CN105793278A - 肽基甘氨肽α酰胺化单氧加氧酶(PAM)用于C端酰胺化的用途 - Google Patents

肽基甘氨肽α酰胺化单氧加氧酶(PAM)用于C端酰胺化的用途 Download PDF

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Abstract

本文公开的一个方面是，用于对多肽进行体内C端酰胺化的方法，其特征在于，(待酰胺化)多肽和人肽基甘氨肽α?酰胺化单氧加氧酶(PAM)在哺乳动物细胞中重组共表达。

Description

肽基甘氨肽α酰胺化单氧加氧酶(PAM) 用于C端酰胺化的用途
本发明是重组多肽生产领域。本文公开体内使用肽基甘氨肽α酰胺化单氧加氧酶(PAM)获得C端酰胺化多肽的方法。
背景技术
近年来多肽生产稳步增加，蛋白质有可能在不久的将来成为可用于各种疾病治疗的最大一组治疗剂。蛋白质的影响来自其特异性，例如特异的靶识别和结合功能。
细胞培养物用于发酵工艺中生产物质，尤其是蛋白质。可以区分以下两种不同的工艺，其一工艺中细胞培养物是未遗传修饰的并生成其自身的代谢产物，而在另一工艺中生物体被遗传修饰以产生更大量的其自身物质例如蛋白质、或产生其在未有所述修饰时不产生的物质例如外源(异源)物质。
一半以上的生物反应性神经肽和肽激素在其C端是酰胺化的。该合成通常发生在内分泌细胞、神经元细胞或其它特殊分化的分泌细胞中。酰胺化肽的生物合成前体是C端甘氨酸延伸的中间体。甘氨酸延伸中间体通常从更大的前体通过在加工位点(一般由一个或多个碱性氨基酸组成)的最初内切蛋白水解切割而产生。之后，C端碱性残基被特定的羧肽酶除去(综述参见例如Bradbury,A.F.和Smyth,D.G.,TIBS16(1991)112-115)。
(α-)酰胺化活性包括两个不同的酶促活性——由肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶(PAM)介导的羟化酶步骤和裂合酶步骤。
Wulf,B.S.,等(Mol.Cell.Endocrin.91(1993)135-141)报道，非内分泌细胞对C-肽缺失的NPY前体的有效酰胺化受到C端Lys-Arg存在的影响。Tateishi,K.等(Biochem.Biophys.Res.Com.205(1994)282-290)报道了人胰腺肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶的分离和功能性表达。Takahashi,K.-Y.等(Peptides 18(1996)439-444)报道了生物活性鲑鱼降钙素自COS-7和CHO细胞的生产。Liu,Z.,等(Mol.Biotechnol.24(2003)21-26)报道了蝎毒素Bmk ITa1cDNA在昆虫细胞中的克隆、与酰胺化酶的共表达、和活性。Manabu Satani等(Protein Express Purif.28(2003)293-302)描述了人双功能肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶的表达和表征。Nozer M.Metha等(Post-translational modification of proteinpharmaceuticals(2009)253-276)报道了C端α-酰胺化。
发明概述
已经发现，使用一定比例的(待酰胺化的)多肽编码核酸与PAM编码核酸，可以有利地实现生产的多肽的C端酰胺化与产量的有益比例。
此外，还发现，使用膜结合形式的PAM(PAM2)或缺失跨膜域的可溶形式PAM(PAM3)，就酰胺化和产量而言，没有不同。
本文公开的一个方面是，用于对多肽进行体内C端酰胺化的方法，其特征在于，(待酰胺化)多肽和人肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶(PAM)两者在哺乳动物细胞中重组共表达(以重组方式共表达)。
本文公开的一个方面是，重组生产C端酰胺化多肽的方法，其特征在于，多肽和人肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶(PAM)两者在哺乳动物细胞中重组共表达(以重组方式共表达)。
在所有方面的一个优选实施方案中，人肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶(PAM)是PAM3(SEQ ID NO:02)。
在所有方面的一个实施方案中，哺乳动物细胞用第一载体和第二载体共转染，第一载体包含含有编码(待酰胺化)多肽的核酸的表达盒，第二载体包含含有编码PAM的核酸的表达盒。
在所有方面的一个实施方案中，第一载体与第二载体的比例为大约90:10至大约40:60。在所有方面的一个实施方案中，第一载体与第二载体的比例为大约70:30至大约60:40。在所有方面的一个优选实施方案中，第一载体与第二载体的比例为大约70:30至大约60:40，且人肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶(PAM)是PAM3(SEQ ID NO:02)。
在所有方面的一个实施方案中，哺乳动物细胞包含编码多肽的第一核酸和编码PAM的第二核酸。
在所有方面的一个实施方案中，第一核酸与第二核酸的比例为大约90:10至大约40:60。在所有方面的一个实施方案中，第一核酸与第二核酸的比例为大约70:30至大约60:40。在所有方面的一个优选实施方案中，第一核酸与第二核酸的比例为大约70:30至大约60:40，且人肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶(PAM)是PAM3(SEQ ID NO:02)。
在所有方面的一个实施方案中，包含编码多肽的核酸的第一哺乳动物细胞和包含编码PAM的核酸的第二哺乳动物细胞用于共表达。
在所有方面的一个实施方案中，第一哺乳动物细胞与第二哺乳动物细胞的比例为大约90:10至大约40:60。在所有方面的一个实施方案中，第一哺乳动物细胞与第二哺乳动物细胞的比例为大约70:30至大约60:40。
在所有方面的一个实施方案中，多肽与抗体重链或其Fc区的C端融合。
在所有方面的一个实施方案中，多肽是神经激肽(Neurokinin),抑咽侧体神经肽(Allatostatin),Lem-KI,TRH,红色素凝集激素(Red PigmentConcentrating Hormone),降钙素(Calcitonin),CRF,LHRH,白细胞焦激肽(Leucopyrokinin),胃泌素(Gastrin)I,色素分散激素(PigmentDispersing Hormone),皮啡肽(Dermorphin),催产素(Oxytocin),P物质(Substance P),NPY,苯丙氨酰甲硫氨酰精氨酰苯丙氨酰胺(FMRFamide),铃蟾肽(Bombesin),支链淀粉(Amylin),[Arg8]血管加压素(Vasopressin),BId-GrTH,降钙素(Calcitonin),Cam-HrTH-II,胃泌素释放肽(GastrinReleasing Peptide),神经介肽B(Neuromedin B),胰抑制素(Pancreastatin),食鱼螺毒素(Conotoxin)M1,促胰液素(Secretin),GHRF,蜂毒肽(Melittin),麻蝇毒素(Sarcotoxin)1A,VIP,α-MSH或MIF-1。在所有方面的一个实施方案中，多肽是SEQ ID NO:05的肽YY(PYY 3-36)。
本文公开的一个方面是，人肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶(PAM)用于重组生产C端酰胺化多肽的用途，其特征在于，(待酰胺化)多肽和人PAM两者在哺乳动物细胞中以重组方式共表达。
序列简述
SEQ ID NO:01 人PAM2的氨基酸序列
SEQ ID NO:02 人PAM3的氨基酸序列
SEQ ID NO:03 人IgG1Fc部分的氨基酸序列
SEQ ID NO:04 G4Sx3接头的氨基酸序列
SEQ ID NO:05 肽YY(PYY)3-36的氨基酸序列
SEQ ID NO:06 肽YY(PYY)3-36加上C端甘氨酸(G)的氨基酸序列
SEQ ID NO:07 肽YY(PYY)3-36加上C端甘氨酸(G)和赖氨酸(K)的氨基酸序列
SEQ ID NO:08 肽YY(PYY)3-36加上C端甘氨酸(G)和赖氨酸(K)和精氨酸(R)的氨基酸序列
SEQ ID NO:09 人IgG1Fc部分和G4Sx3接头和肽YY(PYY)3-36的融合蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO:10 人IgG1Fc部分和G4Sx3接头和肽YY(PYY)3-36加上C端甘氨酸(G)的融合蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO:11 人IgG1Fc部分和G4Sx3接头和肽YY(PYY)3-36加上C端甘氨酸(G)和赖氨酸(K)的融合蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO:12 人IgG1Fc部分和G4Sx3接头和肽YY(PYY)3-36加上C端甘氨酸(G)和赖氨酸(K)和精氨酸(R)的融合蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO:13 人IgG1重链的氨基酸序列
SEQ ID NO:14 人IgG1重链和G4Sx3接头和肽YY(PYY)3-36的融合蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO:15 人IgG1重链和G4Sx3接头和肽YY(PYY)3-36加上C端甘氨酸(G)的融合蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO:16 人IgG1重链和G4Sx3接头和肽YY(PYY)3-36加上C端甘氨酸(G)和赖氨酸(K)的融合蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO:17 人IgG1重链和G4Sx3接头和肽YY(PYY)3-36加上C端甘氨酸(G)和赖氨酸(K)和精氨酸(R)的融合蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO:18 人κ轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO:19 G4Sx5接头的氨基酸序列
SEQ ID NO:20 人κ轻链和G4Sx5接头和肽YY(PYY)3-36的融合蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO:21 人κ轻链和G4Sx5接头和肽YY(PYY)3-36加上C端甘氨酸(G)的融合蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO:22 人κ轻链和G4Sx5接头和肽YY(PYY)3-36加上C端甘氨酸(G)和赖氨酸(K)的融合蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO:23 人κ轻链和G4Sx5接头和肽YY(PYY)3-36加上C端甘氨酸(G)和赖氨酸(K)和精氨酸(R)的融合蛋白的氨基酸序列
附图说明
图1：C端酰胺化产品的产量
在其C端带有PYY+Gly肽的IgG-Fc分子与各种比例的PAM3表达质粒一起重组表达(见表3)。通过质谱分析表达产物的C端Gly残基加工效率，并通过蛋白A层析确定表达产量。从这两个参数，使用以下公式计算了C端酰胺化产品的产量：酰胺化产品的产量＝总产量x C端酰胺化百分数/100。结果来自2个独立实验。*30％PAM3值是2次实验的平均值。
发明详述
本文公开，在体内使用肽基甘氨肽α酰胺化单氧加氧酶(PAM)获得重组表达的C端酰胺化多肽的方法。
已经发现，与不使用重组人PAM的工艺相比，使用一定比例的(待酰胺化)多肽编码核酸与PAM编码核酸，可以有益于提高体内重组生产的多肽的C端酰胺化产量。
此外，发现，可以使用可溶的，即，缺失跨膜域的PAM(PAM 3)，替代膜结合PAM(PAM2；主要的天然存在形式)。
术语“大约”是指，其后尾随的值不是一个确切值，而是一个范围的中心点，所述范围是该值+/-10％、或该值+/-5％、或该值+/-2％、或该值+/-1％的范围。如果值是以百分数给出的相对值，则术语“大约”也指，其后尾随的值不是一个确切值，而是一个范围的中心点，所述范围是该值+/-10％、或该值+/-5％、或该值+/-2％、或该值+/-1％的范围，其中所述范围的上限不能超过值的100％。
术语“生物活性多肽”在本文中用于指有机分子，例如生物大分子，例如肽、蛋白、糖蛋白、核蛋白、粘蛋白、脂蛋白、合成的多肽或蛋白，当施用于或施用给人工生物系统(例如使用细胞系和病毒的生物试验)、或体内施用给动物(包括但不限于鸟类或哺乳动物，包括人)时，所述生物活性多肽产生生物学效应。该生物效应可以是，但不限于，酶抑制或激活，结合受体或配体，在结合位点或周围，信号触发或信号调节。生物活性分子不限于例如，免疫球蛋白、或激素、或细胞因子、或生长因子、或受体配体、或激动剂或拮抗剂、或细胞毒素、或抗病毒剂、或成像剂、或酶抑制剂、酶激活剂、或酶活性调节剂例如变构物。
本文公开的一个方面是，用于对多肽进行体内C端酰胺化的方法，其特征在于，待酰胺化的多肽和人肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶(PAM)两者在哺乳动物细胞中重组共表达(以重组方式共表达)。
许多多肽的生物学活性要求C端酰胺化。此类多肽的一些例子是神经激肽(Neurokinin),抑咽侧体神经肽(Allatostatin),Lem-KI,TRH,红色素凝集激素(Red Pigment Concentrating Hormone),降钙素(Calcitonin),CRF,LHRH,白细胞焦激肽(Leucopyrokinin),胃泌素(Gastrin)I,色素分散激素(Pigment Dispersing Hormone),皮啡肽(Dermorphin),催产素(Oxytocin),P物质(Substance P),NPY,苯丙氨酰甲硫氨酰精氨酰苯丙氨酰胺(FMRFamide),铃蟾肽(Bombesin),支链淀粉(Amylin),[Arg8]血管加压素(Vasopressin),BId-GrTH,降钙素(Calcitonin),Cam-HrTH-II,胃泌素释放肽(Gastrin Releasing Peptide),神经介肽B(Neuromedin B),胰抑制素(Pancreastatin),食鱼螺毒素(Conotoxin)M1,促胰液素(Secretin),GHRF,蜂毒肽(Melittin),麻蝇毒素(Sarcotoxin)1A,VIP,α-MSH或MIF-1。在生物体中，C端酰胺化通过存在于特化的细胞，通常内分泌细胞中的特化机制进行。该机制在通常用于重组生产多肽的哺乳动物细胞中无效，或甚至不存在。
因此，对于将内源C端酰胺化的多肽，当在哺乳动物细胞中重组生产时，根本无法以C端酰胺化的形式获得，或不能以充足量获得该多肽。
为了解决该问题，通常，在重组生产和至少部分纯化后，“在体外”对多肽进行C端酰胺化。在该体外方法中，待酰胺化的多肽：i)在多肽本身已经在不同工艺中产生后在C端被化学或酶学修饰，和ii)暴露于非天然的(苛刻的)条件。
与之相反，在本文公开的方法中，重组产生的多肽已经“在体内”，即，在多肽表达期间或表达后不久于细胞中或培养介质中，被C端酰胺化。在本发明中，这意味着，在生产多肽的相同宿主细胞中、或在已产生多肽的培养物中，不经事前纯化和加入其他酶，实现C端酰胺化。因此，可以在连续/恒定工艺中进行生产，而无需在酰胺化之前对待酰胺化的多肽进行中间体分离(或纯化)，即，多肽在相同/单一步骤中获得表达和酰胺化。这可以通过以重组方式共表达编码目的多肽的核酸和编码酶的核酸来实现，其中所述酶能够在目的多肽中引入C端酰胺化。
可以在多肽中引入C端酰胺化的一个示例性酶是肽基甘氨肽α酰胺化单氧加氧酶(PAM)。
术语“人肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶”或“人PAM”是指，包含具有下列催化活性的两个酶活性结构域的多肽：肽基甘氨肽α-羟化单氧加氧酶(PHM)和肽基α-羟基甘氨肽α-酰胺化裂合酶(PAL)。该酶包含两个具有催化活性的酶活性结构域。这些催化结构域相继工作，将神经内分泌肽转化成活性α-酰胺化产品。
已经描述过编码不同PAM同种型的不同剪接变体(即，可变剪接转录物)。这些剪接变体中的两个是被称为PAM2和PAM3的变体。PAM2和PAM3转录物之间的差异在于，存在(PAM2)或缺失(PAM3)包含跨膜域的外显子。
在所有方面的一个实施方案中，人肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶(PAM)是PAM3(SEQ ID NO:02)。
表：PAM2和PAM3剪接变体表达构建体之间的比较
重组表达了在其C端带有PYY+Gly肽的IgG-Fc分子。与IgG-Fc表达质粒一起，共转染了不同比例的PAM2或PAM3表达质粒。通过质谱分析了表达产物的C端Gly残基加工。
术语“表达”在本文中用于指发生在细胞内的转录和/或翻译过程。目的核酸序列在细胞中的转录水平可以基于存在于该细胞中的相应mRNA的量来确定。例如，从目的序列转录的mRNA可以通过RT-PCT或通过Northern杂交来定量(参见Sambrook等,1989)。可以通过各种方法定量目的核酸编码的多肽，例如，通过ELISA，分析多肽的生物活性，或利用独立于该活性的分析试验，例如使用识别和结合该多肽的免疫球蛋白的Western印迹或放射免疫分析(参见Sambrook等,1989,同上)。
术语“共表达”或“共表达的”在本文中指，两个或两个以上的编码不同重组多肽的核酸在相同宿主细胞中或在共培养的两种或两种以上宿主细胞(相同培养物)中同时地表达。在第一种情况下，编码不同多肽(待酰胺化的多肽和PAM)的所有核酸包含在单一一种宿主细胞中。在第二种情况下，每种宿主细胞各包含至少一种编码重组多肽(待酰胺化的多肽或PAM)的核酸。例如，在同时表达两种不同重组多肽的情况下，可以使用一种(即单一一种)包含两种重组多肽编码核酸的细胞，或可以使用分别包含(正好)一种重组多肽编码核酸的两种细胞。可以将不同重组多肽编码核酸包含在单顺反子或多顺反子表达盒中。这些表达盒可以在相同表达质粒上或在不同表达质粒上。
本领域技术人员明了，术语“重组”或“重组的”描述一种情况，在该情况下重组的多肽编码核酸已转染至哺乳动物细胞中。这可以不是(完全)内源的多肽，而是至少部分人工地插入细胞中的。
“表达质粒”是提供所含结构基因(一种或多种)在宿主细胞中表达所需的所有元件的核酸。术语“载体”在本申请中与“质粒”同义。典型地，表达质粒包含原核质粒扩增单位(例如对于大肠杆菌，包含复制起点和选择标记)、真核选择标记、和用于表达目的结构基因(一个或多个)的一个或多个表达盒(每个表达盒分别包含启动子、结构基因和转录终止子，包括聚腺苷酸化信号)。基因表达通常被置于启动子的控制下，该结构基因被称作与启动子“可操作连接”。类似地，调节元件和核心启动子可操作地连接，由此调节元件可以调节核心启动子的活性。
“表达盒”指，含有在宿主细胞中表达至少所含核酸所需的调节元件，例如启动子和聚腺苷酸化位点，的构建体。
“启动子”指，可以控制与其可操作连接的核酸转录的核酸，即，多核苷酸序列。启动子可以包括用于RNA聚合酶结合和转录起始的信号。在考虑表达所述可操作连接的核酸的宿主细胞的细胞类型中，所用启动子(一个或多个)将是功能性。许多启动子，包括来自各种不同来源的、组成型、诱导型、和阻遏型启动子，是本领域熟知的(并在数据库例如GenBank中标识)。启动子可以从(例如保藏机构，例如ATCC，以及其它商业或个人来源)获得或在克隆的多核苷酸中获得。“启动子”包含指导例如可操作连接的结构基因转录的核苷酸序列。典型地，启动子位于基因的5'非编码或5’非翻译区(5’UTR)，紧靠结构基因的翻译起始位点。启动子中在转录起始中发挥作用的序列元件常常可以通过共有核苷酸序列予以表征。这些序列元件包括RNA聚合酶结合位点，TATA序列,CAAT序列,分化特异性元件(DSEs；McGehee,R.E.,等,Mol.Endocrinol.7(1993)551),环AMP反应元件(CREs),血清反应元件(SREs；Treisman,R.,Seminars in Cancer Biol.1(1990)47),糖皮质激素反应元件(GREs),和其它转录因子的结合位点，例如CRE/ATF(O'Reilly,M.A.,等,J.Biol.Chem.267(1992)19938),AP2(Ye,J.,等,J.Biol.Chem.269(1994)25728),SP1,cAMP反应元件结合蛋白(CREB；Loeken,M.R.,Gene Expr.3(1993)253-264)和八聚体因子(一般参见，Watson等,eds.,MolecularBiology of the Gene,4th ed.,The Benjamin/Cummings PublishingCompany,Inc.1987,和Lemaigre,F.P.和Rousseau,G.G.,Biochem.J.303(1994)1-14)。如果启动子是诱导型启动子，则转录速率响应于诱导剂而增加。相反，如果启动子是组成型启动子，转录速率不受诱导剂调节。阻遏型启动子也是已知的。例如，c-fos启动子在生长激素结合细胞表面上其受体时被特异地激活。可以通过由例如CMV启动子后随两个Tet操纵基因位点组成的人工杂合启动子，实现四环素(tet)调节的表达。Tet-阻遏物结合两个Tet操纵基因位点，阻断转录。在添加诱导剂四环素后，Tet-阻遏物从Tet操纵基因位点释放，转录继续进行(Gossen,M.和Bujard,H.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)5547-5551)。对于其它诱导型启动子，包括金属硫蛋白和热休克启动子，参见例如Sambrook,等(supra),和Gossen,M.,等,Curr.Opin.Biotech.5(1994)516-520。已经鉴定为强启动子用于高水平表达的真核启动子有：SV40早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白I启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重复、中国仓鼠延伸因子1α(CHEF-1,参见例如US 5,888,809)、人EF-1α、泛素、和人巨细胞病毒立即早期启动子(CMV IE)。增强子(即，作用于启动子上以增强转录的顺式作用DNA元件)可能是必需的，与启动子联合起作用以增强使用单独启动子时所获得的表达水平，其可以作为转录调节元件被包括在内。常常，含有启动子的多核苷酸片段也包括增强子序列(例如CMV或SV40)。
术语“细胞”或“宿主细胞”指，可以引入或转染、或已经引入或转染了核酸，例如编码异源多肽的核酸的细胞。如果将包含核酸的两个或两个以上载体同时引入相同细胞中，则该过程称为“共转染”。术语“细胞”包括用于扩增质粒的原核细胞、和用于表达核酸的真核细胞。优选地，真核细胞是哺乳动物细胞。优选地，哺乳动物细胞选自包括CHO细胞(例如CHO K1,CHO DG44),BHK细胞,NS0细胞,SP2/0细胞,HEK 293细胞,HEK 293EBNA细胞,PER.细胞,和COS细胞的哺乳动物细胞组。在本文中，表述“细胞”包括主题细胞及其后代。因此，表述“转化体”和“转化的细胞”包括原代主题细胞和来源于其的培养物，而不管转移的次数。也可以理解，所有后代可能在DNA内容上由于有意的或无意的突变而不完全相同。就针对最初转化的细胞所筛选的功能或生物活性而言，具有相同的功能或生物活性的变体后代包括在本发明中。
由于用于多肽重组生产的细胞的翻译机器的能力有限，必须在待酰胺化的多肽和PAM的表达之间达成平衡。此外，必须考虑待酰胺化多肽的总产量和酰胺化百分数之间的平衡。
在所有方面的一个实施方案中，哺乳动物细胞用第一载体和第二载体共转染，第一载体包含含有编码待酰胺化多肽的核酸的表达盒，第二载体包含含有编码PAM的核酸的表达盒。
在所有方面的一个实施方案中，第一载体与第二载体的比例为大约90:10至大约40:60。在所有方面的一个实施方案中，第一载体与第二载体的比例为大约70:30至大约60:40。在所有方面的一个优选实施方案中，第一载体与第二载体的比例为大约70:30至大约60:40，且人肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶(PAM)是PAM3(SEQ ID NO:02)。
在所有方面的一个实施方案中，哺乳动物细胞包含编码多肽的第一核酸和编码PAM的第二核酸。
在所有方面的一个实施方案中，第一核酸与第二核酸的比例为大约90:10至大约40:60。在所有方面的一个实施方案中，第一核酸与第二核酸的比例为大约70:30至大约60:40。在所有方面的一个优选实施方案中，第一核酸与第二核酸的比例为大约70:30至大约60:40，且人肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶(PAM)是PAM3(SEQ ID NO:02)。
在所有方面的一个实施方案中，包含编码多肽的核酸的第一哺乳动物细胞和包含编码PAM的核酸的第二哺乳动物细胞用于共表达。
在所有方面的一个实施方案中，第一哺乳动物细胞与第二哺乳动物细胞的比例为大约90:10至大约40:60。在所有方面的一个实施方案中，第一哺乳动物细胞与第二哺乳动物细胞的比例为大约70:30至大约60:40。
当使用不同哺乳动物细胞共表达时，第一哺乳动物细胞不包含编码PAM的核酸，第二哺乳动物细胞不包含编码多肽的核酸。
这些比例可以通过百分数反映(如在本文实施例中)。例如，40:60的比例(第一载体/第一核酸；多肽:第二载体/第二核酸；PAM)可以表示为60％PAM。同样地，70:30或60:40比例可以分别表示为30％PAM或40％PAM。
表：C端酰胺化vs.产量
在其C端带有PYY+Gly肽的IgG-Fc分子与各种比例的PAM3表达质粒一起重组表达。通过质谱分析表达产物的C端Gly残基加工，并通过蛋白A层析确定产量。结果来自2个独立实验。
本文公开的一个方面是，用于重组生产C端酰胺化多肽的方法，其特征在于，多肽和人肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶(PAM)两者在哺乳动物细胞中重组共表达(以重组方式共表达)。一般，多肽的重组生产通过转染核酸、培养细胞、收获细胞和纯化多肽来进行。
“抗体重链”指天然抗体的一部分。天然抗体是具有各种结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是大约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻链和两条相同的重链通过二硫键连接而组成。从N端至C端，每条抗体重链具有可变区(VH)——也称作可变重链域或重链可变域，之后是三个恒定结构域(CH1,CH2,和CH3)。
术语“Fc区”或“Fc部分”在本文中用于定义含有至少部分恒定区的免疫球蛋白重链的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226,或从Pro230延伸到重链的羧基末端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基编号基于描述在Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中的EU编号系统，也称作EU索引，进行。
在所有方面的一个实施方案中，多肽与抗体重链或其Fc区的C端融合。
神经肽Y受体(NYR)是一类G蛋白偶联受体，其被密切相关的肽激素神经肽Y、肽YY、和胰多肽激活。
肽YY(PYY)，也称作肽酪氨酸酪氨酸或胰肽YY3-36，是在人类中由PYY基因编码的肽。肽YY与胰肽家族相关，其36个氨基酸中18个与胰肽位于相同位置。肽YY的两种主要形式是PYY1-36和PYY3-36，具有PP折叠结构基序。然而，最常见的循环PYY免疫反应性形式是PYY3-36，其与Y2受体(NPY2R,Y2R)结合。
在所有方面的一个实施方案中，多肽是神经激肽(Neurokinin),抑咽侧体神经肽(Allatostatin),Lem-KI,TRH,红色素凝集激素(Red PigmentConcentrating Hormone),降钙素(Calcitonin),CRF,LHRH,白细胞焦激肽(Leucopyrokinin),胃泌素(Gastrin)I,色素分散激素(PigmentDispersing Hormone),皮啡肽(Dermorphin),催产素(Oxytocin),P物质(Substance P),NPY,苯丙氨酰甲硫氨酰精氨酰苯丙氨酰胺(FMRFamide),铃蟾肽(Bombesin),支链淀粉(Amylin),[Arg8]血管加压素(Vasopressin),BId-GrTH,降钙素(Calcitonin),Cam-HrTH-II,胃泌素释放肽(GastrinReleasing Peptide),神经介肽B(Neuromedin B),胰抑制素(Pancreastatin),食鱼螺毒素(Conotoxin)M1,促胰液素(Secretin),GHRF,蜂毒肽(Melittin),麻蝇毒素(Sarcotoxin)1A,VIP,α-MSH或MIF-1。在所有方面的一个实施方案中，多肽是SEQ ID NO:05的肽YY(PYY 3-36)。
本文公开的一个方面是，人肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶(PAM)用于重组生产C端酰胺化多肽的用途，其中，(待酰胺化)多肽和人PAM两者在哺乳动物细胞中重组共表达(以重组方式共表达)。
提供以下实施例以帮助理解本发明，本发明的真实范围由后附权利要求确定。应当理解，可以对所述方法进行修改而不偏离本发明精神。
材料和方法
重组DNA技术
按照Sambrook,J.等,Molecular cloning:A laboratory manual；ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中的描述，使用标准方法操作DNA。根据生产商的说明书，使用分子生物学试剂。
基因和寡核苷酸合成
在Geneart GmbH(Regensburg,德国)，通过化学合成，制备期望的基因区段。合成的基因片段克隆至大肠杆菌质粒中用于扩增/增殖。通过DNA测序，验证了亚克隆的基因片段的DNA序列。备选地，通过退火化学合成的寡核苷酸或通过PCR，装配了短的合成DNA片段。相应寡核苷酸由metabion GmbH(Planegg-Martinsried,德国)制备。
实施例1
产生用于重组表达/共表达人PAM2和PAM3的表达质粒
如上所述，包含人PAM信号肽、前肽序列、和成熟人PAM2或PAM3编码序列的人PAM2和PAM3编码基因，通过化学合成而获得，并克隆入cDNA表达载体。用于在HEK293细胞中瞬时表达人PAM2或PAM3的表达质粒，除了包含PAM cDNA外，还包含来自载体pUC18的复制起点(其允许该质粒在大肠杆菌中复制)、和β内酰胺酶基因(其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性)。PAM2或PAM3分子的转录单位因此包含以下功能性元件：
-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子(P-CMV)，包括内含子A，
-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5’UTR)，
-PAM2或PAM3cDNA，包括PAM信号肽和前肽，和
-牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
实施例2
产生用于重组表达抗体-PYY融合蛋白和基于抗体片段的PYY融合蛋白的表达质粒
a)产生质粒用于表达基于人IgG1恒定区(huIgG1-Fc)且带有C端融合肽序列的人免疫球蛋白重链衍生片段
编码人IgG1基抗体片段的融合基因包含人IgG1Fc片段(由部分铰链区和IgG1CH2和CH3结构域组成)和相应的肽序列，通过如下方式组装：将编码如上所述的相应人IgG1Fc片段的DNA片段，通过甘氨酸-丝氨酸接头(G4Sx3)分隔的方式，与编码相应肽序列的序列元件融合。为了分析酶促C端酰胺化，编码单甘氨酸(-G)残基、或甘氨酸-赖氨酸二肽(-GK)、或甘氨酸-赖氨酸-精氨酸三肽(-GKR)的序列，如果尚不存在的话，加至相应IgG-Fc-肽融合分子的C端氨基酸上。用于在HEK293细胞中瞬时表达人IgG1-Fc基抗体重链片段融合分子的表达质粒，除了包含人IgG1-Fc融合分子外，还包含来自载体pUC18的复制起点(其允许该质粒在大肠杆菌中复制)、和β内酰胺酶基因(其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性)。IgG1-Fc基抗体重链片段融合分子的转录单位因此包含以下功能性元件：
-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子(P-CMV)，包括内含子A，
-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5’UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-人IgG1Fc编码核酸，
-甘氨酸-丝氨酸接头(G4Sx3)编码核酸，
-具有C端G或GK或GKR的肽的编码核酸，
-牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
b)产生质粒用于表达带或不带C端融合肽序列的人免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链使用人IgG1恒定区
人IgG1重链融合基因包含人IgG1恒定区(CH1、铰链、CH2和CH3)、V-重链可变域、和在肽融合分子的情况下相应的肽序列，通过如下方式组装：将编码人IgG1恒定区的DNA片段融合到编码VH可变区的序列元件上，并在肽融合分子的情况下将编码相应肽序列的序列元件，通过甘氨酸-丝氨酸接头(G4Sx3)分隔的方式，融合到其C端。为了允许酶促C端酰胺化，将单甘氨酸(-G)残基、或甘氨酸-赖氨酸二肽(-GK)、或甘氨酸-赖氨酸-精氨酸三肽(-GKR)，如果尚不存在的话，加至相应IgG-Fc-肽融合分子的C端氨基酸上。用于在HEK293细胞中瞬时表达人IgG1重链基抗体融合分子的表达质粒，除了包含人IgG1重链融合分子、还包含来自载体pUC18的复制起点(其允许该质粒在大肠杆菌中复制)、和β内酰胺酶基因(其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性)。抗体重链的转录单位因此包含以下功能性元件：
-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子(P-CMV)，包括内含子A，
-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5’UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-人IgG1重链编码核酸，
-可选地，甘氨酸-丝氨酸接头(G4Sx3)编码核酸和具有C端G或GK或GKR的肽的编码核酸，
-牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
c)产生质粒用于表达带或不带C端融合肽序列的人免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链使用人Igκ恒定区
人κ轻链编码融合基因包含人Igκ恒定区(Cκ)、V-κ可变域、和如果需要的话，相应的肽序列，通过如下方式组装：将编码人Igκ恒定区的DNA片段融合到编码Vκ可变区的序列元件上，且如果需要的话，将编码相应肽序列的序列元件，通过甘氨酸-丝氨酸接头(G4Sx5)分隔的方式，融合到其C端。为了允许酶促C端酰胺化，将单甘氨酸(-G)残基、或甘氨酸-赖氨酸二肽(-GK)、或甘氨酸-赖氨酸-精氨酸三肽(-GKR)，如果尚不存在的话，加至相应Ig-κ-肽融合分子的C端氨基酸上。用于在HEK293细胞中瞬时表达人Igκ基抗体轻链融合分子的表达质粒，除了包含人Igκ融合分子外，还包含来自载体pUC18的复制起点(其允许该质粒在大肠杆菌中复制)、和β内酰胺酶基因(其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性)。该抗体重链的转录单位因此包含以下功能性元件：
-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子(P-CMV)，包括内含子A，
-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5’UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-人Igκ编码核酸，
-可选地甘氨酸-丝氨酸接头(G4Sx5)编码核酸和具有C端G或GK或GKR的肽的编码核酸，
-牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。
实施例3
瞬时重组表达抗体-PYY融合蛋白和基于抗体片段的PYY融合蛋白
通过用相应表达质粒瞬时转染培养在F17培养基(Invitrogen Corp.)中的HEK293细胞(人胚肾细胞系293来源的细胞)，产生重组融合蛋白质。为了转染，使用“293-Free“转染剂(Novagen)。分别从相应的表达质粒，表达了上述的抗体-和抗体基-肽修饰的融合分子。为了并行C端酰胺化，与免疫球蛋白表达质粒一起，共转染PAM2或PAM3编码表达质粒。按照生产商的说明书，进行转染。转染后3-7天，收获含有重组蛋白的细胞培养物上清液。在纯化前，将上清液储存在降低的温度(例如，-80℃)。关于人免疫球蛋白在例如HEK293细胞中重组表达的一般信息参见：Meissner,P.等,Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203。
实施例4
纯化重组蛋白
过滤含有Fc或抗体融合蛋白的培养物上清液，通过两个层析步骤纯化。使用以PBS缓冲液(10mM Na2HPO4,1mM KH2PO4,137mM NaCl和2.7mM KCl,pH 7.4)平衡的MabSelectSuRe(GE Healthcare)，通过亲和层析，捕获融合蛋白。用平衡缓冲液洗出未结合的蛋白。用25-50mM柠檬酸缓冲液,pH 3.2，洗脱抗体(或抗体衍生物)。含蛋白级分用0.1ml 2M Tris缓冲液,pH 9.0中和。然后，合并洗脱的蛋白级分，用Amicon Ultra离心过滤装置(MWCO:10K,Millipore)浓缩，上样到以20mM组氨酸,140mM NaCl,pH 6.0平衡的Superdex200HiLoad 26/60凝胶过滤柱(GEHealthcare,Sweden)上。测定280nm的光密度(OD)和320nm的OD(作为背景校正)，根据Pace等,Protein Science 4(1995)2411-2423，使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，确定了纯化的抗体和衍生物的蛋白浓度。合并单体Fc级分，闪冻，储存在-80℃。提供部分样品用于随后的蛋白分析和表征。在存在和不存在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)的情况下进行SDS-PAGE，并用考马斯亮蓝染色，分析了Fc-或抗体-融合蛋白的纯度和正确形成。通过高效SEC，使用GFC300分析性大小排阻柱(TosohBioscience,Stuttgart,Germany)，确定了Fc-融合蛋白制备物的聚集物含量。
实施例5
FLIPRTM(荧光成像读板器)测定试验
稳定转染了G蛋白嵌合物Gαqi9和潮霉素B抗性基因的HEK-293细胞，进一步用Y2受体(Y2R)或不同人NPY受体(NPY1-,NPY4-和NPY5-受体)转染，并进行G418抗生素选择。在潮霉素-B和G418选择后，分析各单克隆对PYY3-36的反应。将转染的细胞培养在DMEM培养基中，所述培养基补充了10％胎牛血清,50μg/mL潮霉素-B,2mM谷氨酰胺,100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素和250μg/mL G418。用胰蛋白酶-EDTA收获细胞，用ViaCount试剂计数。用完全生长培养基，将细胞悬浮液体积调整到4.8×105个细胞/ml。将25μL的等分试样分配到384孔Poly-D赖氨酸包被的黑色/透明微量板(Falcon)中，将微量板放在CO2温箱中37℃过夜。通过如下方式制备上样缓冲液(钙-3测定试剂盒,Molecular Devices)：将一瓶内容物(Express Kit)溶解在含有20mMHEPES和5mM丙磺舒(probenecid)的1000mL Hank平衡盐溶液中。将稀释后的染料的等分试样(25μL)分配到细胞板中，然后37℃孵育板1小时。在孵育期间，以3.5×期望浓度，在HBSS(20mM HEPES)/0.05％BSA/1％DMSO中制备了试验化合物，转移到384孔板用于FLIPRTM。孵育后，对细胞和化合物板进行FLIPRTM，通过FLIPRTM将20μL稀释的化合物转移到细胞板上。在测定试验期间，每隔1.5秒，同时从细胞板的全部384孔读取荧光读数。取5个读数建立稳定基线，然后将20μL样品快速地(30μL/sec)且同时地加入细胞板的各孔中。在样品添加之前、期间和之后，持续100秒的总经过时间，连续地监测荧光。确定添加后每孔中的反应(峰荧光的增加)。在配体刺激前，每孔的初始荧光读数用作该孔数据的零基线值。反应表达为阳性对照的最大反应的百分数。
实施例6
PAM2vs.PAM3
已知存在几种不同的PAM剪接变体，其中两个是称作PAM2和PAM3的变体。PAM2和PAM3转录物之间的差异在于，存在(PAM2)或缺失(PAM3)包含跨膜域的外显子(Eipper等,1993)。因此，PAM可以插入ER膜中(PAM2)或分泌到ER腔中(PAM3)。为了评价共转染的PAM对C端酰胺化的相应体内活性，鉴定了对应于剪接变体PAM2和PAM3的人PAM序列。合成制备了编码PAM2和PAM3的相应人变体的cDNA片段，如上详述地克隆至表达载体。重组表达带有待酰胺化的C端肽基序的人IgG1-Fc基分子(Fc-PYY+Gly)。除了Fc-PYY+Gly编码质粒外，还以不同比例共转染了PAM2或PAM3编码表达质粒，以在细胞培养物中体内实现中间体C端Tyr残基的酰胺化。如上所述纯化了Fc融合分子，随后通过质谱分析以评估C端Gly残基切割的百分数，用于量度PAM对C端的正确加工以及相应地中间体C端Tyr残基酰胺化的程度(如上详述)。如表1所示，高达大约60％(30％PAM共转染的)C端甘氨酸残基以剂量依赖性方式在翻译后从C端切除。就C端Gly加工而言，在PAM2和PAM3构建体之间没有观察到显著差异。使用PAM3表达质粒，进行所有的其它实验。
表1：PAM2和PAM3剪接变体表达构建体之间的比较
重组表达了在其C端带有PYY+Gly肽的IgG-Fc分子。与IgG-Fc表达质粒一起，共转染了不同比例的PAM2或PAM3表达质粒。通过质谱分析了表达产物的C端Gly残基加工。
实施例7
C端酰胺化融合分子的分析性表征
为了确定C端Tyr酰胺化的程度，重组表达了具有不同N端但相同C端的人IgG1-Fc基分子(Fc-PYY+Gly)。除了Fc-PYY编码质粒外，还共转染了PAM3表达质粒(总质粒的40％)，以在细胞培养物中体内实现由此新产生的C端Tyr残基的改善酰胺化。如上所述纯化了Fc融合分子，随后通过质谱和肽图谱分析，分别评估C端Gly残基切割的百分数和新产生的C端Tyr残基的酰胺化程度。在用肽-N-糖苷酶F(Roche Applied Science)酶促处理去除N-聚糖后，在有和无先前的还原的情况下，通过电喷雾离子化(ESI)质谱验证了PYY融合蛋白的氨基酸主链的完整性。使用TCEP进行还原。在自装G25-Sephadex-Superfine柱上，使用等度甲酸梯度，进行脱盐。在配备有纳米ESI源(TriVersa NanoMate,Advion)的Q-TOF仪器(maxis,Bruker)上，记录ESI质谱(+ve)。MS参数设定如下：转移:FunnelRF,400Vpp；ISCID能量,0eV；多极RF,400Vpp；四极:离子能量,3.0eV；低质量,850m/z；源:干燥气体,8L/min；干燥气体温度,160℃；碰撞室:碰撞能量,8eV；碰撞RF:3800Vpp；离子冷却器:离子冷却器RF,800Vpp；转移时间:140μs；Pre Puls储存,20μs；扫描范围m/z 600至2000。质量分析软件(内部开发)用于数据评估。此外，由于PAM引起的酶促酰胺化过程中C端Gly残基会被去除，故从ESI质谱推导了C端Gly残基相对于全长链的切割程度，作为C端酰胺化的第一量度。此外，通过肽图谱分析，确定了去除Gly的PYY融合分子的Tyr残基的C端酰胺化，从而也正式地证实缺少C端Gly残基的这些分子具有酰胺化的C末端。为此，使用DTT还原PYY融合蛋白，使用碘乙酸烷基化，使用蛋白酶AspN和GluC(Roche Applied Science)的组合酶促切割。使用反相HPLC在Polaris 3C18Ether柱(Varian)上和乙腈/甲酸梯度，分离肽。使用TriversaNanoMate在柱后分开流出物，将纳升流出部分导至LC/MS界面，使用电喷雾离子化将其喷雾至LTQ-FT质谱仪(Thermo)中。记录了220nm的UV色谱和ESI-MS和ESI/MS。使用Mascot搜索算法(Matricscience)和内部蛋白质序列数据库，鉴定了缺乏C端Gly残基的C端肽。肽的酰胺化形式和游离酸形式的量，使用这两种物质的提取离子色谱图，相对于彼此进行了估计。
如表2所示，大约63％至86％的C端甘氨酸残基在翻译后从C端切除；质谱和肽图谱分析在此方面给出了非常相似的结果。此外，肽图谱分析显示，超过98％的具有加工后的C端(即，切除了Gly残基)的分子被PAM修饰，具有酰胺化的C端而非酸性C端。由于如上所述我们发现如果C端Gly残基被切除则重组分子的C端可以几乎定量地被酰胺化，故在所有后续实验中使用C端Gly切割的程度作为C端正确加工(即，酰胺化)的量度。
表2：不同C端修饰的百分数
对使用PAM3表达质粒共转染产生的重组蛋白，使用质谱分析了C端甘氨酸残基的存在或不存在(Gly切割的或Gly未切割的，栏2和3)，并使用肽图谱分析了不同C端修饰物的确切比例(Gly切割且酰胺化的，Gly切割而未酰胺化的，Gly未切割的；栏4-6)。
实施例8
PAM共表达vs.产量
除了证明PAM2和PAM3等价外，表1所示结果还证实PYY肽部分以剂量依赖性方式的C端酰胺化，即，加工的C端的百分数随着转染试验中PAM表达质粒百分数的增加而增加。在进一步实验中，确定了表达产量和C端加工之间的比例。这使用1％,3％,10％,30％,40％或60％PAM3表达质粒用于与IgG1-Fc-PYY+Gly表达质粒共转染来进行。当上升到60％PAM3表达质粒时，相比于30％PAM3表达质粒,C端加工更高(80％vs.67％Gly加工)。还存在表达产量的并行降低(15μg/ml vs.73μg/ml)。组合地评价了表达产量和C端酰胺化(见图1)。基于此，对于所有后续发酵，选择40％PAM表达质粒百分数。
表3：C端酰胺化vs.产量
在其C端带有PYY+Gly肽的IgG-Fc分子与各种比例的PAM3表达质粒一起重组表达。通过质谱分析了表达产物的C端Gly残基加工，并通过蛋白A层析确定产量。结果来自2个独立实验。
实施例9
C端序列对C端加工的影响
有文献报道，除了为PAM酶活性所需的位于C端待酰胺化的氨基酸的C端的Gly残基外，以下两种碱性氨基酸，即Lys和Arg，的存在也影响非内分泌细胞的内源PAM对神经肽Y(NPY)的酰胺化。由于PYY也具有该序列基序-GlyLysArg，故与重组PAM3的共表达组合，测试了该序列基序的存在或不存在的影响。如表4所示，就C端甘氨酸残基的切除而言，无显著差异。因此，对于以共转染的重组PAM酶进行的C端酰胺化而言，以Gly或GlyLys或GlyLysArg结尾的肽或蛋白序列可以被视为同等有效。
表4:C端序列基序对C端加工的影响
％PAM共转染的 ％Gly切割的
IgG1-Fc-PYY+G 无PAM3 17％
IgG1-Fc-PYY+G 30％PAM3 68％
IgG1-Fc-PYY+G 60％PAM3 79％
IgG1-Fc-PYY+GKR 无PAM3 24％
IgG1-Fc-PYY+GKR 30％PAM3 76％
IgG1-Fc-PYY+GKR 60％PAM3 79％
在C端带有PYY+Gly肽或在C端带有PYY+GlyLysArg肽的IgG-Fc分子，与30％或60％PAM3表达质粒组合、或在根本无PAM3表达质粒的情况下(以建立内源基线酰胺化)，重组表达。通过质谱分析了表达产物的C端加工。
实施例10
体内酰胺化的重组分子在PYY受体上的活性
待酰胺化的、带有C端肽基序的、重组表达的人IgG1-Fc-基分子(Fc-PYY+Gly)，如上所述进行了表达、纯化和分析，并在细胞培养物试验中，使用转染了PYY的关连受体Y2R或NPY的相关受体(即，NPY1R,NPY4R,或NPY5R，作为对照)的细胞，在Ca-flux试验中进行了测试。象成熟PYY分子一样在其C端带有酪氨酸-酰胺残基的化学合成的PYY肽被用作阳性对照，在其C端带有具有羧酸的酪氨酸残基的类似合成的PYY肽用作阴性对照。如表5详述的，就刺激Y2R而言，体内酰胺化的Fc-PYY融合分子明确具有活性，而同时对三种不同NPY受体(NPY1R,NPY4R,NPY5R)无活性。具有更高程度的加工N端的分子倾向于比具有较低程度的N端加工的分子具有更高的活性。
表5：重组体内酰胺化的Fc-PYY融合分子的Y2R活性

Claims (10)

1.用于对多肽进行体内C端酰胺化的方法，其特征在于，所述多肽和人肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶(PAM)在哺乳动物细胞中重组共表达。
2.用于重组生产C端酰胺化的多肽的方法，其特征在于，所述多肽和人肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶(PAM)在哺乳动物细胞中重组共表达。
3.前述权利要求之任一的方法，特征在于，人肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶(PAM)是PAM3(SEQ ID NO:02)。
4.前述权利要求之任一的方法，特征在于，哺乳动物细胞包含编码所述多肽的第一核酸和编码PAM的第二核酸。
5.权利要求4的方法，特征在于，第一核酸与第二核酸的比例为大约90:10至大约40:60。
6.权利要求4的方法，特征在于，第一核酸与第二核酸的比例为大约70:30至大约60:40。
7.前述权利要求之任一的方法，特征在于，多肽与抗体重链或其Fc区的C端融合。
8.前述权利要求之任一的方法，特征在于，多肽是神经激肽(Neurokinin),抑咽侧体神经肽(Allatostatin),Lem-KI,TRH,红色素凝集激素(Red Pigment Concentrating Hormone),降钙素(Calcitonin),CRF,LHRH,白细胞焦激肽(Leucopyrokinin),胃泌素(Gastrin)I,色素分散激素(Pigment Dispersing Hormone),皮啡肽(Dermorphin),催产素(Oxytocin),P物质(Substance P),NPY,苯丙氨酰甲硫氨酰精氨酰苯丙氨酰胺(FMRFamide),铃蟾肽(Bombesin),支链淀粉(Amylin),[Arg8]血管加压素(Vasopressin),BId-GrTH,降钙素(Calcitonin),Cam-HrTH-II,胃泌素释放肽(Gastrin Releasing Peptide),神经介肽B(Neuromedin B),胰抑制素(Pancreastatin),食鱼螺毒素(Conotoxin)M1,促胰液素(Secretin),GHRF,蜂毒肽(Melittin),麻蝇毒素(Sarcotoxin)1A,VIP,α-MSH或MIF-1。
9.前述权利要求之任一的方法，特征在于，多肽是SEQ ID NO:05的肽YY(PYY 3-36)。
10.人肽基甘氨肽α-酰胺化单氧加氧酶(PAM)用于重组生产C端酰胺化的多肽的用途，其特征在于，所述多肽和人PAM在哺乳动物细胞中重组共表达。
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