CN105793440A - 用于编码多个pcr反应进行测定识别的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了使用荧光染料鉴定用于执行PCR测定的试剂和溶液的方法和组合物。

Description

用于编码多个PCR反应进行测定识别的方法

技术领域

本发明涉及通过聚合酶链式反应(PCR)测定进行核酸扩增的领域。具体地，本发明涉及荧光染料用于鉴定试剂的用途，所述试剂用于执行PCR测定。

背景技术

PCR是一种用于扩增DNA或RNA的有力技术，所述DNA或RNA可以用于多种目的。PCR的众多应用包括它的用于诊断病毒或细菌基因以及鉴定基因突变的应用。目前，PCR测定可以以实时同质形式执行，例如TaqMan?测定，并使用可以同时试验多达四种核酸序列的仪器。在一种典型的TaqMan?测定中，通过使用淬灭的荧光探针来检测靶核酸（所述荧光探针在PCR扩增过程中切割，从而导致荧光信号的增加）。但是，为了控制在PCR过程中可能发生的变异性以及控制给定PCR测定的灵敏度的优化，经常使用执行PCR所需的不同的酶、金属辅因子和组分的浓度。在实践中，在按照测定的基础上将这些组分中的许多预混合成单一溶液，其被称作主混合物。因为此，使用相同荧光团、但是使用不同组分的测定可能并行地执行(例如在多孔板上的邻近孔中)且未经预先鉴定，所述反应将是不能辨别的，这意味着，阳性荧光信号可能误解为错误靶核酸的阳性结果。

目前，不存在克服以下困难的方法：确保在给定靶核酸的PCR测定中使用正确的主混合物。该问题在临床实验室场合中是特别关键的，以确保没有发生用户错误。尽管这些错误的发生率较低，它们的发生可能被导致非常重要的要减弱的假阳性或假阴性结果的产生。

发明概述

本发明解决了以下需要：在PCR测定所用的试剂和主混合物溶液的适当制备中建立确定性，并在从这样的PCR测定产生的数据中产生较高可靠性。在一个方面，本发明提供了一种用于制备多种反应混合物的方法，所述多种反应混合物用于执行多种靶核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增，所述方法包括提供第一主混合物溶液，所述溶液包含至少一种执行第一靶核酸的PCR扩增所需的物质，且进一步包含以所述第一主混合物溶液独有的预定浓度比存在的第一荧光染料和第二荧光染料；提供第二主混合物溶液，所述溶液包含至少一种执行第二靶核酸的PCR扩增所需的物质，且进一步包含以预定浓度比存在的所述第一荧光染料和所述第二荧光染料，所述预定浓度比不同于所述第一主混合物溶液中的预定浓度比且是所述第二主混合物溶液所独有的；将所述第一主混合物溶液加入第一反应混合物以执行所述第一靶核酸的PCR扩增；和将所述第二主混合物溶液加入第二反应混合物以执行所述第二靶核酸的PCR扩增。

在另一个方面，本发明提供了一种用于编码靶核酸的PCR扩增所用的主混合物溶液的身份的方法，所述方法包括在主混合物溶液中将以预定浓度比存在的第一荧光染料和第二荧光染料混合在一起，所述预定浓度比产生所述第一荧光染料相对于所述第二荧光染料的荧光比，所述荧光比可与从其它主混合物溶液产生的荧光比区分开；检测来自所述第一荧光染料和来自所述第二荧光染料的荧光；和确定所述荧光比，由此鉴定所述主混合物溶液。

在还另一个方面，本发明提供了一种用于执行多种靶核酸的PCR扩增的试剂盒，所述试剂盒包含多种主混合物溶液，其中来自所述多种主混合物溶液的每一种主混合物溶液包含至少一种执行特定靶核酸的PCR扩增所需的物质，且进一步包含第一荧光染料和第二荧光染料；且其中对于所述每一种主混合物溶液，所述第一荧光染料和所述第二荧光染料以不同的浓度比存在并产生与来自所述多种主混合物溶液的每种其它主混合物溶液可辨别的荧光比。

附图说明

图1描绘了在实施例1中进行的实验的图，该图显示了就JA270/Cy5.5而言浓度比和荧光比之间的关联。左图描绘了右图在0-1.66之间的浓度比处的放大图。

发明详述

定义

本文中使用的术语“样品”包括包含核酸的样本或培养物(例如，微生物培养物)。术语“样品”还意图包括生物样品和环境样品。样品可以包括合成起源的样本。生物样品包括全血、血清、血浆、脐带血、绒毛膜绒毛、羊水、脑脊液、脊髓液、洗出液(例如，支气管肺泡的、胃的、腹膜的、管的、耳的、关节镜的洗出液)、活组织检查样品、尿、粪便、痰、唾液、鼻粘液、前列腺液、精液、淋巴液、胆汁、泪液、汗液、乳汁、乳房流体、胚胎细胞和胎儿细胞。在一个优选的实施方案中，所述生物样品是血液，并且更优选地是血浆。本文中使用的术语“血液”包括全血或任何血液级分，诸如如常规地定义的血清和血浆。血浆表示由用抗凝剂处理过的血液的离心产生的全血级分。血清表示血液样品已经凝固后剩下的流体的水样部分。环境样品包括环境材料诸如表面物质、土壤、水和工业样品，以及得自食物和乳制品加工仪器、仪器、设备、器皿、一次用弃的和非一次用弃的物品的样品。

本文中使用的术语“靶标”或“靶核酸”意图指要检测或测量其存在、或者要研究其功能、相互作用或特性的任何分子。因此，靶标包括用于它的可检测探针(例如，寡核苷酸探针)或测定存在或可以由本领域技术人员生产的基本上任意的分子。例如，靶标可以是生物分子，诸如核酸分子、多肽、脂质或碳水化合物，其能够与可检测探针(例如抗体)结合或以其它方式发生接触，其中所述可检测探针还包含能够通过本发明的方法检测的核酸。本文中使用的“可检测探针”表示能够与目标靶生物分子杂交或对合且允许如本文中所述的靶生物分子的特异性检测的任何分子或试剂。在本发明的一个方面，所述靶标是核酸，且所述可检测探针是寡核苷酸。术语“核酸”和“核酸分子”可以贯穿本公开内容互换使用。所述术语表示寡核苷酸、寡物、多核苷酸、脱氧核糖核苷酸(DNA)、基因组DNA、线粒体DNA(mtDNA)、互补DNA(cDNA)、细菌DNA、病毒DNA、病毒RNA、RNA、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、siRNA、催化性RNA、克隆、质粒、M13、P1、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、扩增的核酸、扩增子、PCR产物及其它类型的扩增的核酸、RNA/DNA杂交体和聚酰胺核酸(PNA)，所有这些可以呈单链或双链形式，并且除非另有限制，否则将包括天然核苷酸的已知类似物，其可以以与天然存在的核苷酸类似的方式起作用，及其组合和/或混合物。因而，术语“核苷酸”表示天然存在的和经修饰的/非天然存在的核苷酸，包括三、二和单磷酸核苷，以及在聚核酸或寡核苷酸内存在的单磷酸单体。核苷酸还可以是核糖核苷酸、2'-脱氧核苷酸、2',3'-脱氧核苷酸以及本领域众所周知的广泛多样的其它核苷酸模仿物。模仿物包括链终止核苷酸，诸如3'-O-甲基、卤代碱基或糖取代；替代性的糖结构，包括非糖、烷基环结构；替代性的碱基，包括肌苷；脱氮修饰的；接头修饰的χ和ψ；质量标记修饰的；磷酸二酯修饰或替换，包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硼代磷酸酯、酰胺、酯、醚；和碱基或完全核苷酸间替换，包括切割键诸如光可切割的硝基苯基部分。

可以定量地或定性地测量靶标的存在或不存在。靶标可以以多种不同形式出现，包括例如简单或复杂混合物，或基本上纯化的形式。例如，靶标可以是含有其它组分的样品的组成部分，或可以是样品的唯一或主要组分。因此，靶标可以是全细胞或组织的组分、细胞或组织提取物、其分级分离的裂解物或基本上纯化的分子。另外，靶标可以具有已知的或未知的序列或结构。

术语“扩增反应”表示用于增加靶核酸序列的拷贝的任何体外方式。

“扩增”表示使溶液处于足以允许扩增的条件的步骤。扩增反应的组分可以包括、但不限于例如引物、多核苷酸模板、核酸聚合酶、核苷酸、dNTP等。术语“扩增”通常表示靶核酸的“指数”增加。但是，本文中使用的“扩增”还可以表示选定的靶核酸序列的数目的线性增加，但是不同于一次性的、单引物延伸步骤。

“聚合酶链式反应”或“PCR”表示用于以等比数列扩增靶双链DNA的特定区段或子序列的方法。PCR是本领域技术人员众所周知的；参见，例如，美国专利号4,683,195和4,683,202；和PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,Innis等人编,1990。

本文中使用的“寡核苷酸”表示通过磷酸二酯键或其类似物连接的天然或经修饰的核苷单体的线性寡聚体。寡核苷酸包括能够特异性地结合靶核酸的脱氧核糖核苷、核糖核苷、其端基异构形式、肽核酸(PNA)等。通常，单体通过磷酸二酯键或其类似物连接以形成寡核苷酸，所述寡核苷酸的大小范围从几个单体单元(例如3-4个)至几十个单体单元(例如40-60个)。每当寡核苷酸通过字母的序列诸如“ATGCCTG”表示时，应该理解，核苷酸从左到右是5'-3'次序，并且除非另外指出，否则“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示脱氧胸苷，并且“U”表示核糖核苷尿苷。通常，寡核苷酸包含四种天然脱氧核苷酸；但是，它们还可以包含核糖核苷或非天然核苷酸类似物。当酶由于活性具有特定寡核苷酸或多核苷酸底物要求时，例如单链DNA、RNA/DNA双链体等，则关于寡核苷酸或多核苷酸底物的适当组成的选择完全是在普通技术人员的知识内。

本文中使用的“寡核苷酸引物”或简称“引物”表示这样的多核苷酸序列：其与靶核酸模板上的序列杂交并且促进寡核苷酸探针的检测。在本发明的扩增实施方案中，寡核苷酸引物充当核酸合成的起始点。在非扩增实施方案中，寡核苷酸引物可以用于建立能够被切割试剂切割的结构。引物可以具有多种长度，并且通常是小于50个核苷酸的长度，例如12-25个核苷酸的长度。可以基于本领域技术人员已知的原则来设计用于PCR中的引物的长度和序列。

本文中使用的术语“寡核苷酸探针”表示这样的多核苷酸序列：其能够与目标靶核酸杂交或对合并且允许所述靶核酸的特异性检测。

术语“试剂溶液”是含有至少一种试剂的任何溶液，所述试剂是PCR目的所需的或用于PCR目的。最通常的成分是聚合酶、核苷酸、引物、离子、镁、盐、pH缓冲剂、脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)、探针、荧光染料(可以附着至探针)、核酸结合剂、核酸模板。所述试剂还可以是其它聚合酶反应添加剂，其对聚合酶反应或它的监测具有影响。

术语“主混合物”表示PCR发生所需的所有或大部分成分或因子的混合物，且在某些情况下，表示除了样品和扩增子特异性的模板和引物以外的全部。商购可得的主混合物经常是浓缩的溶液。主混合物可以含有多种样品共有的所有试剂，但是它也可以仅为一种样品构建。使用主混合物有助于减小由吸量的体积之间的差异引起的样品之间的吸量错误和变动。

“核酸聚合酶”表示催化核苷酸向核酸内的掺入的酶。示例性的核酸聚合酶包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、末端转移酶、逆转录酶、端粒末端转移酶等。

“热稳定的DNA聚合酶”表示这样的DNA聚合酶：当遭受高温选定的时间段时，其为稳定的(即抵抗分解或变性)且保持足够的催化活性。例如，当遭受高温使双链核酸变性所需的时间时，热稳定的DNA聚合酶保留实现后续引物延伸反应的足够活性。核酸变性所需的加热条件是本领域众所周知的，并且在美国专利号4,683,202和4,683,195中举例说明。本文中使用的热稳定的聚合酶通常适用于温度循环反应诸如聚合酶链式反应(“PCR”)中。热稳定的核酸聚合酶的例子包括水生栖热菌TaqDNA聚合酶、栖热菌属(Thermus)种Z05聚合酶、黄栖热菌(Thermusflavus)聚合酶、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)聚合酶诸如TMA-25和TMA-30聚合酶、TthDNA聚合酶等。

“经修饰的”聚合酶表示其中至少一个单体不同于参照序列的聚合酶，所述参照序列是例如所述聚合酶的天然或野生型形式或所述聚合酶的另一种修饰形式。示例性修饰包括单体插入、缺失和置换。经修饰的聚合酶还包括嵌合聚合酶，其具有衍生自两个或更多个亲本的可鉴定的组分序列(例如，结构或功能结构域等)。在经修饰的聚合酶的定义内还包括包含参照序列的化学修饰的那些。经修饰的聚合酶的例子包括G46EE678GCS5DNA聚合酶、G46EL329AE678GCS5DNA聚合酶、G46EL329AD640GS671FCS5DNA聚合酶、G46EL329AD640GS671FE678GCS5DNA聚合酶、G46EE678GCS6DNA聚合酶、Z05DNA聚合酶、ΔZ05聚合酶、ΔZ05-Gold聚合酶、ΔZ05R聚合酶、E615GTaqDNA聚合酶、E678GTMA-25聚合酶、E678GTMA-30聚合酶等。

术语“5'至3'核酸酶活性”或“5'-3'核酸酶活性”表示通常与核酸链合成相关的核酸聚合酶的活性，由此核苷酸从核酸链的5'末端除去。例如，大肠杆菌DNA聚合酶I具有该活性，而克列诺片段没有。一些具有5'至3'核酸酶活性的酶是5'至3'外切核酸酶。这样的5'至3'外切核酸酶的例子包括：得自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的外切核酸酶，得自脾的磷酸二酯酶，λ外切核酸酶，得自酵母的外切核酸酶II，得自酵母的外切核酸酶V，和得自粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)的外切核酸酶。

利用5'至3'核酸酶活性的靶核酸的检测可以通过如以下文献所述的“TaqMan?”或“5′-核酸酶测定”来执行：美国专利号5,210,015、5,487,972和5,804,375；和Holland等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7276-7280。在TaqMan?测定中，在扩增区内杂交的标记的检测探针在扩增反应期间存在。探针如此进行修饰，以阻止探针充当DNA合成的引物。所述扩增使用具有5'至3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶执行。在扩增的每个合成步骤期间，与来自待延伸引物下游的靶核酸杂交的任何探针通过DNA聚合酶的5'至3′外切核酸酶活性降解。因而，新靶链的合成也导致探针的降解，并且降解产物的积累会提供靶序列合成的量度。

适合用于检测降解产物的任何方法均可用在5'核酸酶测定中。通常，检测探针用两种荧光染料进行标记，其中之一能够淬灭另一种染料的荧光。所述染料附着至探针，通常报道或检测染料附着至5'末端，且淬灭染料附着至内部位点，使得当探针处于非杂交状态时，淬灭发生，并且使得通过DNA聚合酶的5'至3'外切核酸酶活性实现的探针切割发生在两种染料之间。扩增导致染料之间的探针切割，伴随淬灭的消除和来自最初淬灭的染料的可观察的荧光的增加。通过测量反应荧光的增加，监测降解产物的积累。美国专利号5,491,063和5,571,673描述了用于检测与扩增伴随发生的探针降解的替代方法。

荧光染料可以包括带负电荷的染料，诸如荧光素家族的染料，或电荷中性的染料，诸如罗丹明家族的染料，或带正电荷的染料，诸如花青家族的染料。荧光素家族的染料包括，例如，6-羧基-荧光素(FAM)、2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素(HEX)、TET、JOE、NAN和ZOE。罗丹明家族的染料包括，例如，德克萨斯红、ROX、R110、R6G和TAMRA或罗丹明衍生物JA270(参见，美国专利号6,184,379)。FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G和TAMRA可商购得自，例如，Perkin-Elmer,Inc.(Wellesley,MA,USA)，且德克萨斯红可商购得自，例如，MolecularProbes,Inc.(Eugene,OR)。花青家族的染料包括，例如，Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5和Cy7，且可商购得自，例如，AmershamBiosciencesCorp.(Piscataway,NJ,USA)。

用于检测靶核酸的5'核酸酶测定可以采用具有5'至3′外切核酸酶活性的任何聚合酶。因此，在某些实施方案中，具有5'核酸酶活性的聚合酶是热稳定和热活性的核酸聚合酶。这样的热稳定的聚合酶包括、但不限于来自真细菌属栖热菌属、热袍菌属(Thermatoga)和栖热腔菌属(Thermosipho)的多个种的天然和重组形式的聚合酶以及其嵌合形式。例如，可以用于本发明的方法中的栖热菌属种聚合酶包括水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)(Tth)DNA聚合酶、栖热菌属种Z05(Z05)DNA聚合酶、栖热菌属种sps17(sps17)和栖热菌属种Z05(例如在美国专利号5,405,774、5,352,600、5,079,352、4,889,818、5,466,591、5,618,711、5,674,738和5,795,762中所述)。可以用于本发明的方法中的热袍菌属聚合酶包括例如海栖热袍菌DNA聚合酶和新阿波罗栖热袍菌(Thermatoganeapolitana)DNA聚合酶，而可以使用的栖热腔菌属聚合酶的一个例子是非洲栖热腔菌(Thermosiphoafricanus)DNA聚合酶。海栖热袍菌和非洲栖热腔菌DNA聚合酶的序列公开于国际专利公开号WO92/06200中。新阿波罗栖热袍菌的序列可以在国际专利公开号WO97/09451中找到。

在5'核酸酶测定中，扩增检测通常与扩增同时发生(即，“实时”)。在某些实施方案中，扩增检测是定量的，并且扩增检测是实时的。在某些实施方案中，扩增检测是定性的(例如，靶核酸的存在或不存在的终点检测)。在某些实施方案中，扩增检测在扩增之后。在某些实施方案中，扩增检测是定性的，并且扩增检测在扩增之后。

本发明提供了在内部编码PCR测定中所用的每种反应混合物的机会，以建立在适当反应物制备中的确定性以及在得到的数据中的较高可靠性，例如，是更可靠的。本发明的方法利用基于荧光的方案，其允许通过可以检测荧光信号的仪器使预混合的主混合物鉴定自动化。

本发明利用两种以不同浓度比存在的不同的未淬灭的荧光染料，所述不同浓度比又产生两种染料的独特荧光比。这些染料必须独特地不同于PCR探针所用的荧光染料，因为所述探针甚至在有淬灭剂分子存在下发射低荧光。重点放在荧光比而不是原始荧光的应用，因为即使发生错误诸如少吸或多吸预先制备的主混合物，所述比率也不会变化。这样的错误会造成原始荧光值的变化，但是荧光比保持恒定。因而，用于执行特定靶核酸的PCR扩增的主混合物可以用第一荧光染料和第二荧光染料的预定比率来命名，例如，所述比率是在0-5之间，或一个单位的第一染料:四个单位的第二染料。所述荧光用可以检测荧光信号的PCR仪器（例如LightCycler?仪器(RocheDiagnostics)）读出，并产生两种染料各自的大约1:4的比率的荧光值。这允许PCR仪器鉴定为其使用特定主混合物的靶标特异性的测定。可以使用第一染料和第二染料之间的宽浓度比跨度，注意使得任何给定主混合物的浓度比不会过于类似于其它主混合物的浓度比。通过使用本发明的方法，PCR仪器诸如LightCycler?480仪器(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN)可以确定和报告靶标特异性的测定，从而将自动化的有用信息提供给临床实验室用于确认和质量控制目的。

在利用的第一染料和第二染料之间的浓度比中包括0量的第一染料、0量的第二染料、和/或0量的第一染料和第二染料。LightCycler?仪器会通过原始荧光丰度远远低于所述染料的检测限度来识别0量的染料。使用的染料的最低浓度应当仍然显著高于检测限度，以便使背景噪音最小化并确保即使在少吸的情况下，主混合物仍然被LightCycler?仪器准确地鉴定。

提供以下实施例和附图以帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求书中阐述。

实施例

JA270和Cy5.5的应用

执行一个实验以确定两种荧光染料JA270和Cy5.5的不同浓度比是否可以产生允许PCR分析和检测仪器(例如得自RocheDiagnostics的LightCycler?仪器)或荧光读数器区分和鉴定所述不同浓度比的荧光比。使用了JA270和Cy5.5的12种不同浓度比，量的范围是在100μl水中从0pmol至20pmol。在表1中显示了试验的不同浓度比。

表1

JA270 (pmol)	0	20	20	20	20	20	20	16	12	8	4	0
													Cy5.5 (pmol)	0	0	4	8	12	16	20	20	20	20	20	20

在96-孔微孔滴定板中制备三个重复以检查精确度和再现性。使用610nm的激发波长和650nm的发射波长（对于JA270）以及670nm的激发波长和710nm的发射波长（对于Cy5.5），在BMGPolarStar仪器中测量荧光。该实验的结果显示在图1上，其中右图在x-轴上显示了在0-5之间的JA270/Cy5.5浓度比，且左图显示了在0-1.6之间的JA270/Cy5.5浓度比的放大视图。为了基于这些数据确定最大可能的预见到的变异性，将得自每组重复的最大JA270荧光值与每个对应组的重复的最小Cy5.5荧光值进行对比。还进行了将最小JA270荧光值与最大Cy5.5值的对比。数据表明，在任何最大值或最小值之间没有重叠，这意味着试验的每个浓度比可与其它浓度比区分开（如通过荧光比所鉴定的），由此验证了该方法用于鉴定不同溶液（诸如PCR主混合物）的用途。

Claims (12)

1.一种用于制备多种反应混合物的方法，所述多种反应混合物用于执行多种靶核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增，所述方法包括：

提供第一主混合物溶液，其包含至少一种执行第一靶核酸的PCR扩增所需的物质，且进一步包含第一荧光染料和第二荧光染料，其中所述第一染料和所述第二染料以所述第一试剂溶液独有的预定浓度比存在；

提供第二主混合物溶液，其包含至少一种执行第二靶核酸的PCR扩增所需的物质，且进一步包含所述第一荧光染料和所述第二荧光染料，其中所述第一染料和所述第二染料以预定浓度比存在，所述预定浓度比不同于所述第一主混合物溶液的浓度比且是所述第二主混合物溶液所独有的；

将所述第一主混合物溶液加入第一反应混合物以执行所述第一靶核酸的PCR扩增；和

将所述第二主混合物溶液加入第二反应混合物以执行所述第二靶核酸的PCR扩增。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述第一主混合物溶液或所述第二主混合物溶液中，所述预定浓度比具有0量的第一荧光染料。

3.根据权利要求1所述的方法，其中在所述第一主混合物溶液或所述第二主混合物溶液中，所述预定浓度比具有0量的第二荧光染料。

4.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中在所述第一主混合物溶液或所述第二主混合物溶液中，所述预定浓度比是在0-5之间。

5.根据权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中所述第一荧光染料是JA270，且所述第二荧光染料是Cy5.5。

6.一种用于编码执行靶核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增所用的主混合物溶液的身份的方法，所述方法包括：

在主混合物溶液中将以预定浓度比存在的第一荧光染料和第二荧光染料混合在一起，所述预定浓度比产生所述第一荧光染料相对于所述第二荧光染料的荧光比，所述荧光比可与从其它主混合物溶液产生的荧光比区分开；

检测来自所述第一荧光染料和来自所述第二荧光染料的荧光；和

确定所述荧光比，由此鉴定所述主混合物溶液。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述主混合物溶液具有0量的第一荧光染料。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述主混合物溶液具有0量的第二荧光染料。

9.根据权利要求6-8中的任一项所述的方法，其中所述预定浓度比是在0-5之间。

10.根据权利要求6-9中的任一项所述的方法，其中所述第一荧光染料是JA270，且所述第二荧光染料是Cy5.5。

11.一种用于执行多种靶核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增的试剂盒，所述试剂盒包含多种主混合物溶液，其中来自所述多种主混合物溶液的每一种主混合物溶液包含至少一种执行特定靶核酸的PCR扩增所需的物质，且进一步包含第一荧光染料和第二荧光染料；且其中对于所述每一种主混合物溶液，所述第一荧光染料和所述第二荧光染料以不同的浓度比存在并产生与来自所述多种主混合物溶液的每种其它主混合物溶液可辨别的荧光比。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述第一荧光染料是JA270，且所述第二荧光染料是Cy5.5。