CN105754898B - 一株水解猪血的蛋白酶产生菌——解淀粉芽孢杆菌及其筛选与使用方法 - Google Patents

一株水解猪血的蛋白酶产生菌——解淀粉芽孢杆菌及其筛选与使用方法 Download PDF

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Abstract

一株水解猪血的蛋白酶产生菌——解淀粉芽孢杆菌及其筛选与使用方法，该蛋白酶产生菌是解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），该菌株纯培养物已于2016年1月4日保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 2016003；简称解淀粉芽孢杆菌GUHP86。本发明的解淀粉芽孢杆菌GUHP86，具有产蛋白酶的性质，直接用于水解猪血蛋白，符合利用蛋白酶水解蛋白质的发展趋势。请优点是成本低、能循环利用、稳定性好、绿色安全、能直接用于生物催化，原料来源广泛，方法简单实用。因此GUHP86在水解猪血蛋白上具有重要应用前景，亦可应用于其他蛋白质的水解。

Description

一株水解猪血的蛋白酶产生菌——解淀粉芽孢杆菌及其筛选 与使用方法
技术领域
本发明涉及微生物或酶，特别涉及蛋白酶产生菌。
背景技术
微生物蛋白酶主要来源于微生物的代谢产物，这些微生物主要是一些细菌、霉菌等。例如一些枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、黑曲酶、黄曲霉、米曲酶等都可以产生蛋白酶。
家畜血液是丰富的蛋白质资源，其中猪 、牛和其它饲养动物的血液中蛋白质含量约为18%～22% ,含有多种氨基酸和微量元素。家畜血中猪血尤其是一种宝贵的资源，猪血中蛋白质含量占鲜血总量的18.9%，因此猪血被成为“液态肉”。在我国猪血资源十分丰富，但由于猪血含水量高容易受到污染发生腐败，另外猪血的适口性差，血腥味浓重；虽然猪血中氨基酸含量丰富但异亮氨酸，甲硫氨酸和半胱氨酸含量较低，而组氨酸和赖氨酸含量较高，各种氨基酸含量并不平衡。因此，除了少量猪血被用来食用以外，大量的猪血被浪费，不仅造成了环境的污染还造成了蛋白质资源的严重浪费。所以，开发出利用猪血的新方法、新工艺显的非常重要，可以创造出很高的社会经济效益。
蛋白质经酸、碱或者蛋白酶处理可获得氨基酸和多肽。酸、碱水解作用强烈会破坏一些敏感氨基酸，并且生成有毒的氯丙醇类物质。酶水解条件温和，对敏感氨基酸无破坏，能最大保留原料理化性质、风味、功能特性、绿色安全，能耗小。但用商品蛋白酶水解蛋白质的生产成本较高。
中国专利数据库中，涉及蛋白酶产生菌的申请件有2007101919691号《一种耐有机溶剂碱性蛋白酶产生菌以及该耐有机溶剂碱性蛋白酶的基因和应用》、ZL2010101038046号《一种耐有机溶剂蛋白酶产生菌及其所产耐有机溶剂蛋白酶的基因和应用》、ZL2013101991045号《一种胶原蛋白酶产生菌》、2014104745390号《一株水解米渣的蛋白酶产生菌：枯草芽孢杆菌及其筛选与使用方法》和2014104753113号《一株水解米渣的蛋白酶产生菌——解淀粉芽孢杆菌及其筛选与使用方法》。2014104745390号和2014104753113号分别公开了一株水解米渣的蛋白酶产生菌。但迄今为止，尚无水解猪血的蛋白酶产生菌的申请件。
发明内容
本发明旨在提供一株水解猪血的蛋白酶产生菌——解淀粉芽孢杆菌，使之能够用于猪血蛋白的生物法水解。
本发明的又一目的在于提供所述水解猪血的蛋白酶产生菌的筛选与使用方法，使前述的蛋白酶产生菌可以生产并得以实际应用。
发明人提供的一株水解猪血的蛋白酶产生菌是解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），该菌株纯培养物已经于2016年1月4日保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，该中心地址是：中国武汉·武汉大学，邮政编码：430072；保藏编号为CCTCC NO. M2016003；该菌株简称解淀粉芽孢杆菌GUHP86，系从中国贵州屠宰场污血中分离得到。
上述水解猪血的蛋白酶产生菌---解淀粉芽孢杆菌GUHP86形态特征和生理生化特征接近芽孢杆菌属，淀粉芽孢杆菌GUHP86的16S rRNA序列与Bacillus amyloliquefaciensFZB42(T)序列同源性在99％以上，看家基因recA序列与Bacillus amyloliquefaciens（CP007244.1）序列同源性达99％。根据≤伯杰氏系统细菌学手册≥中芽孢杆菌属的分类概况，解淀粉芽孢杆菌GUHP86属芽孢杆菌纲（Bacilli）,芽孢杆菌目（Bacillales），芽孢杆菌科（Bacillaceae）,芽孢杆菌属（Bacillus），解淀粉芽孢杆菌种（Bacillus amyloliquefaciens）。
发明人提供的解淀粉芽孢杆菌GUHP86的筛选方法是：先从屠宰场污血采样，将样品中的蛋白酶产生菌分别经富集培养后，采用酪蛋白为底物，经过富集培养后稀释涂布在酪蛋白平板选择培养基上，以微生物分解酪蛋白的能力作为初筛指标，挑取具有透明圈较大的菌落在酪蛋白平板上三区划线纯化，纯化后的单菌落移接斜面培养基保存，从而实现初筛；之后以新鲜猪血为底物，摇瓶发酵复筛，以微生物摇瓶发酵猪血，离心，上清液注酪蛋白平板孔，恒温培养，以平板孔直径为指标第一次复筛；平板经直径较大的菌株再经摇瓶发酵猪血，离心后测上清液蛋白酶活力，以酶活为指标二次复筛；最后酶活较高的菌株发酵猪血，离心，上清液沸水灭酶，测上清液中氨态氮，以氨态氮为指标第三次复筛。
上述富集培养的条件为：富集培养基以g/100mL计的成分为：牛肉膏0.5～1.0，蛋白胨0.5～1.0，猪血粉0.5～1.0，(NH4)2SO4 0.1～0.2，K2HPO4 0.5～1.0，MgSO4·7H2O 0.01～0.02，CaCl2 0.01～0.02，NaCl 0.5～1.0， pH 6.5～7.5; 酪蛋白选择培养基以g/100mL计的成分为：牛肉膏0.5～1.0，酪蛋白0.5～1.0，猪血粉0.5～1.0，(NH4)2SO4 0.1～0.2，K2HPO4 0.5～1.0，MgSO4·7H2O 0.01～0.02，CaCl2 0.01～0.02，NaCl 0.5～1.0，琼脂粉2.0，pH 6.5～7.5;斜面保藏培养基细菌为细菌完全培养基，种子培养基以g/100mL计的成分为：猪血粉1.2～1.8，NaCl 0.5～1.0，MgSO4·7H2O 0.01～0.02，CaCl2 0.01～0.02，K2HPO4 0.5～1.0，pH 6.5～7.5;发酵培养基为新鲜猪血。
为了验证本发明的菌株，发明人进行了如下实验：
⑴样品采集
从贵阳花溪屠宰厂污血、土壤，以及传统豆豉、腊肉、酸肉，大曲、酒醅中取样，用聚乙烯袋封口；取回样品后，即着手分离工作。
⑵ 富集培养
称取5.0g样品，加入到50mL无菌生理盐水中，再放入4颗小玻璃珠，30℃、180r/min下振荡培养30min，取5mL加入富集培养基中，30℃、180r/min下摇床富集培养24h。
⑶初筛
取上述0.2mL稀释适当梯度的富集菌液涂布于酪蛋白选择培养基平板，静置5min，倒置于平板上，于30℃下培养。挑取形成透明圈较大的单一菌落，划线纯化后在试管斜面上划Z形线，30℃下培养至出现丰满的菌落后，4℃冰箱保藏。初筛共获得形成明显透明圈的菌株120株，其中解淀粉芽孢杆菌GUHP86形成的透明圈最大。
⑶第一次复筛
用打孔器在初筛酪蛋白选择培养基平板上打孔，每平板均匀打3孔（三孔为一组平行），孔径为0.4cm。挑取初筛试管菌2环接入种子培养基中，以30℃、180r/min下培养24h后，以6％～8％（1.235×106 cfu/mL, 指每毫升样品中含有的细菌群落总数）接种量接入发酵培养基中，在同样条件下培养24h后，于4℃、10000r/min离心10min，得到的上清液即粗酶液。取30μL粗酶液注入平板孔，平板于30℃恒温培养12h后，测量水解透明圈直径d作为第一次复筛指标；选取形成透明圈直径最大的酶液所对应的菌株以备第二次复筛。
经第一次复筛，120株菌株粗酶液都形成透明圈，透明圈直径从1.0cm到2.8cm不等，透明圈直径d≥2.5cm的菌株共30株，菌株解淀粉芽孢杆菌GUHP86形成的透明圈直径最大，为2.85±0.05cm。
⑸第二次复筛
选取水解透明圈直径d≥2.4cm的菌株，采用Folin-酚试剂显色法测定其粗酶液（粗酶液制备同第一次复筛中粗酶液制备）中蛋白酶活力。
标准曲线的绘制：取9个10mL容量瓶依次编号0到8，分别加入100µg/mL的酪氨酸标准溶液0，1，2，3，4，5，6，7，8mL，用蒸馏水定容，制得浓度依次为0，10，20，30，40，50，60，70，80µg/mL的酪氨酸溶液。分别取上述梯度酪氨酸溶液1mL，各加0.4mol/L Na2CO3溶液5mL，Folin-酚试剂1mL，置于40℃水浴中显色20min，取出于680nm波长，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0号管为空白，分别测定其吸光度；再以吸光度为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制吸光度值-酪氨酸浓度标准曲线。
酶活力测定：粗酶液用pH7.5磷酸缓冲液稀释适当的倍数，供测试用。将1％酪蛋白溶液放入40℃恒温水浴中预热5min，然后按下述过程操作：① 试验组（作3个平行试验）：吸取1m稀释的粗酶液加入试管，40℃水浴预热2min，加1％酪蛋白溶液1mL摇匀，40℃准确计时10min，加0.4mol/L三氯乙酸2mL摇匀终止反应，取出静置10min，过滤，取1mL滤液，加0.4mol/LNa2CO35mL，加Folin-酚试剂1mL，40℃显色20min，于680nm波长，用10mm比色皿测其吸光度。②空白组：同试验组，只是将酪蛋白溶液和三氯乙酸溶液的加入顺序调换。
酶活力计算：酶活单位定义为1mL粗酶液在40℃条件下，1min水解酪蛋白产生1µg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位（u）。发酵液蛋白酶活力（u/mL）=A×K×4n/10，式中，A—样品平行试验的平均吸光度；K—吸光常数；4—反应液的总体积（mL）；10—反应时间（min）；n—粗酶液稀释倍数。
经第二次复筛得到发酵液酶活在190u/mL以上的菌株10株，其中菌株GUHP86的蛋白酶活力高于其他9株，达274±1.5u/mL。
⑹第三次复筛
选取上述蛋白酶活力在190u/mL以上的10株菌株发酵后离心，上清液沸水灭酶后测定其中氨基酸态氮含量；所述上清液制备同第一次复筛上清液的制备。
氨基酸态氮的测定：吸取5mL上述灭过酶的发酵上清液，置于100mL容量瓶中，蒸馏水定容。然后吸取20mL置于200mL烧杯中，加60mL蒸馏水，开动磁力搅拌器，用0.05mol/LNaOH标准溶液滴定至酸度计指示pH=8.2。再加入10mL甲醛溶液混匀，再用0.05mol/L NaOH标准溶液滴定至pH=9.2，记下消耗0.05mol/L NaOH标准溶液的毫升数。同时做试剂空白试验。
氨基酸态氮计算：X=[(V1-V2)·C×0.014] ×100/[5×(V3/100)]
式中：X—样品中氨态氮的含量，g/100mL；V1—测定用样品稀释液加入甲醛溶液后消耗NaOH标准溶液的体积，mL；V2—实际空白试验加入甲醛溶液后消耗NaOH标准溶液的体积，mL；V3—样品稀释液取用量，mL；C—NaOH标准溶液的浓度，mol/L；0.014—1mL1mol/LNaOH标准溶液溶液相当于氮的g数。经第三次复筛，菌株GUHP86发酵血蛋白水解度为（18.93±0.5）％。
菌株GUHP86的鉴定：鉴定菌种的属种，了解其基本的生理生化特征，对有效地利用已有文献、指导进一步实验有着重要作用。为此，对解淀粉芽孢杆菌GUHP86菌株进行形态学观察，生理生化特征，16S rRNA及看家基因recA序列鉴定。
形态特征：将菌种划线接种于细菌完全培养基固体平板于30℃，培养18h。在细菌完全培养基上解淀粉芽孢杆菌GUHP86菌落生长较快，菌落呈淡黄色，半透明，圆形或近圆形，边缘齐整，光滑半湿润，菌落直径1.5～3.5mm，不产生色素，粘稠、易挑取。取斜面保存幼龄菌进行革兰氏染色，在光学显微镜下解淀粉芽孢杆菌GUHP86为短直杆状，革兰氏染色都呈紫色，为革兰氏阳性杆菌。生理生化特征采用API 20NE 、Biolog GP微生物鉴定自动分析系统，生理生化结果见表1、表2。
表1 菌株GUHP-86生理生化特性-酶活、碳源同化
检测项目 检测结果
NO3 硝酸盐还原到亚硝酸盐 -
TRP 吲哚 -
GLU 酸化葡萄糖 -
ADH 精氨酸双水介酶 -
URE 脲酶 -
ESC 水解七叶灵(β-葡萄糖甙酶) +
GEL 水解明胶(蛋白酶) +
PNPG β-半乳糖甙酶 -
GLU 同化葡萄糖 +
ARA 同化阿拉伯糖 W
MNE 同化甘露糖 +
MAN 同化甘露醇 +
NAG 同化N-乙酰-葡萄糖胺 +
MAL 同化麦芽糖 +
GNT 同化葡萄糖酸盐 W
CAP 同化癸酸 -
ADI 同化已二酸 -
MLT 同化苹果酸 +
CIT 同化柠檬酸 W
PAC 同化苯乙酸 -
注：+：阳性反应； -：阴性反应； W：弱阳性反应
表2 菌株GUHP-86生理生化特性--碳源同化
检测项目 结果 检测项目 结果
1.0 RHA 鼠李糖 - 0.0 MAN 甘露醇 +
1.1 NAG N-乙酰葡萄糖胺 + 0.1 GLU D-葡萄糖 +
1.2 RIB D-核糖 + 0.2 SAL 水杨素 +
1.3 INO 肌醇 + 0.3 MEL D-蜜二糖 W
1.4 SAC 蔗糖 + 0.4 FUC L-岩藻糖 -
1.5 MAL 麦芽糖 + 0.5 SOR D-山梨醇 +
1.6 ITA 衣康酸 - 0.6 ARA L-阿拉伯糖 +
1.7 SUB 辛二酸盐 - 0.7 PROP丙酸盐 -
1.8 MNT 丙二酸盐 - 0.8 CAP 癸酸盐 -
1.9 ACE 乙酸盐 - 0.9 VALT戊酸盐 -
1.A LAT DL-乳酸盐 + 0.A CIT 柠檬酸盐 W
1.B ALA L-丙氨酸 + 0.B HIS 组氨酸 W
1.C 5KG 5-酮基-葡萄糖酸盐 - 0.C 2KG 2-酮葡萄糖酸盐 -
1.D GLYG 糖原 W 0.D 3OBU 33- 羟基-丁酸盐 -
1.E MOBE 3-羟基-苯甲酸盐 - 0.E pOBE 4-羟基-苯甲酸盐 -
1.F SER L-丝氨酸 - 0.F PRO L-脯氨酸 +
注： +：阳性反应； -：阴性反应；W：弱阳性
根据以上形态和生理生化特征结果，菌株GUHP86特征符合芽孢杆菌属特征，初步鉴定属芽孢杆菌属。
16S rRNA序列及看家基因recA序列由武汉中国典型培养物保藏中心（CCTCC）鉴定；测序后获得的16S rRNA和recA基因序列登陆http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi网站，用Blast程序与Genbank中已知序列进行比对分析。
系统发育树构建：将菌株GUHP86的16S rRNA、看家基因recA序列登陆NCBI（National Center for Biotechnology Information）数据库，通过在线BLAST（BasicLocal Alignment Search Tool）程序与Genbank中已知序列进行分析比较。CCTCC NO. M2014201的16S rRNA序列BLAST共搜索到49个与该序列同源性较高的基因片段的菌株，该菌株与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum Trigo Cor1448）（CP007244.1）的16S rRNA 序列同源性在99％以上，选取序列同源性较高的35株菌株，应用MEGA5.0分析软件构建系统进化树，结果如图4。
因此，根据其形态特征、生理生化特征、16S rRNA及看家基因recA分析鉴定，菌株GUHP86更接近解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），根据≤伯杰氏系统细菌学手册≥中芽孢杆菌属的分类概况，属芽孢杆菌纲（Bacilli），芽孢杆菌目（Bacillales），芽孢杆菌科（Bacillaceae），芽孢杆菌属（Bacillus），解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
发明人提供的解淀粉芽孢杆菌GUHP86使用方法是：取斜面保藏菌株解淀粉芽孢杆菌HP86 2环分别接于种子培养基中，30℃，180r/min摇床培养24h后，以6％～8％（0.1～5×106 cfu/mL）接种量分别接入发酵培养基中，同样条件下摇床培养24h，即用于猪血蛋白水解。
上述种子培养基的成分以g/100mL计的成分为：猪血粉1.2～1.8，NaCl 0.5～1.0，MgSO4·7H2O 0.01～0.02，CaCl2 0.01～0.02，K2HPO4 0.5～1.0，pH 6.5～7.5。
本发明所筛选到的解淀粉芽孢杆菌GUHP86，具有产蛋白酶的性质，直接用于猪血蛋白的水解，符合利用蛋白酶水解蛋白质的发展趋势。该菌株用于水解猪血蛋白的优点是成本低、能循环利用、稳定性好、绿色安全、能直接用于生物催化，原料来源广泛，方法简单实用。因此GUHP86在水解猪血蛋白上具有重要应用前景，亦可应用于其他蛋白质的水解。
附图说明
图1为菌株GUHP86在酪蛋白选择培养基上分离纯化的平板观察照片；图2为菌株GUHP86在细菌完全培养基平板上的菌落形态观察照；图3为菌株GUHP86在光学显微镜下1000倍的革兰氏染色细胞形态观察照；图4为根据GUHP86 16S rRNA序列同源性构建的系统发育树。
由图4可知，菌株GUHP86与Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42(T) (CP000560)同属于一个最小分支中，表明它们之间的亲缘性最近。
具体实施方式
实施例1：水解猪血的蛋白酶产生菌的筛选
从中国贵阳花溪传统腊肉、豆豉、酸肉、发酵肉、豆制品、酒曲、酒醅采样80g，用聚乙烯袋封口；从贵州省黔东南州屠宰场污血污染的表层土壤、淤泥采样80g，用聚乙烯袋封口。
称取5.0g样品，加入到50mL无菌生理盐水中，再放入4颗小玻璃珠，30℃、180r/min振荡培养30min，取5mL加入富集培养基中，30℃、180r/min摇床富集培养24h。所用富集培养基成分（g/100mL）为：牛肉膏0.5～1.0，蛋白胨0.5～1.0，(NH4)2SO4 0.1～0.2，K2HPO4 0.5～1.0，MgSO4·7H2O 0.01～0.02，CaCl2 0.01～0.02，NaCl 0.5～1.0， pH 6.5～7.5。
初筛：取上述0.2mL稀释适当梯度的富集菌液涂布于酪蛋白选择培养基平板，静置5min，倒置平板，于30℃培养。挑取形成透明圈较大的单一菌落，划线纯化后在试管斜面上划Z形线，30℃下培养至出现丰满的菌落后，4℃冰箱保藏。所用酪蛋白选择培养基成分（g/100mL）为：牛肉膏0.5～1.0，酪蛋白0.5～1.0，(NH4)2SO4 0.1～0.2，K2HPO4 0.5～1.0，MgSO4·7H2O 0.01～0.02，CaCl2 0.01～0.02，NaCl 0.5～1.0，琼脂粉2.0，pH 6.5～7.5。
斜面保藏培养基：细菌用细菌完全培养基。
复筛：（1）平板孔试验：取2环初筛到的菌株接种于种子培养基，30℃，180r/min培养24h，以6％～8％（0.1～5×106 cfu/mL）接种量分别接入发酵培养基中，同样条件下培养24h后，4℃、10000r/min离心10min，上清液注酪蛋白平板孔，30℃培养12h，选取透明水解圈直径最大的菌株进行下面复筛。所用种子培养基成分（g/100mL）为：猪血粉1.2～1.8，NaCl0.5～1.0，MgSO4·7H2O 0.01～0.02，CaCl2 0.01～0.02，K2HPO4 0.5～1.0，pH 6.5～7.5；所用发酵培养基：猪血50mL。
（2）选取平板孔试验水解透明圈直径最大的菌株同平板孔试验方法制得上清酶液，上清酶液按照福林酚显色法测蛋白酶活力，酶活高的菌株在进行下一步复筛。
（3）酶活高的菌株再按照平板孔试验方法制得上清酶液，上清酶液于100℃水域灭酶5min，测其氨态氮量，氨态氮含量最高的即为最终目标菌株GUHP86。
实施例2：水解猪血的胞外蛋白酶产生菌的使用
取斜面保藏菌株解淀粉芽孢杆菌GUHP86 2环分别接于种子培养基中，30℃，180r/min摇床培养24h后，以6％～8％（0.1～5×106 cfu/mL）接种量接入发酵培养基中，同样条件下摇床培养24h，之后直接用于猪血中蛋白质的水解，水解度达18.93％。

Claims (2)

1.一株水解猪血的蛋白酶产生菌解淀粉芽孢杆菌，其特征在于该蛋白酶产生菌是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，该菌株纯培养物已经于2016年1月4日保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，该中心地址是:中国武汉·武汉大学，邮政编码:430072；保藏编号为CCTCC NO.M 2016003；该菌株简称解淀粉芽孢杆菌GUHP86；所述解淀粉芽孢杆菌GUHP86系从中国贵州的屠宰场污血中分离得到的新菌株，其发酵水解猪血蛋白的水解度达18％。
2.如权利要求1所述的水解猪血的蛋白酶产生菌解淀粉芽孢杆菌，其特征在于所述解淀粉芽孢杆菌GUHP86形态特征和生理生化特征接近芽孢杆菌属，解淀粉芽孢杆菌GUHP86的16S rRNA序列与Bacillus amyloliquefaciens FZB42(T)序列同源性在99％以上，看家基因recA序列与Bacillus amyloliquefaciens CP007244.1序列同源性达99％；根据伯杰氏系统细菌学手册三中芽孢杆菌属的分类概况，解淀粉芽孢杆菌GUHP86属芽孢杆菌纲(Bacilli)，芽孢杆菌目(Bacillales)，芽孢杆菌科(Bacillaceae)，芽孢杆菌属(Bacillus)，解淀粉芽抱杆菌种(Bacillus amyloliquefaciens)。
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