CN105816487A - 五层龙的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明关于一种五层龙在制备糖原磷酸化酶抑制剂类产品中的应用。所述五层龙优选为翅子藤科五层龙属五层龙Salacia prinoids(Willd.)DC.的干燥藤茎。本发明还提供一种具有抑制糖原磷酸化酶活性的组合物，其以五层龙原生药材或其饮片或其提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料。所述组合物或其制剂可用于抑制糖原磷酸化酶活性，临床上可用于预防和/或治疗2型糖尿病。本品可作为保健食品或食品使用，安全性较高。本发明所提供的制备方法简单，采用常规的提取分离工艺即可获得具有临床疗效的产品。

Description

五层龙的新用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及五层龙作为糖原磷酸化酶抑制剂应用的新用途，其可用于预防和/或治疗2型糖尿病。

背景技术

五层龙，学名：Salaciaprinoids(Willd.)DC.，又名桫拉木，是翅子藤科五层龙属植物。五层龙在民间用其根入药，据《中华本草》载:五层龙味涩、性温，有祛风除湿，通经活血之功效，可治风湿痹症，血瘀腰痛。现代药理研究发现五层龙属植物的根或茎的水溶性组分大多具有降血糖、保肝、抗氧化、降脂减肥、抗菌和防醉醒酒的作用。五层龙主要分布于海南、广东、广西一带，资源丰富，但目前国内外对于五层龙的研究还很匮乏，尚待我们进一步去挖掘。

糖原分解是阻断肝葡糖生产的重要靶向。肝脏通过糖原分解产生葡糖(葡糖聚合物糖原的分解)和葡糖异生(从2-和3-碳前体合成葡糖)。肝脏是调节吸收后状态中血糖的主要器官。尽管对调节餐后血糖水平的贡献具有较小作用，但是肝脏对外源血糖的反应是保持血糖正常能力的关键。肝葡糖生产是非胰岛素依赖性糖尿病(2型糖尿病，NIDDM)疗法的一个重要靶向，肝脏在吸收后(禁食)状态中是血浆葡糖水平的主要调节器，并且在NIDDM患者中肝葡糖生产的速率明显高于正常个体。同样地，在进食(进餐)状态中，肝脏在总血浆葡糖供应中具有成比例减小的作用，肝葡糖生产在NIDDM患者中异常的高。

许多条证据表明，糖原分解在NIDDM中可能对肝葡糖输出具有重要贡献。首先，在正常的吸收后人体中，高达75％的肝葡糖生产被评估为源自糖原分解。其次，患有肝脏糖原贮存疾病的患者，包括Hers氏病(糖原磷酸化酶缺乏)表现出阵发式低血糖。这些观察提示糖原分解可能是肝葡糖生产的一个重要途径。糖原磷酸化酶是通过葡萄糖-1-磷酸的糖原分解作用在肝脏以及其它组织如肌肉和神经组织中产生葡萄糖的关键酶。通过抑制糖原磷酸化酶活性可以预期可用于治疗2型糖尿病、胰岛素耐受性、高胰岛素血症、血胰高血糖素过多症和肥胖症，特别是2型糖尿病。

长期服用化学合成的糖原磷酸化酶抑制剂对人体某些器官如消化道、肝和肾的副作用会随时间的增长而变得显著起来。而天然植物中也存在具有抑制糖原磷酸化酶活性的物质，其中有些天然植物或其水煎液经过了长期的食用，对其安全性已得到了广泛认可和证实，且其来源广泛，制备成本低，相比其它来源的糖原磷酸化酶抑制剂更具有开发价值。因此，有必要开发出安全、有效的天然糖原磷酸化酶抑制剂。

然而，至今尚未见任何有关五层龙在抑制糖原磷酸化酶活性方面的研究报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种安全、有效的天然糖原磷酸化酶抑制剂。

因此，本发明的目的在于提供一种五层龙抑制糖原磷酸化酶活性的新用途。同时，本发明的目的还在于寻找一种新的安全有效的天然糖原磷酸化酶抑制剂，为临床上提供一种新的天然的糖原磷酸化酶抑制剂，也为临床上防治2型糖尿病等疾病提供一种新的用药选择或提供一种新的保健品或食品。

为实现上述发明目的，本发明提供五层龙在制备糖原磷酸化酶抑制剂类产品中的应用。

所述糖原磷酸化酶抑制剂类产品包括但不限于药品、保健品、食品或用于制备所述药品、保健品、食品的中间体。

本发明所述五层龙为翅子藤科五层龙属植物五层龙Salaciaprinoids(Willd.)DC.的根、茎、藤、叶、根茎和/或藤茎，优选根茎或藤茎，更优选藤茎。所述五层龙是指五层龙原生药材或五层龙制品，所述制品是指五层龙经干燥的药材，或经切割或粉碎后的药材，或经加工后得到的饮片，或经溶剂提取制成的提取物，或它们的任意组合。

在一具体实例中，本发明所述五层龙为五层龙Salaciaprinoids(Willd.)DC.的藤茎的干燥粉末。在另一具体实例中，所述五层龙饮片可以是满足临床用药需求和药品质量要求的任何形式的饮片。在又一具体实例中，所述五层龙提取物可以是以药材或饮片为原料，用水或其它适合的溶剂提取制备的提取物。在一些具体实例中，本发明所述五层龙提取物为例如以五层龙药材或饮片为原料，使用水和/或与水混溶溶剂进行提取所得到的提取物。所述“与水混溶溶剂”是指能与水以任意比例混合的溶剂，例如甲醇、乙醇、丙醇、甲酸、乙酸、乙腈、丙酮或四氢呋喃。所述“与水混溶溶剂”优选为乙醇或丙酮；考虑到药品、保健品或食品领域的安全性和生产成本等问题，所述“与水混溶溶剂”更优选为乙醇。在一具体实例中，所述提取物由五层龙药材或饮片经乙醇溶液提取制成，其中，乙醇溶液的浓度优选为1～100％(V/V)，更优选为5～99％(V/V)，进一步优选为95％(V/V)。

例如，五层龙提取物可以由以下方法制得：

取五层龙药材或饮片，加4-10倍量水，提取1-3次，每次提取0.5-3小时，提取液过滤、浓缩得稠膏，干燥即得。

所述五层龙提取物还可以由以下方法制得：

取五层龙药材或饮片，加4-10倍量95％乙醇(V/V)，提取1-3次，每次提取0.5-3小时，提取液过滤、浓缩得稠膏，干燥即得。

本发明的又一目的在于提供一种具有抑制糖原磷酸化酶活性的组合物，其以五层龙作为药物活性成分，加入药学上可接受的辅料。

其中，所述五层龙是指五层龙原生药材或五层龙制品，所述制品是指五层龙干燥药材，切割或粉碎后的药材，五层龙药材经加工后得到的饮片，或五层龙经过溶剂提取制成的提取物。

优选地，所述五层龙为翅子藤科五层龙属五层龙Salaciaprinoids(Willd.)DC.的藤茎。

在一具体实例中，所述五层龙为五层龙原生药粉；所述五层龙的原生药粉，可以按以下方法制备：

取五层龙药材，例如五层龙的藤茎，干燥，除去杂质，粉碎成10～120目的粉末；优选粉碎成95％～100％过20目筛的粉末；更优选粉碎成95％～100％过40目筛的粉末。

在另一具体实例中，所述五层龙提取物由为翅子藤科五层龙属五层龙Salaciaprinoids(Willd.)DC.的藤茎为原料，经过溶剂提取制备而成，优选以水或乙醇溶液作为溶剂，其中乙醇溶液的浓度优选为95％(V/V)。

本发明所述五层龙提取物可以是通过使用水和/或与水可混溶的溶剂提取五层龙药材后得到的混合物，也可以是将该混合物进一步纯化后得到的纯化后的提取物。可以由本发明例举的制备方法得到，也可以是通过本领域技术人员所能想到的其它常规方法得到，还可以是直接购买的五层龙提取物。只要能实现本发明目的，本发明对五层龙提取物的制备方法或来源不作限制。

以上所述的提取，可以采用现代技术中大生产上和药物上可接受的各种提取方法进行提取，如浸渍提取、渗漉提取、回流提取、微波辅助提取、超声提取、超临界提取等；提取液浓缩，可以采用常压浓缩、也可以采用减压浓缩等；浓缩液干燥，可以采用热风干燥、真空减压干燥、微波(真空)干燥、喷雾干燥等大生产上和药物上可接受的各种干燥方式。

本发明还提供一种用于抑制糖原磷酸化酶活性的制剂，所述制剂含有五层龙药材或其饮片或其提取物。其中所述五层龙药材优选为粉末形态，即五层龙原生药粉。所述五层龙提取物可以是水和/或醇粗提物，也可以是粗提物经进一步纯化后所得的纯化后的提取物。

本发明所述制剂可以是五层龙原药生粉直接制成散剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂或丸剂等临床上可接受的制剂；也可以是将原生药粉加入药学上可接受的适宜的载体后制成临床上可接受的制剂，例如片剂、丸剂或颗粒剂等。以原生药粉入药的制剂，日服剂量为按生药材计6～15g/d，优选7.2g/d。

本发明所述制剂也可以是以五层龙饮片或其提取物入药，直接或加入药学上可接受载体后制成丸剂、颗粒剂、口服液、胶囊剂、片剂、糖浆剂、注射剂等临床上可接受的制剂。优选为口服制剂，例如丸剂、颗粒剂、口服液、胶囊剂或片剂。

在一些具体实例中，所述药学上可接受的载体可以是任何制备口服或注射等常规制剂常用的药学上可接受的载体，例如：蔗糖、糊精、淀粉、乳糖、甘露醇、木糖醇、甲壳胺、壳聚糖、双岐糖、滑石粉、羧甲基纤维素钠(CMS-Na)、微晶纤维素(MCC)、微粉硅胶、α-环糊精(α-CD)、β-环糊精(β-CD)、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、羟丙基纤维素、聚乙二醇(PEG)。还可添加染料，例如氧化铁黄和/或氧化铁红，和/或二氧化钛，其目的是进行配色。上述药学上可接受的载体可以单独使用，也可以联合使用。本领域的普通技术人员可以理解，只要能够实现本发明的目的，任何药学上可接受的辅料或赋形剂均可用于制备本发明制剂。

本发明所述制剂可用于抑制糖原磷酸化酶活性。临床上可用于预防和/或治疗2型糖尿病等。另一方面，本发明提供一种抑制糖原磷酸化酶活性的保健品，其含有五层龙药材或其饮片或其提取物。所述保健品添加的辅料和制剂技术都是本领域常规的，本发明不做限制，只要符合相应质量标准或临床使用的需求均可。

本发明可获得的有益效果至少包括：

1.本发明提供了五层龙药材的一种新的临床应用价值或保健价值，并且原生药粉、粗提物即可发挥抑制糖原磷酸化酶活性的作用；

2.本发明提供的五层龙及其制剂可用于防治2型糖尿病等疾病，起效剂量低，且安全无毒副作用；

3.本发明所提供的制备方法简单，采用常规的提取分离工艺即可获得具有临床疗效的产品，便于产业推广应用。

4.本发明提供了一种五层龙新的用药部位：藤茎，相比五层龙传统用药部位：根而言，五层龙藤茎资源更加丰富，加上五层龙植物分布广泛，可满足大规模生产对原药材产量的需求，因而具有良好的药物开发前景。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例

实施例1五层龙水粗提物1的制备

取五层龙的干燥藤茎，粉碎，称取大约20g，用10倍量水提取3次，提取时间分别为1h、0.5h、0.5h，合并提取液，减压浓缩至10ml，规格为2:1(g/ml)。

实施例2五层龙水粗提物2的制备

取五层龙的干燥根茎，粉碎，称取大约20g，用10倍量水提取3次，提取时间分别为1h、0.5h、0.5h，合并提取液，减压浓缩至10ml，规格为2:1(g/ml)。

实施例3五层龙乙醇粗提物1的制备

取五层龙的干燥藤茎，粉碎，称取大约20g，用10倍量95％乙醇提取3次，提取时间分别为1h、0.5h、0.5h，合并提取液，减压浓缩至10ml，规格为2:1(g/ml)。

实施例4五层龙乙醇粗提物2的制备

取五层龙的干燥根茎，粉碎，称取大约20g，用10倍量95％乙醇提取3次，提取时间分别为1h、0.5h、0.5h，合并提取液，减压浓缩至10ml，规格为2:1(g/ml)。

实施例5五层龙原生药胶囊的制备

取五层龙的干燥藤茎，按常规方法粉碎，过筛，筛取60-80目的五层龙细粉，细粉装入胶囊，灭菌，分装即成。

实施例6五层龙水提物片剂的制备

按照实施例1的方法制备五层龙水提物，取其中的400ml，加淀粉50g、糊精50g混合均匀后，加入2％的羟丙甲纤维素作为粘合剂进行制软材，制粒干燥，加入崩解剂4％的羧甲基淀粉钠和润滑剂0.5％硬脂酸镁，混合均匀，压片，即得1000片。每片含所述五层龙水提物0.4ml，折算成药材，每片含五层龙原生药材约0.8g，口服给药，每日3次，每次3片。

实施例7五层龙水提物口服液的制备

取本发明实施例3制备的五层龙水提物100ml，加入适量糖浆4g溶于100ml的纯净水中，均质，过滤，经过高温瞬时灭菌(135℃，4s)。无菌灌装、分装，制得口服液。

实施例8本发明提取物体内药效学实验

五层龙不同药用部位水提物、醇提物体内降糖效果比较，具体结果见表1。

表1SG水、醇提取物药后7天对四氧嘧啶诱发高血糖小鼠血糖的影响

注：与模型对照组比较，^***P<0.001，^**P<0.01，^*P<0.05；与空白对照组比较，^△△△P<0.001.

上述实验结果表明：模型对照组与空白对照组比较，小鼠血糖值明显升高，差异有显著性(P<0.001)；降糖灵组与模型对照组比较，小鼠血糖值明显降低，差异有显著性(P<0.001)，降糖率为64.19％，说明模型成功；SG根茎水提取物组、SG根茎醇提取物组、SG藤茎水提取物组、SG藤茎醇提取物组与模型对照组比较，小鼠血糖值明显降低，差异有显著性(P<0.001～P<0.01)，降糖率分别为51.27％、52.60％、41.79％、44.56％；SG枝叶水、醇提取物组与模型对照组比较，小鼠血糖值降低趋势，但均未出现统计学差异(P>0.05)，降糖率分别为24.14％、21.47％。虽然根茎降糖效果较藤茎降糖效果稍好，推测在防治2型糖尿病方面，根茎可能优于藤茎。但由于根茎的采挖破坏植被严重，藤茎资源相对丰富，且其采收不会破坏原植株的生长、繁殖，因此，优选藤茎作为药用部位使用。

实施例9五层龙水提物、醇提物对糖原磷酸化酶活性的体外抑制作用

由前面的实验结果可知，五层龙根茎和藤茎具有较好的降糖效果，叶无明显降糖效果。因此，本发明通过如下体外实验检测根茎和藤茎在抑制糖原磷酸化酶活性上的药理活性，进一步为确定五层龙药材药用部位提供依据。

本实验以96孔板为反应载体，最终反应体积为100μL。基本的操作方法为：预先往板孔里加入86μl的Hepes缓冲液(含有不同浓度的药物和糖原)，再加入10μl浓度为0.5mmol/l的底物(D-葡萄糖-1-磷酸二钠溶液)溶液和4μl的酶溶液(400ng)，充分混匀，30℃孵育30min。设立酶活性对照组(缓冲液+底物+酶液)、空白对照组(缓冲液+底物)、阳性药物组(缓冲液+阳性药+酶+底物)、阳性药对照组(缓冲液+阳性药+底物)、五层龙藤茎水提物组(缓冲液+不同浓度五层龙藤茎水提物+酶+底物)、五层龙藤茎醇提物组(缓冲液+不同浓度五层龙藤茎醇提物+酶+底物)、五层龙根茎水提物组(缓冲液+不同浓度五层龙根茎水提物+酶+底物)和五层龙根茎醇提物组(缓冲液+不同浓度五层龙根茎醇提物+酶+底物)，每个药物组分别设定无酶对照组，每组设3个复孔。

30℃孵育30min后，向反应孔中加入显色液，测定底物在OD_630nm处吸光值并计算抑制率。所述显色液是孔雀绿和钼酸铵溶液以体积比2:1进行配制，现用现配。其中，孔雀绿溶液按如下方法配制：准确称取0.7g的聚乙烯醇于80ml的去离子水中，加热至80℃，放冷，再称取0.077g的孔雀绿溶于冷却的聚乙烯醇中，定容至100ml，于4℃保存备用；钼酸铵溶液按如下方法配制：取5.6ml的浓硫酸加入20ml的去离子水中，玻璃棒搅匀，冷却后，称量2.58g的四水合钼酸铵溶于以上冷却的硫酸中，待完全溶解后加去离子水定容至50ml，于4℃保存备用。

糖原磷酸化酶酶活性单位定义：在30℃，pH6.8条件下1min内水解葡萄糖-1-磷酸释放1μmol磷酸根所需的酶量。

酶活性抑制率计算公式：抑制率(％)＝{[(a-b)-(c-d)]/(a-b)}×100％

a：为酶活性对照组吸光度；b：为空白对照组吸光度；

c：药物组吸光度；d：药物对照组吸光度。

具体实验结果如表2～表5所示。

表2五层龙藤茎醇提物对糖原磷酸化酶的抑制作用

由表2可见，阳性药物阿卡波糖对糖原磷酸化酶的抑制率为56.80％，五层龙藤茎醇提物抑制率随浓度的增加而增加，在25～100mg生药/mL浓度范围内线性关系良好，回归方程y＝0.3909x+39.705，r＝0.997。当y＝50时，x＝26.34，因此EC₅₀＝26.34mg生药/ml。

表3五层龙藤茎水提物对糖原磷酸化酶的抑制作用

由表3可见，五层龙藤茎水提物对糖原磷酸化酶的抑制率随浓度增加而增加，并在12.5～100mg生药/mL浓度范围内线性关系良好，回归方程y＝0.2966x+39.951，r＝0.957。当y＝50时，x＝33.88，因此EC₅₀＝33.88mg生药/ml。

表4五层龙根茎醇提物对糖原磷酸化酶的抑制作用

由表4可见，阳性药物阿卡波糖对糖原磷酸化酶的抑制率为62.57％。五层龙根茎醇提物对糖原磷酸化酶的抑制率随浓度增加而增加，并在12.5～50mg生药/mL浓度范围内线性关系良好，回归方程y＝0.838x+27.445，r＝0.986。当y＝50时，x＝26.92，因此EC₅₀＝26.92mg生药/ml。

表5五层龙根茎水提物对糖原磷酸化酶的抑制作用

由表5可见，五层龙根茎水提物对糖原磷酸化酶的抑制率随浓度增加而增加，并在6.25～25mg生药/mL浓度范围内线性关系良好，回归方程y＝1.2071x+24.65，r＝0.982。当y＝50时，x＝21，因此EC₅₀＝21mg生药/ml。

综上，由表2～5可见，五层龙藤茎醇提物、藤茎水提物、根茎醇提物、根茎水提物均对糖原磷酸化酶活性具有抑制作用；且在一定浓度范围内抑制作用与浓度成良好的线性相关。提示五层龙对与人类血清中糖原磷酸化酶水平有关的疾病可能具有预防和/或治疗作用，所述“与人类血清中糖原磷酸化酶水平有关的疾病”的例子包括但不限于2型糖尿病。

五层龙根茎水提物比五层龙藤茎水提物抑制糖原磷酸化酶活性稍强；五层龙根茎醇提物与五层龙藤茎醇提物在抑制糖原磷酸化酶活性方面效果相当。考虑到资源问题，仍然优选藤茎作为药用部位。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (4)

1.五层龙在制备糖原磷酸化酶抑制剂类产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述五层龙是指五层龙原生药材或五层龙制品，所述制品是指五层龙经干燥的药材，经切割或粉碎后的药材，经加工后得到的饮片，或经溶剂提取制成的提取物。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述五层龙为翅子藤科五层龙属五层龙Salaciaprinoids(Willd.)DC.的藤茎。

4.一种具有抑制糖原磷酸化酶活性的组合物，其特征在于，以五层龙作为药物活性成分，加入药学上可接受的辅料。