CN105816429A

CN105816429A - 叶酸受体靶向的降压肽组合物及其制备方法

Info

Publication number: CN105816429A
Application number: CN201610293728.7A
Authority: CN
Inventors: 杨剑; 宋相容; 孙海燕; 刘冬
Original assignee: Shenzhen Polytechnic
Current assignee: Shenzhen Polytechnic
Priority date: 2016-05-05
Filing date: 2016-05-05
Publication date: 2016-08-03
Anticipated expiration: 2036-05-05
Also published as: CN105816429B

Abstract

叶酸受体靶向的降压肽组合物及其制备方法，涉及降压肽。降压肽组合物的组成：降压肽VP5 0.5～10，叶酸修饰脂质0.1～5，磷脂1～30，胆固醇0.25～10，聚酯材料10～100。制备方法：1)制备装载VP5的聚酯纳米粒；2)将叶酸修饰脂质、磷脂和胆固醇，溶于有机溶剂，减压，旋转蒸发挥去有机溶剂，得薄膜，加入装载VP5的聚酯纳米粒，水化脱膜，超声后均质或挤出，制得降压肽组合物；或将叶酸修饰脂质、磷脂和胆固醇，溶于有机溶剂，减压，旋转蒸发挥去有机溶剂，制得均一的薄膜；再加入生理盐水溶液、葡萄糖溶液或磷酸盐缓冲溶液，水化脱膜后，加入装载VP5的聚酯纳米粒，超声后，均质或挤出，制得降压肽组合物。

Description

叶酸受体靶向的降压肽组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及降压肽，具体是涉及一种叶酸受体靶向的降压肽组合物及其制备方法。

背景技术

降压肽是一类能降低人体血压的小分子多肽的总称。它是血管紧张素转换酶的抑制剂，可通过抑制人体血管紧张素Ⅱ的生成而达到降低血压的目的，具有降压效果明显、对正常血压无影响等优点。本申请人(基因重组高效表达降血压肽对自发性高血压大鼠的急性降压效果.中华高血压杂志，2010，18(1).)构建了多条降压肽，经过大量筛选研究，最终优选出Val-Leu-Pro-Val-Pro(VLPVP，VP5)具有较好的降压效果，但其存在常规肽类药物存在的问题，如口服吸收差，吸收入血后降解快，导致降压效果呈现较为明显的“峰谷”波动，不利于高血压患者平稳降压。

高血压患者通常需要长期服药，因此，降压肽的理想制剂仍是口服制剂，才能满足患者顺应性的要求。肽类药物的分子量较大，不易透过生物膜，口服通常难以吸收或生物利用度极低，且在胃肠道或血液中极易被酶降解。胃酸的pH约1～2.5，用餐后有所提高，许多肽类药物在这种环境下的生物活性几乎绝大部分或全部丧失。胃肠道内酶的降解作用是导致肽类药物口服生物利用度较低的重要因素之一。肽类药物口服后，首先被胃液中的胃蛋白酶降解成短链肽。药物进人肠道后进一步被胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等降解。胃肠道粘膜的通透性极低，多肽类药物大多脂溶性较差，不利于通过生物膜。肽类药物口服吸收后，首先随血液循环至肝脏，因肝脏是最重要的药物代谢器官，多肽类药物在进入体循环之前，极易被肝脏大量酶类代谢降解。因此，目前肽类药物制剂研究的重点在于提高肽类和药物对生物膜的通透性和抵抗蛋白酶的降解作用。

本申请人(重组降血压肽乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球的制备与体外释放研究.中国药学杂志，2012，47(24))前期用聚酯材料乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(D，L-lactide-co-glycolide)，PLGA)制备了降压肽-PLGA缓释微球，体外释放实验表明，该微球在pH7.4的磷酸缓冲液中具有较好的缓释效果；口服给药后(重组降血压肽-聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物缓释微球对自发性高血压大鼠的降压作用.中国药学杂志，2012，47(16))，对自发性高血压大鼠呈现较为平稳的降压效果；然而，该制剂的口服生物利用度仍有待进一步提高。因此，本发明拟将VP5用聚酯纳米粒装载，可进一步增加小肠上皮细胞的摄取效率，增加VP5的生物利用度；吸收入血后，聚酯纳米粒也可缓慢释放VP5，达到缓释长效的目的。

文献(Elnakat,H.,Ratnam,M.Distribution:functionalityandgeneregulationoffolatereceptorisoforms:implicationsintargetedtherapy.Adv.DrugDeliv.Rev.56,1067–1084.2004.)报道，小肠上皮细胞有大量叶酸受体表达(一种糖基化的膜糖蛋白)。利用叶酸受体的配体分子或单克隆抗体修饰的聚酯纳米制剂装载VP5，有望通过细胞膜穴样内陷促进小肠上皮细胞的吸收，进一步增加VP5的口服生物利用度，提高降压治疗效果，有助于推动VP5的临床应用。

发明内容

本发明的目的在于提供可提高VP5的口服生物利用度和降压效果的一种叶酸受体靶向的降压肽组合物及其制备方法。

所述叶酸受体靶向的降压肽组合物按质量比的组成如下：

降压肽VP50.5～10，叶酸修饰脂质0.1～5，磷脂1～30，胆固醇0.25～10，聚酯材料10～100；

优选降压肽VP50.5～8，叶酸修饰脂质0.25～5，磷脂1～20，胆固醇0.25～5，聚酯材料20～80。

所述降压肽VP5为缬氨酸-亮氨酸-脯氨酸-缬氨酸-脯氨酸(Val-Leu-Pro-Val-Pro，VLPVP)。

所述叶酸修饰脂质是指叶酸修饰在所述磷脂或胆固醇分子上而得的靶向脂质。具体地，叶酸直接与磷脂或胆固醇分子的功能基团如氨基或羟基反应实现偶联，形成酰胺化物或酯化物；也可在两者之间引入间隔基团实现偶联，间隔基团包括但不限于以下分子中的至少一种：不同分子量的聚乙二醇(200～5000道尔顿)、氨基己酸等；也可直接购买商品化的叶酸修饰脂质，如F-PEG-Chol、F-PEG-DSPE等。所述叶酸修饰脂质可选自叶酸修饰磷脂或叶酸修饰胆固醇。

所述磷脂是指磷脂及其衍生物，所述磷脂可选自磷脂酰胆碱(PC)、大豆磷脂、卵磷脂、脑磷脂、鞘磷脂、二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)、sn-甘油1,2-二油酰-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(氯化物盐)(DOTAP)、1,2–二十八烷基-SN-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)等中的一种。

所述胆固醇是指胆固醇及其衍生物，所述胆固醇可选自胆固醇、[N-(N'，N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆甾醇盐酸盐(DC-胆固醇)等中的一种。

所述聚酯材料可选自PLGA、聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚乙二醇(PEG)与聚酯类的嵌段共聚物等中的至少一种；所述聚乙二醇(PEG)与聚酯类的嵌段共聚物可选自PEG-PCL、PEG-PLA、PEG-PLGA、PEG-PCL-PEG、PEG-PLA-PEG、PEG-PLGA-PEG、PCL-PEG-PCL、PLA-PEG-PLA、PLGA-PEG-PLGA等中的一种。

所述叶酸受体靶向的降压肽组合物的制备方法之一包括以下步骤：

1)制备装载VP5的聚酯纳米粒；

2)将叶酸修饰脂质、磷脂和胆固醇，溶于有机溶剂，减压，旋转蒸发挥去有机溶剂，制得均一的薄膜，加入步骤1)得到的装载VP5的聚酯纳米粒，水化脱膜，超声后，均质或挤出，制得叶酸受体靶向的降压肽组合物。

在步骤1)中，所述制备装载VP5的聚酯纳米粒可采用复乳法，具体方法如下：将聚酯材料溶于有机溶剂中，得混合液，在混合液中再加入VP5水溶液，超声，形成油包水初乳(W/O)；再加入3～20倍体积的表面活性剂溶液，超声，形成复乳(W/O/W)，在30～50℃下减压旋转蒸发挥去有机溶剂，即得装载VP5的聚酯纳米粒；所述混合液的质量浓度可为5～100mg/ml；所述有机溶剂可选自二氯甲烷，氯仿，乙酸乙酯，二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯和丙酮的混合液等中的一种；所述油包水初乳(W/O)中水相/有机溶剂为1∶(2～10)，油相/外水相体积比为1∶(3～20)；所述表面活性剂可选自聚乙烯醇(PVA)、泊洛沙姆188(F68)、维生素E1000聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)等中的一种。

在步骤2)中，所述有机溶剂可选自二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙醚等中的至少一种；所述减压的温度可为30～50℃；所述水化脱膜的温度可为40～60℃。

所述叶酸受体靶向的降压肽组合物的制备方法之二包括以下步骤：

1)制备装载VP5的聚酯纳米粒；

2)将叶酸修饰脂质、磷脂和胆固醇，溶于有机溶剂，减压，旋转蒸发挥去有机溶剂，制得均一的薄膜；再加入生理盐水溶液、葡萄糖溶液或磷酸盐缓冲溶液，水化脱膜后，加入步骤1)得到的装载VP5的聚酯纳米粒，超声后，均质或挤出，制得叶酸受体靶向的降压肽组合物。

在步骤2)中，所述有机溶剂可选自二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙醚等中的至少一种；所述减压的温度可为30～50℃；所述葡萄糖溶液的质量百分浓度可为5％；所述水化脱膜的温度可为40～60℃。

所述叶酸受体靶向的降压肽组合物可在制备降压用Val-Leu-Pro-Val-Pro制剂中应用。

所述叶酸受体靶向的降压肽组合物可在制备治疗降压药物中应用。

本发明构建一种叶酸受体靶向分子修饰的新型降压肽VP5组合物，可在制备降压用Val-Leu-Pro-Val-Pro制剂和降压药物中应用。利用小肠上皮细胞表面高表达的叶酸受体介导降压肽的高效摄取，提高降压肽摄取入血的量，提高生物利用度，降低给药剂量，达到较好的降压效果。

附图说明

图1为PLGA及其衍生物制得的叶酸修饰VP5聚酯纳米粒(实施例13～16)，呈现较为明显的缓释特性。

图2为PCL及其衍生物制得的叶酸修饰VP5聚酯纳米粒(实施例17～20)，呈现较为明显的缓释特性。

图3为PLA及其衍生物制得的叶酸修饰VP5聚酯纳米粒(实施例21～24)，呈现较为明显的缓释特性。

图4为VP5-PLGA-PEG-PLGA(实施例15)、VP5-PEG-PCL-PEG(实施例20)和VP5-PEG-PLA(实施例22)呈现明显的平稳持续降压作用。

具体实施方式

以下通过对本发明具体实施方式的描述说明但不限制本发明。

实施例1～6以α-羧基-ω-氨基聚乙二醇为间隔基制备叶酸修饰胆固醇

具体投料如表1所示。

表1

具体操作为：取α-羧基-ω-氨基聚乙二醇(氨基末端保护)0.5mmol，胆固醇0.75mmol，4-二甲氨基吡啶0.75mmol和1-乙基-3–(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺0.75mmol溶于100ml二氯甲烷中，反应约72～96h。减压旋蒸除去有机溶剂，真空干燥得氨基聚乙二醇胆固醇粗产品。称取叶酸1mmol、N-羟基琥珀酰亚胺2.5mmol、1-乙基-3–(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺2.5mmol和三乙胺10mmol溶于50ml无水DMSO中，加入约0.5mmol氨基聚乙二醇胆固醇粗产品，25～30℃反应约72～96h，反应液转入透析袋(MWCO＝3500Da)，分别以20％(v/v)DMSO和水为透析介质透析，透析7天后，转移透析样品至丝口瓶中，冻干，即得叶酸-聚乙二醇-胆固醇。叶酸反应、纯化及冻干全程避光，产物避光保存于干燥器中。

实施例7～12以双氨基聚乙二醇为间隔基制备叶酸修饰胆固醇

具体投料如表2所示。

表2

实施例	7	8	9	10	11	12
							双氨基聚乙二醇分子量(道尔顿)	400	1000	5000	1000	1500	2000
胆固醇	+	+	+	+	+	+

具体操作为：将胆固醇(10mmol)，丁二酸酐(50mmol)，DMAP(5mmol)溶于50mL二氯甲烷中，45℃剧烈回流，搅拌48h，得丁二酰化脂质(胆固醇或磷脂)。取丁二酰化脂质(4mmol)，1-乙基-3–(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(10mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(10mmol)溶于少量二氯甲烷中，滴加至100ml的双氨基聚乙二醇(5mmol)二氯甲烷溶液中，室温搅拌反应约72～96h。反应液用60～80目硅胶拌样，300～400目硅胶湿法装柱，干法上样。以二氯甲烷-甲醇体系为洗脱剂，比例从80∶1，60∶1，40∶1到20∶1(体积比)，收集含有目标产物的洗脱液，合并浓缩除去有机溶剂，得氨基聚乙二醇-胆固醇。将叶酸(0.42mmol)、NHS(0.5mmol)、EDCI(0.5mmol)和三乙胺(4mmol)溶于5ml无水二甲亚砜中，滴加氨基聚乙二醇-胆固醇(0.21mmol)的DMSO溶液。25～30℃反应约120～144h后，将反应液转入透析袋(MWCO＝1000Da)，分别以20％(v/v)DMSO和水为透析介质透析，透析14天后，转移透析样品至丝口瓶中，冻干，即得叶酸-聚乙二醇-胆固醇。叶酸反应、纯化及冻干全程避光，产物避光保存于干燥器中。

实施例13薄膜-纳米水化法制备叶酸修饰VP5-PLGA纳米粒

取PLGA10mg，1ml二氯甲烷中超声溶解，加入含有0.5mg的VP5的内水相200μl，探头超声处理1min。再加入0.5％PVA溶液4ml，探头超声处理3min。于37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得VP5-PLGA纳米胶体溶液。取实施例1的叶酸修饰胆固醇0.1mg、磷脂1mg、胆固醇0.25mg，1ml氯仿溶解，30℃旋转蒸发除去有机溶剂，得脂质薄膜，加入VP5-PLGA纳米胶体溶液，60℃旋转水化30min，超声，即得。包封率为54％，粒径为138nm。

实施例14薄膜法制备叶酸修饰VP5-PEG-PLGA纳米粒

取PEG-PLGA100mg，1ml氯仿和0.1ml丙酮混合溶液中超声溶解，加入含有10mg的VP5的内水相200μl，探头超声处理1min。再加入1％F68溶液10ml，探头超声处理3min。于37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得VP5-PEG-PLGA纳米胶体溶液。取实施例2的叶酸修饰胆固醇2mg、大豆磷脂30mg、胆固醇10mg，5ml氯仿溶解，50℃旋转蒸发除去有机溶剂，得脂质薄膜，加入5％葡萄糖溶液，50℃旋转水化45min，加入VP5-PEG-PLGA纳米胶体溶液，混匀，挤出器挤出3次，即得。包封率为68％，粒径为285nm。

实施例15薄膜法制备叶酸修饰VP5-PLGA-PEG-PLGA纳米粒

取PLGA-PEG-PLGA10mg，2ml乙酸乙酯溶液中超声溶解，加入含有0.5mg的VP5的内水相500μl，探头超声处理1min。再加入1％TPGS溶液8ml，探头超声处理3min。于37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得VP5-PLGA-PEG-PLGA纳米胶体溶液。取实施例3的叶酸修饰胆固醇0.25mg、磷脂10mg、胆固醇2mg，2ml乙醚溶解，40℃旋转蒸发除去有机溶剂，得脂质薄膜，加入生理盐水溶液，40℃旋转水化30min，加入VP5-PLGA-PEG-PLGA纳米胶体溶液，混匀，置高压均质机内匀化3次，即得。包封率为76％，粒径为108nm。

实施例16薄膜法制备叶酸修饰VP5-PEG-PLGA-PEG纳米粒

取PEG-PLGA-PEG80mg，2ml二氯甲烷溶液中超声溶解，加入含有8mg的VP5的内水相500μl，探头超声处理1min。再加入1％PVA溶液20ml，探头超声处理3min。于37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得VP5-PEG-PLGA-PEG纳米胶体溶液。取商品化的叶酸修饰磷脂F-PEG2000-DSPE5mg、磷脂20mg、胆固醇5mg，5ml氯仿-甲醇(4∶1，v/v)溶解，37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得脂质薄膜，加入5％葡萄糖溶液，60℃旋转水化30min，加入VP5-PEG-PLGA-PEG纳米胶体溶液，混匀，置高压均质机内匀化3次，即得。包封率为72％，粒径为125nm。

实施例17薄膜法制备叶酸修饰VP5-PCL纳米粒

取PCL50mg，1ml二氯甲烷溶液中超声溶解，加入含有2mg的VP5的内水相500μl，探头超声处理1min。再加入0.5％PVA溶液8ml，探头超声处理3min。于37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得VP5-PCL纳米胶体溶液。取实施例4的叶酸修饰胆固醇2mg、磷脂10mg、胆固醇1mg，10ml二氯甲烷溶解，45℃旋转蒸发除去有机溶剂，得脂质薄膜，加入磷酸盐缓冲溶液，50℃旋转水化30min，加入VP5-PCL纳米胶体溶液，混匀，置挤出器内挤出3次，即得。包封率为75％，粒径为114nm。

实施例18薄膜-纳米水化法制备叶酸修饰VP5-PEG-PCL纳米粒

取PEG-PCL20mg，1ml氯仿中超声溶解，加入含有1mg的VP5的内水相100μl，探头超声处理1min。再加入0.5％F68溶液20ml，探头超声处理3min。于37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得VP5-PEG-PCL纳米胶体溶液。取实施例8的叶酸修饰胆固醇1mg、磷脂10mg、胆固醇1mg，2ml乙酸乙酯溶解，50℃旋转蒸发除去有机溶剂，得脂质薄膜，加入VP5-PEG-PCL纳米胶体溶液，60℃旋转水化30min，置高压均质机内匀化3次，即得。包封率为79％，粒径为142nm。

实施例19薄膜法制备叶酸修饰VP5-PCL-PEG-PCL-纳米粒

取PCL-PEG-PCL60mg，1ml二氯甲烷溶液中超声溶解，加入含有8mg的VP5的内水相500μl，探头超声处理1min。再加入1％TPGS溶液20ml，探头超声处理3min。于37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得VP5-PCL-PEG-PCL纳米胶体溶液。取实施例12的叶酸修饰胆固醇3mg、磷脂20mg、胆固醇2mg，2ml氯仿-甲醇(1∶1，v/v)溶解，50℃旋转蒸发除去有机溶剂，得脂质薄膜，加入5％葡萄糖溶液，60℃旋转水化30min，加入VP5-PCL-PEG-PCL纳米胶体溶液，混匀，超声，即得。包封率为75％，粒径为156nm。

实施例20薄膜法制备叶酸修饰VP5-PEG-PCL-PEG纳米粒

取PEG-PCL-PEG50mg，1ml二氯甲烷溶液中超声溶解，加入含有1mg的VP5的内水相100μl，探头超声处理1min。再加入4％PVA溶液8ml，探头超声处理3min。于37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得VP5-PEG-PCL-PEG纳米胶体溶液。取实施例8的叶酸修饰胆固醇1mg、磷脂10mg、胆固醇3mg，1ml氯仿溶解，40℃旋转蒸发除去有机溶剂，得脂质薄膜，加入5％葡萄糖溶液，50℃旋转水化30min，加入VP5-PEG-PCL-PEG纳米胶体溶液，混匀，置高压均质机内匀化3次，即得。包封率为88％，粒径为138nm。

实施例21薄膜法制备叶酸修饰VP5-PLA纳米粒

取PLA20mg，1ml氯仿中超声溶解，加入含有2mg的VP5的内水相100μl，探头超声处理1min。再加入1％F68溶液4ml，探头超声处理3min。于45℃旋转蒸发除去有机溶剂，得VP5-PLA纳米胶体溶液。取商品化的叶酸修饰胆固醇F-PEG-Chol0.25mg、磷脂5mg、胆固醇1mg，1ml乙酸乙酯溶解，37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得脂质薄膜，加入5％葡萄糖溶液，40℃旋转水化45min，置高压均质机内匀化3次，即得。包封率为73％，粒径为103nm。

实施例22薄膜-纳米水化法制备叶酸修饰VP5-PEG-PLA纳米粒

取PEG-PLA40mg，2ml乙酸乙酯溶液中超声溶解，加入含有1mg的VP5的内水相10μl，探头超声处理1min。再加入2％PVA溶液20ml，探头超声处理3min。于40℃旋转蒸发除去有机溶剂，得VP5-PEG-PLA纳米胶体溶液。取实施例8的叶酸修饰胆固醇1mg、大豆磷脂10mg、胆固醇3mg，1ml氯仿溶解，37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得脂质薄膜，加入VP5-PEG-PLA纳米胶体溶液，60℃旋转水化30min，超声，即得。包封率为88％，粒径为129nm。

实施例23薄膜-纳米水化法制备叶酸修饰VP5-PLA-PEG-PLA纳米粒

取PLA-PEG-PLA80mg，1m二氯甲烷溶液中超声溶解，加入含有5mg的VP5的内水相100μl，探头超声处理1min。再加入4％PVA溶液20ml，探头超声处理3min。于50℃旋转蒸发除去有机溶剂，得VP5-PLA-PEG-PLA纳米胶体溶液。取实施例5的叶酸修饰胆固醇3mg、磷脂20mg、胆固醇2mg，5ml乙酸乙酯溶解，40℃旋转蒸发除去有机溶剂，得脂质薄膜，加入VP5-PLA-PEG-PLA纳米胶体溶液，50℃旋转水化30min，混匀，置挤出器内挤出3次，即得。包封率为80％，粒径为165nm。

实施例24薄膜-纳米水化法制备叶酸修饰VP5-PEG-PLA-PEG纳米粒

取PEG-PLA-PEG50mg，1ml氯仿和0.5ml丙酮溶液中超声溶解，加入含有3mg的VP5的内水相100μl，探头超声处理1min。再加入0.5％TPGS溶液5ml，探头超声处理3min。于37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得VP5-PEG-PLA-PEG纳米胶体溶液。取实施例9的叶酸修饰胆固醇2mg、磷脂150mg、胆固醇3mg，5ml氯仿-甲醇(4∶1，v/v)溶解，37℃旋转蒸发除去有机溶剂，得脂质薄膜，加入VP5-PEG-PLA-PEG纳米胶体溶液，60℃旋转水化30min，置高压均质机内匀化3次，即得。包封率为78％，粒径为146nm。

试验例1体外缓释特性研究

采用体外释放试验研究叶酸修饰VP5-聚酯纳米粒的缓释特性。参考2015版中国药典配制体外释放介质pH7.4的磷酸盐缓冲溶液，取10ml转入三角瓶内；将游离VP5、实施例13～实施例24制得的VP5-聚酯纳米粒各0.5ml，分别转入透析袋中，将透析袋两端扎紧，悬置于具塞锥形瓶中，37±1℃恒速振荡(70r/min)。按预设时间点(5min、15min、30min、1h、2h、6h、12h、24h)定时取样0.5ml，同时补加相同体积的释放介质。将样品注入高效液相色谱仪，测定峰面积，用外标一点法计算浓度，并计算各时间点的累积释放百分率。以VP5的累积释放百分率为纵坐标、释放时间为横坐标作图，结果见图1～3。可见游离VP5释放较快，2h内即全部从透析袋中释放出来，提示透析袋对VP5的释放没有明显的滞留效应。图1显示，PLGA及其衍生物制得的叶酸修饰VP5聚酯纳米粒，呈现较为明显的缓释特性；图2显示，PCL及其衍生物制得的叶酸修饰VP5聚酯纳米粒，也呈现较为明显的缓释特性；图3显示，PLA及其衍生物制得的叶酸修饰VP5聚酯纳米粒，与游离VP5比较呈现较为明显的缓释特性。

试验例2降压作用评价

取购自北京维通利华实验动物技术有限公司得自发性高血压大鼠，体重270g左右，雄性，15～16周龄；将其饲养于屏障系统动物房中，空气洁净度10000级，温度20±2℃，相对湿度40％～60％RH，光照周期：12(日)/12(夜)h，每笼饲养不超过3只。垫料经高温高压灭菌后，每3天换一次；饲料采用北京华阜康大鼠正常维持饲料；饮水用纯化水，经高温高压灭菌后自由饮用，每2天换一次。采用智能无创血压计(鼠仪BP-2010A,北京软隆生物技术有限公司)测定大鼠基础血压值(记为0h)，随机分组，每组12只；然后分别单次灌胃给药游离VP5，包封率较高的几组纳米粒，分别为：实施例15制得的叶酸修饰VP5-PLGA-PEG-PLGA纳米粒、实施例20制得的叶酸修饰VP5-PEG-PCL-PEG纳米粒、实施例22制得的叶酸修饰VP5-PEG-PLA纳米粒。分别于给药后2、4、8、12、24h监测血压，以血压值为纵坐标、监测时间为横坐标作图，结果见图2。可见，游离VP5降压迅速，在给药后2h即达到最大降压作用，但降压持续时间短，给药8h后血压基本回升到给药前状态；3组靶向纳米组，降压相对平稳，给药后，血压逐渐下降，在给药后4h，血压降低达到游离VP5水平，且血压持续维持在较低且比较平稳的状态，提示纳米粒可促进VP5的吸收，且吸收入血后，能缓慢释放VP5，发挥平稳持久的降压作用。

Claims

1.叶酸受体靶向的降压肽组合物，其特征在于按质量比的组成如下：

2.如权利要求1所述叶酸受体靶向的降压肽组合物，其特征在于所述叶酸修饰脂质是指叶酸修饰在所述磷脂或胆固醇分子上而得的靶向脂质；所述叶酸修饰脂质选自叶酸修饰磷脂或叶酸修饰胆固醇。

3.如权利要求1所述叶酸受体靶向的降压肽组合物，其特征在于所述磷脂是指磷脂及其衍生物，所述磷脂选自磷脂酰胆碱、大豆磷脂、卵磷脂、脑磷脂、鞘磷脂、二甲基双十八烷基溴化铵、sn-甘油1,2-二油酰-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(氯化物盐)、1,2–二十八烷基-SN-甘油-3-磷酸乙醇胺中的一种；

所述胆固醇是指胆固醇及其衍生物，所述胆固醇可选自胆固醇、[N-(N'，N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆甾醇盐酸盐(DC-胆固醇)中的一种；

所述聚酯材料可选自PLGA、聚己内酯、聚乳酸、聚乙二醇与聚酯类的嵌段共聚物中的至少一种；所述聚乙二醇与聚酯类的嵌段共聚物可选自PEG-PCL、PEG-PLA、PEG-PLGA、PEG-PCL-PEG、PEG-PLA-PEG、PEG-PLGA-PEG、PCL-PEG-PCL、PLA-PEG-PLA、PLGA-PEG-PLGA中的一种。

4.如权利要求1所述叶酸受体靶向的降压肽组合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)制备装载VP5的聚酯纳米粒；

5.如权利要求4所述叶酸受体靶向的降压肽组合物的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述制备装载VP5的聚酯纳米粒采用复乳法，具体方法如下：将聚酯材料溶于有机溶剂中，得混合液，在混合液中再加入VP5水溶液，超声，形成油包水初乳(W/O)；再加入3～20倍体积的表面活性剂溶液，超声，形成复乳(W/O/W)，在30～50℃下减压旋转蒸发挥去有机溶剂，即得装载VP5的聚酯纳米粒；所述混合液的质量浓度可为5～100mg/ml；所述有机溶剂可选自二氯甲烷，氯仿，乙酸乙酯，二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯和丙酮的混合液中的一种；所述油包水初乳(W/O)中水相/有机溶剂为1∶(2～10)，油相/外水相体积比为1∶(3～20)；所述表面活性剂可选自聚乙烯醇、泊洛沙姆188、维生素E1000聚乙二醇琥珀酸酯中的一种。

6.如权利要求4所述叶酸受体靶向的降压肽组合物的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙醚中的至少一种；所述减压的温度可为30～50℃；所述水化脱膜的温度可为40～60℃。

7.如权利要求1所述叶酸受体靶向的降压肽组合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)制备装载VP5的聚酯纳米粒；

8.如权利要求7所述叶酸受体靶向的降压肽组合物的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述制备装载VP5的聚酯纳米粒采用复乳法，具体方法如下：将聚酯材料溶于有机溶剂中，得混合液，在混合液中再加入VP5水溶液，超声，形成油包水初乳(W/O)；再加入3～20倍体积的表面活性剂溶液，超声，形成复乳(W/O/W)，在30～50℃下减压旋转蒸发挥去有机溶剂，即得装载VP5的聚酯纳米粒；所述混合液的质量浓度可为5～100mg/ml；所述有机溶剂可选自二氯甲烷，氯仿，乙酸乙酯，二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯和丙酮的混合液中的一种；所述油包水初乳(W/O)中水相/有机溶剂为1∶(2～10)，油相/外水相体积比为1∶(3～20)；所述表面活性剂可选自聚乙烯醇、泊洛沙姆188、维生素E1000聚乙二醇琥珀酸酯中的一种。

9.如权利要求7所述叶酸受体靶向的降压肽组合物的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙醚中的至少一种；所述减压的温度可为30～50℃；所述葡萄糖溶液的质量百分浓度可为5％；所述水化脱膜的温度可为40～60℃。

10.如权利要求1所述叶酸受体靶向的降压肽组合物在制备降压用Val-Leu-Pro-Val-Pro制剂中应用；所述叶酸受体靶向的降压肽组合物在制备治疗降压药物中应用。