CN105754988B - 用于磁珠捕获dna的纯化方法、装置及自动化移液站 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了用于磁珠捕获DNA的纯化方法，以及基于该纯化方法的装置和自动化移液站。纯化方法包括：(1)DNA样品与磁珠室温孵育；(2)吸头吸入溶解液，再吸入矿物油，最后吸入混合磁珠的DNA样品；(3)将吸头下段置于磁力架，磁珠吸附后，向下打液，将矿物油全部打出；(4)撤离磁力架，使磁珠均匀分散到溶解液中，室温孵育，然后再将吸头的溶解液柱段置于磁力架上，直至磁珠吸附到吸头壁时，向下打出溶解液，获得纯化的DNA样品。本申请的纯化方法，平均回收率85％以上，DNA样品在单个吸头中完成纯化，避免了现有方法中反复清洗造成样品损耗，及频繁移液带来的样品污染。
Description
技术领域
本申请涉及DNA样品纯化领域，特别是涉及一种用于磁珠捕获DNA的纯化方法，以及基于该纯化方法的装置和自动化移液站。
背景技术
近年来随着人类对基因组学认识不断深入，研究领域和应用范围也不断扩大。几乎所有涉及到分子生物学的研究者，其首要任务就是要把大量的DNA样品分离提纯。传统的DNA分离方法有过膜层析、酚氯仿抽提等，但是流程繁琐，不易实现高通量自动化流程。
磁珠捕获DNA技术的产生，使得高通量纯化自动化成为可能，磁珠捕获DNA的基本原理是在高盐溶液或者PH<6.5缓冲液中磁珠表面基团捕获DNA，然后用洗涤溶液将残留的盐离子和非特异结合的杂质进行洗脱，在低盐溶液或者PH>8.5缓冲液中DNA从磁珠上洗脱下来。但是由于该技术目前没有成熟的配套方案，因此没有得到广泛的应用。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的专门用于磁珠捕获DNA的纯化方法，以及基于该纯化方法的装置和自动化移液站。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请一方面公开了一种用于磁珠捕获DNA的纯化方法，包括以下步骤，
(1)将DNA样品与磁珠充分混匀，室温孵育；
(2)用吸头吸入一段溶解液，然后再吸入一段矿物油，最后将步骤(1)的混合样品液全部吸入吸头中，在吸头中由上至下形成由溶解液柱、矿物油液柱和混合样品液柱组成的三段液柱；
(3)将吸头的下段，即混合样品液柱段，置于磁力架上，直至磁珠吸附到吸头壁上时，将混合样品液和矿物油打出，直至吸头中只剩下溶解液；
(4)撤离磁力架，使磁珠均匀分散到溶解液中，室温孵育，然后再将吸头的溶解液柱段置于磁力架上，直至磁珠吸附到吸头壁时，向下打出溶解液，获得纯化的DNA样品。
需要说明的是，本申请的关键在于，预先在吸头中吸入溶解液和矿物油，然后将吸附了DNA样品的磁珠通过磁力架吸附在吸头壁上，再依序将吸头中的液体打出，在将液体打出的过程中即实现了吸附在磁珠上的DNA样品的分离和洗脱，最终溶解在溶解液中，整个分离纯化过程一次性完成，与传统的纯化方式相比，省略了反复冲洗的过程，缩短了DNA样品纯化时间，同时，也避免了反复冲洗对DNA样品的损耗。理论上讲，只要DNA样品能够完全被磁珠吸附，则可以达到100％的回收率；而本申请的实施方式中，DNA样品的回收率平均都在85％以上，与传统的纯化方法相比回收率大大提高。
还需要说明的是，本申请中，溶解液的作用是溶解DNA，因此，常用的DNA溶剂如水、EB缓冲液等都可以用于本申请；而矿物油的作用在于与混合样品液中的水形成油水界面，达到纯化的作用；本申请中，经过步骤(3)后，吸附了DNA样品的磁珠处于溶解液中时，DNA样品已经开始分离，并溶解到溶解液中，步骤(4)撤离了磁力架后，磁珠能够更好的分散于溶解液中，从而方便DNA样品的溶解，此时为了使磁珠均匀分散到溶解液中，可以反复吸打溶解液，使其在吸头中上下运动，从而将磁珠分散，本申请的优选方案中，将其全部打出到一个新容器中进行混匀，该优选方案将在以下进行描述；步骤(4)的室温孵育，也是为了使得DNA样品完全从磁珠上脱离，而溶解于溶解液中。
优选的，溶解液柱和矿物油液柱之间有一段空气柱。
需要说明的是，空气柱的作用是，将溶解液柱和矿物油液柱分离，如果没有该空气柱，溶解液与油相不是完全分离，当油相太粘稠时，在打出矿物油时，会造成少量溶解液损失，不能保证溶解液的量恒定。因此，空气柱虽然不是必须的，但有该空气柱效果更好。
优选的，步骤(4)中，使磁珠均匀分散到溶解液中的方式为，将磁珠和溶解液打入一新的容器中进行混匀，在容器中进行室温孵育；然后再将磁珠和溶解液混合液全部吸入吸头，将吸头的溶解液柱段置于磁力架上，直至磁珠吸附到吸头壁时，向下打出溶解液，获得纯化的DNA样品。需要说明的是，将磁珠和溶解液打入新容器中，是为了使磁珠更好的混匀分散于溶解液中，从而利于DNA释放；可以理解，该步骤，实际上也可以直接在吸头中进行。
优选的，在将室温孵育后的磁珠和溶解液混合液全部吸入吸头后，在吸头的吸口端预留至少一倍于溶解液体积的后吸，然后将吸头的溶解液柱段置于磁力架上，直至磁珠吸附到吸头壁时，向下打液，使溶解液与磁珠分离，溶解液暂储于后吸段，再移除磁力架，将分离的溶解液全部打出吸头，获得纯化的DNA样品。
需要说明的是，在吸头中预留至少一倍于溶解液体积的后吸，其作用是，使得溶解液和磁珠在吸头中实现分离，因为预留有后吸，当磁珠被吸附到吸头壁上后，向下打出溶解液，可以使溶解液与磁珠分离，而溶解液还继续在吸头中，直至完全分离后，再一次性的将溶解液打出吸头；这样做的目的是，避免在溶解液与磁珠分离的同时，将溶解液打出吸头口，从而避免微量磁珠会随着液流混合在纯化的DNA样品中。另外，预留的后吸的体积根据溶解液的体积而定，通常，预留体积为溶解液体积的一倍以上。
优选的，步骤(1)中的室温孵育的时间为8-15分钟。
优选的，步骤(4)中的室温孵育的时间为5-10分钟。
优选的，步骤(1)中磁珠与DNA样品混合之前，先室温放置30分钟后使用。需要说明的是，将磁珠预先在室温放置30分钟是为了使磁珠达到室温温度，以便于吸附DNA样品。
优选的，步骤(1)中磁珠的用量是DNA样品体积的至少1倍。需要说明的是，磁珠的用量是根据DNA样品的体积和浓度而定的；可以理解，如果DNA样品比较多，或者DNA样品浓度比较大，为了提高回收率，在操作条件允许的情况下，也可以添加更多的磁珠。
优选的，溶解液为EB缓冲液或水。
本申请的另一面还公开了本申请的纯化方法在高通量测序平台中的应用。
可以理解，在高通量测序平台中，特别是Illumina公司的Hiseq和life tech公司的Proton两大平台，大多数步骤都是酶反应和纯化交替组成，其中，DNA的纯化，完全可以采用本申请的纯化方法。
本申请的另一面还公开了一种采用本申请的纯化方法进行样品纯化的自动化移液站，该自动化移液站配备有吸头的工作平台，以及与吸头规格匹配的磁力架。
需要说明的是，本申请的自动化移液站与现有的自动化工作站的区别就在于，其配置了吸头的工作平台，和与吸头规格匹配的磁力架；可以理解，实际上就是控制吸头自动吸取溶解液、矿物油和孵育好的磁珠-DNA混合液，然后自动控制将液体打出；至于磁力架，可以根据吸头的大小、形状以及自动化移液站的工作通道数量等自行定制，在本申请中不做具体限定；同样的，吸头的大小和规格也可以根据具体需求而购买或定制。例如，图11所示为8通道的磁力架示意图；图12所示为96通道移液站的磁力架示意图。
本申请的另一面还公开了一种采用本申请的纯化方法进行样品纯化的装置，包括移液器、吸头和与吸头相匹配的磁力架；吸头可拆卸的固定于移液器上，磁力架用于放置吸头，并且磁力架上设置有磁力环。
需要说明的是，本申请的装置，其关键在于其配备有与吸头匹配的磁力架，以方便磁珠捕获；本申请中移液器的作用是给吸头提供吸取或打出液体的动力，可以采用现有市场售卖的移液枪、移液器或类似功能的器件，也可以是单通道或多通道的，在此不做具体限定。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请的纯化方法，纯化样品平均回收率在85％以上，每个DNA样品在单个吸头中完成去除杂质过程，有效的避免了现有的磁珠纯化方法中反复清洗磁珠时，容易造成的样品损耗，以及移液步骤频繁带来的样品间交叉污染等问题。并且，本申请的纯化方法，大大简化了磁珠纯化流程，至少节省了一半的纯化时间和耗材成本，自动化程度和自动化效率大大提高，可以广泛应用于各种自动化移液站或者高通量测序平台。
附图说明
图1-图8：是本申请实施例中8个DNA样品的Agilent 2100分析结果图，各图中A为纯化前的分析结果，B为纯化后的分析结果；
图9：是本申请实施例中纯化方法的原理示意图；
图10：是本申请实施例中纯化回收DNA的示意图；
图11：是本申请实施例中匹配8通道移液平台的吸头纯化方案的磁力架示意图；
图12：是本申请实施例中匹配96通道移液平台的吸头纯化方案的磁力架示意图。
具体实施方式
本申请的关键在于创造性的采用吸头纯化的方式对磁珠捕获DNA进行纯化，无需反复的冲洗或频繁的移液，与现有的手工或者自动化纯化方法相比，既避免了反复冲洗造成的DNA损耗，又避免了频繁移液容易造成污染的问题。本申请中，纯化所采用的磁珠可任意选择市面上销售的用于DNA捕获的磁珠；在确定好吸头和与吸头配套的磁力架后，可以直接对接现有的自动化移液工作站，其移液范围为1uL-1mL；具体的本申请所需要的吸头配备到工作站上，同时，将磁力架放置在吸头的正下方即可；而磁力架的具体结构，也根据工作站的通道数设计，例如8通道工作站，则设计如图11所示的8通道磁力架，96通道工作站，则设计如图12所示的96通道磁力架，在此不累述。
本申请中，磁力架是指可以放置吸头，并且可以配套安装到装置或自动化移液站上的一个架体，类似于试管架等；并且，在磁力架上，适当位置安装有磁铁，即磁力环，用于吸附磁珠，磁铁的具体位置可以根据试验需求安装，在此不做具体限定。
下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
本例采用的DNA样品为基因组DNA的文库PCR产物，该PCR产物即在建库或测序时，对两端添加测序接头后的基因组DNA片段进行PCR后获得的产物。本例采集了8个独立的来源于人淋巴组织的炎黄细胞(即YH细胞)基因组DNA片段的PCR产物进行研究。
本例采用Axygen磁珠和自动化8通道移液平台分别对8个DNA样品进行纯化，在纯化前先测定8个样品的DNA浓度，并预先采用Agilent 2100对8个未纯化的样品进行分析。
纯化方法包括如下步骤：
(1)将Axygen磁珠从4℃冰箱取出，室温放置30分钟。需要说明的是，室温放置30分钟是为了使磁珠溶液达到室温温度，可以理解，如果磁珠溶液本身已经是室温温度，则不需要再室温放置30分钟，此外，室温放置的时间也可以根据具体室温情况进行调整。
(2)向DNA样品中加入1倍体积的磁珠，吹打混匀，室温孵育8分钟。
需要说明的是，室温孵育是为了让DNA样品充分附着在磁珠上，该时间可以根据具体条件进行调整。本例采用40ul的样品与40ul的磁珠吹打混匀。
(3)准备矿物油，本例采用的是Sigma-Aldrich公司生产的矿物油；吸头先吸入一段溶解液，本例采用EB缓冲液作为溶解液，用量为40ul；然后吸入30ul矿物油，最后再吸入步骤(2)的磁珠和DNA的混合样品液；在吸头中由上至下形成由溶解液柱、矿物油液柱和混合样品液柱组成的三段液柱。优选的，在溶解液柱和矿物油液柱之间有一段空气柱。如图9所示。
(4)将吸头下段，即磁珠和DNA的混合样品液柱段，置于磁力架中，直至磁珠吸附到吸头壁上时，缓慢向下打液，直至混合样品液和矿物油全部喷出，只剩溶解液留在吸头中。
(5)撤离磁力架，使磁珠分散到溶解液中，并将溶解液和磁珠一起打出，置于一个新的容器中。可以理解，如果磁珠和溶解液可以在吸头中进行混匀，则不需要将其打出到新容器中，直接在吸头中混匀，然后室温孵育5分钟即可。
(6)在步骤(5)所述的新的容器中将磁珠和溶解液混匀，室温孵育5分钟。
(7)将步骤(6)的溶解液吸入吸头并加约50ul的后吸，将吸头置于磁力架上，直至磁珠吸附到吸头壁时，缓慢向下打出溶解液，直至液面与磁珠分离，将吸头移离磁力架。其中，后吸的目的是，使与磁珠分离的溶解液暂时留在该后吸空间段，留在吸头中，直至磁珠与溶解液完全分离；因此，后吸的体积根据溶解液的体积而定。如图10所示。
(8)将吸头中液体打出到新管中，完成了DNA样品纯化。
本例中纯化8个样品的时间为20-25分钟，而现有的乙醇纯化或自动化纯化都在35分钟以上，可见，本例的纯化方法能有效的缩短纯化时间。获得8个DNA样品的纯化样品后，按照公式：(纯化后的体积×纯化后的浓度)÷(纯化前的体积×纯化前的浓度)，计算DNA样品的回收效率，结果如表1所示，本例的DNA样品纯化的平均回收率为86％，最高可达93％；而现有的手工或自动化纯化的平均回收率最高仅为80％，与之相比本例的回收率远大于现有水平。
表1DNA样品纯化回收率
另外，本例还采用Agilent 2100分别对8个DNA样品的纯化前和纯化后进行分析，分析结果如图1-8所示，分析数据如表2所示；图1-8依序为DNA样品1-8的分析结果图，图中A为纯化前的分析结果，B为纯化后的分析结果，50bp的峰是Low Marker，17000bp的峰是Upper Marker。
表2DNA样品纯化前后Agilent的分析数据
注：表中50bp片段为Low Marker；17000bp片段为Upper Marker；其余片段为样品。
表2中的数据表示，样品1纯化前分析输出的四组长度的DNA片段及其对应的浓度，50bp浓度8.3ng/ul，88bp浓度3.15ng/ul，283bp浓度22.49ng/ul，17000bp浓度4.2ng/ul；纯化后分析输出的三组长度的DNA片段及其对应的浓度，50bp浓度8.3ng/ul，269bp浓度18.25ng/ul，17000bp浓度4.2ng/ul；可见，纯化后的样品中没有小于100bp的片段检出。其余样品的数据的读取方式类似，在此不累述。需要说明的是，表2的数据为统计数据，如与图1-8中数据不符，以图1-8中的显示的数据为准。
从表2和图1-8可见，纯化的目的DNA片段为240bp-300bp，符合基因组DNA片段的预期，通过纯化前后比较可知，纯化前存在小于100bp的片段杂质，而纯化后该杂质被移除，目的DNA片段240bp-300bp被完整的保留。可见，本例的纯化方法可以很好的用于高通量测序中去除接头的纯化。
本例采用的是自动化8通道移液平台，因此，与吸头配套的磁力架如图11所示，由并排的八个吸头支架2组成，吸头支架2通过一体成型的安装架1固定到自动化8通道移液平台，对应的，在每个吸头支架2中都设置有半圆环型磁铁3。此外，可以理解，如果采用96通道的移液平台，则相应的需要采用如图12所示的96通道磁力架。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。
Claims (8)
1.一种用于磁珠捕获DNA的纯化方法，其特征在于：包括以下步骤，
(1)将DNA样品与磁珠充分混匀，室温孵育；
(2)用吸头吸入一段溶解液，然后再吸入一段矿物油，最后将步骤(1)的混合样品液全部吸入吸头中，在吸头中由上至下形成由溶解液柱、矿物油液柱和混合样品液柱组成的三段液柱；
(3)将吸头的下段，即混合样品液柱段，置于磁力架上，直至磁珠吸附到吸头壁上时，将混合样品液和矿物油打出，直至吸头中只剩下溶解液；
(4)撤离磁力架，使磁珠均匀分散到溶解液中，室温孵育，然后再将吸头的溶解液柱段置于磁力架上，直至磁珠吸附到吸头壁时，向下打出溶解液，获得纯化的DNA样品。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述步骤(2)中，溶解液柱和矿物油液柱之间有一段空气柱。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述步骤(4)中，使磁珠均匀分散到溶解液中的方式为，将磁珠和溶解液打入一新的容器中进行混匀，在容器中进行室温孵育；然后再将磁珠和溶解液混合液全部吸入吸头，将吸头的溶解液柱段置于磁力架上，直至磁珠吸附到吸头壁时，向下打出溶解液，获得纯化的DNA样品。
4.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于：将在室温孵育后的磁珠和溶解液混合液全部吸入吸头后，在吸头的吸口端预留至少一倍于溶解液体积的后吸，然后将吸头的溶解液柱段置于磁力架上，直至磁珠吸附到吸头壁时，向下打液，使溶解液与磁珠分离，溶解液暂储于后吸段，再移除磁力架，将分离的溶解液全部打出吸头，获得纯化的DNA样品。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述步骤(1)中的室温孵育的时间为8-15分钟；所述步骤(4)中的室温孵育的时间为5-10分钟。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述步骤(1)中磁珠的用量是DNA样品体积的至少1倍。
7.根据权利要求1-6任一项所述的纯化方法，其特征在于：所述溶解液为EB缓冲液或水。
8.权利要求1-7任一项所述的纯化方法在高通量测序平台中的应用。
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