制备的抗体。己烯雌酚半抗原，其结构式如式Ⅰ所示。既保留了DES分子原有的立体结构，又有利于特异性抗体的产生。己烯雌酚人工抗原，它为式Ⅰ所示化合物与载体蛋白的偶联物。本发明还提供了以该己烯雌酚人工抗原为免疫原制备得到的抗体，及一种检测己烯雌酚的试剂盒，它包括己烯雌酚半抗原和/或己烯雌酚人工抗原和/或抗体。

Description

一种己烯雌酚人工抗原及其制备的抗体
技术领域
本发明涉及一种己烯雌酚人工抗原及其制备的抗体。
背景技术
己烯雌酚(diethylstibestrol，DES)是一种人工合成的雌激素，具有促进动物生长、增加蛋白质沉积、提高饲料转化率和减少脂肪沉积的作用，因此曾作为生长促进剂广泛用于畜禽养殖中。但DES可导致机体代谢紊乱和发育异常，国际癌症研究机构(IARC)研究还发现DES是一种致癌物，能够在动物源性食品如肉、蛋、奶中残留，并通过食物链危害人体健康。因此欧盟等国规定禁止在食品动物养殖中使用DES，我国农业部2002年先后发布了176号和193号公告，明确规定了禁止在所有食用动物饲养中使用己烯雌酚以促生产或其它用途。
目前，国内外己建立了多种检测DES残留的理化检测方法，主要包括高效液相色谱法(HPLC)，液质联用法(LC–MS)，但仪器方法样品前处理过程复杂，检测时间长，仪器设备昂贵，且需专业人员操作，严重限制了这种方法的推广和应用。酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)具有特异性强、简便、快速、成本低等优点，目前已广泛应用于食品安全检测领域。而基于酶联免疫吸附法的快速检测试剂盒，更适合企业进行现场监测，方便实用，易于推广，是目前食品安全检测领域中最具有发展前景和产业化的检测手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种己烯雌酚人工抗原及其制备的抗体，本发明在DES分子结构中的一个酚羟基的位置引入羧基制得己烯雌酚半抗原，再与蛋白质交联形成偶联物制得己烯雌酚全抗原，既保留了DES分子原有的立体结构，又有利于特异性抗体的产生。
本发明提供的己烯雌酚半抗原，其结构式如下：
上述己烯雌酚半抗原(式Ⅰ所示化合物)的制备方法，包括如下步骤：
(1)己烯雌酚与式Ⅱ所示化合物经取代反应(Williamson成醚反应)，得到式Ⅲ所示化合物(己烯雌酚丁酸乙酯中间体)；式Ⅱ中，X为氯、溴或碘；
(2)式Ⅲ所示化合物(己烯雌酚丁酸乙酯中间体)经水解反应，得到式Ⅰ所示化合物。
上述的制备方法中，步骤(1)中，所述乙烯雌酚与所述4-溴丁酸乙酯的摩尔比为1：(1～1.2)，具体为1：1；和/或，
所述取代反应在碱的条件下进行，所述碱与所述己烯雌酚的摩尔比可为1：(1～1.2)，具体为1：1；所述碱可为氢化钠、氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化锂中的任一种；
所述取代反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂可为二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)；和/或，
所述取代反应的温度可为35～40℃，具体可为35℃；时间可为1～2小时，具体可为1小时。
上述的制备方法，步骤(2)中，所述水解反应(酯的水解)在碱的条件下进行，所述碱可为氢氧化锂、氢氧化钠和氢氧化钾中的任一种；所述式Ⅱ所示化合物与所述碱的摩尔比可为1：(3～4)，具体可为1：3；所述碱以碱的水溶液的形式添加，所述碱的水溶液的摩尔浓度可为1～1.2mol/L，具体可为1mol/L；和/或，
所述水解反应的温度可为35～40℃，具体可为35℃，时间可为1～2小时，具体可为1小时。
本发明提供的己烯雌酚人工抗原，它为上述己烯雌酚半抗原(式Ⅰ所示化合物)与载体蛋白的偶联物。所述偶联物的结构式如式Ⅳ所示：
上述的偶联物中，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)或鸡卵清白蛋白(OVA)。
上述的偶联物中，己烯雌酚半抗原(式Ⅰ所示化合物)与载体蛋白的偶联比(摩尔比)可为(3～10):1，具体可为5.65:1或3.61:1。该己烯雌酚人工抗原可以作为免疫原也可以作为包被原。将该己烯雌酚人工抗原免疫动物，可获得高特异性的多克隆抗体，方法简便、易行。
本发明还提供了上述的偶联物在制备己烯雌酚抗体中的应用。
上述的应用中，所述抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明提供的抗体，它为以上述任一项所述的偶联物为免疫原制备得到的抗体。
本发明还提供了一种试剂盒，它包括己烯雌酚半抗原(式Ⅰ所示化合物)和/或己烯雌酚人工抗原(偶联物)和/或所述的抗体。
己烯雌酚是小分子物质，不具备免疫原性，只有反应原性，无法直接诱导机体产生特异性抗体，因此需要与大分子共价结合后才能使动物免疫系统识别，产生相应的抗体，本发明利用4-溴丁酸乙酯与DES进行反应，在酚羟基的位置引入羧基，再与蛋白质交联形成DES-BSA偶联物，与文献报道方法相比，既保留了DES分子原有的立体结构，又有利于特异性抗体的产生。经质谱扫描鉴定，免疫产生高滴度抗体证实，得到了具有免疫原性和特异反应性的人工抗原。
附图说明
图1为己烯雌酚半抗原的合成线路图。
图2为己烯雌酚半抗原的HPLC-MS图谱。
图3为牛血清蛋白BSA和免疫原DES-BBAE-BSA的MALDI-TOF图谱，其中图3(a)为牛血清蛋白的MALDI-TOF图谱，3(b)为免疫原DES-BBAE-BSA的MALDI-TOF图谱。
图4为实施例5中间接ELISA法测定所得血清的IC50的曲线图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
己烯雌酚原料药购于大连美仑生物技术有限公司，其结构式如式Ⅴ所示：
牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、4-溴丁酸乙酯、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司；其他试剂为国产分析纯。新西兰大白兔：北京市实验动物中心。
实施例1、制备己烯雌酚半抗原
一、制备过程
按照图1所示合成线路图进行制备，具体步骤如下：
(1)将536mg己烯雌酚原料药溶于5mLDMF，搅拌15min后于室温加入68.57mg70％的氢化钠，磁力搅拌反应1小时。然后滴加390mg4-溴丁酸乙酯磁力搅拌反应1小时，将反应液滴加到45ml冰水中析出类白色固体，过滤，滤饼用10ml水洗，收集滤饼45℃鼓风干燥4小时，得到己烯雌酚丁酸乙酯中间体。
(2)在圆底烧瓶中加入500mg己烯雌酚丁酸乙酯中间体和10mlTHF，25℃磁力搅拌20min后滴加3.5ml1M氢氧化锂水溶液，磁力搅拌3小时后40℃减压浓缩，残留物中加入20ml水，用盐酸调节pH至5.5--6.0，析出类白色固体，过滤，滤饼用10ml水洗，收集滤饼45℃鼓风干燥5小时得到己烯雌酚丁酸半抗原，简称DES-BBAE。
二、表征
半抗原DES-BBAE经HPLC-MS鉴定，结果见图2。DES-BBAE的分子量理论应为354，此次鉴定试验采用的是负离子模式，由此可知353.5对应的峰对应的峰即为半抗原DES-BBAE，说明半抗原DES-BBAE合成成功。
实施例2、制备己烯雌酚人工抗原
一、己烯雌酚免疫原
1、己烯雌酚免疫原的制备过程
按照如下步骤制备免疫原(DES-BBAE-BSA)：
(1)将15.86mg实施例1中制备得到的己烯雌酚半抗原用1.5mLDMF溶解，200rpm搅拌10min，加入21.5mgEDC，溶解后再加入13mgNHS，室温搅拌(500rpm)活化2h。
(2)称取50mg牛血清白蛋白溶于3.5mL0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，将步骤1反应液在反应盒中冰浴(<4℃)搅拌(1000rpm)中逐滴加入(1mL/min)，搅拌(500rpm)反应24h。
(3)将反应产物装入干净透析袋，在1L0.01MPBS(pH7.2)透析液中4℃搅拌(100rpm)透析3天，每天换液3次，将透析产物5000rpm离心6min，1.5mL/管分装，得到己烯雌酚免疫原，简称DES-BBAE-BSA，-20℃保存备用。
2、己烯雌酚免疫原的表征
采用MALDI-TOF技术，对合成的抗原进行鉴定，牛血清蛋白BSA质谱峰质荷比为66538.973，人工抗原DES-BBAE-BSA的质谱峰质荷比分别为68539.643，见图3，说明半抗原DES-BBAE成功结合了BSA，经计算其结合比为5.65：1。
二、己烯雌酚包被原
1、己烯雌酚包被原的制备过程
(1)将15.86mg实施例1中制备得到的己烯雌酚半抗原用1.5mLDMF溶解，200rpm搅拌10min，加入21.5mgEDC，溶解后再加入13mgNHS，室温搅拌(500rpm)活化2h。
(2)称取33.6mg鸡卵清白蛋白溶于3.5mL0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，将步骤1反应液在反应盒中冰浴(<4℃)搅拌(1000rpm)中逐滴加入(1mL/min)，搅拌(500rpm)反应24h。
(3)将反应产物装入干净透析袋，在1L0.01MPBS(pH7.2)透析液中4℃搅拌(100rpm)透析3天，每天换液3次，将透析产物5000rpm离心6min，1.5mL/管分装，得到己烯雌酚包被原，简称DES-BBAE-OVA，-20℃保存备用。
2、表征
采用TNBS法测定结合比，己烯雌酚包被原DES-BBAE-OVA的结合比3.61：1。
实施例3、多克隆抗体的制备
以实施例2制备得到的DES-BBAE-BSA作为免疫原，免疫3-4月龄新西兰大白兔。首次免疫，将制备好的免疫原与等体积的弗氏完全佐剂进行乳化，于腋下、颈背部皮下多点注射。加强免疫，将弗氏完全佐剂换成弗氏不完全佐剂，免疫剂量和免疫方法同上。每次免疫间隔为3周。从第四次免疫起，每次免疫的第七天于耳缘静脉采血，用间接竞争ELISA法检测抗体效价和IC50。待抗体性能参数达到要求后，心脏采血，离心分离多抗血清(抗体)。
实施例4、抗体纯化
以proteinA-Sepharose4B作为亲和层析介质，采用免疫亲和层析法对多抗血清进行纯化。用5倍柱体积的结合缓冲液(3.0mol/L的NaCl，100mmol/L柠檬酸/磷酸盐缓冲液，pH9.0)冲洗柱子，流速为5ml/min，用磷酸缓冲液稀释多抗血清后上柱，流速为0.5ml/min，继续添加结合缓冲液，当280nm的吸光值回到基线时，加洗脱缓冲液(100mM柠檬酸/磷酸盐缓冲液，pH3.0)，流速0.5ml/min，迅速用1MTris中和抗体，将抗体装入透析袋，4℃条件下PBS溶液透析，测定浓度，4℃保存。
实施例5、抗体效价、IC50的确定
(1)采用间接ELISA法测定实施例4所得血清的抗体效价，具体步骤如下：
1)包被：96孔酶标板每孔加入100μL浓度为2μg/mL的“己烯雌酚-OVA”溶液(用包被缓冲液进行稀释)，4℃包被过夜，用PBST洗涤3次。
包被缓冲液：pH9.6、0.05mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(溶剂为水，溶质及其浓度如下：Na2CO31.59g/L和NaHCO32.93g/L)。
2)封闭：每孔加入150μL/孔的封闭液，在37℃孵育2h，弃封闭液，PBST洗涤3次，拍干。置于4℃冰箱保存备用。
封闭液：含有0.5％(体积百分含量)小牛血清、3％(3g/100ml)酪蛋白的磷酸盐缓冲液，pH7.4。
3)竞争反应：每孔加入100μL实施例4制备的血清的梯度稀释液(采用pH7.4、0.01mol/L的PBS缓冲液进行梯度稀释)，37℃孵育30min，洗板4次，拍干。采用将未经任何免疫的4月龄的雌性新西兰大白兔的血清作为实施例4制备的血清的阴性对照。采用pH7.4、0.01mol/L的PBS缓冲液作为血清稀释液的空白对照。
4)加酶标二抗：HRP标羊抗兔IgG抗体(JacksonImmunoResearch公司，货号111-035-003)，100μl/孔，37℃孵育30min，PBST洗涤4次，拍干。
5)显色：四甲基联苯胺(TMB)-双氧水溶液100ul/孔，室温显色15min。
6)终止：加入终止液(2MH2SO4)50μl/孔。
7)读数：以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔(以PBS代替待测样品的对照)OD值的比值(P/N)大于2.1为限，作为判断为血清效价的临界点。其中P/N＝(标本OD450nm值－空白对照OD450nm值)/(阴性对照OD450nm值－空白对照OD450nm值)。
ELISA结果判定方法：抗体效价以P/N>2.1的血清最大稀释倍数表示。
结果表明血清中的抗体效价为1：10000。
(2)采用间接ELISA法测定所得血清的IC50，具体步骤如下：
1)包被：96孔酶标板每孔加入100μL浓度为2μg/mL的“己烯雌酚-OVA”溶液(用包被缓冲液进行稀释)，4℃包被过夜，用PBST洗涤3次。
包被缓冲液：pH9.6、0.05mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(溶剂为水，溶质及其浓度如下：Na2CO31.59g/L和NaHCO32.93g/L)。
2)封闭：每孔加入150μL/孔的封闭液，在37℃孵育2h，弃封闭液，PBST洗涤3次，拍干。置于4℃冰箱保存备用。
封闭液：含有0.5％(体积百分含量)小牛血清、3％(3g/100ml)酪蛋白的磷酸盐缓冲液，pH7.4。
3)竞争反应：阳性孔中先后加入己烯雌酚标准品溶液和己烯雌酚抗体各50ul，以10mMPBS代替己烯雌酚标准品溶液作为阴性对照孔。37℃孵育30min，洗板4次，拍干。
4)加酶标二抗：HRP标羊抗兔IgG抗体(JacksonImmunoResearch公司，货号111-035-003)，100μl/孔，37℃孵育30min，PBST洗涤4次，拍干。
5)显色：四甲基联苯胺(TMB)-双氧水溶液100ul/孔，室温显色15min。
6)终止：加入终止液(2MH2SO4)50μl/孔。
7)读数：以450nm单波长测定各孔OD值，即OD450nm。以己烯雌酚浓度为横坐标，以B/B0为纵坐标建立曲线。B为加入己烯雌酚溶液后得到OD450nm值，B0为加入PBS缓冲液后得到的OD450nm值。曲线见图4。IC50为0.025ng/mL。

Claims (9)

1.式Ⅰ所示化合物；
2.权利要求1所述化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)己烯雌酚与式Ⅱ所示化合物经取代反应，得到式Ⅲ所示化合物；式Ⅱ中，X为氯、溴或碘；
(2)式Ⅲ所示化合物经水解反应，得到式Ⅰ所示化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述乙烯雌酚与所述4-溴丁酸乙酯的摩尔比为1：(1～1.2)；和/或，
所述取代反应在碱的条件下进行，所述碱与所述己烯雌酚的摩尔比为1：(1～1.2)；所述碱具体为氢化钠、氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化锂中的任一种；和/或，
所述取代反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂为二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；和/或，
所述取代反应的温度为35～40℃，时间为1～2小时。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述水解反应在碱的条件下进行；所述式Ⅱ所示化合物与所述碱的摩尔比为1：(3～4)；所述碱具体为氢氧化锂、氢氧化钠和氢氧化钾中的任一种；和/或，
所述碱以碱的水溶液的形式添加，所述碱的水溶液的摩尔浓度为1～1.2mol/L；和/或，
所述水解反应的温度为35～40℃，时间为1～2小时。
5.权利要求1所述化合物与载体蛋白的偶联物。
6.根据权利要求5所述的偶联物，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白。
7.权利要求5或6所述的偶联物在制备己烯雌酚抗体中的应用。
8.以权利要求5或6所述的偶联物为免疫原制备得到的抗体。
9.一种检测己烯雌酚的试剂盒，它包括权利要求1所述的化合物和/或权利要求5或6所述的偶联物和/或权利要求8所述的抗体。
CN201610247793.6A 2016-04-20 2016-04-20 一种己烯雌酚人工抗原及其制备的抗体 Pending CN105820033A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610247793.6A CN105820033A (zh) 2016-04-20 2016-04-20 一种己烯雌酚人工抗原及其制备的抗体

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610247793.6A CN105820033A (zh) 2016-04-20 2016-04-20 一种己烯雌酚人工抗原及其制备的抗体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105820033A true CN105820033A (zh) 2016-08-03

Family

ID=56526190

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610247793.6A Pending CN105820033A (zh) 2016-04-20 2016-04-20 一种己烯雌酚人工抗原及其制备的抗体

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105820033A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107698441A (zh) * 2017-11-02 2018-02-16 山东师范大学 一种雌酚类半抗原、完全抗原及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DD253491A1 (de) * 1986-10-22 1988-01-20 Akad Wissenschaften Ddr Verfahren zur herstellung eines wasserloeslichen diethylstilbestrol-konjugats
CN1967247A (zh) * 2006-05-18 2007-05-23 李季 一种适用于己烯雌酚残留分析的酶联免疫吸附检测试剂盒
CN101059511A (zh) * 2006-05-18 2007-10-24 李季 一种适用于己烯雌酚残留分析的酶联免疫吸附检测试剂盒
CN101914157A (zh) * 2010-07-06 2010-12-15 华南农业大学 一种己烯雌酚抗体的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DD253491A1 (de) * 1986-10-22 1988-01-20 Akad Wissenschaften Ddr Verfahren zur herstellung eines wasserloeslichen diethylstilbestrol-konjugats
CN1967247A (zh) * 2006-05-18 2007-05-23 李季 一种适用于己烯雌酚残留分析的酶联免疫吸附检测试剂盒
CN101059511A (zh) * 2006-05-18 2007-10-24 李季 一种适用于己烯雌酚残留分析的酶联免疫吸附检测试剂盒
CN101914157A (zh) * 2010-07-06 2010-12-15 华南农业大学 一种己烯雌酚抗体的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WANG, WEN-JUN等: "Development of an Indirect Competitive ELISA Based on Polyclonal Antibody for the Detection of Diethylstilbestrol in Water Samples", 《CHINESE JOURNAL OF CHEMISTRY》 *
彭池方等: "食品中残留已烯雌酚人工抗原的制备、分析与鉴定", 《食品科学》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107698441A (zh) * 2017-11-02 2018-02-16 山东师范大学 一种雌酚类半抗原、完全抗原及其制备方法
CN107698441B (zh) * 2017-11-02 2021-05-04 山东师范大学 一种雌酚类半抗原、完全抗原及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101962358A (zh) 环丙沙星半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN106831498B (zh) 呋喃西林代谢物sem衍生化半抗原、人工抗原的制备方法及其应用
CN109212200A (zh) 一种尼卡巴嗪半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
CN108484751B (zh) 川陈皮素抗原及其制备方法与应用
CN111333503A (zh) 三氯杀螨醇半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN104744294B (zh) 邻苯二甲酸二(α‑乙基己)酯半抗原、人工抗原及其抗体制备方法及应用
CN104950105B (zh) 氯霉素半抗原和抗原的制备方法及其在化学发光免疫试剂盒中的应用
CN109956848A (zh) 一种三氯生半抗原和抗原及其制备方法和用途
CN109053477A (zh) 一种仲丁灵半抗原与抗原的制备方法及应用
CN110872344B (zh) 一种氯霉素完全抗原及其制备方法与应用
CN105820033A (zh) 一种己烯雌酚人工抗原及其制备的抗体
CN114316027A (zh) 一种氟尼辛人工抗原及其制备方法与应用
CN115215811B (zh) 丙硫菌唑半抗原、抗原、抗体、检测装置及其制备和应用
CN109575123B (zh) 一种氟乙酰胺半抗原及单克隆抗体的制备方法与应用
CN107118159A (zh) 呋喃妥因代谢物ahd衍生化半抗原、人工抗原的制备方法及其应用
CN106496296A (zh) 一种雌二醇人工抗原及其制备方法与应用
CN114031528B (zh) 氟苯尼考半抗原、人工抗原、抗体及其合成方法和应用
CN109608479A (zh) 一种毒鼠强半抗原及单克隆抗体的制备方法与应用
CN109305963A (zh) 一种酮康唑半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
CN110746286B (zh) 一种丁香酚半抗原、人工抗原及其制备方法与应用
CN108107223A (zh) 检测雌二醇和/或苯甲酸雌二醇的方法及其所用酶联免疫试剂盒
CN109187948B (zh) 一种洛克沙胂和硝苯胂酸双联检测试纸
CN108132348B (zh) 苏丹红iii半抗原、偶联抗原、抗体及胶体金快速检测装置及其用途
CN111499637A (zh) 一种育亨宾半抗原yha、人工抗原和其抗体及其制备和应用
CN106596959B (zh) 一种洛美沙星免疫原及其制备方法和检测试纸卡

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160803

RJ01 Rejection of invention patent application after publication