CN105770010A - 一种抗肿瘤联合免疫用药物及其制备方法、用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤联合免疫用药物，所述抗肿瘤联合免疫用药物由胡桃萃取物、香艾萃取物和丁香萃取物为原料；所述胡桃萃取物、香艾萃取物和丁香萃取物的重量配比为77∶54∶98。该抗肿瘤联合免疫用药物能抑菌杀菌、增强机体免疫力、具有较强的抗癌活性、能防止肿瘤复发。本发明的抗肿瘤联合免疫用药物通过超临界流体制备，安全无副作用，提取过程无破坏原植物生物活性成分，还将其生物活性成分制成比表面积大的萃取物，有利于体内溶出和人体吸收。

Description

一种抗肿瘤联合免疫用药物及其制备方法、用途
技术领域
本发明属于药物领域，更具体地说，它涉及一种抗肿瘤联合免疫用药物及其制备方法、用途。
背景技术
恶性肿瘤常称癌症，是严重威胁人类健康的常见病、多发病。目前治疗恶性肿瘤的三大主要方法为化学治疗(简称化疗)、手术治疗和放射治疗。恶性肿瘤的发生发展与机体免疫功能密切相关。放、化疗治疗方法会使机体免疫功能不断下降，影响治疗效果。
授权公告号为CN1997361B的中国专利公开了一组抗肿瘤药物，这种抗肿瘤药物和大部分化疗、手术治疗和放疗一样，其虽然可以杀死肿瘤细胞，但是其在杀灭肿瘤细胞的同时也同时杀死了其正常细胞，这导致患者的免疫力下降，影响了治疗效果，也增加了肿瘤复发的概率。
授权公告号为CN103301201B的中国专利公开了一种提高免疫力辅助抗肿瘤的中草药复方，这种中草药复方虽然在一定程度上可以提高免疫力，但是其无法修复患者原治疗破坏的免疫力，且这种中草药和抗肿瘤药物的配伍性较差。
如何在最大限度杀灭肿瘤细胞的同时，修复并提高机体的免疫功能，使机体正常或强化了免疫细胞杀灭残存的肿瘤细胞是治疗肿瘤的关键。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种能抑菌杀菌、增强机体免疫力、具有较强的抗癌生物活性、能防止肿瘤复发的抗肿瘤联合免疫用药物。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种抗肿瘤联合免疫用药物，所述抗肿瘤联合免疫用药物由胡桃萃取物、香艾萃取物和丁香萃取物为原料；所述胡桃萃取物、香艾萃取物和丁香萃取物的重量配比为77∶54∶98。
作为优选，所述胡桃为黑胡桃，香艾为中亚苦蒿，丁香为公丁香。
胡桃，为胡桃科植物JulansregiaL.。本发明的胡桃萃取物是用北美洲黑胡桃(BlackWalnut，JuglansnigraL)的内皮萃取制成，其含有胡桃醌、黄酮类物质、鞣质、多糖、没食子酸，挥发油、植物粘胶、白蛋白、矿物质、纤维素、亚油酸、甘油酯、亚麻酸、油酸甘油酯、核黄素、胡萝卜素、水杨梅丁素、木麻黄素、刺玫果素，研究发现其活性成分的比例不同均能达到本发明的目的，且通过本发明的制备方法制备的胡桃萃取物的效果最佳。
香艾，又名艾叶、艾蒿、蕲艾或家艾，为菊科植物艾ArtemisiaargyiLevl.etVant.的干燥叶。其辛、苦，温；有小毒，能散寒止痛，温经止血。本发明的香艾萃取物优选用北美洲中亚苦蒿(woormwood，或Artemisiaabsinthium)的全草萃取制成，其主要成分为挥发油，油中有萜品烯醇-4(Terpinenol-4)、β-石竹烯(β-Caryophyllene)、蒿醇(Artemisiaalcohol)、芳樟醇(Linalool)、樟脑(Camphorae)、龙脑(冰片，Borneol)、桉油素(Cineol，Eucalyptol)及反式-葛缕醇、α-萜品烯醇等，又含多糖类物质、鞣酸、侧柏酮、水芹烯、β-谷甾醇、5，7-二羟基-6，3′4′-三甲基黄酮，研究发现其活性成分的比例不同均能达到本发明的目的，且通过本发明的制备方法制备的香艾萃取物的效果最佳。
丁香，别名熊丁香或公丁香，为桃金娘科植物丁香EugeniacaryophyllataThumb.的干燥花蕾。其辛、温，温中降逆，补肾助阳。本发明的丁香萃取物优选用主产地为澳大利亚和美洲的热带和亚热带地区的公丁香Eugeniacaryphyllata的干燥的尚未开放的花蕾萃取制成，其主要成分为挥发油，油中主含丁香酚(Eugenol)、丁香烯(Caryophyllene)、乙酸丁香酚(Acetyleugenol)，还含有庚酮-2(Methyl-n-amyl-Ketone)、水杨酸甲醛、α-丁香烯、衣兰烯(Ylangene)、胡椒酚(Chavicol)、丁香子酚、丁香子酚乙酸酯、齐墩果酸、山柰酚、鼠李素、苯并吡酮类化合物番樱桃素(Eugenin)、番樱桃素亭(Eugenitin)、异番樱桃素亭(Isoeugenitin)、异番樱桃酚(Isoeugenitol)、谷甾醇、鞣质、香草醛、绿叶蜡质、有机酸类、黄酮类、蛋白质等，研究发现其生物活性成分的比例不同均能达到本发明的目的，且通过本发明的制备方法制备的丁香萃取物的效果最佳。
研究发现，本发明的抗肿瘤联合免疫用药物，其胡桃萃取物、香艾萃取物和丁香萃取物的重量配比为77∶54∶98，其组合增效：
(1)对肿瘤患者能起到缓解和改善症状的作用，增加其生存质量，如缓解疼痛、增加食欲、镇痛补血；
(2)抑菌杀菌、抗病毒，具有较强的抗氧化性和羟自由基清除能力，增强肿瘤患者对抗其他新疾病的能力；
(3)对于血液系统能直接刺激骨髓干细胞的分裂、分化和成熟，维持体内正常白细胞数量和血小板数量抗炎和止血的功效，能刺激细胞免疫调节因子，增强细胞免疫活性；还能调节机体内环境、恢复正常的生理平衡，确保肿瘤的治疗能正常开展；
(4)与肿瘤细胞有着极强亲和力，能修饰肿瘤细胞，能改变恶性细胞膜的特性，对肿瘤细胞有极强的杀伤作用，其具有较强的抗癌活性，能干预肿瘤细胞的分裂周期，使肿瘤细胞的生长停滞在分裂前期，可使肿瘤缩小，甚至消失；
(5)能修复其因化疗等受损的免疫力，提高低下的免疫功能或抑制亢进的免疫功能，调节机体内环境、维持机体免疫功能平衡，防止肿瘤复发。
作为优选，所述药物的制剂为胶囊剂。
以胶囊剂给药，有利于保证本发明的抗肿瘤联合免疫用药物能准确、方便给药，有利于控制。
研究发现，将胡桃萃取物、香艾萃取物、丁香萃取物和紫杉醇联合用时，其抗肿瘤能力能进一步增加。
本发明的目的还在于提供一种所述的抗肿瘤联合免疫用药物的制备方法，所述方法包括胡桃萃取物胶囊的制备、香艾萃取物胶囊的制备和丁香萃取物胶囊的制备；所述胡桃萃取物胶囊、香艾萃取物胶囊和丁香萃取物胶囊的制备均包括：
S1，取原料进行筛选和清洗，将干净的原料通过减压冷浸法软化；
S2，取经S1步软化的原料，超临界流体萃取，分离得到萃取液与残渣；
S3，取S2步得到的残渣，将其粉碎研磨；
S4，取S2步得到的萃取液，将其喷雾干燥，喷雾干燥的过程中加入S3步得到的粉碎研磨后的残渣，得到干燥的原料萃取物；
S5，取配方量的S4步得到的原料萃取物，填充至胶囊壳内，得到胶囊。
本发明采用减压冷浸软化法，借负压的作用将水迅速吸入，加速药材的软化，确保在常温下用水软化药材，缩短浸润时间，减少有效成分的流失、破坏和药材的霉变。
本发明采用超临界流体萃取技术萃取药用植物，其超临界流体萃取的流体为二氧化碳，其萃取温度为30～40℃，能避免挥发油等成分在萃取过程中的挥发，能最大程度的保持药用植物的有效生物活性成分；同时因为过程中不适用有机溶剂，无溶剂残留，保证了原料的纯天然性，环保，安全无副作用。
本发明采用喷雾干燥将本发明的原料萃取液快速干燥，得到的产品粒度细小、均匀，流动性好，增加了其比表面积，有利于其在机体内的溶出，有利于人体吸收。原料萃取液经喷雾干燥后得到细小的颗粒物质，由于其含有糖类、蛋白质、淀粉等黏性较大的物质，本发明在原料萃取液喷雾干燥的过程中加入其原料的残渣，原料的残渣能吸附经喷雾干燥的原料萃取液，且经喷雾干燥的原料萃取液与原料的残渣的结合力较强，能防止其出现粘壁的情况；同时充分利用原料药，未添加其他外加辅料，有利于保存其纯天然性。
通过上述制备得到的胶囊，安全无副作用，提取过程无破坏原植物活性成分，还能充分将其活性成分制成比表面积大的萃取物，有利于体内溶出和人体吸收；同时使用该方法，能避免生产过程中产生的粘壁现象等。
研究发现，优选S1中，所述减压冷浸法的温度为10～40℃，压强为-0.1～-0.09MPa；
S2中，所述超临界流体萃取的流体为二氧化碳，萃取温度为30～40℃；
S4中，所述喷雾干燥的温度为40～80℃，干燥时间为3～60S；所述原料萃取物的颗粒度为10～60μm；
S5中，所述胶囊壳为天然植物胶囊壳。
本发明的目的还在于提供一种所述的抗肿瘤联合免疫用药物的制备方法，所述方法包括黑胡桃萃取物胶囊的制备、中亚苦蒿萃取物胶囊的制备和丁香萃取物胶囊的制备；所述黑胡桃萃取物胶囊的制备方法均包括：
所述方法包括胡桃萃取物胶囊的制备、香艾萃取物胶囊的制备和丁香萃取物胶囊的制备；所述胡桃萃取物胶囊的制备包括：
S1，取胡桃筛选、清洗，将干净的胡桃的内皮通过减压冷浸法软化；所述减压冷浸法的温度为10～40℃，压强为-0.1～-0.09MPa；
S2，取经S1步软化的胡桃，超临界流体萃取，分离得到胡桃萃取液与胡桃残渣；所述超临界流体萃取的流体为二氧化碳，萃取温度为30～40℃；
S3，取S2步得到的胡桃残渣，将其粉碎研磨；
S4，取S2步得到的胡桃萃取液，将其喷雾干燥，喷雾干燥的过程中加入S3步得到的粉碎研磨后的胡桃残渣，得到干燥的胡桃萃取物；所述喷雾干燥的温度为40～80℃，干燥时间为3～60S；所述胡桃萃取物的颗粒度为10～60μm；
S5，取77份S4步得到的胡桃萃取物，填充至天然植物胶囊壳内，得到胡桃萃取物胶囊；所述香艾萃取物胶囊的制备包括：
S1，取香艾筛选、清洗，将干净的香艾的全草通过减压冷浸法软化；所述减压冷浸法的温度为10～40℃，压强为-0.1～-0.09MPa；
S2，取经S1步软化的香艾，超临界流体萃取，分离得到香艾萃取液与香艾残渣；所述超临界流体萃取的流体为二氧化碳，萃取温度为30～40℃；
S3，取S2步得到的香艾残渣，将其粉碎研磨；
S4，取S2步得到的香艾萃取液，将其喷雾干燥，喷雾干燥的过程中加入S3步得到的粉碎研磨后的香艾残渣，得到干燥的香艾萃取物；所述喷雾干燥的温度为40～80℃，干燥时间为3～60S；所述香艾萃取物的颗粒度为10～60μm；
S5，取54份S4步得到的香艾萃取物，填充至天然植物胶囊壳内，得到香艾萃取物胶囊；所述丁香萃取物胶囊的制备包括：
S1，取丁香筛选、清洗，将干净的丁香的尚未开放的花蕾通过减压冷浸法软化；所述减压冷浸法的温度为10～40℃，压强为-0.1～-0.09MPa；
S2，取经S1步软化的丁香，超临界流体萃取，分离得到丁香萃取液与丁香残渣；所述超临界流体萃取的流体为二氧化碳，萃取温度为30～40℃；
S3，取S2步得到的丁香残渣，将其粉碎研磨；
S4，取S2步得到的丁香萃取液，将其喷雾干燥，喷雾干燥的过程中加入S3步得到的粉碎研磨后的丁香残渣，得到干燥的丁香萃取物；所述喷雾干燥的温度为40～80℃，干燥时间为3～60S；所述丁香萃取物的颗粒度为10～60μm；
S5，取98份S4步得到的丁香萃取物，填充至天然植物胶囊壳内，得到丁香萃取物胶囊；所述胡桃为黑胡桃，香艾为中亚苦蒿，丁香为公丁香。
本发明的抗肿瘤联合免疫用药物中，黑胡桃萃取物胶囊、中亚苦蒿萃取物胶囊和公丁香萃取物胶囊分开制备，一方面可以避免三种植物在处理过程中的相互干扰，有利于保证产品质量；另一方面在治疗时，可以根据需求而灵活给药，适于不同类型的病人。
本发明的目的还在于提供一种所述的抗肿瘤联合免疫用药物用以制备预防或治疗癌症的药物的用途，所述癌症包括肠癌、乳癌、胃癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、肾癌、淋巴瘤、白血病、皮肤癌、黑色素瘤、间质细胞瘤、骨髓瘤或脑星形细胞瘤。
一种所述的制备方法制备得到的抗肿瘤联合免疫用药物用以制备预防或治疗癌症的药物的用途，所述癌症包括肠癌、乳癌、胃癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、肾癌、淋巴瘤、白血病、皮肤癌、黑色素瘤、间质细胞瘤、骨髓瘤或脑星形细胞瘤。
通过采用上述技术方案，具有以下有益效果：
1.本发明的抗肿瘤联合免疫用药物组合增效，一方面能抑菌杀菌，能够杀死肿瘤细胞，其具有较强的抗癌生物活性；另一方面其能增强机体免疫力，调节机体内环境，恢复机体的正常平衡。这能保证其在治疗癌症期间，还能提高机体免疫力，避免机体免疫被破坏，有利于保证抗癌效果，还能进一步防止肿瘤复发。
2.本发明的抗肿瘤联合免疫用药物的制备过程中，未使用有机溶剂和破坏性条件，能最大程度的提取药用植物的有效活性成分，安全无副作用，同时还能将其有效成分制成比表面积大的颗粒物质，有利于人体吸收。
3.本发明的抗肿瘤联合免疫用药物的制备过程中，在原料萃取液喷雾干燥的过程中加入其原料的残渣，有利于和常规防止粘壁的操作共同作用来解决原料萃取物在生产的过程中出现的粘壁现象，还能充分利用原料药，保持纯天然性。
4.本发明的抗肿瘤联合免疫用药物采用胶囊形式，给药精确且方便，有利于保存，稳定性好。
具体实施方式
实施例中，胡桃选自北美洲黑胡桃(BlackWalnut，又名JuglansnigraL)。香艾选自中亚苦蒿(woormwood，或Artemisiaabsinthium)。丁香选自主产地为澳大利亚和美洲的热带和亚热带地区的公丁香(Eugeniacaryphyllata)。
取经筛选、清洗的胡桃的内皮，将干净的胡桃的内皮在10～40℃和-0.1～-0.09MPa下减压冷浸软化。胡桃的内皮软化后，在30～40℃下利用二氧化碳流体进行超临界流体萃取，分离得到胡桃萃取液与胡桃残渣。取胡桃残渣粉碎研磨，过200-300目筛。利用喷雾干燥将胡桃萃取液喷涂到经过筛的胡桃残渣上，喷雾干燥的温度为40～80℃，干燥时间为3～60S，得到颗粒度为10～60μm的胡桃萃取物。取胡桃萃取物，按常规的胶囊填充方法填充至天然植物胶囊壳内，得到胡桃萃取物胶囊。
取经筛选、清洗的香艾的全草，将干净的香艾的全草在10～40℃和-0.1～-0.09MPa下减压冷浸软化。香艾软化后，在30～40℃下利用二氧化碳流体进行超临界流体萃取，分离得到香艾萃取液与香艾残渣。取香艾残渣粉碎研磨，过200-300目筛。利用喷雾干燥将香艾萃取液喷涂到经过筛的香艾残渣上，喷雾干燥的温度为40～80℃，干燥时间为3～60S，得到颗粒度为10～60μm的香艾萃取物。取香艾萃取物，按常规的胶囊填充方法填充至天然植物胶囊壳内，得到香艾萃取物胶囊。
取经筛选、清洗的丁香(Eugeniacaryphyllata)的干燥的尚未开放的花蕾，将干净的丁香尚未开放的花蕾在10～40℃和-0.1～-0.09MPa下减压冷浸软化。丁香软化后，在30～40℃下利用二氧化碳流体进行超临界流体萃取，分离得到丁香萃取液与丁香残渣。取丁香残渣粉碎研磨，过200-300目筛。利用喷雾干燥将丁香萃取液喷涂到经过筛的丁香残渣上，喷雾干燥的温度为40～80℃，干燥时间为3～60S，得到颗粒度为10～60μm的丁香萃取物。取丁香萃取物，按常规的胶囊填充方法填充至天然植物胶囊壳内，得到丁香萃取物胶囊。
使用本发明的抗肿瘤联合免疫用药物时，将胡桃萃取物胶囊、香艾萃取物胶囊和丁香萃取物胶囊按按一定比例同时给药。
表1本发明的抗肿瘤联合免疫用药物
对比例一毒理学试验
受试物：胡桃萃取物、香艾萃取物、丁香萃取物均由实施例一制备。分别取胡桃萃取物、香艾萃取物、丁香萃取物，分别经70℃水浴1小时、浸泡12小时、浓缩后，供试验用。
2、试验动物：
选用中国药品生物制品检定所实验动物中心提供的昆明种健康小白鼠。
3、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验
采用间隔24hr两次经口灌胃法进行试验。用体重25-30克小白鼠50只，按体重随机分为5组，按体重随机分为5组，每组10只，雌雄各半。以50mg/kg·bw剂量的环磷酰胺(cp)为阳性对照，蒸馏水为阴性对照，本发明的抗肿瘤联合免疫用药物的剂量分别为1.25、2.50、5.00g/kg·bw，用蒸馏水配至所需浓度。末次给本发明的抗肿瘤联合免疫用药物后6hr，颈椎脱臼处死动物，取胸骨骨髓用小牛血清稀释涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在光学显微镜下，每只动物计数1000个嗜多染红细胞(PRC)，微核的发生率以含微核的PRC千分率计，并进行统计处理。本发明的抗肿瘤联合免疫用药物对小鼠骨髓微核发生率的影响的结果统计见表2。
表2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验的结果统计
*与阴性对照组比较差异有极显著性(P＜0.01)
由表2可见，小本发明的抗肿瘤联合免疫用药物各剂量组微核率，各剂量组与阴性对照组比较差异无显著性，而环磷酰胺组与阴性对照组比较差异有极显著性(P＜0.01)。未见本发明的抗肿瘤联合免疫用药物对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率产生影响。
4、小鼠精子畸形试验
用体重30-35克的性成熟雄性小鼠50只，随机分为5组。以40mg/kg·bw剂量的环磷酰胺为阳性对照，蒸馏水为阴性对照，本发明的抗肿瘤联合免疫用药物的剂量为1.25、2.50、5.00g/kg·bw，用蒸馏水配至所需浓度。每日灌胃一次，连续5天，末次灌胃后30天处死动物，取附睾制片，伊红染色，每组计数5只动物，每只动物计数1000个结构完整的精子，计算畸变精子发生率(以百分率计)，并进行统计处理。本发明的抗肿瘤联合免疫用药物对小鼠精子畸形发生率的影响的结果统计见表3。
表3小鼠精子畸形试验的结果统计
*与阴性对照组比较差异有极显著性(P＜0.01)
由表3可见，本发明的抗肿瘤联合免疫用药物对小鼠精子畸形发生率未产生明显改变，各剂量组与阴性对照组比较差异无显著性，而环磷酰胺阳性对照组比较差异有极显著性(P＜0.01)。因此，本发明的抗肿瘤联合免疫用药物对小鼠精子畸形产生影响。
对实施例二和实施例三制备的本发明的抗肿瘤联合免疫用药物也进行相同毒理学试验，其结果和实施例一制备的本发明的抗肿瘤联合免疫用药物的结果相同。
对比例二免疫调节作用试验
1、受试物：胡桃萃取物胶囊、香艾萃取物胶囊、丁香萃取物胶囊均由实施例一制备。人体口服推荐量为2.1g/天，以每人60kg体重计算(每个品种各一粒)，相当于0.035g/kg·bw。小鼠的等效剂量相当于人体推荐量的10倍，即每日0.35定型产品/kg·bw(中剂量)。上、下各设一个剂量组：1.05g定型产品/kg·bw(高剂量)和0.035g定型产品/kg·bw(低剂量)。样品以已消毒的水配制，对照组以已消毒的水代替。连续灌胃30天后测各项免疫指标。因为胡桃萃取物胶囊、香艾萃取物胶囊、丁香萃取物胶囊均不溶于水，用10倍于推荐量的热水(70-80℃)分3次，每次1小时浸泡，然后在旋转蒸发仪(50-60℃)蒸发浓缩成30倍推荐剂量浓度，再按比例稀释进行灌胃。
2、试验动物：
选用中国药品生物制品检定所实验动物中心提供的昆明种健康雄性小鼠75只，体重18-22g，分为4组，剂量组每组15只，对照组30只，进行迟发型变态反应和抗体生成细胞检测。
选用中国药品生物制品检定所实验动物中心提供的昆明种健康雌性小鼠75只，体重18-22g，分为4组，剂量组每组15只，对照组30只，进行碳粒廓清试验。
3、迟发型变态反应检测(DTH)(足跖增厚法)
小鼠经腹腔注射2％(v/v，用生理盐水配制)的SRBC(0.2mL/每鼠)，致敏后4天，测量左右足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。然后在测量部位皮下注射20％(v/v，用生理盐水配制)的SRBC(20μL/每鼠)，于注射后24小时测量左右跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。以注射前后足跖厚度的差值(足跖肿胀度)来表示DTH的程度。本发明的抗肿瘤联合免疫用药物对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响的结果统计见表4。
表4小鼠迟发型变态反应(DTH)的结果统计
组别 动物数(只) 足跖肿胀度(mm)
对照 30 0.523±0.109
低剂量 15 0.683±0.106
中剂量 15 0.737±0.127
高剂量 14 0.703±0.111
由表4可见，经口给予小鼠不同剂量的本发明的抗肿瘤联合免疫用药物30天，经统计学处理，其足跖肿胀度在低、中、高剂量组与对照组间比较均有极显著性差异(P＜0.01)，即本发明的抗肿瘤联合免疫用药物能明显增强小鼠的迟发型变态反应。
4、抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)
小鼠经腹腔注射0.2mL2％(v/v，用生理盐水配制)的SRBC(0.2mL/每鼠)进行免疫。5天后，将小鼠处死，取脾，轻轻撕碎，用Hank′s液制成细胞悬液，洗涤、离心2次，将细胞悬浮在5mLHank′s液上。将表层培养基(琼脂糖)加热溶解后，与等量双倍Hank′s液混合，分装小试管、每管0.5ml，再向管内加10％(v/v，用SA液配制)的SRBC50μL、脾细胞悬液20μL，迅速混匀后，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放人二氧化碳培养箱中温育1.5hr，然后用SA缓冲液稀释的补体(1∶10)加人到玻片架凹槽内，继续温育1.5hr后，计数溶血空斑数。本发明的抗肿瘤联合免疫用药物对抗体生成细胞数的影响的结果统计见表5。
表5抗体生成细胞检测的结果统计
组别 动物数(只) 溶血空斑数(×103/全脾)
对照 22 111.8±60.8
低剂量 11 102.2±45.6
中剂量 13 131.6±62.3
高剂量 12 129.6±101.3
4、抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)
小鼠经腹腔注射0.2mL2％(v/v，用生理盐水配制)的SRBC(0.2mL/每鼠)进行免疫。5天后，将小鼠处死，取脾，轻轻撕碎，用Hank′s液制成细胞悬液，洗涤、离心2次，将细胞悬浮在5mLHank′s液上。将表层培养基(琼脂糖)加热溶解后，与等量双倍Hank′s液混合，分装小试管、每管0.5ml，再向管内加10％(v/v，用SA液配制)的SRBC50μL、脾细胞悬液20μL，迅速混匀后，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放人二氧化碳培养箱中温育1.5hr，然后用SA缓冲液稀释的补体(1∶10)加人到玻片架凹槽内，继续温育1.5hr后，计数溶血空斑数。本发明的抗肿瘤联合免疫用药物对抗体生成细胞数的影响的结果统计见表5。
由表5可见，经口给予小鼠不同剂量的本发明的抗肿瘤联合免疫用药物30天，经统计学处理，其足跖肿胀度在低、中、高剂量组与对照组间比较均无极显著性差异(P＞0.05)，即本发明的抗肿瘤联合免疫用药物对小鼠的抗体生成细胞数无影响。
5、小鼠碳廓清实验测试
小鼠尾静脉注射以生理盐水稀释4倍的印度墨汁，每10g体重注射0.1mL，墨汁注入后立即计时。注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，加到2mL0.1％Na2CO3溶液中，摇匀。以0.1％Na2CO3溶液作空白对照，用721分光光度计在600nm波长处测光密度值(OD)。将小鼠处死，取肝、脾，称重(体重为m，肝重为m1，脾重为m2)，按下式计算吞噬指数a：
本发明的抗肿瘤联合免疫用药物对对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响结果统计见表6。
表6小鼠碳廓清测试的结果统计
组别 动物数(只) 吞噬指数
对照 26 5.97±0.60
低剂量 15 6.33±0.40
中剂量 14 5.88±0.58
高剂量 14 5.87±0.63
由表6可见，经口给予小鼠不同剂量的本发明的抗肿瘤联合免疫用药物30天，经统计学处理，其足跖肿胀度在低、中、高剂量组与对照组间比较均无极显著性差异(P＞0.05)，即本发明的抗肿瘤联合免疫用药物对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清功能无影响。
由表4至表6可见，经口给予小鼠不同剂量的本发明的抗肿瘤联合免疫用药物30天，能明显增强小鼠的迟发型变态反应，对小鼠的抗体生成细胞数和小鼠单核-巨噬细胞碳廓清功能无影响。由此可见，本发明的抗肿瘤联合免疫用药物具有增强细胞免疫功能的作用。
对实施例二和实施例三制备的本发明的抗肿瘤联合免疫用药物也进行相同的免疫调节作用试验，其结果和实施例一制备的本发明的抗肿瘤联合免疫用药物的结果相同。
对比例三、制剂的卫生学检验
参考GB4789-94和GB4789.15-94，对实施例一制备的本发明的抗肿瘤联合免疫用药物进行大肠菌群、菌落总数、致病菌、霉菌、酵母计数的检测。分别对刚生产的一组样品和在25℃/60％RH下放置3年后的一组样品进行检测，且两组样品均为同一个生产批次的样品。每组样品均平行取10个样品。其卫生学检验结果详见表7。
表7制剂的卫生学检验结果统计
由表7可见，抗肿瘤联合免疫用药物在生产后及在25℃/60％RH下放置3年，其卫生学检验合格。
对实施例二和实施例三制备的本发明的抗肿瘤联合免疫用药物也进行相同卫生学检验，其结果和实施例一制备的本发明的抗肿瘤联合免疫用药物的结果相同。
对比例四、临床试验
取中晚期癌症患者病例进行临床试验，病例入选标准为：
(1)均经病理学、细胞学或结合临床影像学证实诊断；
(2)KPS评分≥50分，预计可生存6个月；
(3)停用放化疗或其他治疗一个月以上；
其中诊断通过以下手段结合：血尿粪常规检查、痰液检查痰液直接涂片染色做脱落细胞检查、胸及腹水检查、胃及十二指肠液检查、生化检查、肿瘤标记物用化学或免疫学方法、影像检查(包括普通x线检查、B型超声检查、放射性核素检查、CT、MRI、PET等)、内镜检查、病理检查(包括脱落细胞检查、组织印片染色检查、病理切片检查)。
共取中晚期癌症患者200例，其中男100例，女100例，年龄38-78岁，平均年龄60岁。其中乳癌30例、消化道(食管、胃、结直肠)癌100例、肺癌30例、泌尿道癌30例、多发性骨髓瘤10例。临床分期：II期70例、III期40例、IV期90例。
治疗方法：全组病例每天均口服实施例一制备的本发明的抗肿瘤联合免疫用药物，120天为一个疗程，每天具体用量见表8，其中胡桃萃取物胶囊用I表示，用香艾萃取物胶囊用II表示，丁香萃取物胶囊用III表示。
表8每一个疗程的第一阶段20天(强化量)服用表
表9每一个疗程的第二阶段100天(维持量)服用表
*维持量为日量，不需分早、中、晚。且第二阶段的每个胶囊的服用量均分别为200粒。
1、治疗后KPS评分变化
根据KPS评分规则，对该组癌症患者进行服用本发明的抗肿瘤联合免疫用药物治疗前后的KPS评分进行比较，其比较数据见表10。
表10中晚期癌症患者KPS评分的影响
*“-”表示与治疗前比较评分下降
“+”表示与治疗前比较评分上升。
由表10可见，经抗肿瘤联合免疫用药物治疗后，95％的病例评分提高，其中提高20分以上者达20％。
2、治疗后生存质量评估
主要观察各类肿瘤的常见症候如神疲乏力、纳差、心烦失眠、恶心、呕吐等，比较治疗前后症状改变情况。
按症状轻重程度(表11)，治疗后评分≥2分者为显著改善，1分者为部分改善，计分无改变者为无效，其具体结果见表12。
表11症状轻重分级评分表
表12本发明的抗肿瘤联合免疫用药物对中晚期癌症患者生存质量评分的影响
由表12可见，经抗肿瘤联合免疫用药物治疗后，主要症状显著改善者达70％。
3、治疗后体重变化
以治疗后体重增加或减少≥1kg作为体重上升或下降，未超过1kg者为稳定，结果见表13。
表13本发明的抗肿瘤联合免疫用药物对中晚期癌症患者体重的影响
由表13可见，经抗肿瘤联合免疫用药物治疗后，90％患者体重上升，其中增加2-3kg者达55％。
4、毒副反应观察
全组病例在治疗期间均为观察到心、肝、肾功能等的不良反应，外周血象未见异常。未观察到皮疹等过敏现象发生。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种抗肿瘤联合免疫用药物，其特征在于，所述抗肿瘤联合免疫用药物由胡桃萃取物、香艾萃取物和丁香萃取物为原料；所述胡桃萃取物、香艾萃取物和丁香萃取物的重量配比为77∶54∶98。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤联合免疫用药物，其特征在于，所述胡桃为黑胡桃，香艾为中亚苦蒿，丁香为公丁香。
3.根据权利要求1或2所述的抗肿瘤联合免疫用药物，其特征在于，所述药物的制剂为胶囊剂。
4.根据权利要求1所述的抗肿瘤联合免疫用药物，其特征在于，所述抗肿瘤联合免疫用药物中还包括紫杉醇。
5.一种如权利要求3所述的抗肿瘤联合免疫用药物的制备方法，其特征在于，所述方法包括胡桃萃取物胶囊的制备、香艾萃取物胶囊的制备和丁香萃取物胶囊的制备；所述胡桃萃取物胶囊、香艾萃取物胶囊和丁香萃取物胶囊的制备均包括：
S1，取原料进行筛选和清洗，将干净的原料通过减压冷浸法软化；
S2，取经S1步软化的原料，超临界流体萃取，分离得到萃取液与残渣；
S3，取S2步得到的残渣，将其粉碎研磨；
S4，取S2步得到的萃取液，将其喷雾干燥，喷雾干燥的过程中加入S3步得到的粉碎研磨后的残渣，得到干燥的原料萃取物；
S5，取配方量的S4步得到的原料萃取物，填充至胶囊壳内，得到胶囊。
6.根据权利要求5所述的抗肿瘤联合免疫用药物的制备方法，其特征在于，S1中，所述减压冷浸法的温度为10～40℃，压强为-0.1～-0.09MPa；
S2中，所述超临界流体萃取的流体为二氧化碳，萃取温度为30～40℃；
S4中，所述喷雾干燥的温度为40～80℃，干燥时间为3～60S；所述原料萃取物的颗粒度为10～60μm；
S5中，所述胶囊壳为天然植物胶囊壳。
7.一种如权利要求3所述的抗肿瘤联合免疫用药物的制备方法，其特征在于，所述方法包括胡桃萃取物胶囊的制备、香艾萃取物胶囊的制备和丁香萃取物胶囊的制备；
所述胡桃萃取物胶囊的制备包括：
S1，取胡桃筛选、清洗，将干净的胡桃的内皮通过减压冷浸法软化；所述减压冷浸法的温度为10～40℃，压强为-0.1～-0.09MPa；
S2，取经S1步软化的胡桃，超临界流体萃取，分离得到胡桃萃取液与胡桃残渣；所述超临界流体萃取的流体为二氧化碳，萃取温度为30～40℃；
S3，取S2步得到的胡桃残渣，将其粉碎研磨；
S4，取S2步得到的胡桃萃取液，将其喷雾干燥，喷雾干燥的过程中加入S3步得到的粉碎研磨后的胡桃残渣，得到干燥的胡桃萃取物；所述喷雾干燥的温度为40～80℃，干燥时间为3～60S；所述胡桃萃取物的颗粒度为10～60μm；
S5，取77份S4步得到的胡桃萃取物，填充至天然植物胶囊壳内，得到胡桃萃取物胶囊；
所述香艾萃取物胶囊的制备包括：
S1，取香艾筛选、清洗，将干净的香艾的全草通过减压冷浸法软化；所述减压冷浸法的温度为10～40℃，压强为-0.1～-0.09MPa；
S2，取经S1步软化的香艾，超临界流体萃取，分离得到香艾萃取液与香艾残渣；所述超临界流体萃取的流体为二氧化碳，萃取温度为30～40℃；
S3，取S2步得到的香艾残渣，将其粉碎研磨；
S4，取S2步得到的香艾萃取液，将其喷雾干燥，喷雾干燥的过程中加入S3步得到的粉碎研磨后的香艾残渣，得到干燥的香艾萃取物；所述喷雾干燥的温度为40～80℃，干燥时间为3～60S；所述香艾萃取物的颗粒度为10～60μm；
S5，取54份S4步得到的香艾萃取物，填充至天然植物胶囊壳内，得到香艾萃取物胶囊；
所述丁香萃取物胶囊的制备包括：
S1，取丁香筛选、清洗，将干净的丁香的尚未开放的花蕾通过减压冷浸法软化；所述减压冷浸法的温度为10～40℃，压强为-0.1～-0.09MPa；
S2，取经S1步软化的丁香，超临界流体萃取，分离得到丁香萃取液与丁香残渣；所述超临界流体萃取的流体为二氧化碳，萃取温度为30～40℃；
S3，取S2步得到的丁香残渣，将其粉碎研磨；
S4，取S2步得到的丁香萃取液，将其喷雾干燥，喷雾干燥的过程中加入S3步得到的粉碎研磨后的丁香残渣，得到干燥的丁香萃取物；所述喷雾干燥的温度为40～80℃，干燥时间为3～60S；所述丁香萃取物的颗粒度为10～60μm；
S5，取98份S4步得到的丁香萃取物，填充至天然植物胶囊壳内，得到丁香萃取物胶囊；
所述胡桃为黑胡桃，香艾为中亚苦蒿，丁香为公丁香。
8.一种如权利要求1所述的抗肿瘤联合免疫用药物用以制备预防或治疗癌症的药物的用途，其特征在于，所述癌症包括肠癌、乳癌、胃癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、肾癌、淋巴瘤、白血病、皮肤癌、黑色素瘤、间质细胞瘤、骨髓瘤或脑星形细胞瘤。
9.一种如权利要求5-7任一项所述的制备方法制备得到的抗肿瘤联合免疫用药物用以制备预防或治疗癌症的药物的用途，其特征在于，所述癌症包括肠癌、乳癌、胃癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、肾癌、淋巴瘤、白血病、皮肤癌、黑色素瘤、间质细胞瘤、骨髓瘤或脑星形细胞瘤。
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