具体实施方式
以下将配合附图说明本发明的实施例与实验例,而相关文义说明可参照前述,于此不再赘述。
本发明提供一种自人类个体所取得的粪便检体中评估所述人类个体罹患结肠直肠癌(CRC)风险的方法,在本实施例中,将前述方法简称为评估方法,并将接受评估测试的人类个体称为评估对象。本发明的评估方法是通过检测评估对象的粪便检体,以评估罹患结肠直肠癌的风险。
本实施例可通过收取评估对象的粪便检体,并以棉棒(swab)或采便器沾取粪便检体后,置入缓冲保存试剂中。接着,通过震荡的方式,将附着于棉棒或采便器上的粪便检体均匀地溶入缓冲保存试剂,并将缓冲保存试剂的液体部分取出。而采样所使用的试剂可直接比照大便潜血检查(FOBT)采样所使用的采样试剂,例如OC-SensorDianaLatexReagent(EikenChemical,Tokyo,Japan),当然亦可以为其它品牌的采样试剂,本发明不以此为限。
图1为本发明第一实施例的评估方法的流程示意图,请参考图1所示。本实施例的评估方法包括以下步骤:由粪便检体中检测第一微核糖核酸以及第二微核糖核酸的表达量(步骤S10);以及根据第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例,以评估人类个体罹患结肠直肠癌的风险(步骤S20)。
其中,第一微核糖核酸与第二微核糖核酸可以分别为多个微核糖核酸所组合成的群组,例如第一微核糖核酸选自由miR-223、miR-25及miR-93所组成的群组,而第二微核糖核酸选自由miR-221、miR-222、miR-21、miR-93、miR-141、miR-200c、miR-191、miR-17、miR-148a、miR-106a、miR-195、miR-20a、miR-181b、miR-145、miR-155、miR-106b、miR-24、miR-19b、miR-130b及miR-18a所组成的群组。整理如表一所示:
表一:第一微核糖核酸群组与第二微核糖核酸群组列表。
需注明的是,当第一微核糖核酸为miR-93时,第二微核糖核酸限定为miR-17、miR-106a、miR-195、miR-20a、miR-181b、miR-155、miR-24、miR-19b、或miR-18a。因此,本实施例所述的评估方法并不包含第一微核糖核酸与第二微核糖核酸同时为miR-93的情况。
在步骤S10中,通过检测粪便检体中上述第一微核糖核酸以及第二微核糖核酸的表达量。较佳地,可藉由微列阵生物芯片(microarray)或定量聚合酶链反应(quantitativepolymerasechainreaction,qPCR)的技术以检测第一微核糖核酸以及第二微核糖核酸的表达量。以微列阵生物芯片而言,可通过将一微列阵生物芯片区分为两个区域,分别设置可对应于上表的第一微核糖核酸群组及第二微核糖核酸的核酸探针(nucleotideprobe)。抑或是,于一微列阵生物芯片设置可对应于上表的第一微核糖核酸群组的核酸探针,并于另一微列阵生物芯片设置可对应于上表的第二微核糖核酸群组的核酸探针,以两片微列阵生物芯片进行检测。以定量聚合酶链反应而言,则可通过设计出可侦测前述的各第一微核糖核酸及第二微核糖核酸的引物(primer)及核酸探针,并通过定量聚合酶链反应以检测各个第一微核糖核酸及第二微核糖核酸的表达量。
另外,第一微核糖核酸群组及第二微核糖核酸群组所包含的各个微核糖核酸的序列,可于miRBase的在线数据库已公开的微核糖核酸序列中查询,并可依据所述序列设计对应的引物(primer)及核酸探针,对应的引物(primer)及核酸探针亦可直接自美商应用生命系统(AppliedBiosystem)公司的网站输入对应的索引编号(AccessionNo.)后购得,如后实验例一中所说明的。
本实施例的第一微核糖核酸及第二微核糖核酸表达量是以经由定量聚合酶链反应所得到Cq值换算为核酸片段浓度(以拷贝/μl为单位)为例说明。Cq值(定量循环,亦称阈值循环)即指在定量聚合酶链反应的过程中,核酸片段的生成量大于阈值(thresholdvalue)时所对应的循环数值(cyclenumber)。而本发明所属技术领域普通技术人员均可明了,在定量聚合酶链反应中核酸片段的起始浓度的对数值与其Cq值为线性关系,故由未知样本中所测得的Cq值,与由标准样本所建立的拷贝数-Cq值标准曲线(copynumber-Cqvaluestandardcurve)比对后,即可推算出所述未知样本中待测核酸片段的浓度。因此,将两个待测核酸片段miRNAX以及miRNAY样本经定量聚合酶链反应所得的CqX、CqY值相减后取以二为底的指数运算,亦可换算出这两个待测核酸片段样本的起始浓度的比例,换算公式则如下所示:
其中,miRX代表miRNAX的起始浓度,miRY代表miRNAY的起始浓度,CqX为miRNAX经定量聚合酶链反应所测得的Cq值,CqY为miRNAY经定量聚合酶链反应所测得的Cq值。
另外,本实施例中进行的定量聚合酶链反应以两阶段(two-step)定量聚合酶链反应为例说明,即先将总RNA(totalRNA)反转录(reversetranscription)成互补脱氧核糖核酸(complementarydeoxyribonucleicacid,cDNA)后,再以互补脱氧核糖核酸为模板(template)进行定量聚合酶链反应。详细而言,将自前述评估对象所取得的溶于缓冲保存试剂中的粪便检体经高速离心后,取其上清液以进行总RNA的萃取。接着,将萃取出的总RNA以前述的第一核糖核酸群组及第二核糖核酸群组所对应的引物的混合物进行反转录反应,以取得互补脱氧核糖核酸。再以互补脱氧核糖核酸为模板,并分别以前述的第一核糖核酸群组及第二核糖核酸群组所对应的引物,进行定量聚合酶链反应,以在取得前述各个第一核糖核酸及各个第二核糖核酸的Cq值后以前述公式进行换算,以作为本实施例的表达量的比例。
而本发明所属技术领域普通技术人员均应明了,目前定量聚合酶链反应的侦测将超过40个循环(cycles)的信号(Cq>40)均认定为低可信度。因此本实施例依MicroRNA实验方案,将定量聚合酶链反应的循环数设定为40,故Cq值最大为40。
通过定量聚合酶链反应以检测各个第一微核糖核酸及各个第二微核糖核酸的表达量后,在步骤S20中,根据第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例,以评估人类个体罹患结肠直肠癌的风险。当第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例大于检测阈值时,评估为高风险。需说明的是,本实施例所述第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例可以为第一核糖核酸的表达量与第二核糖核酸的表达量相除所得比值(以下以「第一核糖核酸/第二核糖核酸」称之),例如miR-223/miR-221的比值;或是第二核糖核酸的表达量与第一核糖核酸的表达量相除所得比值(以下以「第二核糖核酸/第一核糖核酸」称之),例如miR-221/miR-223的比值,本发明并不限制。而针对不同第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的比例组合所对应的检测阈值范围,及其适用的比例组合方式为第一微核糖核酸/第二微核糖核酸或第二微核糖核酸/第一微核糖核酸,皆记载于表二。因此,可以依据表二记载的内容以评估所述评估对象罹患结肠直肠癌的风险程度。在本说明书中所使用的「检测阈值(threshold)」一词意指评估人类个体罹患结肠直肠癌的参考值。检测阈值位于一较佳的数值范围内,换言之,其非为一定值,随着检测阈值改变,其检测敏感度与特异性会随之改变。本发明所属技术领域普通技术人员亦可明了不同第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的搭配组合所对应的检测阈值会有所变化。以下将具体说明各种第一微核糖核酸及第二微核糖核酸的组合所适用的检测阈值及其较佳范围。
如表二所示,在本实施例中,第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例(即前述第一微核糖核酸/第二微核糖核酸或第二微核糖核酸/第一微核糖核酸的比值)大于所述检测阈值者评估为高风险,小于所述检测阈值者评估为低风险。或者,第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例(即前述第一微核糖核酸/第二微核糖核酸或第二微核糖核酸/第一微核糖核酸的比值)大于所述检测阈值范围者评估为高风险,落入所述检测阈值范围内者评估为中风险,小于所述检测阈值范围者评估为低风险。
表二:第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例所对应检测阈值范围的列表。
第一微核糖核酸/第二微核糖核酸 |
检测阈值(范围) |
miR-223/miR-221 |
9.563(4.143-13.92) |
miR-223/miR-222 |
8.846(4.798-12.54) |
miR-223/miR-21 |
0.6263(0.317-0.787) |
miR-223/miR-93 |
1.239(0.676-1.897) |
miR-223/miR-141 |
20.33(12.66-28.45) |
miR-223/miR-200c |
3.706(1.697-5.152) |
miR-223/miR-191 |
42.41(25.11-58.04) |
miR-223/miR-17 |
2.838(1.509-3.541) |
miR-223/miR-148a |
137.5(64.19-205.4) |
miR-223/miR-106a |
9.550(5.79-13.95) |
miR-223/miR-195 |
46.19(29.43-67.23) |
miR-223/miR-20a |
9.458(5.79-12.94) |
miR-223/miR-181b |
61.39(24.5-89.83) |
miR-223/miR-145 |
96.44(34.58-168.9) |
miR-223/miR-155 |
128.4(63.18-200) |
miR-223/miR-106b |
4.233(1.689-5.794) |
miR-223/miR-24 |
47.21(23.65-63.29) |
miR-223/miR-19b |
41.34(19.41-56.91) |
miR-223/miR-130b |
13.93(4.649-26.92) |
miR-223/miR-18a |
42.98(19.5-66.67) |
miR-25/miR-221 |
0.4366(0.21-0.666) |
miR-25/miR-222 |
0.2664(0.139-0.386) |
miR-25/miR-21 |
0.05433(0.027-0.076) |
miR-25/miR-93 |
0.05303(0.017-0.092) |
miR-25/miR-141 |
1.061(0.714-1.897) |
miR-25/miR-200c |
0.2325(0.132-0.356) |
miR-25/miR-191 |
1.118(0.965-2.577) |
miR-25/miR-17 |
0.2446(0.125-0.363) |
miR-25/miR-148a |
8.776(3.382-14.08) |
miR-25/miR-106a |
0.1484(0.061-0.202) |
miR-25/miR-195 |
0.4772(0.292-0.724) |
miR-25/miR-20a |
0.2475(0.125-0.36) |
miR-25/miR-181b |
1.766(0.998-3.883) |
miR-25/miR-145 |
1.176(0.972-2.98) |
miR-25/miR-155 |
1.557(0.995-3.246) |
miR-25/miR-106b |
0.1166(0.052-0.185) |
miR-25/miR-24 |
1.143(0.996-2.376) |
miR-25/miR-19b |
1.105(0.993-1.873) |
miR-25/miR-130b |
1.008(0.996-1.988) |
miR-25/miR-18a |
1.041(1-1.96) |
第二微核糖核酸/第一微核糖核酸 |
检测阈值(范围) |
miR-17/miR-93 |
0.1135(0.084-0.151) |
miR-106a/miR-93 |
0.1522(0.104-0.191) |
miR-195miR-93 |
0.1517(0.089-0.209) |
miR-20a/miR-93 |
0.2473(0.172-0.289) |
miR-181b/miR-93 |
0.01116(0.007-0.014) |
miR-155/miR-93 |
0.005128(0.004-0.006) |
miR-24/miR-93 |
0.1271(0.038-0.187) |
miR-19b/miR-93 |
0.04282(0.012-0.06) |
miR-18a/miR-93 |
0.03339(0.018-0.043) |
举例而言,在定量聚合酶链反应后,将miR-223(第一微核糖核酸)的浓度与miR-221(第二微核糖核酸)的浓度相除后(分母为miR-221)可得到一比值,或是将miR-223及miR-221经定量聚合酶链反应所得的Cq值以前述公式(1)换算为比值,并将比值与表二进行比对。若比值大于9.563,会评估为罹患结肠直肠癌的高风险者;若比值小于9.563,则评估为低风险者。而若是使用检测阈值范围的方式进行评估,则若比值大于13.92,评估为罹患结肠直肠癌的高风险者;若比值落在4.143~13.92之间(包含等于4.143、13.92),则评估为中风险者;若比值小于4.143,则评估为低风险者。
需说明的是,虽然上述实施例以当第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例(即前述第一微核糖核酸/第二微核糖核酸或第二微核糖核酸/第一微核糖核酸的比值)大于表二所列出的对应检测阈值时评估为高风险;然而本领域普通技术人员亦当明了,若将分子分母互换后的比值与互换前的比值两者间仅为倒数关系,而以此进行评估时所使用的对应检测阈值则可将原本的检测阈值进行倒数换算而得出,且此时评估方式则转换为将小于所述对应的检测阈值的评估对象评估为高风险。并且,其检验效果(受试者操作曲线下面积、敏感度及特异性)均不因此而发生变化。
举例而言,若以miR-223/miR-221的比值进行评估,则如上表二中所显示的当miR-223/miR-221的比值大于13.92则评估为罹患结肠直肠癌的高风险者;若比值落在4.143~13.92之间(包含等于4.143、13.92),则评估为中风险者;若比值小于4.143,则评估为低风险者。而若以miR-221/miR-223的比值进行评估,则对应的检测阈值范围转换为0.072(约是13.92的倒数)至0.241(约是4.143的倒数),且当miR-221/miR-223的比值小于0.072则评估为罹患结肠直肠癌的高风险者;若比值落在0.072~0.241之间(包含等于0.072、0.241),则评估为中风险者;若比值大于0.241,则评估为低风险者。同样地,若以miR-25/miR-24的比值进行评估,则如上表二中所显示的当miR-25/miR-24的比值大于2.376则评估为罹患结肠直肠癌的高风险者;若比值落在0.996~2.376之间(包含等于0.996、2.376),则评估为中风险者;若比值小于0.996,则评估为低风险者。而若以miR-24/miR-25的比值进行评估,则对应的检测阈值范围转换为0.421(约是2.376的倒数)至1.005(约是0.996的倒数),且当miR-24/miR-25的比值小于0.421则评估为罹患结肠直肠癌的高风险者;若比值落在0.421~1.005之间(包含等于0.421、1.005),则评估为中风险者;若比值大于1.005,则评估为低风险者。
本实施例的评估方法,包括表一所示的第一微核糖核酸群组及第二微核糖核酸群组的微核糖核酸种类,以及表二所示的阈值范围,是分别收集144位确诊罹患结肠直肠癌及390位健康的人类个体的粪便检体,并由其粪便检体中微核糖核酸的含量,经发明人费心计算归纳出表示中的第一微核糖核酸群组及第二微核糖核酸群组的微核糖核酸种类,以及取得相对应的检测阈值范围。而本实施例的评估方法可达到的检验效果(敏感度及特异性),以下实验例二呈现。
由于在粪便检体中的总核糖核酸含量极低,绝对定量模板(template)浓度并不准确。而一般微核糖核酸的侦测方法皆须通过聚合酶链反应(PCR)放大微核糖核酸的浓度后,再续行定量的试验。但其仍存在的问题是,粪便检体中的核酸片段浓度,即用于聚合酶链反应的模板(template)浓度,会因采样时间不同、是否震荡均匀等因素而有很大的误差,故难以控制每一批次的粪便检体皆在相同的基准。因此,仅使用聚合酶链反应(PCR)相关的测量方法所建立的评估方法,亦有相当大的误差。
为了解决上述缺点,本发明第一实施例所示的评估方法通过第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例计算,在第一微核糖核酸的表达量与第二微核糖核酸的表达量相除的计算过程中,即可排除模板(template)浓度不同所导致的差异,故所建立的评估方法可降低因每次粪便检体采样的差异进而造成检测误差的问题。
在第一实施例所示的评估方法中,较佳的,若在第一微核糖核酸群组中,选取miR-223作为检测标记,且在第二微核糖核酸群组中选取miR-221、miR-222、miR-21、或miR-93作为检测标记,并比对第一微核糖核酸与第二微核糖核酸表达量的比例,亦即比对miR-223/miR-221、miR-223/miR-222、miR-223/miR-21、miR-223/miR-93的比值,可具有较佳的评估效果。在本实施例中,第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例所得的诊断准确度(曲线下面积,AUC)大于单独使用第一微核糖核酸或单独使用第二微核糖核酸的诊断准确度。
此外,若在第一微核糖核酸群组中,选取miR-25作为检测标记,且在第二微核糖核酸群组选取miR-221、miR-222、miR-21、miR-93、miR-141、miR-200c或miR-191作为标记物,并比对第一微核糖核酸与第二微核糖核酸表达量的比例,亦即比对miR-25/miR-221、miR-25/miR-222、miR-25/miR-21、miR-25/miR-93、miR-25/miR-141、miR-25/miR-200c、或miR-25/miR-191的比值,同样可具有较佳的评估效果。同样的,此时使用第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例所得的诊断准确度(AUC)大于单独使用第一微核糖核酸或单独使用第二微核糖核酸的诊断准确度。
图2为本发明第二实施例的评估方法的流程示意图,请参考图2所示。本实施例的评估方法包括以下步骤:由粪便检体中检测第一微核糖核酸以及第二微核糖核酸的表达量(步骤S10);判断第一微核糖核酸的表达量是否大于浓度阈值(步骤S30)。若为「是」,亦即当第一微核糖核酸的表达量大于浓度阈值时,则评估为高风险(步骤S32);若为「否」,亦即当第一微核糖核酸小于浓度阈值时,则根据第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例以评估人类个体罹患结肠直肠癌的风险(步骤S34)。其中,第一微核糖核酸与第二微核糖核酸皆为多个微核糖核酸所组合成的群组,而其详细内容可参考表一所列的第一微核糖核酸群组及第二微核糖核酸群组。
在本实施例中,亦先检测微核糖核酸的表达量(步骤S10),接着,判断第一微核糖核酸的表达量是否大于浓度阈值(步骤S30)。当第一微核糖核酸的表达量大于浓度阈值时,则评估为高风险。具体而言,在第一微核糖核酸群组中,若有其中第一微核糖核酸(miR-223、miR-25或miR-93)的表达量大于浓度阈值,则可评估为罹患结肠直肠癌的高风险者(步骤S32)。而本实施例所称的「浓度阈值」是核酸片段的浓度(拷贝/μl)是否大于参考值,若大于此参考值则评估为高风险。本实施例中第一微核糖核酸miR-223、miR-25及miR-93所使用的对应的默认值如下表三所示。需说明的是,表三所列的评估的参考值以较佳的浓度阈值(例如550.6拷贝/μl)为例说明,当然,在其它实施例中,亦可于浓度阈值范围(例如226.4~804.8拷贝/μl)中选取适合的浓度阈值作为评估的参考值,本发明不以此为限。当然,在其它实施例中,使用其它第一微核糖核酸时,其对应的浓度阈值自为不同,故本发明不以此为限。步骤S30利用第一微核糖核酸的表达量是否大于对应的浓度阈值来评估个体罹患结肠直肠癌的风险程度。
表三:第一微核糖核酸miR-223、miR-25及miR-93所使用的浓度阈值及其较佳范围
第一微核糖核酸 |
浓度阈值(范围)(拷贝/μl) |
miR-223 |
550.6(226.4-804.8) |
miR-25 |
8.005(0.465-16.42) |
miR-93 |
276.7(241.8-305.8) |
当第一微核糖核酸的表达量小于浓度阈值时,则进入步骤S34,依据第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例以评估人类个体罹患结肠直肠癌的风险。举例而言,在步骤S10中以miR-223、miR-25及miR-93所对应的引物进行定量聚合酶链反应,若其结果为miR-223的浓度为34拷贝/μl、miR-25的浓度为6拷贝/μl、miR-93的浓度为5拷贝/μl,其皆小于浓度阈值,故进一步进行步骤S34的评估步骤。亦即,分别计算miR-223、miR-25、miR-93的表达量与miR-221、miR-222、miR-21、miR-93、miR-141、miR-200c、miR-191、miR-17、miR-148a、miR-106a、miR-195、miR-20a、miR-181b、miR-145、miR-155、miR-106b、miR-24、miR-19b、miR-130b、及miR-18a(第二微核糖核酸)的表达量比例后,再与表二所示阈值范围进行比对,以评估罹患结肠直肠癌的风险。而步骤S34的细节内容,可参考第一实施例的步骤S20,于此不加赘述。
另外,本实施例选用miR-223、miR-25及miR-93作为第一微核糖核酸群组,由于miR-223、miR-25及miR-93的表达量为上调,亦即指在罹患结肠直肠癌的病患的粪便检体中,其第一微核糖核酸的表达量大于正常人类个体的粪便检体中的第一微核糖核酸的表达量,可作为评估罹患结肠直肠的风险的基准。因此,本实施例先于步骤S30将第一微核糖核酸的表达量大于等于浓度阈值者(即一般医疗检验领域所称的「阳性(positive)」者),评估为高风险。接着,再于步骤S40,将第一微核糖核酸的表达量小于浓度阈值者(即一般医疗检验领域所称的「阴性(negative)」者),以比例计算及其对应的评估方式进行二次评估,可避免仅以第一微核糖核酸进行评估所可能存在的「伪阴性(falsenegative)」的情形。其中,「伪阴性」指罹患有结肠直肠癌却未被检测出来的情形,此为医疗检验单位所极力避免的情形。
图3为本发明第三实施例的评估方法的流程示意图,请参考图3所示。在一实施例中,评估方法还可与粪便潜血检测(FOBT)搭配使用,具体实施步骤如下:检测粪便检体的潜血反应以及检测miR-93、miR-155、miR-223、miR-221、miR-222的表达量,并评估粪便检体是否有潜血反应(步骤S40)。
若于步骤S40评估为「是」,亦即选取有潜血反应的所述粪便检体,并进一步计算miR-93与miR-155的表达量的第一比例、miR-223与miR-221的表达量的第二比例、或miR-223与miR-222的表达量的第三比例(步骤S50);接着,判断第一比例、第二比例或第三比例是否大于对应的检测阈值(步骤S52);若步骤S52判断为「是」,亦即当第一比例、第二比例或第三比例中任何一者大于其对应的检测阈值时,评估为高风险(步骤S54),反之,评估为低风险(步骤S56)。
而若于步骤S40评估为「否」,亦即选取无潜血反应的所述粪便检体,并同样进一步计算miR-93与miR-155的表达量的第一比例、miR-223与miR-221的表达量的第二比例、或miR-223与miR-222的表达量的第三比例(步骤S60);接着,判断第一比例、第二比例及第三比例是否大于对应的检测阈值(步骤S62);若步骤S62判断为「是」,亦即当第一比例、第二比例与第三比例均大于其对应的检测阈值时,才评估为高风险(步骤S64),反之,评估为低风险(步骤S66)。
承上,第三实施例的评估方法,于步骤S40先进行粪便检体的潜血反应及检测miR-93、miR-155、miR-223、miR-221、miR-222的表达量,而潜血反应与检测表达量可同时进行,分开进行,本发明不以此为限。其中,检测miR-93、miR-155、miR-223、miR-221、miR-222的表达量的方法可参考第一实施例的步骤S10,于此不加赘述。而步骤S40还依据粪便检体的潜血反应以评估大便是否有潜血反应。接着,选取有潜血反应(即一般医疗检验领域所称的「阳性」者)进行步骤S50~S56;并选取无潜血反应(即一般医疗检验领域所称的「阴性」者)进行步骤S60~S66。换言之,步骤S50~S56与步骤S60~S66的评估步骤流程实质上相同,仅检测对象(有潜血反应或无潜血反应的粪便检体)及评估标准略有不同。因此,以下以步骤S50~S56为例说明。
在步骤S50中,先计算miR-93与miR-155的表达量的第一比例、miR-223与miR-221的表达量的第二比例、或miR-223与miR-222的表达量的第三比例。在本实施例中,即是依据表二所示的第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的比例组合以及步骤S40所取得的miR-93、miR-155、miR-223、miR-221、miR-222的表达量,计算出miR-155/miR-93的比值(第一比例)、miR-223/miR-221的比值(第二比例)、以及miR-223/miR-222的比值(第三比例)。接着,续于步骤S52将前述所取得第一比例、第二比例或第三比例与表二所示的检测阈值比对,以判断其是否大于对应的检测阈值。具体而言,即判断第一比例是否大于0.0051,第二比例是否大于9.563,以及第三比例是否大于8.846,若其中之一大于对应的检测阈值,则可评估为高风险(步骤S54)。反之,若第一比例、第二比例及第三比例皆小于对应的检测阈值,则可评估为低风险(步骤S56)。
换言之,步骤S50~S56即为选取有潜血反应的粪便检体,并根据miR-93与miR-155的表达量的第一比例、miR-223与miR-221的表达量的第二比例、或miR-223与miR-222的表达量的第三比例,以评估人类个体罹患结肠直肠癌的风险,当第一比例、第二比例或第三比例任何一者大于其所对应的检测阈值时,则评估为高风险。相对应地,步骤S60~S66即为选取无潜血反应的粪便检体,并根据miR-93与miR-155的表达量的第一比例、miR-223与miR-221的表达量的第二比例、以及miR-223与miR-222的表达量的第三比例,当第一比例、第二比例以及第三比例均大于对应的各检测阈值时,评估为高风险;反之,若第一比例、第二比例及第三比例任何一者小于对应的检测阈值,则可评估为低风险。
因此,第三实施例依据粪便检体的潜血反应的初步结果,将评估为有潜血反应者(阳性),再进一步以miR-155/miR-93(第一比例)、miR-223/miR-221(第二比例)、以及miR-223/miR-222(第三比例)进行二次评估,以进一步确认有潜血反应者(阳性)同时具有罹患结肠直肠癌的高风险者,并可同时排除「伪阳性(falsepositive)」者。具体而言,粪便检体的潜血反应常因月经出血、痔疮或便秘出血、或血尿等原因而造成产生「伪阳性」的检测结果,而第三实施例的评估方法续以三种微核糖核酸的比例进行二次评估,可进一步排除伪阳性的结果,使检测结果更为精确。
另外,第三实施例针对无潜血反应者(阴性),同样进一步以miR-155/miR-93(第一比例)、miR-223/miR-221(第二比例)、以及miR-223/miR-222(第三比例)进行二次评估,亦即步骤S62~S66,以进一步确认无潜血反应者(阴性)具有罹患结肠直肠癌的高风险者,亦即可找出「伪阴性(falsenegative)」者。
较佳地,具体而言,粪便检体的潜血反应亦可能因结肠直肠癌患者无血便的情形,而无法藉由粪便检体的潜血反应评估,进而有「伪阴性」的情况发生,而续以三种微核糖核酸的比例进行二次评估,可进一步找出伪阴性的结果,使检测结果更为精确。
此外,本发明的第四实施例亦同时提供一种用于自人类个体所取得的粪便检体中评估个体罹患结肠直肠癌风险的标志物。所述标志物包括:第一微核糖核酸以及第二微核糖核酸,且第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例在罹患结肠直肠癌的患者所取得的粪便检体中与对照粪便检体中具有显著差异。本实施例中的第一微核糖核酸群组与第二微核糖核酸群组与第一实施例中相同,如表一中所示。
本发明第四实施例的标志物,用于评估个体罹患结肠直肠癌的风险,其操作步骤及效果与第一实施例相同,藉由采检罹患结肠直肠癌患者的粪便检体与健康人类个体的粪便检体,并检测所述粪便检体中如表一所示的第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例,其细节步骤可参考第一实施例,在此不再赘述。而由检测结果可发现罹患结肠直肠癌患者相较于健康人类个体的粪便检体,具有至少一种第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例具有显著差异。亦即,本实施例所称的「对照粪便检体」指健康人类个体的粪便检体,作为与罹患结肠直肠癌的患者的比对基础。
承上所述,依据本发明的评估方法及标志物,其根据第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例,以评估人类个体罹患结肠直肠癌的风险,对于非入侵性、及高准确性的目的,提供了显著的功效。
本评估方法是通过收集144位罹患结肠直肠癌病患及390位健康的人类个体的粪便检体,并分析其各种微核糖核酸表达量,以找出可作为评估罹患结肠直肠癌的标志物(如表一所列的微核糖核酸),或称生物标记,以及所述些标志物所对应的检测阈值(如表二所示)。换言之,藉由所述些标志物及其对应的检测阈值以建立出本评估方法。以下先以实验例一确认本评估方法可用于评估人类个体罹患结肠直肠癌的风险,而并于后续实验例证实其具有较佳的评估效果。
实验例一:本评估方法可用于评估人类个体罹患结肠直肠癌的风险
评估对象与粪便检体
本实验例自台湾长庚医院(ChangGungMemorialHospitalinTaiwan)收集144位罹患结肠直肠癌病患及390位健康的人类个体的粪便检体,并分析如表一所示的各种微核糖核酸表达量。癌症是根据2009年美国癌症联合委员会分期标准第7版(2009AmericanJointCommitteeonCancerstagingcriteria,7thedition)进行判定,同时记录其临床病理因素,包括年龄,性别和免疫大便潜血检查(iFOBT)结果。对于样品的采集,则收取结肠直肠癌病患所捐赠的粪便样本,所述粪便样本为经由常规iFOBT检测所残留的剩余样本,且采集所述粪便样本前所述病患并未进行任何治疗。针对健康对照组,则均从桃园长庚医院的健康检查中心所取得。参加者接受了结肠镜(colonoscopy)检查,并且镜检结果均为无瘤、良性病理增生(pathologicallyapprovedhyperplasia)或小于10毫米的管状腺瘤(tubularadenoma)等阴性结果,同时亦记录其免疫大便潜血检查(iFOBT)结果。所有的病患和健康者均以书面方式提供告知同意,且本研究经长庚医院的审查委员会审核通过。
本实验例使用免疫大便潜血检查(iFOBT)的采检容器及试剂盒,如OC-SensorDianaLatexReagent(EikenChemical,Tokyo,Japan)试剂盒。具体而言,通过棉棒(swab)或采便器沾取粪便检体后,置入缓冲保存试剂中,并通过震荡的方式,将附着于棉棒或采便器上的粪便检体均匀的溶入缓冲保存试剂,并将经震荡后具有粪便检体的缓冲保存试剂取出而置于微量离心管(eppendrof)或其它容器中,以供后续实验。而在实验尚未进行的期间,可将处理后的粪便检体保存于-80℃备用。
萃取微核糖核酸(ExtractionofmicroRNA)
在本实验例中,以核糖核酸萃取试剂盒miRNeasyMiniKit(QIAGEN,CA,USA)萃取粪便检体中的总核糖核酸(TotalRNA),其包括微核糖核酸(microRNA)。首先,将前述处理后的粪便检体以高速离心去除杂质,并取300μL的上清液置入miRNeasyMiniKit所附的收集管中。并依据miRNeasyMiniKit所附的操作方法添加缓冲液,最后以30μL的去RNA酶水(RNase-freewater)流洗,以取得约30μL的总核糖核酸及微核糖核酸溶液,并可将其置于-80℃备用。
反转录反应(ReversetranscriptionPCR,RT-PCR)
接着,本实验例以TaqManmiRNAReverseTranscriptionKit(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)进行反转录聚合酶链反应(RT-PCR)。以前述萃取的总核糖核酸及微核糖核酸为模板(template),并反转录形成互补脱氧核糖核酸(cDNA)。本实验例于反转录聚合酶链反应中所使用的引物(primer)与后续定量聚合酶链反应所使用的引物与探针(probe)均由美商应用生命系统(AppliedBiosystem)公司的网站(http://bioinfo.appliedbiosystems.com/genome-database/mirna.html)输入对应的索引编号(AccessionNo.)后购得。本实验例中所使用的第一与第二微核糖核酸的反转录聚合酶链反应中所使用的引物与定量聚合酶链反应所使用的引物与探针所对应的索引编号如下表四所示:
表四:本实验例中所使用的微核糖核酸的反转录聚合酶链反应中所使用的反转录引物与定量聚合酶链反应所使用的PCR引物与探针所对应的索引编号:
微核糖核酸 |
索引编号 |
miR-223 |
MI0000300 |
miR-25 |
MI0000082 |
miR-93 |
MI0000095 |
miR-221 |
MI0000298 |
miR-222 |
MI0000299 |
miR-21 |
MI0000077 |
miR-141 |
MI0000457 |
miR-200c |
MI0000650 |
miR-191 |
MI0000465 |
miR-17 |
MI0000071 |
miR-148a |
MI0000253 |
miR-106a |
MI0000113 |
miR-195 |
MI0000489 |
miR-20a |
MI0000076 |
miR-181b |
MI0000270 |
miR-145 |
MI0000461 |
miR-155 |
MI0000681 |
miR-106b |
MI0000734 |
miR-24 |
MI0000080 |
miR-19b |
MI0000074 |
miR-130b |
MI0000748 |
miR-18a |
MI0000072 |
接着,再依据TaqManmiRNAReverseTranscriptionKit所提供的操作方法,将由上述方式购得的引物与总核糖核酸及微核糖核酸(模板)及其它反应试剂混合后,进行反转录反应。其中,反转录的反应步骤:以16℃处理30分钟;再以20℃处理30秒,42℃处理30秒,50℃处理1秒,并重复50个循环;最后,再以70℃处理10分钟,以取得互补脱氧核糖核酸(cDNA)。
定量聚合酶链反应(Quantitative-PCR)
本实验例以TaqManHumanMiRNAAssay(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)试剂盒进行定量聚合酶链反应(qPCR)。首先,将前述取得的互补脱氧核糖核酸(cDNA)作为定量聚合酶链反应的模板,并分别依据表四所示的索引编号至美商应用生命系统公司的网站所购得的引物添加对应的引物及探针,并依MicroRNA实验方案(2006年版,型号(产品号)4364031,Rev.B)设定定量聚合酶链反应所需各项参数,以检测对应的第一微核糖核酸及第二微核糖核酸,进而取得对应的微核糖核酸于评估对象的粪便检体中的浓度(拷贝/μl)或Cq值。
表五:实验例一的评估对象的第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量。
表五显示本实验例中所收集的6位确诊罹患结肠直肠癌及6位健康的人类个体的粪便检体的检测结果。其中,「样本编号」字段中,「N」表示为正常组,即健康的人类个体的粪便检体的检测结果;「CRC」表示为结肠直肠癌组,即确诊罹患结肠直肠癌的病患的粪便检体的检测结果。而本实验例各取6位作为正常组或结肠直肠癌组,分别1~6表示之。本实验例依据前述步骤分别取得评估对象(N1~N6及CRC1~CRC6)的粪便检体中的第一微核糖核酸(miR-223)及第二微核糖核酸(miR-221)的浓度后,便可根据第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例,评估个体罹患结肠直肠癌的风险。
依据表二所示可知,当第一微核糖核酸为miR-223,而第二微核糖核酸为miR-221时,其检测阈值为9.563,故若miR-223/miR-221的比值大于9.563则可评估为高风险,一般临床检测可称为阳性。若miR-223/miR-221的比值小于9.563则可评估为低风险,一般临床检测可称为阴性。而由表四可知,正常组(N1~N6)的miR-223/miR-221的比值皆小于3,评估为低风险,且结肠直肠癌组(CRC1~CRC6)的miR-223/miR-221的比值皆大于19,可评估为高风险。因此,由实验例一所示的结果可证实本评估方法确实可用于评估人类个体罹患结肠直肠癌的风险。
实验例二:本评估方法与免疫大便潜血试验进行评估的效果比较
在实验例二中,以实验例一中所收集的390位健康的人类个体及144位确诊罹患结肠直肠癌的粪便检体,并依据实验例一的采样方法及表达量的测量方法,检测粪便检体中如表一所列的第一微核糖核酸及第二微核糖核酸的浓度(表达量)。
接着,依据表二以第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的组合比例,以及各粪便样本来源所代表的个体是健康对照组或是结肠直肠癌患者以PASWStatistics18.0软件绘制接受者操作特征曲线(Receiveroperatingcharacteristiccurve,ROCcurve)并计算出接受者操作特征曲线下的面积(AreaUndertheROCcurve,AUC),以取得对应的约登指数做为检测阈值,而所述点代表其特异性(specificity)及敏感度(sensitivity)的和为最大值。ROC曲线下的面积(AreaUndertheROCcurve,AUC),其可用于衡量所用的评估方法正确鉴定的概率,而可用来确定检验的有效性,故亦可称为诊断准确度,以下以AUC值称之。实验例二的置信区间(confidenceinterval)设定在95%,而所得的p值小于0.05代表统计上有显著差异。
同样地,以相同的数据处理方法,直接将第一微核糖核酸及第二微核糖核酸的浓度以PASWStatistics18.0软件计算接受者操作特征曲线(ROCcurve),并取得对应的AUC值,并藉由比对AUC值,以评估本评估方法的有效性。在本实验例以及后续的实验例中,除有特别说明外,其所显示的AUC值的p值均小于0.05。
此外,本实验例中亦计算结肠直肠癌患者粪便检体中,表二所示的各个第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例,与健康正常组的大便中各个第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例,两者的间的倍数,并同时进行曼-怀二氏U检测(Mann-WhitneyUtest),若所得的p值(p-value)小于0.05则定义为有统计上显著差异。
在本实验例中,以表二所示的检测阈值为基准,第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例大于检测阈值者则判定为阳性(positive,P),而小于检测阈值的最高值者则判定为阴性(negative,N)。举例而言,miR-223/miR-221的比值大于9.563者,判定为阳性,而小于9.563者,则判定为阴性。接着,在判定阳性的粪便检体中,若来自于「144位确诊罹患结肠直肠癌」的粪便检体,则为「真阳性(truepositive,TP)」,若来自于「390位健康的人类个体」的粪便检体,则为「伪阳性(falsepositive,FP)」。同理,在判定阴性的粪便检体中,若来自于「390位健康的人类个体」的粪便检体,则为「真阴性(truenegative,TN)」,若来自于「144位确诊罹患结肠直肠癌」的粪便检体,则为「伪阴性(falsenegative,FN)」。将前述「真阳性(TP)」、「伪阳性(FP)」、「真阴性(TN)」、「伪阴性(FN)」的数量,计算出如表六所示的各个第一微核糖核酸及第二微核糖核酸的组合的敏感度(sensitivity)及特异性(specificity)。其中,敏感度指「TP/(TP+FP)」,即判定为阳性(P)的样本中,已确诊为结肠直肠癌的真阳性(TP),而特异性指「TN/(TN+FN)」,即判定为阴性(N)的样本中,来自于健康的人类个体样本的真阴性(TN)。
依据本实验例的上述实验方法使用表二中所示第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例进行评估的AUC值、检测阈值、敏感度及特异性如下所示。表中所列的AUC值均有统计上显著意义(p<0.05)。同时,表六中所列的第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例,在结肠直肠癌患者的粪便检体与健康正常组的粪便检体的比例(癌症患者/健康者的倍数)经统计后其p值均小于0.05,故显示表六中所列的第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例,在结肠直肠癌患者的粪便检体与健康正常组的粪便检体中具有显著差异。
表六:表二中所示第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例进行评估的检测阈值(范围)、特异性及敏感度
此外,将实验例一所收集的粪便样本进行免疫大便潜血测试发现,免疫大便潜血测试的敏感度及特异性分别为55.2%及66.2%。因此,由上表可得知,不论是使用miR-223与miR-221、miR-223与miR-222、miR-223与miR-93、miR-223与miR-141、miR-223与miR-148a、miR-223与miR-106a、miR-223与miR-20a、miR-223与miR-181b、miR-223与miR-155、miR-223与miR-106b、miR-223与miR-24、miR-223与miR-18a、miR-25与miR-222、miR-25与miR-21、miR-25与miR-200c、miR-25与miR-191、miR-25与miR-106a、miR-25与miR-181b、miR-25与miR-155、miR-25与miR-106b等组别的比例评估个体罹患结肠直肠癌的风险,相较于使用免疫大便潜血试验方法,均有较高的敏感度及特异性。故第一实施例的评估方法相较于免疫大便潜血试验方法,亦能更为有效地评估个体罹患结肠直肠癌的风险。
实验例三:本评估方法与使用单一微核糖核酸进行评估的效果比较
在实验例三中,其实验流程与数据计算整理皆可参照前述实验例二。在本实验例中,相较于使用单一微核糖核酸(第一微核糖核酸或第二微核糖核酸)的表达量进行评估,使用表二中所示的第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例会有较为良好的效果。举例而言,如表七所示的,miR-223/miR-221、miR-223/miR-222、miR-223/miR-21、miR-223/miR-93、miR-25/miR-221、miR-25/miR-222、miR-25/miR-21、miR-25/miR-93、miR-25/miR-141、miR-25/miR-200c、及miR-25/miR-191所得的AUC值(诊断准确度)大于单独使用第一微核糖核酸(miR-223、miR-25)或单独使用第二微核糖核酸(miR-221、miR-222、miR-21、miR-93、miR-141、miR-200c、miR-191)的AUC值(诊断准确度),显示使用前述这些第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的表达量的比例来评估人类个体罹患直肠结肠癌风险,相较于单独使用对应的第一微核糖核酸(miR-223、miR-25)或单独使用对应的第二微核糖核酸(miR-221、miR-222、miR-21、miR-93、miR-141、miR-200c、miR-191),来得更为有效。
表七:实验例二的评估对象的第一微核糖核酸与第二微核糖核酸的组合比例的AUC值
实验例四:表一所示的第一及第二微核糖核酸在不同检体的表达变化量的比较
实验例四比较表一所示的第一微核糖核酸及第二微核糖核酸分别在粪便检体、组织检体及血液检体中的表达改变程度。本实验例同样是以实验例一中所收集的144位确诊罹患结肠直肠癌者(结肠直肠癌组)及390位健康的人类个体(正常组)的粪便检体进行分析。而组织检体部分,则是收集81位确诊罹患结肠直肠癌者(结肠直肠癌组)的经手术癌化组织检体及同一患者非病灶组织(正常组)的结肠组织检体进行分析。血液检体部分,则是抽取215位确诊罹患结肠直肠癌者(结肠直肠癌组)的血液检体及173位健康的人类个体(正常组)的血液检体进行分析。并将所收集到的检体依据实验例一的操作步骤,进行微核糖核酸萃取、反转录反应及定量聚合酶链反应,以取得粪便检体、组织检体及血液检体中的各第一微核糖核酸及第二微核糖核酸的表达量。
接着,分别计算不同检体中,同一微核糖核酸(如miR-223)于结肠直肠癌组与正常组的表达量的比值,并以正常组作为分母,以取得相较于正常组的倍数(Fold),同时进行曼-怀二氏U检测(Mann-WhitneyUtest),若所得的p值(p-value)小于0.05则定义为有统计上显著差异。因此,若结肠直肠癌组与正常组的表达量相同,则比值为1;若结肠直肠癌组的表达量较高,比值大于1;或正常组的表达量较高,则比值介于0~1之间。其它细节操作步骤可参考前述,于此不加赘述。
表八:微核糖核酸分别在粪便检体、组织检体及血液检体中的表达改变程度
由表八可知,表一所示的第一与第二微核糖核酸,在不同的组织检体中,其表达改变程度不一样,且于某一种检体中其改变倍数有统计上差异者,亦不必然在其它种检体中有统计上的差异(例如miR-155、miR-181b、miR-24)。因此,适用于针对组织检体或血液检体来评估个体罹患结肠直肠癌风险的微核糖核酸,不必然就适用于粪便检体中。
此外,若将表一中所示的各微核糖核酸,即便在粪便检体中,其表达改变程度亦非均有统计上差异。所以若是仅用表一中所列的各微核糖核酸的的表达改变程度,亦非均能有效评估个体罹患结肠直肠癌的风险。相较之下,如表六所示,本发明第一实施例的评估方式,利用第一微核糖核酸及第二微核糖核酸表达量的比例的方法,即能将原本无法单一适用于粪便检体中的微核糖核酸,转化为能够作为有效评估的标记。
实验例五:第二实施例的评估方法可减少伪阴性的错误评估
以第二实施例的评估方法来评估个体罹患结肠直肠癌的风险时,即先以第一微核糖核酸的表达量评估后,再以比例计算的方式评估罹患结肠直肠癌的风险,相较于直接使用对应的第一微核糖核酸来评估(即表九「第一微核糖核酸/第二微核糖核酸」字段未显示内容者),可降低其伪阴性。其结果如下表九所示。
表九:第二实施例的评估方法与单纯使用对应的第一微核糖核酸的敏感度
第一微核糖核酸 |
第一微核糖核酸/第二微核糖核酸 |
敏感度(%) |
miR-223 |
- |
63.9 |
miR-223 |
miR-223/miR-21 |
85.4 |
miR-223 |
miR-223/miR-200c |
84.7 |
miR-223 |
miR-223/miR-191 |
84.0 |
miR-223 |
miR-223/miR-130b |
82.6 |
miR-223 |
miR-223/miR-221 |
79.9 |
miR-223 |
miR-223/miR-20a |
79.9 |
miR-223 |
miR-223/miR-19b |
79.9 |
miR-223 |
miR-223/miR-141 |
79.2 |
miR-223 |
miR-223/miR-24 |
79.2 |
miR-223 |
miR-223/miR-17 |
78.5 |
miR-223 |
miR-223/miR-222 |
77.1 |
miR-223 |
miR-223/miR-181b |
77.1 |
miR-223 |
miR-223/miR-195 |
76.4 |
miR-223 |
miR-223/miR-106a |
75.0 |
miR-223 |
miR-223/miR-148a |
72.9 |
miR-223 |
miR-223/miR-106b |
72.9 |
miR-223 |
miR-223/miR-18a |
72.9 |
miR-223 |
miR-223/miR-155 |
72.2 |
miR-223 |
miR-223/miR-145 |
71.5 |
miR-223 |
miR-223/miR-93 |
70.1 |
第一微核糖核酸 |
第一微核糖核酸/第二微核糖核酸 |
敏感度(%) |
miR-25 |
- |
61.11 |
miR-25 |
miR-25/miR-20a |
72.92 |
miR-25 |
miR-25/miR-195 |
81.25 |
miR-25 |
miR-25/miR-106a |
70.83 |
miR-25 |
miR-25/miR-222 |
69.44 |
miR-25 |
miR-25/miR-200c |
68.06 |
miR-25 |
miR-25/miR-21 |
67.36 |
miR-25 |
miR-25/miR-106b |
67.36 |
miR-25 |
miR-25/miR-221 |
66.67 |
miR-25 |
miR-25/miR-155 |
65.97 |
miR-25 |
miR-25/miR-191 |
65.28 |
miR-25 |
miR-25/miR-24 |
65.28 |
miR-25 |
miR-25/miR-130b |
64.58 |
miR-25 |
miR-25/miR-19b |
63.89 |
miR-25 |
miR-25/miR-181b |
63.19 |
miR-25 |
miR-25/miR-145 |
63.19 |
miR-25 |
miR-25/miR-18a |
63.19 |
miR-25 |
miR-25/miR-17 |
62.50 |
miR-25 |
miR-25/miR-141 |
61.81 |
miR-25 |
miR-25/miR-93 |
61.11 |
miR-25 |
miR-25/miR-148a |
61.11 |
第一微核糖核酸 |
第一微核糖核酸/第二微核糖核酸 |
敏感度(%) |
miR-93 |
- |
50.69 |
miR-93 |
miR-93/miR-17 |
90.97 |
miR-93 |
miR-93/miR-155 |
90.97 |
miR-93 |
miR-93/miR-106a |
77.08 |
miR-93 |
miR-93/miR-181b |
77.08 |
miR-93 |
miR-93/miR-18a |
75.69 |
miR-93 |
miR-93/miR-19b |
74.31 |
miR-93 |
miR-93/miR-20a |
65.97 |
miR-93 |
miR-93/miR-24 |
62.50 |
miR-93 |
miR-93/miR-195 |
61.11 |
由上表可知,以第二实施例的评估方法来评估个体罹患结肠直肠癌的风险时,其敏感度相较于直接使用对应的第一微核糖核酸来得高,故显示其可有效降低单纯使用第一微核糖核酸所产生的伪阴性。
实验例六:第一实施例及第三实施例的评估方法与免疫大便潜血试验的比较
本实验例中所使用的粪便检体的收集与采样、免疫大便潜血试验、各微核糖核酸的萃取、反转录反应及定量聚合酶链反应、各微核糖核酸表达量比例的计算,其所使用的材料及实验方式如同实验例一中所述。此外,由于进行性息肉(advancedpolyps)亦有相当风险发展为结肠直肠癌,故本实验例中亦经由结肠镜检(colonoscopy)后判定为进行性息肉(advancedpolyps)的27位个体采集其粪便检体,一并纳入分析。
其实验结果如图4所示,图4为本发明第三实验例的各评估方法的实验结果图。同前所述,免疫大便潜血试验的对结肠直肠癌的敏感度及特异性分别为55.2%及66.2%。由图中可知而第三实施例中所述(使用miR-93与miR-155的表达量的第一比例、miR-223与miR-221的表达量的第二比例,及/或miR-223与miR-222的表达量的第三比例进行评估)的评估方法,其特异性为70.51%,而其对于结肠直肠癌样本的敏感度则为70.14%,对于进行性息肉样本的敏感度则为70.37%。因此,以前述第三实施例中所述的评估方法,评估个体罹患结肠直肠癌的风险时,可同时减少由免疫大便潜血试验所造成的伪阳性及伪阴性的错误评估。
再者,若与仅使用单一比例进行评估相较,使用miR-223/miR-221或miR-223/miR-222进行评估,其对进行性息肉样本的敏感度分别仅为18.52%及29.63%,均低于第三实施例的评估方法对于进行性息肉样本的敏感度(70.37%)。相对地,使用miR-155/miR-93进行评估,其特异性仅为45.13%,低于第三实施例的评估方法的特异性(70.51%)。因此,相较之下,第三实施例的评估方法可以在维持其特异性的情况下,同时保持对进行性息肉样本与结肠直肠癌样本的良好敏感度。故第三实施例的评估方法,更能有效地评估个体罹患结肠直肠癌的风险。
以上所述仅为举例性,而非为限制性。任何未脱离本发明的精神与范畴,而对其进行的等效修改或变更,均应包括于后附的权利要求中。