CN105779573A - 适用于检测转基因抗虫棉花的质粒标准分子及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种质粒标准分子，所述质粒标准分子包括Cry1A基因，CPTI基因，polyA序列，35S启动子序列和NOS终止子序列。本发明还公开了制备所述质粒标准分子的方法和包含所述质粒标准分子的试剂盒。利用本发明的质粒标准分子和/或试剂盒，能够快速、简便准确的检测转Bt基因和/或CPTI基因的棉花。

Description

适用于检测转基因抗虫棉花的质粒标准分子及其用途

技术领域

本发明涉及转基因植物领域，具体的，本发明涉及适用于检测转基因抗虫棉花的质粒标准分子及其用途，更具体的，本发明涉及一种质粒标准分子、质粒标准分子在检测农作物中的CPTI外源基因和Bt外源基因中的用途、质粒标准分子的制备方法、一种试剂盒以及试剂盒在PCR检测转Bt和CPTI双价抗虫基因棉花中的用途。

背景技术

棉花是我国重要的经济作物，在全球经济中起着中流砥柱作用。中国在1997年就已经开始有转基因植物获得安全证书，到目前为止已有8种植物获批，抗虫棉花是最早获批的其中之一。

BT基因即是苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis，简称Bt)基因，因其杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的杀虫微生物。美国孟山都公司把Bt基因插入棉花植株获得了转基因棉花植株，经与农业研究局和一些大学科学家连续两年的田间试验，防治虫害效果良好。我国“抗虫棉”研究在“七五”期间开始进行，“八五”期间，在“863”计划资助下，人工合成的CryIA(b)和CryIA(c)杀虫基因导入我国棉花主栽品种获得成功，成为继美国之后，第二个拥有自主研制抗虫棉的国家。

转基因产品的安全性一直备受关注，因此转基因产品的定量、定性检测尤为重要，转基因标准物质的使用是转基因产品检测结果的有效和可比的的重要保证，质粒标准分子是转基因标准物质中的一种。

发明内容

依据本发明的一方面，本发明提供一种质粒标准分子，所述质粒标准分子包括CryIA基因，CPTI基因，polyA序列，35S启动子序列和NOS终止子序列。所述质粒标准分子能够用于检测转基因作物中的CryIA外源基因和/或CPTI外源基因。在本发明的一个实施例中，所述质粒标准分子的结构示意图如图1，包括依次连接的35S启动子序列，CryIA基因，polyA序列，NOS终止子序列，35S启动子序列，CPTI基因和NOS终止子序列。任选的，还包含LacZ基因，以在含有IPTG，X-gal的平板培养基上，能够进行蓝白斑筛选。本发明一方面或者任一具体实施方式中质粒标准分子，能够用于快速、简便和准确地检测转基因农作物特别是转双价抗虫基因棉花。

依据本发明的另一方面，本发明提供了上述质粒标准分子在检测农作物中的CPTI外源基因和以下至少之一的Bt外源基因中的用途：CryIAa，CryIAb，CryIAc和CryIAab/ac。在本发明的一个实施例中，所述农作物为转Bt和/或CPTI抗虫基因棉花。

依据本发明的再一方面，本发明提供一种上述质粒标准分子的制备方法，所述方法包括：(1)获取Bt-CpTI基因表达质粒；(2)酶切所述表达质粒，获得Bt-CpTI基因片段；(3)将所述Bt-CpTI基因片段连接到克隆载体上，获得所述质粒标准分子。在本发明的一个实施例中，所述表达质粒的结构示意图如图2所示，包括依次连接的35S启动子序列，CryIA基因，polyA序列，NOS终止子序列，35S启动子序列，CPTI基因和NOS终止子序列。所说的Bt-CpTI基因片段为或者包括，依次连接的35S启动子序列、CryIA基因、polyA序列、NOS终止子序列、35S启动子序列、CPTI基因和NOS终止子序列。在本发明的一个实施例中，表达质粒中的Bt-CpTI基因片段的两端分别含有ECOR1和HindIII酶切位点，所以所述酶切为ECOR1和HindIII双酶切。所说的克隆载体为常规的克隆载体，例如可以为pEASY-T3。利用本发明这一方面的质粒标准分子制备方法，能够简单快速的制备出所说的质粒标准分子。

依据本发明的又一方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明一方面或者上述任一具体实施方式中的质粒标准分子。在本发明的一个实施例中，所述试剂盒还包括SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，SEQIDNO：3和SEQIDNO：4。其中，SEQIDNO：1和SEQIDNO：2能够与各种类型的Bt基因进行特异性识别，用于各种类型Bt基因序列的扩增，SEQIDNO：3和SEQIDNO：4能够分别与CPTI基因上的不同位置特异性结合，用作特异性扩增CPTI基因的引物。

依据本发明的一方面，本发明还提供上述试剂盒在PCR检测转抗虫Bt和CPTI基因棉花中的用途。上述对本发明一方面的质粒标准分子的优点和技术特征的描述，也同样适用本发明这一方面的试剂盒和/或试剂盒的用途，在此不再赘述。

本发明的质粒标准分子和/或试剂盒，能够方便快捷的对转基因抗虫农作物进行检测。利用本发明的质粒标准分子的制备方法，能够快速获得所说的质粒标准分子。另外，本发明还建立一套高效的棉花基因组DNA提取方法，使得基因组DNA纯度达到OD260/280为1.8-2.0，提供2对适用转基因农作物分子鉴定的筛选引物，特别适用棉花品种。

附图说明

图1是本发明的一个实施例中的质粒标准分子的结构示意图；

图2是本发明的一个实施例中的Bt-CpTI基因表达质粒的结构示意图；

图3是本发明的一个实施例中的PCR鉴定转基因棉花核酸中的外源Bt基因的电泳图，其中前三泳道分别为marker、阳性对照(带Bt基因)、阴性对照(不带Bt基因)，编号1-10泳道分别为10株不同棉花转Bt-CpTI基因单株；

图4是本发明的一个实施例中的PCR鉴定转基因棉花核酸中的外源CpTI基因的电泳图，其中前三泳道分别为marker、阳性对照(带Bt基因)、阴性对照(不带Bt基因)，编号1-10泳道分别为10株不同棉花转Bt-CpTI基因单株。

具体实施方式

下面示例，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。除另有交待，实施例中未注明具体技术或条件的，可按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。实施例中涉及的未特别交待的受体、酶试剂、PCR试剂、序列(接头、标签和引物)及仪器，都是常规市售产品，比如石远321可购自河北神农高科技股份有限公司，pEASY-T3可购自北京全式金生物技术有限公司等。

实施例一双价抗虫转基因棉花

1.获取Bt-CpTI基因表达质粒

可参照[郭三堆,崔洪志,抗虫棉GFMCry1A杀虫基因的合成及表达载体构建,中国农业科技导报,2000年,第2期]合成或获得抗虫基因及构建表达载体，获得Bt-CpTI基因表达质粒(以下表示为pGBI14ABC)，图2展示其结构示意图，pGBI14ABC包含Bt杀虫基因和修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因，且带有多个表达调控元件。

2.双价抗虫转基因棉花

1)受体棉花为石远321，将上一步骤的BT-CPTI基因表达质粒通过农杆菌介导法导入到石远321。

2)PCR鉴定外源基因是否导入成功，图3和图4分别为PCR鉴定转基因棉花核酸的电泳图，分别显示在1.8kb和270bp左右有特异性条带，对应Bt和CpTI基因，表明成功获得双价抗虫基因，PCR使用的Bt基因的特异性扩增引物为

5’-CCTCTTCTAACTTGCCCTCCGC-3’(SEQIDNO：1)和

5’-CACCCACGATGTTACCGAGTG-3’(SEQIDNO：2)，特异性扩增CPTI基因的引物序列为5’-GATTTGAAGCACCTCGGAAG-3’(SEQIDNO：3)和

5’-CTCATCATCTTCATCCCTGG-3’(SEQIDNO：4)，这两对引物是通过多次重复验证，最终确定下来的，这两对引物可作为转抗虫(Bt+CpTI)基因棉花品种筛选鉴定的引物。

对经过PCR鉴定为阳性的转基因棉花(以下称为SGK321)进行生物性杀虫试验，结果证明其具有抗棉铃虫特性。

实施例二质粒标准分子的制备

以pEASY-T3为载体，利用ECOR1和HindIII双酶切实施例一的Bt-CpTI基因表达盒(表达质粒)，连接构建标准分子。

1.双酶切预计获得的Bt-CpTI重组片段为4635bp，包括Bt(1.8kb)、CpTI(275bp)，连接两个片段的酶切位点ECORI，和插入片段两端的酶切位点HindIII和ECORI。

双酶切反应体系：无菌水37.5μL，表达质粒5μL(浓度为0.09ug/ul)，10XNEBuffer25μL,100XBSA0.5μL，EcoRV1μL，HindIII1μL，将上述加到0.5mlEppendorf管中，混匀后，轻轻离心10秒，37度保温1-1.5小时，然后取出10μl,加2μlLoadingbuffer(上样缓冲液)进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，电泳结果显示在大约4600bp处有条带，基本说明双酶切能够获得Bt-CpTI目的重组片段。

2.重组片段与载体连接

将上述Bt-CpTI基因片段与棉花基因Sadl连接，在连接片段的两端添加Apal、Aatll、Sphl、Sall、Ndel、Sacl、BstXl、Nsil和M13R酶切位点后，按照试剂盒说明书将所得片段插入pEASY-T3克隆载体，完成标准分子的构建。图1示意构建的质粒标准分子的结构。

3.检测所构建的质粒标准分子

根据插入片段(含两端酶切位点)设计引物，进行PCR扩增，将扩增结果进行测序，并对测序结果与设计序列进行匹配比对，结果完全吻合，经测序及PCR扩增，获得与预期片断大小及序列一致的目的基因片段,证明所构建的质粒标准分子是正确的，可以用来作为不同品种转基因农作物定性检测Cry1A基因和CpTI基因的通用阳性标准分子。

实施例三质粒标准分子在检测转基因抗虫棉花中的应用

1.提取转基因棉花基因组DNA

1)取SGK321的种子，去壳备用。

2)试验时，取材料约2g，立即放入冰冻过的研钵中，迅速在种子上均匀撤上约50mg的DIECA晶体，加入液氮后，快速研磨成粉末状。

3)快速装入50ml的离心管，加入60℃的水中预热过的提取液12ml(0.1mol/LTris-HC1pH8.0，0.02mol/LEDTApH8.0，1.5mol/LNaC1，2％PvP40<w/v)，2％CTAB(w/v)，临用前加2％的β-巯基乙醇)，加约50mg活性炭，混匀，60℃水浴40min。

4)取出离心管，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1，v/v)，盖上盖子后，缓慢上下颠倒离心管30～50次。之后，平衡离心管，8000rpm离心10min。

5)取上清于50ml离心管中，加等体积的氯仿:异戊醇(24:1，v/v)，重提2次。

6)重取上清，加0.6倍体积的冰冷异丙醇，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结。静止30min后，8000rpm离心5min

7)倾去上清，用70％的酒精洗2～3次，100％的酒精洗1次，将沉淀转到8ml离心管中，风干。

8)加2mlTE(10mmol/LTris-HCI，1mmol·LEDTA，pH8.0)，65℃的水浴中溶解20min或过夜。

9)加20ul无DNA酶的RNA酶A(10g/L)，37℃保温1h。

10)加等体积的氯仿:异戊醇(24:1，v/v)，缓慢颠倒离心管30～50次，平衡离心管，8000rpm离心10min。

11)取上清，加0.1倍体积的3mol/LNaAc(pH5.2)，混匀后，缓慢加入2倍体积的冰冷的无水乙醇，静止5min后，缓缓水平转离心管5min，此时，将于界面处形成一团粘稠的透明的含有许多气泡的絮状沉淀，将此沉淀轻轻钩出，转到1.5ml的eppendoff管中。

12)加lml70％的酒精，12000rpm离心10min，倾去酒精，再用70％、100％的酒精洗一次，风干。

13)溶于200～500ul的TE中，于-20℃或-70℃的冰箱中保存备用。

2.质粒标准分子DNA提取

可参照已有技术进行。

3.转基因棉花和质粒标准分子DNA检测

电泳检测，根据条带的亮度和扩散程度判断DNA质量，利用紫外分光光度法测定所提DNA的浓度和纯度。棉花富含棉酚、多糖、单宁等其它干扰物质，在细胞破碎时，棉酚等多酚类物质自动氧化，然后跟蛋白质、核酸等发生不可逆反应，结果形成棕色胶状复合物，从而难以获得高质量的DNA。棉籽仁中含有大约87％的蛋白、脂肪和糖类，剩下不足13％的水分、灰分、纤维素和其它。从中能够提出高质量、高效率的DNA是非常困难的。发明人总结了前人提取种子基因组DNA的经验，提出如上述一套高效提取棉花种子基因组DNA的方法，使得提取的基因组DNA纯度达到OD_260/280为1.8-2.0。

4.待测转基因棉花PCR反应

PCR引物可利用前面序列，取PCR产物进行电泳，根据电泳结果是否出现特异性条带，判断该待测转基因棉花是否含有相应的Bt和CpTI外源基因。Bt和CpTI外源基因可一起测也可分别测。

Claims (10)

1.一种质粒标准分子，其特征在于，所述质粒标准分子包括Cry1A基因，CPTI基因，polyA序列，35S启动子序列和NOS终止子序列。

2.权利要求1的质粒标准分子，其特征在于，所述质粒标准分子包括依次连接的35S启动子序列，Cry1A基因，polyA序列，NOS终止子序列，35S启动子序列，CPTI基因，NOS终止子序列；

任选的，所述质粒标准分子包含LacZ基因。

3.权利要求1或2的质粒标准分子在检测农作物中的CPTI外源基因和以下至少之一的Bt外源基因中的用途：Cry1Ab，Cry1Ac和Cry1Ab/Ac。

4.权利要求3的用途，其特征在于，所述农作物为转Bt和/或CPTI基因的棉花。

5.权利要求1或2的质粒标准分子的制备方法，其特征在于，包括，

(1)获取Bt-CpTI基因表达质粒；

(2)酶切所述表达质粒，获得Bt-CpTI基因片段；

(3)将所述Bt-CpTI基因片段连接到克隆载体上，获得所述质粒标准分子。

6.权利要求5的方法，其特征在于，所述表达质粒包括依次连接的35S启动子序列，CryIA基因，polyA序列，NOS终止子序列，35S启动子序列，CPTI基因和NOS终止子序列。

7.权利要求5的方法，其特征在于，所述酶切为EcoR1和HindIII双酶切。

8.权利要求5的方法，其特征在于，所述克隆载体为pEASY-T3。

9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2的质粒标准分子；

任选的，所述试剂盒包括SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，SEQIDNO：3和SEQIDNO：4。

10.权利要求9的试剂盒在PCR检测转Bt和/或CPTI抗虫基因棉花中的用途。