CN105779599A - 一种用于检测转移性去势抵抗性前列腺癌耐药性的试剂盒 - Google Patents

一种用于检测转移性去势抵抗性前列腺癌耐药性的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测转移性去势抵抗性的前列腺癌耐药性的试剂盒，其特征在于：它包括：PSA和PSMA抗体各自独立的与不同的寡核苷酸偶联得到的抗体‑寡核苷酸探针；用于将上述抗体‑寡核苷酸探针进行PCR扩增的扩增引物及缓冲液；还包括荧光探针。本发明通过检测PSA和PSMA抗原表达量，能分析出AR信号的相对活性，从而检测出患者的mCRPC耐药性。

Description

一种用于检测转移性去势抵抗性前列腺癌耐药性的试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫法检测领域，具体地说是一种用于检测转移性去势抵抗性的前列腺癌耐药性的试剂盒。
背景技术
前列腺癌是男性最常见的肿瘤之一，它在早期不容易被发现，通常确诊时病情已发展至晚期。晚期前列腺癌最主要的治疗方法是内分泌治疗。在前列腺癌中，雄激素能够促进肿瘤生长，因此通过雄激素阻断治疗来降低雄激素水平从而实现“去势”。虽然去势治疗有一定疗效，但对肿瘤的控制一般仅能维持1.5～4年[李鸣.前列腺热点问题评述.现代泌尿生殖肿瘤杂志.3.3(2011):129-131]，随后会进一步发展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。甚至转移至前列腺以外的其它器官，比如骨骼，成为转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)。目前，mCRPC患者的生存期通常小于2年。
雄激素受体(androgen receptor，AR)信号通路在维持前列腺功能和促进前列腺癌形成的过程中发挥着重要的作用，是前列腺癌的一个核心信号通路。有研究发现，雄激素水平在一些CRPC患者中比初级前列腺癌患者中要高。为此，出现了几种靶向AR信号通路的药物，比如FDA批准的醋酸阿比特龙和多西他赛。靶向AR信号通路的药物是治疗晚期mCRPC的标准化疗方法，然而数据表明有30％～60％的mCRPC患者对它们无反应。因此，通过检测mCRPC的耐药性，可以对mCRPC患者进行用药指导。
发明内容
本发明的主要目的是针对上述背景技术存在的不足提供一种用于检测转移性去势抵抗性的前列腺癌耐药性的试剂盒，能通过检测PSA和PSMA抗原表达量，分析出AR信号的相对活性，检测出患者的mCRPC耐药性。
本发明是通过如下技术方案实现的：一种用于检测转移性去势抵抗性的前列腺癌耐药性的试剂盒，它包括：
PSA和PSMA抗体各自独立的与不同的寡核苷酸偶联得到的抗体-寡核苷酸探针；
用于将上述抗体-寡核苷酸探针进行PCR扩增的扩增引物及缓冲液；
还包括荧光探针。
进一步的，所述抗体-寡核苷酸探针包括寡核苷酸探针部分和抗体部分；所述寡核苷酸探针部分是将寡核苷酸的5'端进行醛基修饰后得到的，所述抗体部分是将抗体进行肼基修饰后得到的；所述寡核苷酸探针部分和所述抗体部分经过偶联得到所述抗体-寡核苷酸探针。
更进一步的，所述寡核苷酸探针部分是将5’端带有氨基修饰的寡核苷酸，用摩尔当量为5-20倍的SFB进行醛基修饰后得到的；所述抗体部分是将抗体用摩尔当量为10-50倍的SANH进行肼基修饰后得到的。
其中，上述的SFB是指4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯；上述的SANH是指4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯。
所述抗体-寡核苷酸探针是将摩尔比为(7-10):1的寡核苷酸探针部分和抗体部分，在室温条件下反应4-24小时后得到的。
优选的，所述寡核苷酸的长度为16-22nt，5’端为6-14nt长度的引物识别序列，3’端用延伸引物进行延伸扩展。
进一步的，所述延伸引物的长度为50-80nt，它的3’端末端与寡核苷酸的3’端互补配对，5’端可以形成发卡结构，且中间序列与荧光探针的序列互补。延伸引物的序列优选为SEQ ID NO：14所示。
优选的，所述寡核苷酸的序列为SEQ ID NO：1-13中所示的任一个。
所述扩增引物中包括一对用于将抗体-寡核苷酸探针进行PCR扩增的正向、反向引物，所述正向引物的5’端与寡核苷酸互补。
优选的，所述试剂盒用于循环肿瘤细胞检测。
发明原理
在前列腺癌中，雄激素能够促进肿瘤生长，因此通过雄激素阻断治疗来降低雄激素水平可以实现早期的前列腺癌治疗。但是在疾病进展为mCRPC后，前列腺组织中仍然残余着雄激素，并重新激活AR信号通路。Cai等人发现[Cancer Cell,2011,20:457-471.]在前列腺癌细胞中，存在雄激素调控的反馈机制，在雄激素高水平下，会抑制AR信号，而在雄激素低水平下，则会增强AR信号。因此可以通过分析AR信号的相对活性，得到mCPRC的耐药性。
细胞中AR信号的相对活性取决于PSA和PSMA蛋白的表达水平。在研究中发现，PSA+/PSMA-的细胞是雄激素诱导性(AR-on)，PSA-/PSMA+细胞是雄激素抑制型(AR-off)，PSA+/PSMA+(AR混合型)是在AR-off和AR-on细胞中介导细胞间转化的。以未治疗的转移性前列腺病人的CTC细胞为例，大多数CTC细胞都是AR-on表型，但是在1个月的雄激素剥离治疗后，大部分都转化到AR-off表型了。相反，去势抵抗的患者中，异质性非常明显。原发灶只有AR-on或AR-off的细胞，但是在有些病人的CTC中会重新出现混合型的细胞，三种状态都共存，这些发现表明评价CTC上的PSA/PSMA表达信号，进而评估AR信号的动态变化，可用于监控和预测患者对药物的治疗反应。在治疗mCPRC患者中，如果治疗后AR-on的CTC中比例比治疗前有所增加，则说明患者耐药性强，预示整体生存期降低。
本发明具有如下有益效果：
1.本发明所述的试剂盒通过检测PSA和PSMA蛋白的表达水平，得到AR信号的相对活性，从而得到mCPRC的耐药性，对患者具有一定的用药指导作用。
2.本发明通过偶联醛基和肼基得到抗体-寡核苷酸的方式，可以制备得到上述抗体分别与寡核苷酸偶联的两种探针，每种抗体-寡核苷酸探针的寡核苷酸都不相同。从而可以通过寡核苷酸的PCR扩增，来平行检测CTC中各抗体分别对应的抗原含量。
3.用延伸引物对寡核苷酸的3’端扩增，可以保证寡核苷酸链过短时的PCR扩增要求，并且延伸引物5’端的发卡结构可以增加碱基的堆砌力，从而增强探针敏感性，使通用型抗体-寡核苷酸探针检测更加灵敏。
4.由于寡核苷酸与延伸引物是在3’端互补配对的，因此延伸扩展的过程在PCR扩增过程中可自行反应，延伸扩展之后再以延伸后的抗体-寡核苷酸为模板进行扩增，一步反应即可，反应效率高。
5.由于采用了PCR扩增的方式，比传统ELISA方法检测的敏感度提高了几个数量级，即使CTC的浓度很低，也可以对微量抗原进行检测。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明：下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明要得到抗体-寡核苷酸探针，其是通过先将寡核苷酸与抗体分别进行醛基和肼基的定向修饰得到寡核苷酸部分和抗体部分，再进行腙键偶联得到。优选的，所述寡核苷酸探针部分是将5’端带有氨基修饰的寡核苷酸，用摩尔当量为5-20倍的SFB进行醛基修饰后得到的，优选摩尔当量为10倍；所述抗体部分是将抗体用摩尔当量为10-50倍的SANH进行肼基修饰后得到的，优选摩尔当量为25倍。其中，SFB为4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯，SANH为4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯。用SFB修饰寡核苷酸的5’端上的氨基可以得到醛基活化的寡核苷酸，用SANH修饰抗体可以得到肼基活化的抗体蛋白。这两个反应为公开技术可以得到的，如中国文献“基于核酸分子杂交的免疫芯片抗体固定新方法”，《分析化学》，2013年第2期，沙莎等公开的。反应时间、反应温度等条件可根据文献内容做出本领域技术人员公知的调整。本发明优选的技术方案为，将5’端带有氨基修饰的寡核苷酸用pH值为7.4的PBS缓冲液溶解，然后与摩尔当量为寡核苷酸10倍的SFB溶液混合，室温反应2.5小时，再纯化得到醛基修饰的寡核苷酸探针部分。将抗体用pH值为7.4的PBS缓冲液稀释后，与摩尔当量为抗体25倍的SANH溶液混合，室温反应2.5小时，再纯化得到肼基修饰的抗体部分。最后将摩尔比为(7-10)：1的寡核苷酸探针部分和抗体部分在室温下偶联反应得到所述抗体-寡核苷酸探针。
以下通过实施例1来进行进一步说明，其余未说明的具体条件及实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本实施例中所述的“室温”是指常规的室内温度，一般为15-30℃。
本实施例将序列为SEQ ID NO：(1-13)的Oligo简写为Oligo(1-13)，Oligo为寡核苷酸。
本实施例中的PBS缓冲液为磷酸缓冲液，MES缓冲液为2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液。
本实施例中的QPCR为实时荧光定量PCR。
本实施例中的Nanodrop为分光光度计。
本实施例中的BCA法是指蛋白质浓度测定的定量方法。
本实施例所用的缓冲液为：配置不同pH值的PBS缓冲液，在本发明的具体实施方式中，具体包括pH值为6.0的PBS缓冲液，以及pH值为7.4的PBS缓冲液，并且配置pH值为5.0的MES缓冲液，过滤除菌处理，4℃存放。
实施例1 PSA-寡核苷酸探针
(1)寡核苷酸探针的醛基修饰
将50nmol的Oligo1(寡核苷酸)用0.1M的pH 7.4的磷酸缓冲液配置成溶液。称取500nmol的SFB(4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯)，用无水DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶解后，在室温反应2.5h，过柱纯化得到Oligo-FB(醛基修饰的寡核苷酸)。
检测Oligo-FB的浓度：用Nanodrop分光光度计检测A260的值，计算Oligo-FB的浓度为0.63nmol/μL。
检测醛基修饰率：用定量的2-肼吡啶-2-盐酸盐溶液检测醛基修饰率。取上述Oligo-FB加入到2-肼吡啶-2-盐酸盐溶液中，振荡混匀后于37℃反应1h，用Nanodrop检测360nm处的吸光值为1.4，计算其修饰率，A360下的修饰率为0.91。
(2)抗体PSA的肼基修饰
对抗体PSA进行脱盐纯化后用Nanodrop检测抗体蛋白浓度为5.9mg/mL。
用pH值为7.4的磷酸缓冲液稀释抗体PSA至浓度为2mg/mL。称取25倍量的SANH(抗体与SANH的摩尔比为1:25)，溶解在无水DMF中，再加入到抗体中，在室温反应2.5h，过柱纯化得到PSA-SANH(肼基修饰的PSA)。
检测PSA-SANH的浓度：通过BCA法计算修饰后的PSA-SANH的浓度为1.68mg/mL。
检测肼基修饰率：用定量的2-甲酰苯磺酰钠盐溶液检测肼基修饰率。取纯化后的抗体-SANH加入到的2-甲酰苯磺酰钠盐溶液中，涡旋混匀后于37℃反应1h，Nanodrop检测348nm处的吸光值为0.42。通过348nm处的吸光值和PSA-SANH的浓度计算出PSA-SANH的肼基修饰率为3.0。
(3)Oligo-FB与PSA-SANH的偶联
将Oligo-FB与PSA-SANH按照摩尔比7:1混合涡旋混匀，室温反应4h，最后得到的产物经过过柱纯化后即可得到所述通用型PSA-Oligo探针。
取PSA-Oligo探针进行Nanodrop检测。在354nm下有明显吸收峰出现，说明Oligo-FB与PSA-SANH的偶联成功。
取PSA-Oligo探针进行SDS-PAGE检测，分析PSA与oligo偶联程度，跟纯的PSA比较，得到多条电泳条带，说明PSA上偶联了不同数量的寡核苷酸。
取PSA-Oligo探针进行BCA法浓度检测。BCA法浓度检测计算偶联物抗体的浓度。用单链定量试剂盒定量PSA-Oligo中Oligo1的浓度。可以计算出PSA与Oligo1的比例，并可以和修饰率结果比较。说明了PSA-Oligo分子中Oligo1与抗体的偶联比，结果如表1所示。
表1 PSA-Oligo分子中Oligo与抗体的偶联比
实施例2 Oligo分子的QPCR扩增特异性检测
将Oligo1-13分子稀释至浓度为25000分子数/μl、83333分子数/μl和250000分子数/μl三个浓度。然后以Oligo1-3为例，将Oligo1-3在相同浓度下混合，得到混合样品A、B、C，如表2所示。
表2 实施例2样品配方
将上述样品按照表3配置QPCR扩增液，得到QPCR扩增试剂盒，然后按照表4所示的程序对Oligo1-3进行QPCR扩增，以及对混合样品A、B、C中的Oligo1-3各自进行QPCR扩增，以各自延伸扩展后的Oligo1-3为模板，扩增结果的Ct值如表5所示。其中，延伸引物为RT-P，它的3’端末端与寡核苷酸的3’端互补配对，5’端可以形成发卡结构，且中间序列与MGB探针(MGty)的序列互补即可，本实施例的RT-P以序列为SEQ ID NO：14所示为例。正向引物为FP，反向序列为RP。FP以序列为SEQ ID NO：15所示为例，RP以序列为SEQID NO：16所示为例，MGty以序列为SEQ ID NO：17所示为例，5’端的荧光基团用FAM标记，3’端为MGB。
表3 Oligo分子的QPCR扩增试剂盒
试剂 1份用量(μl) 终浓度
Nuclear free water 1.35
RT-P(1uM) 0.25 25nM
FP(10uM) 0.3 300nM
RP(10uM) 0.3 300nM
MGty(10uM) 0.1 100nM
Premix Ex Taq(2×) 5
Oligo 2.5
表4 QPCR扩增程序
表5 扩增结果Ct值
Oligo1 Oligo2 Oligo3
25000分子数/μl 25.33 25.92 23.98
83333分子数/μl 23.50 24.17 22.43
250000分子数/μl 21.96 22.54 20.60
A 25.25 25.88 24.03
B 23.40 24.08 22.27
C 21.81 22.56 20.69
从表5可以看出，混合样品A、B、C中的Oligo1-3，在相同浓度下扩增的Ct值与单个Oligo的扩增Ct值为0.1左右。同时，根据每条Oligo的不同浓度样品绘出回归直线，算得回归直线方程及相关系数R2如下：
Oligo1：y＝-3.3664x+40.11，R2＝0.99937；
Oligo2：y＝-3.384x+40.809，R2＝0.99997；
Oligo3：y＝-3.3824x+38.928，R2＝0.99463。
将每条Oligo对应的A-C号样品根据各个方程进行计算，算得分子数除以对应理论分子数，所得检测效率如下：
Oligo1 Oligo2 Oligo3
A 104.0％ 103.4％ 101.6％
B 110.5％ 105.6％ 101.0％
C 109.0％ 99.0％ 98.5％
因此，平行样品间扩增Ct差值为0.1左右，检测效率为98.5％-110.5％之间，说明三条Oligo分别与其余两条没有非特异性扩增，相互之间不会影响扩增效率。其余Oligo经鉴定可以得到同样结果，说明本实验设计的多条Oligo之间无交叉影响，可以保证多重PCR的特异性、精确性和灵敏度。其他Oligo可以得到同样的结论，由于篇幅原因不一一详细说明。
实施例3 制作标准曲线
以Oligo1-13可以得到同样的结果，为了简化过程，以下实施例以Oligo1-3为例。
按照实施例1的步骤，用摩尔当量为5倍的SFB对Oligo2进行修饰得到Oligo-FB，用摩尔当量为10倍的SANH对PSMA进行肼基修饰得到PSMA-SANH，将摩尔比为10:1的Oligo-FB与PSMA-SANH在室温条件下反应16小时后得到PSMA-Oligo2。
按照实施例1的步骤，用摩尔当量为20倍的SFB对Oligo3进行修饰得到Oligo-FB，用摩尔当量为50倍的SANH对PSMA进行肼基修饰得到PSMA-SANH，将摩尔比为8:1的Oligo-FB与PSMA-SANH在室温条件下反应24小时后得到PSMA-Oligo3。
将PSA-Oligo1、PSMA-Oligo2和PSMA-Oligo3按照表3的试剂盒和表4的程序进行QPCR扩增，以延伸扩展后的Oligo1-3为模板，得到的扩增结果与Oligo1-3单独扩增一致，说明偶联的抗体部分对Oligo的QPCR扩增没有影响。
用标准品稀释液将PSA-Oligo1和PSMA-Oligo2各自稀释成浓度为：833、2500、8333、25000、83333和250000分子数/2.5μl，共六个浓度，空白对照组为去离子水。
按照表3所示的配方配置QPCR扩增试剂盒，然后按照表4所示的程序对以上各浓度的PSA-Oligo1和PSMA-Oligo2进行QPCR扩增，以延伸扩展后的Oligo1-2为模板，扩增结果如表6所示：
表6 标准曲线QPCR扩增结果Ct值
浓度(分子数/2.5μl) PSA-Oligo1 PSMA-Oligo2
0 32.03 30.87
833 31.16 28.82
2500 29.92 27.59
8333 28.18 26.01
25000 26.63 24.30
83333 24.76 22.39
250000 23.08 20.66
根据抗体-Oligo的不同浓度，绘出标准曲线，进行线性回归计算，得到回归直线方程及相关系数如下：
PSA-Oligo1：y＝-3.4181x+39.884，R2＝0.9987；
PSMA-Oligo2：y＝-3.4951x+37.861，R2＝0.9989。
实施例4 循环肿瘤细胞(CTC)抗原的QPCR检测
取不同的前列腺癌患者A-D的外周血血液，对血液中的细胞抗原量进行检测。要求受试者血常规白细胞值位于2×106～1.2×107个/mL之间，并且血液样本在处理过程中，样本没有出现以下异常现象：如样本红细胞裂解不完全导致样本细胞粘连、样本红细胞裂解后剩余细胞偏少/白细胞偏少，全血样本出现溶血或血块凝结。并且受试者相关信息完整，样本采集、保存方法规范，实验操作规范，具体步骤如下：
(1)取不同的前列腺癌患者血液3ml，加入12mL细胞裂解液，轻轻颠倒充分混匀。然后将样品置于2-8℃冰箱中裂解15min后离心弃上清，加入10mLPBS洗涤细胞；离心弃上清，再加入400μLPBS重悬细胞。
(2)加入100μl blocking buffer后室温封闭20min；再加入PSA-Oligo1和PSMA-Oligo2探针后，在室温孵育40min后终止反应并离心去上清。
(3)使用PBS洗涤细胞3遍后加入120ul洗脱液混合均匀，冰上孵育2min，离心取100ul上清，洗脱未反应的探针；最后加入20μL反应中和液中和。
用实施例3制作标准曲线相同的QPCR条件检测PSA-Oligo1和PSMA-Oligo2探针的Ct值，结果如表7所示：
表7 CTC的QPCR检测结果
实施例5 循环肿瘤细胞(CTC)抗原的免疫荧光检测
为了检测本发明试剂盒检测结果的可靠性，对与实施例4相同的血液进行免疫荧光检测，其步骤如下：
(1)取与实施例4相同的病人血液3ml，加入12mL细胞裂解液，轻轻颠倒充分混匀。然后将样品置于2-8℃冰箱中裂解15min后离心弃上清，加入10mLPBS洗涤细胞；离心弃上清，再加入400μLPBS重悬细胞。
(2)使用CD45磁珠去除部分白细胞，离心后使用100ul PBS重悬细胞。
(3)加入浓度为4％的多聚甲醛溶液固定后涂片，PBS洗三遍后封闭30分钟，PBS再洗三遍。
(4)分别加入各个标记的一抗PSA和PSMA抗体，在4℃湿盒内过夜，PBS洗三遍。
(5)DAPI染核并封片后，用荧光显微镜鉴定计数，结果如表8所示：
表8 CTC的免疫荧光检测结果
从表7和表8的检测结果可以看出，Ct值越低的样品，含有的抗原分子个数越高。而镜检所得荧光阳性CTC个数越多，即PSA、PSMA含量越多，表明Ct值与镜检个数二者呈负相关，一致性良好。
实施例6 mCPRC耐药性检测
对三个mCPRC患者进行醋酸阿比特龙用药治疗1个月，对其治疗前和治疗后的外周血进行实施例4、5的检测，得到的检测结果如表9所示。
表9 治疗前、后的蛋白表达量
从表9可以看出，前两个mCPRC患者在经过醋酸阿比特龙用药治疗后PSMA上升，PSA下调明显，说明醋酸阿比特龙药物有良好的效果，而后一个mCPRC患者经过治疗后的PSMA及PSA均上调，说明该激素药物对这个病人无效，建议换其它治疗方案。
这个案例进一步证明我们的方法和镜检所得荧光阳性CTC个数二者呈负相关，一致性良好。
对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于检测转移性去势抵抗性的前列腺癌耐药性的试剂盒，其特征在于：它包括：
PSA和PSMA抗体各自独立的与不同的寡核苷酸偶联得到的抗体-寡核苷酸探针；
用于将上述抗体-寡核苷酸探针进行PCR扩增的扩增引物及缓冲液；
还包括荧光探针。
2.根据权利要求1所述的用于检测转移性去势抵抗性的前列腺癌耐药性的试剂盒，其特征在于：所述抗体-寡核苷酸探针包括寡核苷酸探针部分和抗体部分；所述寡核苷酸探针部分是将寡核苷酸的5'端进行醛基修饰后得到的，所述抗体部分是将抗体进行肼基修饰后得到的；所述寡核苷酸探针部分和所述抗体部分经过偶联得到所述抗体-寡核苷酸探针。
3.根据权利要求2所述的用于检测转移性去势抵抗性的前列腺癌耐药性的试剂盒，其特征在于：所述寡核苷酸探针部分是将5’端带有氨基修饰的寡核苷酸，用摩尔当量为5-20倍的SFB进行醛基修饰后得到的；所述抗体部分是将抗体用摩尔当量为10-50倍的SANH进行肼基修饰后得到的。
4.根据权利要求1所述的用于检测循环肿瘤细胞表型的试剂盒，其特征在于：所述抗体-寡核苷酸探针是将摩尔比为(7-10):1的寡核苷酸探针部分和抗体部分，在室温条件下反应4-24小时后得到的。
5.根据权利要求1所述的用于检测转移性去势抵抗性的前列腺癌耐药性的试剂盒，其特征在于：所述寡核苷酸的长度为16-22nt，5’端为6-14nt长度的引物识别序列，3’端用延伸引物进行延伸扩展。
6.根据权利要求5所述的用于检测转移性去势抵抗性的前列腺癌耐药性的试剂盒，其特征在于：所述延伸引物的长度为50-80nt，它的3’端末端与寡核苷酸的3’端互补配对，5’端可以形成发卡结构，且中间序列与荧光探针的序列互补。
7.根据权利要求1所述的用于检测转移性去势抵抗性的前列腺癌耐药性的试剂盒，其特征在于：所述寡核苷酸的序列为SEQ ID NO：1-13中所示的任一个。
8.根据权利要求1所述的用于检测转移性去势抵抗性的前列腺癌耐药性的试剂盒，其特征在于：所述扩增引物中包括一对用于将抗体-寡核苷酸探针进行PCR扩增的正向、反向引物，所述正向引物的5’端与寡核苷酸互补。
9.根据权利要求1所述的用于检测转移性去势抵抗性的前列腺癌耐药性的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于循环肿瘤细胞检测。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106198985A (zh) * 2016-08-31 2016-12-07 天津市泌尿外科研究所 用于检测去势抵抗性前列腺癌的elisa试剂盒及使用方法
CN106290919A (zh) * 2016-08-31 2017-01-04 天津市泌尿外科研究所 用于检测去势抵抗性前列腺癌的elisa试剂盒及使用方法
CN106405085A (zh) * 2016-08-31 2017-02-15 天津市泌尿外科研究所 用于检测去势抵抗性前列腺癌的elisa试剂盒及使用方法
CN106526185A (zh) * 2016-10-28 2017-03-22 拜尔康(天津)医药科技有限公司 用于检测去势抵抗性前列腺癌的elisa试剂盒及检测方法
CN109234393A (zh) * 2018-09-30 2019-01-18 上海交通大学医学院附属仁济医院 一种用于检测转移性去势抵抗性前列腺癌的基因探针组合物及试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103045720A (zh) * 2011-10-17 2013-04-17 格诺思博生物科技(上海)有限公司 检测病源细胞的靶向性分子及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103045720A (zh) * 2011-10-17 2013-04-17 格诺思博生物科技(上海)有限公司 检测病源细胞的靶向性分子及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAVID T. MIYAMOTO等: "Androgen Receptor Signaling in Circulating Tumor Cells as a Marker of Hormonally Responsive Prostate Cancer", 《CANCER DISCOVERY》 *
JIANG HE等: "An improved method for covalently conjugating morpholino oligomers to antitumor antibodies", 《BIOCONJUGATE CHEM》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106198985A (zh) * 2016-08-31 2016-12-07 天津市泌尿外科研究所 用于检测去势抵抗性前列腺癌的elisa试剂盒及使用方法
CN106290919A (zh) * 2016-08-31 2017-01-04 天津市泌尿外科研究所 用于检测去势抵抗性前列腺癌的elisa试剂盒及使用方法
CN106405085A (zh) * 2016-08-31 2017-02-15 天津市泌尿外科研究所 用于检测去势抵抗性前列腺癌的elisa试剂盒及使用方法
CN106405085B (zh) * 2016-08-31 2018-03-27 天津市泌尿外科研究所 用于检测去势抵抗性前列腺癌的elisa试剂盒及使用方法
CN106290919B (zh) * 2016-08-31 2018-03-27 天津市泌尿外科研究所 用于检测去势抵抗性前列腺癌的elisa试剂盒及使用方法
CN106526185A (zh) * 2016-10-28 2017-03-22 拜尔康(天津)医药科技有限公司 用于检测去势抵抗性前列腺癌的elisa试剂盒及检测方法
CN109234393A (zh) * 2018-09-30 2019-01-18 上海交通大学医学院附属仁济医院 一种用于检测转移性去势抵抗性前列腺癌的基因探针组合物及试剂盒

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