CN105803106A - 一种用于评估皮肤锁水情况的引物和探针及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于评估皮肤锁水情况的引物和探针及试剂盒。所述引物和探针的序列如SEQ ID NO:1‑4，和SEQ ID NO:5‑8；其中SEQ ID NO:3‑4和7‑8的5’端和3’端分别连接不同荧光标记。还公开了利用基因检测辅助客户选择正确美容方法的方法。了解皮肤干燥的内因和外因，为其提供个性化美容健康解决方案，使锁水美容产品效果最大化。

Description

一种用于评估皮肤锁水情况的引物和探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及美容领域，尤其涉及一种用于评估皮肤锁水情况的引物和探针及试剂盒。

背景技术

SNP(单核苷酸多态性)是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，是一种最常见的遗传标记，在人群中的携带频率大于1％，广泛应用于人类疾病诊断、药物个体化使用、生物学基础研究等领域。随着对不同SNP位点研究的深入，通过多个SNP位点的组合检测以及后续的数据分析，可以针对不同人群的基因信息制定个性化健康解决方案。

人体的皮肤外观受到内因和外因的影响，外因包括紫外线、环境污染、不当美容产品使用等，内因则体现在与皮肤相关的生化变化，包括蛋白活性、荷尔蒙水平等，这些变化大多是由遗传基因决定的。现阶段的皮肤保养方法多是根据外因采取的，如使用防晒霜、保湿剂等，然而这些无针对性的保养方法大多效果甚微，治标不治本。随着生活水平的提高，对于提高皮肤光滑和紧固度的需求越来越大，结合内外因进行针对性美容护肤将比传统方法更具优势，因此准确了解内因显得至关重要。

皮肤自我保湿受到多个基因影响，每个基因又存在多个SNP位点，这些位点会影响相关基因的酶活性。通过相关基因的SNP位点检测可以评测不同个体的皮肤锁水能力，还可以评估相关皮肤保湿产品是否适用于检测者，使产品效果达到最大化，在此基础上结合日常生活习惯调整，使皮肤保湿效果进一步提升。对于这种检测方法，选取准确的位点组合以及后续数据分析尤为重要。国内外已有专利报道利用SNP位点基因型判断美容产品适用皮肤类型，但仍存在着易感SNP位点选取不准确、检测结果未能量化综合分析问题。当前未见结合基因SNP位点组合检测和量化算法评估皮肤锁水能力的报道。

中国实用新型专利201320009798.7公开了一种基因芯片，利用该基因芯片检测美白和老化相关基因SNP位点，美白基因的SNP位点包括SLC45A2(re35391)、KITLG(rs642742)、ASIP(rs1015362)、TYR(rs1042602)、OCA2(rs1800414)、DCT(rs2031526)、MC1R(rs885479)，老化基因的SNP包括MMP1(rs1799750)、TIMP1(rs4898)、SIRT6(rs107251)、SOD2(rs4880)、NQO1(rs1800566)、TNFA(rs1800629)、EPHX(rs1051740)，但该专利采用的基因芯片方法较繁琐，难以适用大量检测。中国发明专利申请201180056031.3筛选到了一组与皮肤老化相关的基因(LPL、ADIPOQ、PLN等)，并根据该组基因筛选到一种抗老化新材料，该专利中未提及基因相关SNP位点。中国专利申请201080044917.1提供了一种利用天然反义多核苷酸或化合物调控FLG基因表达，从而达到预防或治疗与FLG相关的疾病。

美国专利US200812286033通过单萜类物质诱导相关基因表达以达到改善皱纹的效果。美国专利US200912512368通过含有异戊烯异黄酮的化妆品诱导ELN和COL3A1基因的表达，达到了改善皮肤外观的效果。美国专利US201514618080和US201313932565通过在皮肤锁水位置使用朝鲜蓟提取物和橄榄油提取物，使包括ELN和COL3A1在内的相关基因受到调控上调表达，从而达到改善锁水皮肤的功效。

以上专利/专利申请均利用外来物质调控体内基因的表达，但每个个体的基因中却存在差异SNP位点，这种方法难以达到个性化保养或治疗。英国专利GB20110021917检测了与美容产品成分生物学途径相关的靶基因SNP位点，进而判断该产品是否适用于使用者，该专利涉及的SNP位点有MMP-1(rs1799750)、NQO1(rs1800566)、GSTP1(rs1695)、hGPX1(rs10504)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于评估皮肤锁水情况的引物和探针。

为实现上述目的，本发明提供一种用于评估皮肤锁水情况的引物和探针，其特征在于，所述序列如SEQIDNO:1-4，和SEQIDNO:5-8；其中SEQIDNO:3-4和7-8的5’端和3’端分别连接不同荧光标记。

本发明还提供一种用于评估皮肤锁水情况的试剂盒，其特征在于，含有所述的引物和探针。

本发明还提供一种利用基因检测辅助客户选择正确美容方法的方法，其特征在于，使用所述的引物和探针，或使用所述的试剂盒。

进一步，步骤为：

1)使用所述的引物和探针或所述的试剂盒对客户进行SNP位点检测；

2)根据易感SNP位点组合计算出客户的皮肤锁水能力值；所述易感SNP位点组合为HAS1rs11084109、HAS1rs11084111；

3)结合1)的SNP位点检测结果及2)的皮肤锁水能力值，进行结果判断。

进一步，所述步骤1)为，

提取客户的DNA样本；

采用所述引物和探针或所述试剂盒进行PCR扩增；优选的，PCR扩增的反应程序为50℃2min，95℃10min，95℃15s、60℃1min循环40次。

进一步，所述步骤2)为，

根据已知易感SNP位点组合的各个位点基因型的致病风险比值比计算出皮肤干燥个体综合风险比值比OR(C)，计算方程式为：

通过已知中国人群不同年龄段皮肤干燥平均风险比值odds(D)，计算出检测个体的皮肤干燥风险值比值odds(X)，计算式为odds(X)＝OR(C)×odds(D)；

计算出综合风险值：

根据已知正常基因型人群风险值F(N)，计算出个体皮肤锁水能力值。

进一步，所述步骤3)的结果判断为，

1)若个体皮肤锁水能力值低于100％，则表示该个体的皮肤锁水能力低于该年龄段人群的正常值，锁水能力差，属于不易锁水的体质；值越低，锁水能力越差；

2)若个体皮肤锁水能力值等于100％，则表示该个体的皮肤锁水能力与该年龄段人群的正常值一样，锁水能力一般；

3)若个体皮肤锁水能力值高于100％，则表示该个体的皮肤锁水能力高于该年龄段人群的正常值，锁水能力较好，属于易锁水的体质；值越高，锁水能力越好；

同时；

若基因HAS1的SNP位点rs11084109为C/T，表明携带杂合突变，透明质酸合成酶活性下降，皮肤保水能力较差；若为T/T，表明携带纯合突变，透明质酸合成酶活性下降，皮肤保水能力较差；若为C/C，则为正常基因型；

若基因HAS1的SNP位点rs11084111为A/G，表明携带杂合突变，透明质酸合成酶活性下降，会导致皮肤保留水分子的能力下降，造成皮肤干燥；若为A/A，表明携带纯合突变，透明质酸合成酶活性下降，会导致皮肤保留水分子的能力下降，造成皮肤干燥；若为G/G，则为正常基因型。

本发明(1)筛选出一组可经过多篇文献验证，且分子机制清晰，可用于全面准确评估皮肤锁水能力的SNP位点组合；(2)采用特异性强、灵敏度高的TaqMan-MGB探针检测方法进行检测，可同时检测多个样本；(3)通过算法精确量化皮肤干燥风险以评估皮肤锁水能力，为检测者提供个性化的皮肤保湿方案。

本发明采用的技术方案为：结合分子机制研究、文献检索和临床数据筛选，得到一组皮肤锁水相关的易感SNP位点组合，所述组合位点为HAS1(rs11084109、rs11084111)，所述组合的位点信息见表1，该组合位点可以准确评估不同个体的皮肤锁水能力。

表1易感SNP位点信息表

SNP_ID	基因
		rs11084109	HAS1
rs11084111	HAS1

为了检测所述位点，根据引物和荧光探针最优原则设计检测所需的引物和探针，所述引物及荧光探针如下(下划线为SNP位点)：

HAS1(rs11084109)引物及荧光探针序列：

正向引物CCAGCCCCAATCGTCATCCATSEQIDNO:1；

反向引物ATCCTGCATCAGCGGTCCTCSEQIDNO:2；

荧光探针FAM-CCATATCCTTTTTCCAACC–MGBSEQIDNO:3；

荧光探针VIC-CCATATCTTTTTTCCAACC–MGBSEQIDNO:4；

HAS1(rs11084111)引物及荧光探针序列：

正向引物CCGCTCCACATTGAAGGCTASEQIDNO:5；

反向引物ATGCCTTCCTCTCAAGCATCSEQIDNO:6；

荧光探针FAM-ATCCGCACATCCCCACCAAC-MGBSEQIDNO:7；

荧光探针VIC-ATCCGCACGTCCCCACCAAC–MGBSEQIDNO:8；

所述位点检测方法具体步骤如下：

1、人体唾液样本采集。采用无创唾液自动流出采集方式，在唾液采集前30min需用饮用水清理口腔中杂物，采集2mL唾液存放于唾液保存液以供检测。

2、人体全基因组DNA提取。采用碘化钾法，参考具体步骤为：取0.1mL唾液于1.5mL离心管中，加入500μL0.01mol/LPBS溶液反复吹打，10000rpm离心5min；去上清，沉淀加入50μL5mol/LKI溶液，震荡混匀，再加入100μL0.9％NaCl溶液、150μL酚/氯仿(25∶24，V/V)混合液，震荡30s，10000rpm离心5min；取200μL上清，加入200μL异丙醇，混匀，10000rpm离心5min；去上清，沉淀加入1mL无水乙醇洗涤，10000rpm离心5min；弃无水乙醇，沉淀在超净台中吹干，加50μLTE缓冲液溶解，-20℃保存备用。

3、PCR反应体系及反应程序。10μL反应体系含UniversalPCRMasterMix(AppliedBiosystems，美国应用生物技术有限公司)5μL、DNA模板1μL、荧光探针(每个SNP位点的检测对应探针混合在一起)(2.5μM)和引物混合液(每个SNP位点的检测对应引物混合在一起)1.5μL、ddH₂O2.5μL。反应程序为50℃2min，95℃10min，95℃15s、60℃1min循环40次。检测仪器为StepOnePlus实时荧光定量PCR仪(AppliedBiosystems，美国应用生物技术有限公司)。

4、实验结果分析。采用StepOnePlus^TMSoftwarev2.3(AppliedBiosystems，美国应用生物技术有限公司)进行分析，根据不同的荧光信号，得出对应SNP位点的基因型。

皮肤锁水能力量化方法如下：

1、皮肤干燥个体综合风险比值比计算。已知检测所得的各个位点基因型的风险比值比为分别为OR₁、OR₂…OR_m(文献查询得知，结果见表3)，可以计算出皮肤干燥个体综合风险比值比OR(C)，计算方程式如下：

$OR\left(C\right)={\Π}_{k=1}^n{\mathrm{OR}}_m.$

2、通过步骤1计算出的皮肤干燥个体风险比值比OR(C)，通过文献或其它统计途径可以获得中国人群不同年龄段皮肤干燥平均风险比值odds(D)(已知中国人群不同年龄段皮肤干燥平均风险比值odds(D)分别为：20-35岁：0.05，36-45岁：0.21，46-55岁：0.43)，通过比值比计算公式可以计算出检测个体的皮肤干燥风险值比值odds(X)，计算方程式如下：

$OR\left(C\right)=\frac{odds\left(X\right)}{odds\left(D\right)}.$

3、通过步骤2计算出的个体皮肤干燥风险比值odds(X)，即可以通过风险值推算公式可以计算出综合风险值F(X)，计算方程式如下：

$F\left(X\right)=\frac{odds\left(X\right)}{odds\left(X\right)+1}.$

4、通过步骤3计算得到的综合风险值可以评估不同个体的皮肤锁水能力，已知正常基因型人群风险值F(N)(已知正常基因型人群风险值F(N)分别为：20-35岁：4.76％，36-45岁：17.35％，46-55岁：30.07％)，可以计算出个体皮肤锁水能力值V，计算方程式如下：

$V=\frac{F\left(N\right)}{F\left(X\right)}\×100\%.$

检测结果个性化分析及解决方案：

根据锁水能力量化计算结果，结合相关位点的功能及分子机制，判断皮肤问题的可能性，评估检测者可以使用含有何种成分的美容产品，并为其调整有利于护肤的日常生活饮食习惯。相关基因的分子机制如下：如果HAS1携带突变，则透明质酸合成受到影响，皮肤保湿功能下降，容易干燥。

有益效果：

可以充分了解皮肤干燥的内因和外因，为用户提供个性化美容健康解决方案，使皮肤保湿产品使用效果最大化。此外，还可以为检测者调整有利于护肤的日常生活饮食习惯。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：引物和探针设计

1、设计并合成以下引物和探针，合成单位：AppliedBiosystems，美国应用生物技术有限公司。

HAS1(rs11084109)引物及荧光探针序列：

正向引物CCAGCCCCAATCGTCATCCATSEQIDNO:1；

反向引物ATCCTGCATCAGCGGTCCTCSEQIDNO:2；

荧光探针FAM-CCATATCCTTTTTCCAACC–MGBSEQIDNO:3；

荧光探针VIC-CCATATCTTTTTTCCAACC–MGBSEQIDNO:4；

HAS1(rs11084111)引物及荧光探针序列：

正向引物CCGCTCCACATTGAAGGCTASEQIDNO:5；

反向引物ATGCCTTCCTCTCAAGCATCSEQIDNO:6；

荧光探针FAM-ATCCGCACATCCCCACCAAC-MGBSEQIDNO:7；

荧光探针VIC-ATCCGCACGTCCCCACCAAC–MGBSEQIDNO:8；

2、SNP位点检测

1)、样本采集。本实施例中的检测样本采用人体唾液，在唾液采集前30min需用饮用水清理口腔中杂物，采集2mL唾液存放于唾液保存液以供检测。

2)、人体全基因组DNA提取。采用碘化钾法，参考具体步骤为：取0.1mL唾液于1.5mL离心管中，加入500μL0.01mol/LPBS溶液反复吹打，10000rpm离心5min；去上清，沉淀加入50μL5mol/LKI溶液，震荡混匀，再加入100μL0.9％NaCl溶液、150μL酚/氯仿(25∶24，V/V)混合液，震荡30s，10000rpm离心5min；取200μL上清，加入200μL异丙醇，混匀，10000rpm离心5min；去上清，沉淀加入1mL无水乙醇洗涤，10000rpm离心5min；弃无水乙醇，沉淀在超净台中吹干，加50μLTE缓冲液溶解，-20℃保存备用。

3)、反应体系及反应程序10μL反应体系含UniversalPCRMasterMix(AppliedBiosystems，美国应用生物技术有限公司)5μL、DNA模板1μL、荧光探针(每个SNP位点的检测对应探针混合在一起)(2.5μM)和引物混合液(每个SNP位点的检测对应引物混合在一起)1.5μL、ddH₂O2.5μL。反应程序为50℃2min，95℃10min，95℃15s、60℃1min循环40次。检测仪器为StepOnePlus实时荧光定量PCR仪(AppliedBiosystems，美国应用生物技术有限公司)。

4)、检测程序运行结束后，采用StepOnePlus^TMSoftwarev2.3(AppliedBiosystems，美国应用生物技术有限公司)对检测结果进行分析，得出对应SNP的基因型(见表2)。

表2SNP位点检测结果表

检测基因	SNP_ID	基因型
			HAS1	rs11084109	C/T
HAS1	rs11084111	G/G

3、锁水能力量化评估及个性化解决方案

1)、皮肤干燥综合风险值计算。通过文献查询得知，不同位点的比值比如表3所示。

表3相关位点基因型的风险比值比(OR)表

(1)皮肤干燥个体综合风险比值比计算。不同位点的OR值如表3所示，则

(2)通过步骤(1)计算出皮肤干燥个体综合风险比值比OR(C)，综合文献和调查数据得知中国人群20-35年龄段皮肤干燥的比值odds(D)约为0.05(本实施例的检测样本属于该年龄段，故选择该年龄段的数据)，通过比值比计算公式可以计算出检测个体的皮肤干燥风险值比值odds(X)＝OR(C)×odds(D)＝1.2×0.05＝0.06。

(3)通过步骤(2)计算出的检测个体风险比值odds(X)，综合风险值

(4)已知正常基因型人群风险值F(N)为4.76％，可以计算出皮肤锁水能力值

2)、检测结果综合分析。通过现有报道数据分析，该个体皮肤锁水能力值为84.1％，遗传的皮肤锁水能力较差。同时结合相关基因的分子机制，由表2可知该检测个体中的HAS1携带易感位点杂合突变，透明质酸合成酶1活性下降，皮肤锁水能力受到影响，综合考虑该检测者锁水能力较差。

3)、个性化解决方案：HAS1基因的突变使得该个体锁水能力较一般人差，为了抵消遗传基因带了的不利影响，应选用含透明质酸成分的化妆品，卸妆应彻底，减少皮肤毛孔堵塞。保证足够的饮水量，补充体内和皮肤的水份流失；多摄入碱性食物如蔬菜、瓜果、豆制品等，可以使皮肤细腻光滑；紫外线会造成皮肤的老化、变黑、干燥，因此秋冬季节也应当注意防晒。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (7)

1.一种用于评估皮肤锁水情况的引物和探针，其特征在于，所述序列如SEQIDNO:1-4，和SEQIDNO:5-8；其中SEQIDNO:3-4和7-8的5’端和3’端分别连接不同荧光标记。

2.一种用于评估皮肤锁水情况的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物和探针。

3.一种利用基因检测辅助客户选择正确美容方法的方法，其特征在于，使用权利要求1的引物和探针，或使用权利要求2的试剂盒。

4.权利要求3所述利用基因检测辅助客户选择正确美容方法的方法，其特征在于，步骤为：

1)使用权利要求1的引物和探针或权利要求2的试剂盒对客户进行SNP位点检测；

2)根据易感SNP位点组合计算出客户的皮肤锁水能力值；所述易感SNP位点组合为HAS1rs11084109、HAS1rs11084111；

3)结合1)的SNP位点检测结果及2)的皮肤锁水能力值，进行结果判断。

5.权利要求4所述利用基因检测辅助客户选择正确美容方法的方法，其特征在于，所述步骤1)为，

提取客户的DNA样本；

采用权利要求1所述引物和探针或权利要求2所述试剂盒进行PCR扩增；优选的，PCR扩增的反应程序为50℃2min，95℃10min，95℃15s、60℃1min循环40次。

6.权利要求4所述利用基因检测辅助客户选择正确美容方法的方法，其特征在于，所述步骤2)为，

根据已知易感SNP位点组合的各个位点基因型的致病风险比值比计算出皮肤干燥个体综合风险比值比OR(C)，计算方程式为：

通过已知中国人群不同年龄段皮肤干燥平均风险比值odds(D)，计算出检测个体的皮肤干燥风险值比值odds(X)，计算式为odds(X)＝OR(C)×odds(D)；

计算出综合风险值：

根据已知正常基因型人群风险值F(N)，计算出个体皮肤锁水能力值：

$V=\frac{F\left(N\right)}{F\left(X\right)}\×100\%.$

7.权利要求4所述利用基因检测辅助客户选择正确美容方法的方法，其特征在于，所述步骤3)的结果判断为，

1)若个体皮肤锁水能力值低于100％，则表示该个体的皮肤锁水能力低于该年龄段人群的正常值，锁水能力差，属于不易锁水的体质；值越低，锁水能力越差；

2)若个体皮肤锁水能力值等于100％，则表示该个体的皮肤锁水能力与该年龄段人群的正常值一样，锁水能力一般；

3)若个体皮肤锁水能力值高于100％，则表示该个体的皮肤锁水能力高于该年龄段人群的正常值，锁水能力较好，属于易锁水的体质；值越高，锁水能力越好；

同时；

若基因HAS1的SNP位点rs11084109为C/T，表明携带杂合突变，透明质酸合成酶活性下降，皮肤保水能力较差；若为T/T，表明携带纯合突变，透明质酸合成酶活性下降，皮肤保水能力较差；若为C/C，则为正常基因型；

若基因HAS1的SNP位点rs11084111为A/G，表明携带杂合突变，透明质酸合成酶活性下降，会导致皮肤保留水分子的能力下降，造成皮肤干燥；若为A/A，表明携带纯合突变，透明质酸合成酶活性下降，会导致皮肤保留水分子的能力下降，造成皮肤干燥；若为G/G，则为正常基因型。