TWI551852B

TWI551852B - 生物樣本前處理裝置及生物樣本核酸萃取方法

Info

Publication number: TWI551852B
Application number: TW103128068A
Authority: TW
Inventors: 鐘挺豪; 呂秋瑩; 林旻儀; 官振群
Original assignee: 芮寶生醫股份有限公司
Priority date: 2014-08-15
Filing date: 2014-08-15
Publication date: 2016-10-01
Also published as: TW201606280A

Description

生物樣本前處理裝置及生物樣本核酸萃取方法

本發明係關於一種生物樣本前處理裝置，尤為應用生物樣本前處理裝置之生物樣本核酸萃取方法。

隨著基因之鑑定、檢測、診斷等技術應用蓬勃發展與普及，眾多技術領域對於核酸萃取技術之需求日益增加；且因應大量且快速篩檢的需求，核酸萃取技術發展至今，已逐步由人工操作走向自動化。目前無論是臨床醫療、基礎研究或者法醫應用等領域，自動化核酸萃取技術已然成為了不可或缺的工具。

目前，常用的核酸萃取的方法種類繁多且各具優缺點，例如：有機溶劑(酚及氯仿)萃取的傳統方法，其取得核酸純度、品質均佳，但步驟繁複冗長且造成有機溶劑毒害的問題；樹脂螯合方法(例如Chelex-100樹脂)，能快速取得核酸但純度不高，限制了後續的應用；免疫親和吸附方法，其利用單株抗體吸附核酸達成萃取效果，涉及抗體之製備，成本高，較難普及；管柱吸附方法(column-based method)，主要以矽基質管柱吸附配合離心方式操作萃取核酸，簡易而有效，成為目前主流的方法之一；磁珠萃取方法，其利用微小的磁珠和磁場作用，於高、低鹽溶液環境下吸附或脫附核酸，達到核酸萃取效果，簡易且效率高，核酸純度品質亦佳，亦逐漸成為主流的方法之一。其中，「管柱吸附方法」與「磁珠萃取方法」因其操作簡易之特性，易由機械設備取代人工，進而成為現今應用於自動化核酸萃取的主流方法。

針對高通量、快速篩檢的需求，自動化核酸萃取平台的發展十分熱絡，尤以「管柱吸附方法」與「磁珠萃取方法」為大宗。其中「磁珠萃取方法」因其對於DNA的萃取效果優越，在DNA的萃取領域方面的廣泛應用居領先地位，但對於RNA的萃取的應用能力稍弱；另一方面，「管柱吸附方法」對於RNA的萃取能力較佳，但由於需要配合離心或真空吸引取方法使用，過程相對較為繁複而耗時，且必須於平台中裝設離心裝置或真空吸引裝置，導致設備體積龐大，因此在自動化方面，仍以體積輕巧的「磁珠萃取方法」仍較佔有優勢而普遍。

然而，無論採用何種方法，目前在自動化核酸萃取平台的建構與優化上，均以盡可能減少人工作業的「完全自動化」為目標，具體的需求包括：減少人員與樣本或檢體的接觸與操作、防止氣霧(aerosol)形成、防止樣本交叉汙染、提高平台運作的穩定度及精確性、提升萃取的效能與核酸產物的品質等；尤其針對可能存有生物危害疑慮的生物樣本，或是法醫鑑識用生物樣本，上述需求顯得格外重要。

就現況而言，在核酸萃取的處理流程上仍需要一定程度的人工參與進行操作，其中以生物樣本的「前處理」步驟仍難以完全套用至自動化系統，需要人工手動處理。此所謂生物樣本的前處理步驟主要包含對於生物來源組織的採集與裂解。

舉例言之，傳統的生物樣本的前處理程序，係將生物樣本(生物組織、檢體)置入試管，再加入處理試劑，使處理試劑與生物樣本充分混合，供後續萃取流程之用。傳統上，為加速生物樣本的前處理程序，常採用實心柱塞置入試管容器中，以攪拌或搗磨等手段促進樣本與處理試劑之間的混合、裂解效果，然而，這樣的手法若操作不慎，或柱塞與試管的構型相對位置或構型設計不當，容易造成內容物(液體)溢出甚至產生噴濺等重大問題；另一方面，生物樣本碎屑亦可能堵塞或干擾核酸萃取流程各階段檢體之蒐集，因此，這類型的技術仍難以達成快速混合樣本與處理試劑的效果，亦不利於後續的收集，不適合應用於自動化核酸萃取平台。

另一方面，前述的攪拌或搗磨式的技術亦難以適用於「固態生物樣本」。此謂「固態生物樣本」係指非流質之生物樣本，廣泛包含：軟質或固態之動植物組織；可能沾附有生物組織(血液、皮屑、體液、分泌物等)之固態物質如採樣棉棒、石蠟包埋之生物組織樣本、菸蒂、及各種刑事方面的跡證或檢體等。由於固態生物樣品上所附載的生物組織多半具有微量、分散或破碎等特性，因此，前處理過程攸關取得檢體之含量與品質。更具體而言，在前處理過程中，固態生物樣本必須與處理試劑相當充分地混合，方可完整地將其附載的生物組織充分釋出至處理試劑環境中，供進一步的核酸萃取，以取得濃度與品質均理想的核酸產物。因此，就前述的傳統方法而言，用於流質之生物樣本時，已存有液體溢出、碎屑干擾等問題，若應用至固態生物樣本，其可引發的干擾效果可能加重前述技術之缺失。

對於前述傳統技術之問題，中華民國專利申請案公開第201311885號說明書中提出了一種柱塞裝置，係用於試管內，對生物樣本進行液體處理。參見第1圖，此柱塞1為中空圓柱，底部設有孔洞3，柱面上亦形成若干狹長孔4，藉由在盛裝了生物樣本5與處理液的試管2內上下來回移動，使生物樣本5與處理液充分混合；並於混合後，不必移開柱塞1而允許移液管6經由柱塞1頂部之開口汲取試管2內之混合液體7而不會汲取到生物樣本5之碎屑，以利萃取核酸。雖然此柱塞裝置之設計針對生物樣本於試管內的前處理程序所存有的問題，提出了一種解決方案，就實務上而言，此柱塞裝置應用於自動化核酸萃取平台時，仍存有多項缺失，詳如下述。

其一，由於在進行核酸萃取時所採用的處理液(例如裂解液)常為高鹽溶液且常添加有酶、界面活性劑等成分，用以促進生物樣本釋出，因此黏度通常較高；因此，當使用柱塞1時，上下移動柱塞1使試管2內的處理液受到柱塞1的擠壓後，通過孔洞3與狹長孔4或流動於由試管與柱塞之間的間隙，雖然能有效產生攪動效果，但由於處理液較為黏滯之特性，同時影響了處理液通過孔洞3與狹長孔4的流暢度，對於空間狹小的試管內之液體產生明顯擾動，增加液體噴濺的風險；尤其當施力不當時，即可能導致液體濺出試管2之外。其二，當處理液中含有酶、界面活性劑等添加成分時，影響了處理液整體的表面張力，因而使處理液在通過孔洞3與狹長孔4時可能產生黏附於孔緣或柱塞壁之現象，阻滯處理液的流動，甚至引發液體滴落的問題。其三，在混合生物樣本5與處理液時，產生泡沫為常見的問題，然而，當應用前述之柱塞1混合生物樣本5與處理液時，由於處理液頻繁遭受擠壓而流通於孔洞3、狹長孔4及試管2與柱塞1之間的間隙，將加劇泡沫產生的問題，干擾操作。其四，根據柱塞1之設計，操作柱塞1時必須上下移動，使部分的柱塞1仍須暴露於試管外；且於柱塞1移動同時，試管內的液體亦處於流動的狀態，形成一極不穩定的系統，使柱塞1滴落處理液可能性增高。其五，根據上述潛在顧慮，此柱塞裝置不適宜快速地上下移動，故難以提升核酸萃取效率。此外，前述各問題均可能導致氣霧(aerosol)形成、交叉汙染、感染危害等不良效應。

綜上所述，目前針對自動化核酸萃取平台之生物樣本前處理技術，尚有多項缺點亟待克服。

針對上述技術問題與需求，本發明提供一種生物樣本前處理裝置，包含：一管柱，具有一第一管體部及一第二管體部，管柱為中空且兩端開放，使管柱內形成一流道，且第一管體部之端緣形成一第一開口，第二管體部之端緣形成一第二開口；其中，管柱之內徑沿一軸向方向自第一開口向第二開口逐漸縮減，使第一管體部之平均內徑大於第二管體部之平均內徑；一蓋體，係同軸設置於第一開口以連接第一管體部；以及一托座，係同軸設置流道中，用於托持一生物樣本；其中，托座具有複數通孔，供一試劑通過通孔，使試劑可於流道內往復流通。

根據前述之生物樣本前處理裝置，其中，蓋體進一步形成一頂蓋與一中空之內栓，內栓由第一開口同軸置入第一管道中；且頂蓋之中央形成一頂蓋孔，內栓與頂蓋孔形成一氣道，且氣道與流道相互連通。

根據前述之生物樣本前處理裝置之另一實施例，其中，蓋體形成一頂蓋與一中空之內栓，係同軸設置於第一開口，用以連接第一管體部，同時蓋體於一端形成一頂蓋並於相對頂蓋的另一端形成一底板且於底板上具有一穿透孔；可以供氣體流通，具有氣體導流功能，亦用以避免試劑液體於操作過程中濺起，導致沾染移液設備造成汙染的問題。

根據前述之生物樣本前處理裝置，其中，蓋體與第一管體部之間係以螺紋、卡榫或囓合連接。

根據前述之生物樣本前處理裝置，其中，氣道內同軸設置一阻隔件，用以阻隔試劑流向第一開口。

此外，一種生物樣本的核酸產物萃取方法，其特徵包含：首先，提供一生物樣本前處理裝置，包含一管柱，具有一第一管體部及一第二管體部，管柱為中空且兩端開放，使管柱內形成一流道，且第一管體部之一開放端緣形成一第一開口，第二管體部之一開放端緣形成一第二開口，其中，管柱之內徑沿一軸向方向自第一開口向第二開口逐漸縮減，使第一管體部之平均內徑大於第二管體部之平均內徑，以及一托座，是同軸設置第一管體部中，且托座具有複數通孔；接著，提供一固態生物樣本，是放置托座上；再接著，提供一裂解液試劑，使所述的裂解液試劑通過第二管體部之第二開口並通過托座上的通孔進入第一管體部中，以取得一核酸產物。

根據前述之生物樣本的核酸產物萃取方法，其中，裂解液試劑可以是由一自動化核酸萃取設備提供。

根據前述本發明之生物樣本的核酸產物萃取方法，提供了一種可直接應用於現有自動化核酸萃取設備之生物樣本前處理裝置，有效提升效能，大幅減低既有技術與人工操作可能衍生之氣霧(aerosol)形成、交叉汙染、感染危害等不良效應。

A‧‧‧軸向方向

C‧‧‧中心軸

R‧‧‧徑向方向

T‧‧‧驅動方向

1‧‧‧柱塞

2‧‧‧試管

3‧‧‧孔洞

4‧‧‧狹長孔

5‧‧‧生物樣本

6、80‧‧‧移液管

7‧‧‧混合液體

10‧‧‧第一管體部

11‧‧‧第一開口

20‧‧‧蓋體

30‧‧‧第二管體部

33‧‧‧第二開口

40‧‧‧阻隔件

50‧‧‧固態樣本

52、56‧‧‧FFPE樣本

70‧‧‧儲液容器

90、92、96‧‧‧試劑

100、200‧‧‧生物樣本前處理裝置

101‧‧‧第一管道

110‧‧‧第一螺紋

201‧‧‧中空內栓

203‧‧‧頂蓋部

204‧‧‧氣道

210‧‧‧第二螺紋

301‧‧‧第二管道

500‧‧‧微量離心管

521、522、523、561、562、563‧‧‧裂解檢體

524‧‧‧檢體碎屑

564‧‧‧核酸

60、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610‧‧‧托座

801‧‧‧濾塞

901‧‧‧水層

902‧‧‧有機層

1030‧‧‧管柱

1032‧‧‧管壁

2010‧‧‧底板

2011‧‧‧穿透孔

2020‧‧‧內栓氣流道

2030‧‧‧頂蓋孔

6010、6020、6030、6050、6060、6070、6090、6010、6020、6030、6050、6060、6070、6080、6090、6100‧‧‧通孔

6040‧‧‧濾網

6071、6081‧‧‧托座側壁

6072、6082、6092、6102‧‧‧托座面

6074、6084‧‧‧肩部

11a、11b、12a、12b‧‧‧核酸產物PCR檢測結果

901’、92’、96’‧‧‧粗萃取液

A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7‧‧‧電泳結果

為了讓本創作之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖係先前技術之生物樣本前處理裝置示意圖。

第2圖係根據本發明之生物樣本前處理裝置之透視圖。

第3A圖係根據本發明之一實施例之生物樣本前處理裝置之立體分解圖。

第3B圖係根據本發明之另一實施例之生物樣本前處理裝置之立體分解圖。

第4A圖係根據本發明之一實施例之生物樣本前處理裝置之剖視圖。

第4B圖係根據本發明之一實施例之生物樣本前處理裝置之剖視圖。

第5圖係根據本發明之生物樣本前處理裝置之局部放大示意圖。

第6A、6B、6C、6D、6E、6F圖係根據本發明之生物樣本前處理裝置之托座示意圖。

第7A、7B、7C、7D圖係根據本發明之係根據本發明之生物樣本前處理裝置之托座示意圖。

第8圖係先前技術之人工操作生物樣本前處理之流程示意圖。

第9圖係先前技術之人工操作生物樣本前處理供自動化核酸萃取之流程示意圖。

第10圖係本發明之生物樣本前處理裝置使用於自動化核酸萃取前處理程序之流程示意圖。

第11圖係根據本發明之實驗例1與對照例1所得之核酸膠體電泳圖。

第12圖係根據本發明之實驗例2與對照例2所得之核酸膠體電泳圖。

為使本發明之目的、技術特徵及優點，能更為相關技術領域人員所了解，並得以實施本發明，在此配合所附之圖式，具體闡明本發明之技術特徵與實施方式，並列舉較佳實施例進一步說明。以下文中所對照之圖式，係表達與本發明特徵有關之示意，並未亦不需要依據實際情形完整繪製；而關於本案實施方式之說明中涉及本領域技術人員所熟知之技術內容，亦不再加以贅述，合先敘明。

為利於說明本發明，請參見第2圖所示本發明之一實施例，先行定義本發明係按生物樣本前處理裝置100中管柱1030(外觀為圓柱狀)之長度方向，定義其為「軸向方向」A，且生物樣本前處理裝置100沿此軸向方向A具有一假想之中心軸C；而按管柱1030之橫向方向(即圓柱之橫截面方向)，定義其為「徑向方向」R。此外，基於前述之中心軸C，本發明之各元件設置時，如以此中心軸C為中心點加以設置，則以「同軸」之用語描述之。

參見第2圖，本發明之生物樣本前處理裝置包含管柱1030、蓋體20及托座60。以下依序詳述其實施方式。

首先，本發明之管柱1030係沿軸向方向A依序形成第一管體部10及第二管體部30。且管柱1030為中空且兩端開放，使管柱1030內形成一流道，且此流道按照第一管體部10、第二管體部30可進一步依序區分為第一管道101及第二管道301。其中，第一管體部10沿軸向方向A於鄰近管柱1030之開放端之一開放端緣形成第一開口11，第二管體部30沿軸向方向A於鄰近管柱1030之一開放端之端緣形成第二開口33。其中，由於管柱1030為中空，因而使管道1030向R方向具有特定內徑，而流道沿徑向方向具有特定之管徑(即沿徑向方向之直徑)，且管柱1030與流道位於同一橫截面位置時，管柱1030之內徑與流道之管徑實質上相同。管柱1030之內徑與流道之管徑大小可藉由調整管柱1030之管壁1032的厚度達成，且本發明不限制管壁1032的厚度分布，若因應目前技術實施時製造與使用本發明之常態，本發明係以管壁1032整體厚度一致為較佳實施態樣。惟根據本使用者可依需求調整管壁1032於管柱1030不同位置之厚度、構形以達成不同之效果，例如：減少其厚度以節省材料成本或提升管壁之透明度、增加其厚度以強化結構或調整機械性能、調整其構形以利流體環境優化等，均應涵蓋於本發明之範疇內。

其次，根據本發明之生物樣本前處理裝置100之設計，管柱1030 之內徑沿軸向方向A自第一開口11向該第二開口33逐漸縮減，使第一管體部10之平均內徑(根據本發明之一較佳實施例，可視之為第一管道101之平均管徑)大於第二管體部30之平均內徑(根據本發明之一較佳實施例，可視之為第二管道301之平均管徑)；而在一較佳實施例中，第二開口33的直徑大小一般為0~3mm之間，較好的直徑大小為1~3mm之間，最佳的直徑大小在1~1.5mm之間。根據此管柱1030之設計，使生物樣本前處理裝置100整體呈現漏斗狀，由平均內徑較小的第二管體部30構成一吸管狀的尖端，由第二開口33作為液體試劑出入口，有助於在生物樣本前處理程序中進行液體試劑的汲取與排放。

本發明生物樣本前處理裝置100之蓋體20，係同軸設置於第一開口11上，用以連接第一管體部10。根據本發明之一較佳實施例，蓋體20具有銜接管柱1030與移液設備(提供移液的驅動力)的功能，使生物樣本前處理裝置100能藉由蓋體20連接至移液設備，以驅動生物樣本前處理程序中所使用之試劑液體的移動；而根據現有技術而言，移液設備主要仍以抽吸氣體之手段作為驅動液體移動的動力來源，此為本領域技術所能輕易瞭解，故不再行贅述。

為達成上述目的與效果，參見第2、3A、3B圖，其中第3A圖係根據本發明之一實施例之生物樣本前處理裝置之立體分解圖，而第3B圖係根據本發明之另一實施例之生物樣本前處理裝置之立體分解圖。如第3A圖所示，蓋體20進一步設有一頂蓋部203與自蓋體20一端延伸的中空內栓201；在操作時，中空內栓201可以由第一開口11同軸置入第一管道101中；且頂蓋部203頂部中央形成頂蓋孔2030，使中空內栓201與頂蓋孔2030形成氣道204，且氣道204與管柱1030之流道相互連通，於移液設備抽吸氣體時，此氣道204即為氣體流動之通道。此外，在實施製造本發明之蓋體20時，頂蓋部203與中空內栓201可採用一體成形之製造方式產製(如第3A圖所示)；亦可採用分別製造頂蓋部203與中空內栓201之後加以組裝成蓋體20(如第3B圖所示)。

此外，根據本發明之較佳實施例，蓋體部203與第一管體部10之間係以螺紋、卡榫或囓合連接。螺紋、卡榫或囓合連接係為本領域常用之元件連接手段，其原理與操作方式不再詳述於此。在實施上，使用者可依需求採用螺紋、卡榫、囓合等方式達成連接蓋體20與第一管體部10；例如：螺紋連接具有容易組裝且可再度拆卸之特性；而卡榫連接同樣易於組裝，亦於製造，且其緊固效果佳；囓合連接，設計與製造簡易。根據本發明之一較佳實施例，蓋體20與第一管體部10連接後達成氣密效果有利於移液設備驅動試劑液體之移動，故本發明係以蓋體20與第一管體部10係以螺紋連接為較佳實施態樣，以同時達成緊固連接與氣密的效果；同樣地，當採用其他連接手段時，本發明亦涵蓋採用各種密封環(O-ring)或其他輔助元件，使蓋體20與第一管體部10達成氣密效果之態樣。

此外，螺紋、卡榫及囓合之技術手段均已有現成規格之產品與模具設計可直接套用，有利製造並便於使用者彈性應用。因此，本發明不限制蓋體20與第一管體部10之連接方式，亦不排除一體成形之製造方法，惟蓋體20能達成連接管柱1030與移液設備之功能與前述之各項效果者，均應涵蓋於本發明之範疇。為利於簡潔說明，下文僅以螺紋連接之手段說明本發明生物樣本前處理裝置100之實施方式。

請參見第3A及第4A圖，其中第4A圖係根據本發明之一實施例之生物樣本前處理裝置之剖視圖。本發明之生物樣本前處理裝置100，其係採用螺紋連接之手段將蓋體20連接至第一管體部10；具體而言，第一管體部10之端緣鄰近第一開口11之外壁形成第一螺紋110，而頂蓋部203之內緣對應地設有第二螺紋210，使中空內栓201由第一開口11同軸置入第一管道101後，第二螺紋210旋接至第一螺紋110，達成螺紋連接，以緊固接合第一管體部10與蓋體20；同樣地，當有拆卸第一管體部10與蓋體20需求時，使用者也能輕易地反向旋開第一管體部10與蓋體20，解除兩者之接合。

請進一步參見第4B圖，係示意生物樣本前處理裝置100之設置方式及使用於移液設備時的相對位置。其中，生物前處理程序所用之試劑主要為液體，由儲液容器70盛放，由第二管體部30開放端伸入儲液容器70，並由第二開口33汲取或排放試劑液體，使試劑液體可於第一管道101與第二管道301中流動。

請再參見第2、4A、4B圖，由於手動操作或非全自動之生物樣本前處理程序可能產生交叉汙染的問題，因此本發明進一步在頂蓋部203並於相對頂蓋的另一端上形成一底板2010且在底板2010上配置一穿透孔2011；其中，穿透孔2011可以供氣體流通，具有氣體導流功能，亦用以避免試劑液體於操作過程中濺起，導致沾染移液設備造成汙染的問題。此外，此穿透孔2011的直徑大小與管柱1030的第二開口33直徑大小配合，小於或等於第二開口33的直徑大小，直徑大小一般為0~3mm之間，較好的直徑大小為1~3mm之間，最佳的直徑大小在1~1.5mm之間。穿透孔2011與第二開口33直徑大小配合的主要因素在於：當穿透孔2011過小，在試劑液體受操作過程擠壓通過穿透孔2011時會因擠壓產生氣泡，進而將干擾實驗操作；而穿透孔2011若過大，則可會造成生物樣本阻塞穿透孔2011之問題，因此本發明進而限定穿透孔2011的大小需管柱1030的第二開口33大小配合，小於或等於第二開口33的大小。為避免生物樣本前處理程序中交叉污染的問題，根據本發明之一較佳實施例之生物樣本前處理裝置100，其於氣道204內進一步設有一阻隔件40，係與管柱1030同軸設置，用以封閉並阻隔試劑流向第一開口11。

因此，當試劑液體於第一管道101與第二管道301中流動時，一方面可控制移液設備之氣流(施力大小)以避免試劑液體沖向第一開口11；另一方面，中空內栓201朝第二開口33之方向為半封閉式與穿透孔2011之設計既可達成氣體導流之功能，亦能有效阻擋試劑液體過度流向移液設備；此外，參見第5圖，示意氣體於中空內栓201內所構成之內栓氣流道2020及氣體沿驅動方向T流動之情形，由此可見，阻隔件40之設計亦整體強化了防範試劑液體回流之效果。根據上述目的與功能，阻隔件40之材質以兼具氣體通透性與防水性為較佳實施態樣，此所謂之防水性係廣泛地指向阻擋液體流動之效果，除了透氣的防潑水材料外，具有特定體積之液體吸收能力的材料亦可達成防水性。具體而言，阻隔件40材質較佳為海棉、濾棉、防塵棉、透氣濾膜等材質。

再接著，請參見第2、3A、3B、4A、4B圖。本發明之生物樣本前處理裝置包含托座60，係同軸設置第一管道101中，用於托持生物樣本；其中，托座60具有複數通孔使試劑通過這些通孔，使試劑液體可於管柱1030之流道內往復流通。根據本發明之概念，托座60係托持生物樣本，藉由其上之通孔使試劑液體充分接觸生物樣本，並藉由驅動試劑液體於管道內往復流通，達成沖刷生物樣本，促進帶有核酸成分之生物組織釋出。據此目的，本發明之托座60係以穩定固設於管柱1030之流道為較佳實施態樣。

根據本發明之一實施例，托座60外觀大致呈現一扁圓柱狀，托座60之外徑實質上小於第一管道10之內徑而大於或等於第二管道30之內徑；因此，基於前述生物樣本前處理裝置100、200第一管體部10之平均內徑大於第二管體部30之平均內徑使之構形，當托座60與管柱1030分開製造後再行組裝時，托座60係先行同軸置入第一管道101後，由平均內徑小於第一管道101之第二管道301抵住托座60達成固設效果。根據本發明之另一實施例，為達成同軸設置托座60之效果，可於第一管道101或第二管道301內設有囓合齒、突肋等構造元件並對應調整托座60之外觀設計，使囓合齒、突肋等構造元件對應扣合或抵接托座60，達成固設托座60效果。根據本發明之另一實施例，托座60與管柱1030亦可由一體成形之製造方式達成固設，進而免除了組裝托座60之工序。

關於本發明之托座，本發明不特別限制其通孔之設計，可為各種幾何形狀之通孔，且通孔徑(其實質對應於通孔之截面積)包含廣泛的尺寸分布。舉例言之，參見第6A、6B、6C、6D圖，係舉例示意本發明之托座60之通孔之多種態樣：第6A圖係示意托座601設有多個矩形之通孔6010，且通孔6010規則排列，其中，通孔6010的直徑大小一般為0~3mm之間，較好的直徑大小為1~3mm之間，最佳的直徑大小在1~1.5mm之間。第6B圖係示意托座602設有多個圓形或橢圓形之通孔6020，且通孔6020以不規則方式排列，其中，通孔6020的直徑大小一般為0~3mm之間，較好的直徑大小為1~3mm之間，最佳的直徑大小在 1~1.5mm之間。第6C圖係示意托座603設有多個菱形之通孔6030，且通孔6030以規則方式排列，其中，通孔6030的直徑大小一般為0~3mm之間，較好的直徑大小為1~3mm之間，最佳的直徑大小在1~1.5mm之間。第6D圖係示意托座603之通孔之功能，可由同樣具有通孔或通透網格之濾網6040取代實施，同樣可達成前述托持生物樣本並使試劑液體流通等功能。第6E圖係示意托座605設有多個由小形的狹縫所構成之通孔6050，其中，通孔6050的直徑大小一般為0~3mm之間，較好的直徑大小為1~3mm之間，最佳的直徑大小在1~1.5mm之間。第6F圖係示意托座606設有多個由小形且彎曲的狹縫所構成之通孔6060，其中，通孔6060的直徑大小一般為0~3mm之間，較好的直徑大小為1~3mm之間，最佳的直徑大小在1~1.5mm之間。在第6A、6B、6C、6D圖中通孔6010、6020、6030、6040、6050的直徑大小係與管柱1030的第二開口33直徑大小配合，小於或等於第二開口33的直徑大小，其當通孔6010、6020、6030、6040、6050過小，在試劑液體受操作過程擠壓通過穿透孔2011時會因擠壓產生氣泡，進而將干擾實驗操作；而通孔6010、6020、6030、6040、6050若過大，則可會造成生物樣本阻塞之問題，因此，本發明通孔6010、6020、6030、6040、6050的直徑大小需管柱1030的第二開口33直徑大小配合，小於或等於第二開口33的大小。以避免試劑液體在操作過程中產生氣泡及造成生物樣本阻塞通孔6010、6020、6030、6040、6050之問題。

關於本發明之托座，本發明不特別限制其構形設計。舉例言之，參見第7A、7B、7C、7D圖，係示意本發明之托座60因應不同需求。現僅列舉四種托座之實施態樣加以說明：第7A圖係示意一圓盤狀之托座607，其托座面6072上設有多個圓形或橢圓形的通孔6070，沿著圓盤狀之托座607周緣形成向上突起之肩部6074，托座607之托座側壁6071為直壁，使托座607整體呈現對稱之圓盤狀，此圓盤之設計有利於穩定盛裝生物樣本，且其周緣側壁與管柱內壁之摩擦面積大，可強化固設托座607之效果。第7B圖係示意另一圓盤狀之托座608，其托座面6082上設有多個圓形或橢圓形的通孔6080，沿著圓盤狀之托座608周緣形成向上突起之肩部6084，使托座608整體呈現對稱之圓盤狀；須說明者，托座608之托座側壁6081為弧形托座側壁6081，此設計之適用時機包括當托座608為橡膠、高分子彈性塑料等彈性體所構成時，可藉由弧形托座側壁6081之設計達成固設效果；而當需要強化硬質之托座608之固設效果時，本發明亦納入採用密封環(O-ring)等輔助元件之手段達成，此時密封環便可設置於弧形托座側壁6081或其他構形之托座側壁所形成之空間內，此態樣有助於優化試劑液體的流體穩定性，更適用於自動化。第7C圖係示意另一圓盤狀之托座609，其托座面6092上設有多個矩形通孔6090，沿著圓盤狀之托座609周緣形成向上突起之肩部6094，使托座609整體呈現對稱之圓盤狀，此態樣說明本發明不特別限制托座所設通孔之構形。第7D圖係示意一構形簡單且易於製造之托座610，其上設有多個通孔6100，然而其托座面6102平坦無肩部設計，此簡單構形可降低產製成本，尤其適用於生物樣本充足之大量、快速篩檢用之自動化核酸萃取平台。

須說明者，本發明並不限制外接移液設備的種類，且為了免除增設或大幅調整移液設備及衍生的問題，本發明係以配合現有之移液設備常用之裝置規格為較佳實施態樣，而關於自動化移液設備之裝置原理與常用規格係本領域技術人員所熟知，故不再加以贅述。然而，當未來移液設備逐步改良時，根據本發明之設計，亦可藉由調整蓋體部203之構形設計而達成，不僅減低產製成本，亦能彈性應用至各種移液設備，進而使本發明更容易普及。

為更易於瞭解本發明之生物樣本前處理裝置之具體實施內容、可解決之技術問題與達成之效果，以下列舉實驗例，並配合相關示意與數據圖式加以說明。

首先，簡述說明傳統人工操作生物樣本前處理之流程。由於自動化核酸萃取平台適用的生物樣本種類繁多，其中以固態生物樣本之前處理的難度較高，此謂固態生物樣本包含但不限於：棉棒、血卡、菸蒂、檳榔渣、口香糖渣、頭髮、膠帶等)與福馬林固定石蠟包埋生物組織樣本(以下簡稱FFPF樣本)，較容易產生技術缺失影響核酸萃取表現；因此，以下說明係分別以「固態生物樣本」與「FFPE樣本」作為本發明用以實施生物樣本前處理程序之態樣，並據之列舉實驗例與對照例。

本發明適用於各種自動化核酸萃取平台(設備)之生物樣本前處理程序，例如前述採用管柱吸附方法、磁珠萃取方法等自動化核酸萃取平台；然而，為利於簡潔示意與說明本發明之實施效果，以下說明之實驗例與對照例所提及之人工操作方法係採用市售之試劑套組(MagCore® Genomic DNA Tissue Kit)配合市售之自動化核酸萃取設備(MagCore® Automated Nucleic Acid Extractor)進行操作，其原理與操作細節均已詳盡揭露於產品說明內，係本領域技術人員可輕易明暸及依循操作，故不再於此詳述，合先敘明。

參見第8圖，係先前技術以傳統人工操作固態樣本前處理之流程示意圖。簡言之，將固態樣本50置入微量離心管500後，以移液管80汲取試劑90並加入微量離心管500中，將固態樣本50與試劑90充分混合，先以56℃加熱1小時後再以90℃加熱1小時，促使生物組織裂解釋出。其中，由於試劑90之成分含有油相溶液(或有機溶液)與水相溶液，經前述加熱與裂解程序後產生分層，下層為水層901，上層為有機層902。接著，以移液管80吸取下層之水相層液將水層901移出，即取得粗萃取液901’，此粗萃取液901’係用於後續核酸萃取程序。此傳統方法人工操作時，移液管80以選用設有濾塞801的移液管80為佳，以避免人工操作所衍生的交叉汙染問題。

參見第9圖，係先前技術以傳統人工操作FFPE樣本52前處理之流程示意圖。針對FFPE樣本52，由於現採用之試劑套組已具備良好的裂解FFPE樣本之效果，其操作流程大致上同於前述處理固態樣本之50。簡言之，將FFPE樣本52置入微量離心管500中，以移液管80汲取試劑92並加入微量離心管500中，將FFPE樣本52與試劑92充分混合，先以56℃加熱1小時後再以90℃加熱1小時，使FFPE樣本52中所含有之石蠟融解同時暴露並裂解其中之生物組織檢體，如第9圖中裂解檢體521、裂解檢體522、裂解檢體523所示。接著，完成加熱裂解的步驟後，裂解檢體521、522、523經由充分裂解，形成粗萃取液92’與殘留之檢體碎屑524，其中，此粗萃取液92’係用於後續核酸萃取程序，惟在使用上仍需要以離心手段去除檢體碎屑524之干擾。

由此可見，上述傳統方法須於執行自動化核酸萃取之前，由人工操作生物樣本前處理之程序，難以避免操作繁複與人工操作衍生的諸多問題，因此，本發明現提出了一有效之解決方案。

參見第10圖，係以本發明之生物樣本前處理裝置100，配合自動化核酸萃取設備進行全自動化操作FFPE樣本56前處理之流程示意圖；此外為簡潔說明，第10圖僅簡單示意自動化操作裝置與生物樣本前處理裝置100接觸的介面部份，故並未顯示整個自動化操作裝置。

現同樣以FFPE樣本56之前處理為例：首先，將FFPE樣本56置入管柱內，由托座60托持FFPE樣本56，之後將蓋體組裝至管柱完成生物樣本前處理裝置100，繼而裝設至自動化核酸萃取設備(例如：型號MagCore®系列設備)進行自動化操作。載有FFPE樣本56之生物樣本前處理裝置100深入儲液容器70中，由管柱1030的第二開口33處汲取試劑96(例如：裂解液、細胞裂解液)，使試劑96通過托座60上之通孔與FFPE樣本56混合；接著，按預設的流速、吸放頻率與試劑體積，驅動試劑96於流道內往復流通，達成充分混合試劑96與FFPE樣本56的效果；同時，按預先設定之溫控加熱程序，使試劑96與FFPE樣本56之混合物於混合時同步均勻受熱，促進裂解效果，使FFPE樣本56所含之生物組織檢體釋出，如裂解檢體561、562、563所示。FFPE樣本56經由前處理程序之充分的混合與裂解後，釋出所含之核酸564至粗萃取液96’中，此時即可由自動化核酸萃取設備直接取得粗萃取液96’供後續核酸萃取使用。而針對不同類型(體積、生物組織種類等)的FFPE樣本與各項需求，使用者可預先彈性調整加熱程序與試劑吸放程序之排程，以進一步提高前處理之效能。

請參見以下實驗例與對照例之敘述，進一步呈現本發明所達成之效果。

實驗例1：

本實驗例採用固態生物樣本為採檢所用之棉棒。事先將棉棒沾取定量血液(20μl、15μl、10μl、5μl)，再將沾血棉棒分別置入本發明之生物樣本前處理裝置中，旋緊蓋體後，直接裝設至自動化磁珠萃取設備(型號：MagCore® Super；RBC bioscience)後，自動化進行生物樣本之前處理程序以及核酸萃取程序，各固態生物樣本最終可取得60μl之核酸產物。

對照例1：

本對照例採用固態生物樣本為採檢所用之棉棒。事先將棉棒沾取定量血液(20μl、15μl、10μl、5μl)，再將沾血棉棒放入微量離心管中，由人工加入裂解液及蛋白酶K，將微量離心管置於加熱器上以55℃持續加熱30min以取得裂解產物(lysate)，即完成前處理程序；接著，將裂解產物以人工操作轉移至自動化磁珠萃取設備所使用之反應槽中，後續以磁珠萃取方法分離萃取核酸產物。本實施例係將前處理完之溶液直接應用至自動化磁珠萃取設備(型號：MagCore® Super，RBC bioscience)進行自動化核酸萃取程序，各固態生物樣本最終可取得60μl之核酸產物。

根據上述實驗例1與對照例1所得之核酸產物，進一步以聚合酶連鎖反應(以下簡稱PCR)方法，擴增穩定表現基因「甘油醛3-磷酸脫氫酶」(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase；以下簡稱GADPH)的DNA，確認其濃度與品質是否適用於後續分析，相關結果如第11圖所示。參見第11圖，實驗例1之核酸產物PCR檢測結果11b顯示，沾血量20μl之電泳結果A1、沾血量15μl之電泳結果A2、沾血量10μl之電泳結果A3、沾血量5μl之電泳結果A4均顯示了明顯而清晰的PCR產物，表示無論血液檢體含量多寡，其擴增效果均良好，同時反映經由實驗例1之方法所取得之核酸品質理想，適用於後續的基因檢測。反觀對照例1之核酸產物PCR檢測結果11a，沾血量20μl之電泳結果M1、沾血量15μl之電泳結果M2、沾血量10μl之電泳結果M3、沾血量5μl之電泳結果M4，顯示其PCR產物之亮度稍弱，且PCR產物量不穩定，尤其沾血量15μl之電泳結果M2以及沾血量5μl之電泳結果M4的產物量明顯較少，反映出生物樣本前處理程序可能不盡理想所導致的結果。

實驗例2：

本實驗例採用固態生物樣本為FFPE樣本，並進一步依據FFPE樣本的體積區分為大型、中型、小型樣本。需說明者，由於此實驗例旨在驗證不同前處理方式是否會影響不同體積之FFPE樣本之核酸萃取效果，故不對於體積大小加以具體定義，惟執行時，仍遵循實驗例2與對照例2大型、中型、小型樣本體積相同之原則，以利比較。此外，由於大型FFPE樣本可能為長條狀，為加速前處理效能，可將FFPE樣本同樣地彎折成數等份(每段0.5CM為較佳)後再置入生物樣本前處理裝置中。

分別將大型、中型、小型樣本置入本發明之生物樣本前處理裝置中，加入裂解液試劑。此裂解液試劑係由400μl石蠟溶劑、180μl裂解溶液(1%SDS；30mM Tris-Hcl；10mM EDTA)與20μl蛋白酶K(proteinase K)混合而成。於旋緊蓋體後，直接裝設至自動化磁珠萃取設備(型號：MagCore® Super；RBC bioscience)；同時開始於56℃環境下加熱並進行吸吐混合1小時，接著在90℃環境下加熱並吸吐混合1小時，之後將混合液吸取至生物樣本前處理裝置中於室溫下靜置10分鐘，可觀察到混合液開始產生分層現象；將下層之水層中之粗萃取液約190μl移入新的試管槽後，殘留組織則留在生物樣本前處理裝置中。接著，加入200μl緩衝液AL(Buffer AL)至水相層液，並加以混合均勻，供後續核酸萃取程序使用。本實驗例係以管柱吸附法(層析管柱分離方法)進行核酸分離：加入200μl 100%EtOH至粗萃取液中混合均勻後，將所有液體加入層析管柱中，以層析管柱分離方法進行核酸分離，係採用QIAGEN核酸純化套組(QIAGEN；QIAamp DNA FFPE Tissue Kit；Cat.No.56404)之層析管柱；其操作步驟係依循其產品使用說明，故不在此詳述，最終步驟係以60μl ATE緩衝液分別沖提並取得大型、中型、小型樣本之核酸產物。

對照例2：

分別將大型、中型、小型樣本置入微量離心管中，加入裂解液試劑。此裂解液試劑係由400μl石蠟溶劑、180μl裂解溶液(1%SDS；30mM Tris-Hcl；10mM EDTA)與20μl蛋白酶K(proteinase K)混合而成。於加以震盪混合10秒鐘，取得混合液。接著，以人工對前述各混合液進行加熱，係於56℃環境下加熱1小時之後，於室溫下稍加靜置，同時可將加熱器升溫至90℃，待加熱器溫度完成，於90℃環境下加熱1小時；過程中適度加以小幅震盪混合促進裂解。由於加熱時，微量離心管內會產生水氣，因此可稍微短暫離心將水氣離下至混合液中。於此步驟時，可觀察到混合液開始產生分層現象；接著，以人工操作移液管吸取下層之水層中之粗萃取液約190μl移入新的微量離心管。加入200μl緩衝液AL(Buffer AL)至水相層液，並加以混合均勻，供後續核酸萃取程序使用。本對照例係以管柱吸附法(層析管柱分離方法)進行核酸分離：加入200μl 100%EtOH至粗萃取液中混合均勻後，將所有液體加入層析管柱中，以層析管柱分離方法進行核酸分離，係採用QIAGEN核酸純化套組(QIAGEN；QIAamp DNA FFPE Tissue Kit；Cat.No.56404)之層析管柱；其操作步驟係依循其產品使用說明，故不在此詳述，最終步驟係以60μl ATE緩衝液分別沖提並取得大型、中型、小型樣本之核酸產物。

根據上述實驗例2與對照例2所得之核酸產物，進一步檢測其濃度與核酸品質，其結果列示於表1。由表1可知，無論是大型、中型、小型樣本，使用本發明之生物樣本前處理裝置所得之核酸產物濃度均高於人工前處理；就特定波長吸光值(OD)之比例(OD 260/280)而言，核酸產物(DNA)品質同於對照之組別(小型樣本)或略優於對照之組別(大型、中型樣本)；就特定波長吸光值(OD)之比例(OD 260/230)而言，自動化前處理組別之有機溶劑的殘量狀況近似於人工前處理組別。以上數據顯示使用本發明之生物樣本前處理裝置，確實適用於自動化核酸萃取，並可有效取得濃度高而品質亦佳之核酸產物。

根據上述實驗例2與對照例2所得之核酸產物，進一步以聚合酶連鎖反應(以下簡稱PCR)方法，擴增穩定表現基因GADPH的DNA，確認其品質是否適用於後續分析，相關結果如第12圖所示。參見第12圖，根據實驗例2與對照例2：對大型樣本分離取得之核酸產物PCR檢測結果12a顯示；對中型樣本分離取得之核酸產物PCR檢測結果12b顯示；對小型樣本分離取得之核酸產物PCR檢測結果12b顯示。其中，針對大型樣本，以人工前處理之電泳結果M5與自動化前處理之電泳結果A5表現相似，惟前者稍弱於後者；針對中型樣本，以人工前處理之電泳結果M6顯示其未產出PCR產物，而自動化前處理之電泳結果A6則顯示其產出PCR產物；針對小型樣本，以人工前處理之電泳結果M7顯示其未產出PCR產物，而自動化前處理之電泳結果A7則顯示其產出PCR產物。由此可見，使由本發明之自動化前處理方法所得之核酸品質良好，足以直接用於後續的分析，而人工前處理之組別雖然可測得核酸濃度，卻無法順利產出PCR產物，顯示其品質仍不足以直接使用於核酸分析，需要額外加工或純化方可使用。

除了前述萃取DNA之實施內容外，本發明亦適用於萃取RNA，以下列舉實驗例3與對照例3說明採用本發明之生物樣本前處理裝置萃取RNA之具體內容。以下實驗例3與對照例3係以管柱吸附法(層析管柱分離方法)進行RNA分離，係採用QIAGEN核酸純化套組(QIAGEN；RNeasy FFPE Kit；Cat.No.73504)之層析管柱；其操作步驟係依循產品說明，不詳述於此。

實驗例3：

首先，將FFPE樣本折成數等分(每段不大於0.5公分)盡可能不折斷置入本發明之生物樣本前處理裝置中，旋緊蓋體，由本裝置之吸管端汲取裂解液試劑。此裂解液試劑係由400μl二甲苯、150μl PKD緩衝液與10μl蛋白酶K(proteinase K)混合而成。接著，於56℃環境下加熱並進行吸吐混合1小時，再接著，在90℃環境下加熱並吸吐混合1小時，之後將所有液體吸至生物樣本前處理裝置中於室溫靜置10分鐘，可觀察到混合液開始產生分層現象，由本裝置之吸管端將下層之水層中之粗萃取液約140μl移入新的試管槽後，殘留組織則留在生物樣本前處理裝置中。接著，於冰上靜置3分鐘，接著加入水層總體積十分之一體積的DNA酶緩衝液以及10μl的DNA酶原液，上下翻轉微量離心管以混合均勻，於室溫靜置15分。加入320μl RBC緩衝液混合均勻後，再加入1200μl 100%EtOH，並將所有的樣本混合液加入層析管柱中，最終步驟係以60μl RNase-free純水沖提取得核酸產物。

對照例3：

首先，將將FFPE樣本折成數等分(每段不大於0.5公分)盡可能不折斷置入微量離心管，加入裂解液。此裂解液試劑係由400μl二甲苯、150μl PKD緩衝液與10μl蛋白酶K(proteinase K)混合而成。接著，加以震盪混合10秒鐘，取得一混合液。之後進行加熱步驟，係將前述混合液於56℃環境下加熱15分之後，於室溫下稍加靜置，同時可將加熱器升溫至80℃，待加熱器溫度完成，於80℃環境下加熱混合液達15分。加熱時，管柱內會產生水氣，因此可稍微短暫離心將水氣離下至混合液中。於此步驟時，可觀察到混合液開始產生分層現象，上層為有機層，下層為水層，而殘留組織則留在水層之中。接著，以移液管吸取下層之水層中之粗萃取液約140μl移入新的微量離心管後，於冰上靜置3分鐘，接著加入總水相液層總體積十分之一體積的DNA酶緩衝液以及10μl的DNA酶原液，上下翻轉微量離心管以混合均勻，於室溫靜置15分。加入320μl RBC溶液混合均勻後，再加入1200μl 100%EtOH，並將所有的樣本混合液加入層析管柱中，最終步驟係以60μl RNase-free純水沖提取得核酸產物。

根據前述本發明之生物樣本前處理裝置，提供了一種可直接應用於現有自動化核酸萃取設備之生物樣本前處理裝置，除可以有效提升效能，並更能有效地大幅減低既有技術與人工操作可能衍生之氣霧(aerosol)形成、交叉汙染、感染危害等不良效應。

雖然本發明已將各種較佳實施例揭露如前述，然其並非用以限定本發明，任何熟習本領域技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之專利保護範圍須視本說明書所附之申請專利範圍所界定者為準。

100‧‧‧生物樣本前處理裝置