CN105722982A - 白介素-4受体结合融合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及白介素-4受体结合融合蛋白。更具体地说，本发明部分地提供了包含结合至促凋亡Bcl-2家族成员蛋白部分的白介素-4受体结合融合蛋白部分的融合蛋白。

Description

白介素-4受体结合融合蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及白介素-4受体结合融合蛋白。更具体地说，本发明部分地提供了包含结合至促凋亡Bcl-2家族成员蛋白部分的白介素-4或者白介素-13蛋白部分的融合蛋白。
背景技术
白介素-4(IL-4)是由激活T细胞产生的多效性细胞因子，并且是所述IL-4受体(IL-4R)的配体，其还可以结合至白介素-13(IL-13)。和很多细胞因子一样，白介素-4首先接合至高度亲和性受体链(称为“α”)，然后IL-4-α链复合物与第二低亲和力受体链(称为“γc”)结合。因此，IL-4的初次结合链是IL-4受体α(IL-4Rα)，其以高亲和力(KD＝～10-10M)结合。所述IL-4/IL-4Rα复合物然后能够以相对较低的亲和力结合IL-4受体的第二组分，γc(I型受体)。另外，IL-4/IL-4Rα复合物还能够结合白介素-13(IL-13)受体α1(IL-13Rα1)(II型受体)。
不同的细胞类型表达不同量的I型和II型受体链。例如，IL-4Rα存在于大多数细胞上，而γc一般在造血细胞上表达，并且IL-13Rα1一般在非造血细胞上表达。因此，在T细胞、自然杀伤(NK)细胞、嗜碱性细胞、肥大细胞以及大多数的小鼠B细胞(大多数人类B细胞表达γc和IL-13Rα1两者)上见到的是γc而不是IL-13Rα1。
一些骨髓源性细胞，包括巨噬细胞和树突状细胞，表达γc和IL-13Rα1两者，并因此响应IL-4和IL-13两者。在大多数非骨髓源性细胞包括平滑肌细胞和表皮细胞上见到IL-13Rα1，但是几乎没有或者没有见到γc。
已经提出过对I型和II型受体具有不同选择性的变体型IL-4分子(Junttila等NatureChemicalBiology8：990-998，2012.)。
环状排列(circularlypermuted)的分子是线性分子(例如配体)的末端已经直接或者经由接头连接在一起从而产生环状分子的那些分子，此后所述环状分子在另一个位置打开从而产生新的带有不同于原先分子的末端的末端的线性分子。IL-4的环状排列变体已经在例如于2000年1月4日授权给Pastan等的美国专利No.6,011,002中有描述。
程序化细胞死亡或者“凋亡”是一种在动物细胞发育中常见的现象，并且受到主动调节和被动调节这两者调节。除了其参与神经元和淋巴样系统发育和整个细胞群稳态之外，凋亡还在由凋亡途径的异常调节引起的各种疾病和损伤中发挥重要的作用。例如，由凋亡引起的神经元细胞死亡的异常激活应参与了很多神经退行性疾病和症状，例如阿尔茨海默氏症(Barinaga，Science281：1303-1304)、亨廷顿氏舞蹈症、脊髓性肌肉萎缩症、中风过程中导致的神经元破坏(在Rubin，BritishMed.Bulle.，53(3)：617-631，1997中有综述；以及Barinaga，Science281：1302-1303)、暂时性缺血性神经元损伤(例如，脊髓损伤)等。相反，凋亡的异常抑制能够导致细胞的过度增殖，从而导致癌症和其他类型的过度增殖性紊乱。
凋亡受到很多蛋白的调节，这些蛋白包含Bcl-2家族的成员。Bcl-2是被鉴定为调节凋亡的第一批蛋白之一(Cleary等，Cell47：19-28，1986；Tsujimoto和Croce，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：5214-5218，1986)。由于它的发现，已经有若干个Bcl-2相关蛋白(“Bcl-2家族蛋白”或者“Bcl-2家族成员”)被鉴定为凋亡的调节因子(White，GenesDev.10：1-15，1996；Yang等，细胞80：285-291，1995；Lomonosova，E.和G.Chinnadurai，Oncogene27，S2-S19，2009)。
已经探索了用于治疗神经退行性疾病、癌症等的若干种治疗性试剂，但是这些治疗性试剂表现出限制了它们在临床中的应用的多种局限性。例如，很多化学治疗性试剂通过诱导正在增殖的赘生性细胞中的凋亡来发挥作用，但是它们的治疗价值受到它们对正常细胞具有毒性的程度的限制。使用标准凋亡抑制性分子例如肽类半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspases)抑制剂(例如DEVD类)进行的治疗已经证明由于这些抑制剂具有低的膜渗透性而无法满意地用于临床工作。
已经提出靶向免疫毒素(在有毒分子例如细菌毒素和通常衍生自抗体分子的靶向域之间的遗传融合或者生物化学融合)以尝试选择性地消除癌症分子。例如，已经生成白喉毒素(DT)变体并且测试了它们选择性地杀灭癌症细胞的能力(Thorpe等，Nature271：752-755，1978；Laske等，NatureMedicine3：1362-1368，1997)。类似地，已经研究了假单胞菌(Pseudomonas)外毒素(PE)融合蛋白作为潜在的癌症疗法(Kreitman和Pastan，Blood90：252-259，1997；Shimamura等CancerRes.67：9903-9912；2007)。
发明内容
本发明涉及白介素-4受体结合融合蛋白。更具体地说，本发明部分地提供了包含结合至促凋亡Bcl-2家族成员蛋白部分的白介素-4受体结合融合蛋白部分的融合蛋白及其应用。
在一个方面，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含白介素-4(IL-4)受体结合蛋白和促凋亡Bcl-2家族多肽。在一些实施方式中，所述IL-4受体结合蛋白可以是环状排列的(cp)。在一些实施方式中，所述Bcl-2家族多肽可以是包含BH3域的促凋亡Bcl-2家族多肽(例如Bad、Bik/Nbk、Bid、Bim/Bod、Hrk、Bak或者Bax)。所述BH3域可以进一步包含降低磷酸化的突变。进一步包含降低磷酸化的突变的包含BH3域的所述促凋亡Bcl-2家族多肽是Bad多肽。所述融合蛋白可能能够抑制细胞存活、抑制细胞增殖、或者促进表达IL-4R的靶细胞的细胞死亡或者凋亡。
在一些实施方式中，所述IL-4受体结合蛋白可以是对与I型或II型IL-4受体(IL-4R)的结合具有选择性的突变型IL-4或者IL-13。对与II型IL-4R的结合具有选择性的所述突变型IL-4可以包括KFR变体或者KF变体。对与I型IL-4R的结合具有选择性的所述突变型IL-4可以包括RGA变体。突变型IL-13可以是A11变体或者DN变体。
在一些实施方式中，所述融合蛋白可以进一步包含接头。所述接头可以具有序列GS或者是泛素或者泛素变体分子。所述融合蛋白可以包含在SEQIDNO：24-27中给出的序列。
在一些方面，提供了编码本文所述的融合蛋白的核酸分子、或者包含所述核酸分子的载体、或者包含所述载体的宿主细胞。在一些方面，提供了编码如在SEQIDNO：24-27中给出的融合蛋白的核酸分子或者包含SEQIDNO：35-38的核酸分子。
在一些方面，提供了包含本文所述的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、或者包含所述核酸分子的载体、或者包含所述载体的宿主细胞的药物组合物。
在一些方面，提供了一种诱导细胞死亡的方法，所述方法通过如下方式来进行：向需要的受试者施用包含促凋亡Bcl-2家族多肽的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、或者包含所述载体的宿主细胞。
在一些方面，提供了一种诱导细胞死亡的方法，所述方法通过如下方式来进行：使表达IL-4R的靶细胞与包含促凋亡Bcl-2家族多肽的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、或者包含所述核酸分子的载体接触。
在一些方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法通过如下方式来进行：向需要的受试者施用包含促凋亡Bcl-2家族多肽的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、或者包含所述载体的宿主细胞。
在一些方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法通过如下方式来进行：使表达IL-4R的赘生性细胞与包含促凋亡Bcl-2家族多肽的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、或者包含所述核酸分子的载体接触。
在一些方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法通过如下方式来进行：使在需要的受试者中的肿瘤微环境中表达IL-4R的非恶性细胞与包含促凋亡Bcl-2家族多肽的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、或者包含所述核酸分子的载体接触。在一些实施方式中，所述非恶性细胞在所述受试者开始治疗之前进行接触。
在一些方面，提供了一种治疗过度增生性疾病或者分化性疾病的方法，所述方法通过如下方式来进行：向需要的受试者施用：包含促凋亡Bcl-2家族多肽的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、或者包含所述核酸分子的载体。所述过度增生性疾病或者分化性疾病可以是纤维化症或增生症、炎性疾病或自身免疫疾病。所述纤维化症或增生症可以是肺纤维化症或增生症(例如良性前列腺增生症)、心肌纤维化症、或者肝纤维化症；所述炎性疾病可以是前列腺炎、春季型角膜结膜炎、动脉粥样硬化症或者特发性肺炎；或者所述自身免疫疾病可以是格雷夫氏症。
在一些方面，提供了包含促凋亡Bcl-2家族多肽的融合蛋白、编码所述融合蛋白的核酸分子、或者包含所述核酸分子的载体用于诱导需要的患者中的细胞死亡、或者治疗诱导需要的患者中的过度增生性或者分化性疾病的应用。
在另外可选的方面的各个实施方式中，所述受试者可以是人类。
本发明内容部分不一定描述本发明的所有特征。
附图说明
根据下文的其中参考附图的说明可以使本发明的这些和其他特征更加清楚，其中：
图1是pET24a表达载体中的cpIL-4BAD(cpIL-4g：s-BADaa)的展示图；
图2是显示cpIL-4BAD(cpIL-4BADaa)对IL-4Rα阳性肿瘤细胞(U251)生活力的影响的曲线图；
图3是显示cpIL-4BAD(cpIL-4BADaa)(矩形)在过量IL-4(三角形)存在的情况下对IL-4Rα阳性肿瘤细胞(U251)生活力的影响的曲线图；
图4是显示cpIL-4BAD(cpIL-4BADaa)对IL-4Rα阳性肿瘤细胞(Daudi细胞)生活力的影响的曲线图；
图5是显示cpIL-4BAD(cpIL-4BADaa)(三角形)在过量IL-4(矩形)存在的情况下对IL-4Rα阳性肿瘤细胞Daudi生活力的影响的曲线图；
图6是显示cpIL-4BAD(cpIL-4BADaa)对IL-4Rα阳性肿瘤细胞(U251)菌落数量的影响的曲线图；
图7是显示使用U251肿瘤细胞形成皮下神经胶质瘤肿瘤之后在无胸腺小鼠中肿瘤内(矩形)和腹膜内(三角形)注射cpIL-4BAD的效果的曲线图(圆圈＝对照)；
图8是显示cpIL-4BAD治疗小鼠(肿瘤内注射组＝空白棱形，腹膜内注射组＝三角形，对照＝实心棱形)；的存活的曲线图；
图9显示了pGW07大肠杆菌(E.coli)表达载体的展示图；
图10A-F显示了IL-4BAD(A-B)、cpIL-4BAD(C-D)和cpS4-BAD(E-F)融合构建体的核酸(SEQIDNO：29、30和32)和氨基酸序列(SEQIDNO：18、19和21)；
图11A-B显示了pKFR4-BAD-H6融合构建体的核酸(A；SEQIDNO：37)和氨基酸序列(B；SEQIDNO：26)。
具体实施方式
本发明部分地提供了包含结合至促凋亡Bcl-2家族蛋白的IL-4R结合蛋白的融合蛋白及其应用。
IL-4R结合蛋白
IL-4R结合蛋白包括IL-4和IL-13。
IL-4蛋白或者IL-4“蛋白部分”包括天然的IL-4蛋白以及变体型IL-4蛋白。本文使用的“天然的”或“野生型”IL-4序列是指人类IL-4序列，不管是从天然来源纯化还是使用重组技术制得，并且包含如下氨基酸序列(在N末端带有额外的甲硫氨酸)：
MHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSS(SEQIDNO：1).
另外可选的人类IL-4序列包含如下氨基酸序列(在N末端带有额外的甲硫氨酸)：
MHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAASKDTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSS(SEQIDNO：2).
在一些实施方式中，可以在本公开内容的所述融合蛋白中使用的IL-4蛋白是变体型IL-4蛋白，该变体型IL-4蛋白对γc(I型受体)具有比对IL-13Rα1(II型受体)的选择性高的选择性，或者反之亦然，例如在Junttila等(NatureChemicalBiology8：990-998，2012)中所述。在一些实施方式中，对γc(I型受体)具有高的选择性的变体型IL-4蛋白是相对于天然人类IL-4(例如SEQIDNO：1)的序列或者另外可选的IL-4序列(例如，SEQIDNO：2)而言包含如下突变的IL-4蛋白(编号排除了在N末端的甲硫氨酸)：R121Q/Y124W/S125F(“RGA”或者“super-4”或者“S4”变体)，如在例如Junttila等(NatureChemicalBiology8：990-998，2012)中所述。
在一些实施方式中，对IL-13Rα1(II型受体)具有高的选择性的变体型IL-4蛋白是相对于天然人类IL-4(例如，SEQIDNO：1)或者另外可选的IL-4序列(例如，SEQIDNO：2)而言包含如下突变的IL-4蛋白(编号排除了在N末端的甲硫氨酸)：R121K/Y124F/S125R(“KFR”或者“KFR4”变体)或者R121K/Y124F(“KF”变体)。
在一些实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的IL-4蛋白是环状排列的(circularlypermuted，cp)，如在例如在2000年1月4日授予Pastan等的美国专利No.6,011,002中所述。在一些实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的cpIL-4蛋白包括其中使用GGNGG接头和起始的甲硫氨酸残基将另外可选的IL-4序列(例如，SEQIDNO：2)或者天然人类IL-4(例如，SEQIDNO：1)的残基38-129结合至残基1-37的如下IL-4蛋白(编号排除了在N末端的甲硫氨酸)：
MDTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMREKYSKCSSGGNGGHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAAS(SEQIDNO：3).
在一些另外可选的实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的cpIL-4蛋白包括其中在“RGA”或者“super-4”或者“S4”变体的情况中使用GGNGG接头和起始的甲硫氨酸残基将另外可选的IL-4序列(例如，SEQIDNO：2)或者天然人类IL-4(例如，SEQIDNO：1)的残基38-129结合至残基1-37的如下IL-4蛋白(编号排除了在N末端的甲硫氨酸)：
MDTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLRVIMQSKWFKCGAGGNGGHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAAS(SEQIDNO：4).
在一些另外可选的实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的cpIL-4蛋白包括其中在“KFR”变体的情况中使用GGNGG接头和起始的甲硫氨酸残基将另外可选的IL-4序列(例如，SEQIDNO：2)或者天然人类IL-4(例如，SEQIDNO：1)的残基38-129结合至残基1-37的如下IL-4蛋白(编号排除了在N末端的甲硫氨酸)：
MDTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMKEKFRKCSSGGNGGHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAAS(SEQIDNO：5).
在一些另外可选的实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的cpIL-4蛋白包括其中在“KF”变体的情况下使用GGNGG接头和起始的甲硫氨酸残基将另外可选的IL-4序列(例如，SEQIDNO：2)或者天然人类IL-4(例如，SEQIDNO：1)的残基38-129结合至残基1-37的如下IL-4蛋白(编号排除了在N末端的甲硫氨酸)：
MDTTEKETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLERLKTIMKEKFKCSSGGNGGHKCDITLQEIIKTLNSLTEQKTLCTELTVTDIFAAS(SEQIDNO：6).
在一些另外可选的实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的cpIL-4蛋白包括其中使用GGNGG接头和起始的甲硫氨酸残基将另外可选的IL-4序列(例如，SEQIDNO：2)或者天然人类IL-4(例如，SEQIDNO：1)的残基105-129结合至残基1-104的IL-4蛋白(编号排除了在N末端的甲硫氨酸)，如在例如在2000年1月4日授予Pastan等的美国专利No.6,011,002中所述。
能够在本公开内容的融合蛋白中使用的例示性IL-4蛋白包括本文所述的那些IL-4蛋白，以及与天然的IL-4具有至少80％的序列同一性、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或者甚至是至少99％的序列同一性的序列(“变体型IL-4蛋白”)，只要所述变体型IL-4蛋白保持结合IL-4受体的能力，或者保持对γc(I型受体)比对IL-13Rα1(II型受体)高的选择性，或者反之亦然，例如在Junttila等(NatureChemicalBiology8：990-998，2012)中所述。
应当理解的是，根据本公开内容的IL-4蛋白包括可以比天然的129个氨基酸的IL-4蛋白短的片段，只要IL-4蛋白片段保持结合IL-4受体的能力，或者保持对γc(I型受体)比对IL-13Rα1(II型受体)高的选择性，或者反之亦然，例如在Junttila等(NatureChemicalBiology8：990-998，2012)中所述，或者保持所期望的生物学活性，不管是作为天然序列的片段还是为其cp形式或者片段。
还应当理解的是，本公开内容涵盖编码本文所述的或者本领域已知的IL-4蛋白的核酸分子，包括但不限于与本文所述的DNA序列对应的RNA序列。
例示性的IL-4核酸分子包括：
ATGCACAAATGCGACATTACCCTGCAAGAGATCATTAAGACCCTGAACAGCCTGACCGAGCAAAAGACCCTGTGTACCGAACTGACCGTCACGGACATCTTCGCTGCGTCCAAGGACACTACGGAAAAGGAAACGTTCTGTCGTGCGGCGACGGTGCTGCGCCAGTTCTACAGCCACCATGAGAAAGATACCCGTTGCCTCGGTGCGACCGCGCAACAGTTCCACCGTCACAAACAGCTGATTCGCTTCCTGAAGCGTCTGGATCGCAACCTGTGGGGTTTGGCGGGTCTGAACTCCTGTCCAGTCAAAGAAGCCAATCAGTCTACGCTGGAAAACTTTTTGGAGCGTCTGAAAACTATCATGCGTGAGAAGTACAGCAAATGCAGCAGC(IL4；SEQIDNO：30)；
ATGGATACCACCGAGAAAGAAACGTTCTGCCGTGCTGCCACTGTCCTGCGCCAGTTTTACAGCCATCACGAAAAGGACACCCGTTGCCTGGGTGCGACGGCGCAGCAATTCCACCGCCACAAACAGCTGATTCGTTTCCTGAAGCGTCTGGACCGTAACCTGTGGGGTCTGGCGGGTCTGAACAGCTGTCCAGTGAAAGAAGCGAATCAGAGCACCTTGGAGAATTTCCTCGAACGCCTGAAAACCATCATGCGTGAGAAATACAGCAAGTGTTCTAGCGGCGGTAACGGTGGCCACAAATGCGATATCACCCTGCAAGAGATCATTAAGACGCTGAACTCCTTGACGGAACAAAAGACCCTGTGTACTGAGCTGACGGTCACCGACATTTTCGCGGCGTCC(cpIL4；SEQIDNO：31)；
ATGGATACTACCGAGAAAGAAACGTTTTGCCGTGCTGCGACCGTCCTGCGTCAGTTCTACAGCCACCACGAAAAGGACACCCGCTGTCTGGGTGCGACTGCCCAACAATTCCATCGTCACAAACAGCTGATTCGTTTCCTGAAGCGTCTGGACCGCAACCTGTGGGGTCTGGCGGGCTTGAACTCCTGCCCAGTCAAAGAAGCGAACCAAAGCACCCTGGAAAACTTCTTGGAGCGTCTGAAAACGATCATGAAAGAGAAGTTCCGCAAGTGTAGCAGCGGTGGTAATGGTGGCCACAAGTGCGACATTACGCTGCAGGAAATCATTAAGACCCTGAACTCTCTGACCGAGCAGAAAACCCTCTGTACCGAGCTGACGGTGACGGATATCTTTGCGGCGAGC(所述cpKFR；SEQIDNO：32；和
ATGGATACCACCGAAAAAGAAACTTTTTGTCGTGCCGCGACTGTCCTGCGCCAGTTCTACAGCCACCACGAAAAGGACACCCGTTGCCTGGGTGCGACCGCTCAACAATTCCATCGCCACAAACAGCTGATTCGTTTCCTGAAACGTCTGGATCGCAACCTGTGGGGTCTGGCGGGTTTGAACAGCTGTCCAGTCAAAGAAGCGAACCAGAGCACCCTGGAAAACTTTCTGGAGCGTCTGCGTGTTATCATGCAGAGCAAGTGGTTCAAGTGCGGTGCGGGTGGCAATGGTGGCCACAAGTGTGACATTACCTTGCAAGAGATTATCAAAACGCTGAACTCTCTGACCGAGCAAAAGACGCTGTGCACCGAGCTGACGGTGACGGACATCTTCGCGGCGTCC(cpS4；SEQIDNO：33).
IL-13蛋白或者IL-13“蛋白部分”包括天然的IL-13蛋白以及变体型IL-13蛋白。本文使用的“天然的”或者“野生型”IL-13序列是指人类IL-13序列，不管是从天然来源纯化还是使用重组技术制得，并且包含如下氨基酸序列(在N末端带有额外的甲硫氨酸)：
MPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFN(SEQIDNO：7).
在一些实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的IL-13蛋白是对IL-13Rα1(II型受体)比对野生型IL-13蛋白具有更高的选择性的变体型IL-13蛋白。例如IL-13变体序列可以包含如下氨基酸序列(在N末端带有额外的甲硫氨酸)：
MPGPVPPSTAVRELIEELINITQNQKAPLCNGSMVWSINRTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRSSKIEVAQFVKDLLFHLRTLFREGQFN(“A11”变体；SEQIDNO：8)。
在一些实施方式中，对IL-13Rα1(II型受体)比对野生型IL-13蛋白具有更高的选择性的变体型IL-13蛋白是相对于天然人类IL-13的序列(SEQIDNO：7)包含如下突变的IL-13蛋白(编号排除了在N末端的甲硫氨酸)：L10V/E12A/V18I/R65D/D87S/T88S/L101F/K104R/K105T(“DN”变体)。例如，IL-13变体序列可以包含如下氨基酸序列(在N末端带有额外的甲硫氨酸)：
MPGPVPPSTAVRALIEELINITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRSSKIEVAQFVKDLLFHLRTLFREGQFN(SEQIDNO：9).
在一些实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的IL-13蛋白是环状排列的(cp)。在一些实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的变体型cpIL-13蛋白包括其中使用接头和起始的甲硫氨酸残基将天然人类IL-13(SEQIDNO：7)的残基44-114结合至残基1-43的如下IL-13蛋白：
MYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFNGGSGPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAG(SEQIDNO：10).
在一些实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的变体型cpIL-13蛋白如下：
MYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGQFNGGSGMPGPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAG(SEQIDNO：11).
在一些代替性的实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的变体型cpIL-13蛋白包括在“A11”变体的情况中使用接头和起始的甲硫氨酸残基将天然人类IL-13(SEQIDNO：7)的残基44-114结合至残基1-43的如下IL-13蛋白：
MYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRSSKIEVAQFVKDLLFHLRTLFREGQFNGGSGPGPVPPSTAVRELIEELINITQNQKAPLCNGSMVWSINRTAG(SEQIDNO：12).
在一些实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的变体型cpIL-13蛋白如下：
MYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRSSKIEVAQFVKDLLFHLRTLFREGQFNGGSGMPGPVPPSTAVRELIEELINITQNQKAPLCNGSMVWSINRTAG(SEQIDNO：13).
在一些代替性的实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的变体型cpIL-13蛋白包括在“DN”变体的情况中使用接头和起始的甲硫氨酸残基将天然人类IL-13(SEQIDNO：7)的残基44-114结合至残基1-43的如下IL-13蛋白：
MYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRSSKIEVAQFVKDLLFHLRTLFREGQFNGGSGPGPVPPSTAVRALIEELINITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAG(SEQIDNO：14).
在一些实施方式中，能够在本公开内容的融合蛋白中使用的变体型cpIL-13蛋白如下：
MYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRSSKIEVAQFVKDLLFHLRTLFREGQFNGGSGMPGPVPPSTAVRALIEELINITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAG(SEQIDNO：15).
能够在本公开内容的融合蛋白中使用的例示性IL-13蛋白包括本文所述的那些IL-13蛋白，以及与天然的IL-13具有至少80％的序列同一性、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或者甚至是至少99％的序列同一性的序列(“变体型IL-13蛋白”)，只要所述变体型IL-13蛋白保持结合IL-13受体的能力，或者保持对IL-13Rα1(II型受体)比对野生型IL-13蛋白具有更高的选择性，或者保持所期望的生物学活性。
应当理解的是，根据本公开内容的IL-13蛋白包括可以比天然的114个氨基酸的IL-13蛋白短的片段，只要IL-13蛋白片段保持结合IL-13受体的能力，或者保持对IL-13Rα1(II型受体)比对野生型IL-13蛋白具有更高的选择性，或者保持所期望的生物学活性。
还应当理解的是，本公开内容涵盖编码本文所述的或者本领域已知的IL-13蛋白的核酸分子(包括但不限于RNA序列或者DNA序列)。
BCL-2家族蛋白
Bcl-2相关蛋白或者多肽((“Bcl-2家族蛋白”或者“Bcl-2家族成员”)参与凋亡的调节。Bcl-2家族蛋白分为两个明显不同的类别：抑制细胞死亡的那些Bcl-2家族蛋白(“抗凋亡”Bcl-2家族蛋白)和促进细胞死亡的那些Bcl-2家族蛋白(“促凋亡”Bcl-2家族蛋白)。Bcl-2家族蛋白共同具有1至4个保守的Bcl-2同源(BH)域，它们称为BH1、BH2、BH3和BH4。
促凋亡Bcl-2家族蛋白包括具有BH3域的那些促凋亡Bcl-2家族蛋白，例如Bad(例如，登录号：P116784、CAG46757或者Q92934)、Bik/Nbk(例如，登录号：CAG30276或者Q13323)、Bid(例如，登录号：CAG28531或者P55957)、Bim/Bod(例如，登录号：NP619527)、Hrk(登录号：O00198)、Bak或者Bax。在一些实施方式中，能够在根据本公开内容的融合蛋白中使用的促凋亡Bcl-2家族蛋白带有突变的(例如，在丝氨酸残基处，例如，丝氨酸变为丙氨酸的突变)以防止磷酸化。
Bad、Bcl-2相关联的细胞死亡激动剂是程序化细胞死亡(凋亡)的调节因子。Bad通过与Bcl-xL和Bcl-2形成异源二聚体并且逆转它们的死亡抑制活性来对细胞凋亡进行正向调节。Bad的促凋亡活性通过其磷酸化进行调节。能够在本公开内容的融合蛋白中使用的例示性的Bad蛋白包括GenBank登录号为CAG46757；AAH01901.1；和CAG46733.1，以及在美国专利No.6,737,511中提供的那些序列(在此通过参引方式引入这些序列)和本文所述的那些序列，以及与这些序列具有至少80％的序列同一性、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或者甚至至少99％的序列同一性的序列，只要所述变体保持或者具有增强的天然Bad蛋白的生物学活性。在一些实施方式中，能够在根据本公开内容的所述融合蛋白中使用的Bad蛋白在位置112和/或136处包含丝氨酸突变以降低磷酸化。在一些实施方式中，能够在根据本公开内容的所述融合蛋白中使用的Bad蛋白在位置112和/或136处包含丝氨酸变为丙氨酸的突变以降低磷酸化。在一些实施方式中，能够在根据本公开内容的所述融合蛋白中使用的Bad蛋白包括如下序列或者其片段：
FQIPEFEPSEQEDSSSAERGLGPSPAGDGPSGSGKHHRQAPGLLWDASHQQEQPTSSSHHGGAGAVEIRSRHSSYPAGTEDDEGMGEEPSPFRGRSRAAPPNLWAAQRYGRELRRMSDEFVDSFKKGLPRPKSAGTATQMRQSSSWTRVFQSVWVDRNLGRGSSAPSQ(SEQIDNO：16)；
FQIPEFEPSEQEDSSSAERGLGPSPAGDGPSGSGKHHRQAPGLLWDASHQQEQPTSSSHHGGAGAVEIRSRHSSYPAGTEDDEGMGEEPSPFRGRSRSAPPNLWAAQRYGRELRRMSDEFVDSFKKGLPRPKSAGTATQMRQSSSWTRVFQSVWVDRNLGRGSSAPSQ(登录号：NP116784；SEQIDNO：18)；或
FQIPEFEPSEQEDSSSAERGLGPSPAGDGPSGSGKHHRQAPGLLWDASHQQEQPTSSSHHGGAGAVEIRSRHSSYPAGTEDDEGMGEEPSPFRGRSRSAPPNLWAAQRYGRELRRMSDEFVDSFKKGLPRPKSAGTATQMRQSSSVVTRVFQSWWDRNLGRGSSAPSQ(登录号：CAG46757；SEQIDNO：19)。
在一些实施方式中，能够在根据本公开内容的所述融合蛋白中使用的Bad蛋白包括如下变体序列或者其片段：
FQIPEFEPSEQEDSSSAERGLGPSPAGDGPSGSGKHHRQAPGLLWDASHQQEQPTSSSHHGGAGAVEIRSRHSAYPAGTEDDEGMGEEPSPFRGRSRAAPPNLWAAQRYGRELRRMSDEFVDSFKKGLPRPKSAGTATQMRQSSSWTRVFQSVWVDRNLGRGSSAPSQ(SEQIDNO：17).
能够在根据本公开内容的所述融合蛋白中使用的例示性的Bik/Nbk蛋白包括如下序列或者其片段：
SEVRPLSRDILMETLLYEQLLEPPTMEVLGMTDSEEDLDPMEDFDSLECMEGSDALALRLACIGDEMDVSLRAPRLAQLSEVAMHSLGLAFIYDQTEDIRDVLRSFMDGFTTLKENIMRFWRSPNPGSVVVSCEQVLLALLLLLALLLPLLSGGLHLLLK(登录号：CAG30276；SEQIDNO：20)。
能够在根据本公开内容的所述融合蛋白中使用的例示性的Bid蛋白包括如下序列或者其片段：
DCEVNNGSSLRDECITNLLVFGFLQSCSDNSFRRELDALGHELPVLAPQWEGYDELQTDGNRSSHSRLGRIEADSESQEDIIRNIARHLAQVGDSMDRSIPPGLVNGLALQLRNTSRSEEDRNRDLATALEQLLQAYPRDMEKEKTMLVLALLLAKKVASHTPSLLRDVFHTTVNFINQNLRTYVRSLARNGMD(登录号：CAG28531；SEQIDNO：21)。
能够在根据本公开内容的所述融合蛋白中使用的例示性的Bim/Bod蛋白包括如下序列：
AKQPSDVSSECDREGRQLQPAERPPQLRPGAPTSLQTEPQGNPEGNHGGEGDSCPHGSPQGPLAPPASPGPFATRSPLFIFMRRSSLLSRSSSGYFSFDTDRSPAPMSCDKSTQTPSPPCQAFNHYLSAMASMRQAEPADMRPEIWIAQELRRIGDEFNAYYARRVFLNNYQAAEDHPRMVILRLLRYIVRLVWRMH(登录号：MP619527；SEQIDNO：22)。
能够在根据本公开内容的所述融合蛋白中使用的例示性的Hrk蛋白包括如下序列：
CPCPLHRGRGPPAVCACSAGRLGLRSSAAQLTAARLKALGDELHQRTMWRRRARSRRAPAPGALPTYWPWLCAAAQVAALAAWLLGRRN(登录号：O00198；SEQIDNO：23)。
在一些实施方式中，促凋亡Bcl-2家族蛋白包括至少Bcl-2家族成员的片段，其中所述促凋亡Bcl-2家族蛋白或者片段能够抑制细胞存活、抑制细胞增殖、或者促进细胞死亡或者凋亡。“抑制细胞存活”是指降低(例如，至少10％、20％、30％、或者多达50％、75％、85％或者90％或者更多)的具有细胞死亡风险的细胞将存活的可能性。“抑制细胞增殖”是指降低(例如，至少10％、20％、30％、或者高达50％、75％、85％或者90％或者更多)的细胞的生长或者增殖。“促进细胞死亡或者凋亡”是指提高(例如，至少10％、20％、30％、或者高达50％、75％、85％或者90％或者更多)的具有细胞死亡风险的细胞将经历凋亡、坏死或者其他任何形式的细胞死亡的可能性。用于测量细胞存活的抑制作用、细胞增殖的抑制作用、或者细胞死亡或者凋亡的促进作用的适当的分析法在本文中有描述或者在本领域中是已知的。
还应当理解的是，本公开内容涵盖编码编码本文所述的促凋亡Bcl-2家族成员的核酸分子(例如，RNA序列或者DNA序列)，包括但不限于与本文所述的DNA序列对应的RNA序列。
例示性的促凋亡Bcl-2家族成员的核酸分子包括：
GGTAGCTTTCAGATCCCGGAATTTGAGCCGAGCGAGCAAGAGGATTCAAGCAGCGCGGAGCGCGGTCTGGGTCCGAGCCCGGCAGGCGACGGTCCGAGCGGCAGCGGCAAGCATCACCGCCAGGCGCCAGGCCTGCTGTGGGATGCATCGCATCAACAGGAACAACCGACGAGCAGCAGCCATCATGGTGGCGCTGGTGCGGTTGAGATTAGATCGCGCCACTCCGCATATCCTGCCGGCACCGAAGATGACGAAGGCATGGGCGAGGAACCGAGCCCGTTCCGTGGCCGTAGCCGTGCTGCACCGCCGAATCTGTGGGCCGCACAGCGTTATGGTCGCGAGTTGCGTCGCATGTCCGACGAGTTTGTTGACTCCTTCAAGAAAGGTTTACCGCGTCCGAAATCTGCCGGTACCGCGACGCAGATGCGTCAGAGCAGCAGCTGGACCCGCGTGTTTCAATCTTGGTGGGATCGTAATCTGGGTCGTGGTAGCAGCGCACCGAGCCAA(变体BAD；SEQIDNO：34)。
IL-4受体结合蛋白-Bcl-2家族融合蛋白
根本本公开内容的“融合蛋白”包括利用可选的额外的序列或者部分(例如接头)结合至促凋亡Bcl-2家族成员的IL-4R结合蛋白，例如IL-4和IL-13，如本文所述，以及编码这些融合蛋白的核酸分子。还涵盖的是其中编码融合蛋白的核酸序列被可操作地连接至启动子的重组核酸分子、包含所述分子的载体、和包含这种分子的转基因细胞。
IL-4(包括cpIL-4和IL-4片段和变体)可以被连接至包含BH3域的促凋亡Bcl-2家族多肽，例如Bad、Bik/Nbk、Bid、Bim/Bod、Hrk、Bak、或者Bax或者它们的组合或者它们的片段或者变体，只要促凋亡活性得以保持。可以使用任何形式的IL-4或者其衍生物。例如，可以使用结合至IL-4受体的IL-4或者IL-4的片段。另外，多个促凋亡Bcl-2家族蛋白或者其片段或者变体可以被结合至IL-4或者其片段或者变体，或者可以将多个IL-4蛋白或者其片段或者变体结合至促凋亡Bcl-2家族蛋白或者其片段或者变体。
IL-13(包括IL-13片段或者变体)可以被连接至促凋亡Bcl-2家族多肽，例如包含BH3域如Bad、Bik/Nbk、Bid、Bim/Bod、或者Hrk、或者它们的组合的那些促凋亡Bcl-2家族多肽，只要它们的组合或者片段或者变体保持促凋亡活性。可以使用任何形式的IL-13或者其衍生物。例如，可以使用结合至IL-13受体的IL-13或者IL-13的片段。多个促凋亡Bcl-2家族蛋白或者其片段或者变体可以被结合至IL-13或者其片段或者变体，或者可以将多个IL-13蛋白或者其片段或者变体结合至促凋亡Bcl-2家族蛋白或者其片段或者变体。
cpIL-4可以被连接至促凋亡Bcl-2家族多肽，例如包含BH3域的那些促凋亡Bcl-2家族多肽，例如Bad、Bik/Nbk、Bid、Bim/Bod、Hrk、Bak、或者Bax或者它们的组合，或者它们的片段或者变体，只要促凋亡活性得以保持。可以使用任何形式的cpIL-4或者其衍生物。另外，可以将多个cpIL-4蛋白或者其片段或者变体结合至促凋亡Bcl-2家族蛋白或者其片段或者变体，或者可以将多个促凋亡Bcl-2家族蛋白或者其片段或者变体结合至cpIL-4蛋白或者其片段或者变体。
例示性的融合蛋白在表1中列出。
表1.IL-4/Bcl-2家族融合蛋白
IL-4R结合蛋白，例如IL-4或者IL-13与促凋亡Bcl-2家族成员的结合或者“融合”可以是直接的，使得IL-4R结合蛋白的一个部分直接连接至促凋亡Bcl-2家族成员的一部分。例如，IL-4R结合蛋白的氨基酸序列的一个末端可以直接结合至促凋亡Bcl-2家族成员的氨基酸序列的一个末端。例如，IL-4R结合蛋白的C末端可以连接至促凋亡Bcl-2家族成员的N末端，或者促凋亡Bcl-2家族成员的C末端可以连接至IL-4R结合蛋白的N末端。生成这些融合蛋白的方法是本领域中的常规方法，例如使用重组分子生物学方法。
接头
在一些实施方式中，可以直接通过接头将IL-4R结合蛋白部分连接至促凋亡Bcl-2家族成员部分。所述接头可以例如简单地用作将所述两个部分连接的常规方式、作为将所述两个部分在空间上间隔开的方式，从而为IL-4R结合蛋白或者促凋亡Bcl-2家族成员或者它们的组合提供额外的功能。
一般来说，将IL-4R结合蛋白部分和促凋亡Bcl-2家族成员部分连接的接头可以被设计成用于：(1)允许所述两个分子折叠并且独立于彼此发挥作用；(2)不具有形成可能干扰这两个部分的功能的有序二级结构的倾向性；(3)具有最小的可能与功能性蛋白域相互作用的疏水性或者带电荷特性；和/或(4)提供两个区域的空间分离。例如，在一些情况中，可能希望将IL-4R结合蛋白与促凋亡Bcl-2家族成员在空间上间隔开以防止IL-4R结合蛋白干扰促凋亡Bcl-2家族成员的活性和/或防止促凋亡Bcl-2家族成员干扰IL-4R结合蛋白的活性。还可以使用接头来为促凋亡Bcl-2家族成员和IL-4R结合蛋白之间的连接部分提供了不稳定性、酶切位点(例如蛋白酶的酶切位点)、稳定性序列、分子标签、可检测标签、或者它们的各种组合。在一些实施方式中，可以在IL-4R结合蛋白(例如在cp分子中)或者促凋亡Bcl-2家族成员的两个域之间提供接头。
所述接头可以具有双功能或者多功能，即，含有至少约第一反应官能团和第二反应官能团，所述第一反应官能团位于所述接头的第一末端处或者位于所述接头的第一末端的附近，能够结合至所述IL-4R结合蛋白或者被修饰成结合至所述IL-4R结合蛋白，所述第二反应官能团位于所述接头的相反末端处或者位于所述接头的相反末端的附近，能够结合至被修饰的所述促凋亡Bcl-2家族成员或者被修饰成结合至被修饰的所述促凋亡Bcl-2家族成员。两个或者两个以上的所述官能团可以相同(即，所述接头具有同源双功能)或者它们可以不同(即，所述接头具有异源双官能)。
所述接头的长度和组成可以有相当大的变化。所述接头的长度和组成一般基于所述接头的目标功能以及可选的其他因素例如合成的容易度、稳定性、耐受某些化学品的耐受性和/或温度参数以及生物相容性等考虑进行选择。例如，所述接头不应当对IL-4R结合蛋白和/或促凋亡Bcl-2家族成员的活性造成显著的干扰。
适合于在根据本公开内容的融合蛋白中使用的接头包括肽。可以使用重组DNA技术将所述接头结合至IL-4R结合蛋白部分和/或促凋亡Bcl-2家族成员部分。这些方法在本领域中是已知的，并且这种技术的细节可以在例如Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual.第二版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，1989或者Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，1994)或者其升级版中找到。
所述接头肽可以具有1至500个氨基酸残基(例如1至100、1至50、6至30、1至40、1至20、或者小于30个氨基酸或者5至10个氨基酸)的链长度。在一些实施方式中，接头的长度可以为2、3、4、5、6、7、或者8个氨基酸，或者接头的长度可以为约10、20、30、40或者50个氨基酸。
通常，位于柔性蛋白区域的表面氨基酸包括Gly、Asn和Ser，并且这些氨基酸可以用于接头序列。其他中性的氨基酸，例如Thr和Ala，也可以用于所述接头序列。额外的氨基酸可以被包括在所述接头中，从而在所述接头序列中提供独特的限制位点以便于构建融合体。在一些实施方式中，接头可以例如包括氨基酸序列Gly-Ser(GS)或者可以是氨基酸序列Gly-Ser(GS)或者可以包括泛素序列：
GGGSMQIFVRTLTGRTITLEVEPSDTIENVRARIQDREGIPPDQQRLlFAGRQLEDGRTLSDYNIQRESTLHLVLRLRGGGS(SEQIDNO:28)或者其变体。适合于用作接头的泛素分子描述在例如Bachran，C.等“Anthraxtoxin-mediateddeliveryofthePseudomonasexotoxinAenzymaticdomaintothecytosoloftumorcellsviacleavableubiquitinfusions”,MBio.2013Apr30；4(3)：e00201-13或者PCT公报WO/2012/139112中。
在一个实施例中，可以使用这样的肽接头，该肽接头容易受到具有蛋白水解活性的补体系统的酶、尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂、胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶或者其他酶切割。根据另一个实施例，所述IL-4R结合蛋白可以通过容易受到具有蛋白水解活性的尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂、纤维蛋白溶酶、凝血酶或者胰蛋白酶切割的接头进行连接。另外，所述IL-4R结合蛋白可以通过二硫键(例如在半胱氨酸分子上的二硫键)而被连接到所述促凋亡Bcl-2家族成员。例如，在促凋亡Bcl-2家族蛋白的情况中，由于很多肿瘤天然地释放高水平的谷胱甘肽(一种还原剂)，因此这可能减少了二硫键，且随后在输送位点释放所述促凋亡Bcl-2家族成员。
在一些实施方式中，根据本公开内容的融合蛋白可以包括促凋亡Bcl-2家族成员和通过可切割接头区域连接的IL-4R结合蛋白。在另一个实施方式中，所述可切割接头区域可以是蛋白酶可切割接头，但是也可以使用可以由例如小分子切割的其他接头。蛋白酶切割位点的示例包括那些被因子Xa、凝血酶和胶原蛋白酶切割的那些位点。在一个实施例中，所述蛋白酶切割位点包括被与疾病相关联的蛋白酶切割的那些位点。在另一个实施例中，所述蛋白酶切割位点是一般被与癌症相关联的或者被癌症上调的蛋白酶所切割的切割位点。这种蛋白酶的示例有uPA、基质金属蛋白酶(MMP)家族、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspases)、弹性蛋白酶、前列腺特异性抗原(PSA，丝氨酸蛋白酶)和胞浆素原活化因子家族以及成纤维细胞活化蛋白。在又一个实施例中，所述切割位点被由癌症相关联细胞分泌的蛋白酶所切割。这些蛋白酶的示例包括基质金属蛋白酶、弹性蛋白酶、纤维蛋白溶酶、凝血酶和uPA。在另一个实施例中，所述蛋白酶切割位点是被特定癌症上调或者与特定癌症相关联的位点。精确序列可以在本领域中获得，并且本领域技术人员选择适当的切割位点是没有困难的。举例来说，被因子Xa靶向的蛋白酶切割位点是IEGR。被肠激酶靶向的蛋白酶切割区域是DDDDK。被凝血酶靶向的蛋白酶切割区域是LVPRG。在一个实施例中，可切割的接头区域是被细胞内蛋白酶靶向的接头区域。
所述接头可以使用本领域已知的常规技术连接至所述IL-4R结合蛋白部分和/或促凋亡Bcl-2家族成员部分。
IL-4R结合蛋白/促凋亡Bcl-2家族融合蛋白的制备
可以使用本领域已知的常规方法制备融合蛋白。可以例如通过使用重组DNA技术改造编码所述融合蛋白的核酸或者通过肽合成制备融合蛋白以及对其进行的修饰。对所述融合蛋白进行的修饰可以例如使用化学修饰和/或限制蛋白水解法通过修饰所述融合蛋白多肽本身来进行。也可以使用这些方法的组合来制备所述融合蛋白。
克隆和表达蛋白的方法在本领域中已知的，用于重组蛋白的表达的技术和系统的详细说明可以在例如CurrentProtocolsinProteinScience(Coligan，J.E.,等，Wiley&Sons，NewYork)中找到。本领域技术人员应当理解的是，可以使用各种不同的表达系统来提供重组蛋白。因此，所述融合蛋白可以在原核生物宿主(例如，大肠杆菌(E.coli)、杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)或者枯草芽孢杆菌(B.subtilis))或者真核生物宿主(例如，酵母菌(Saccharomyces)或者毕赤酵母(Pichia)；哺乳动物细胞，例如COS、NIH3T3、CHO、BHK、293、或者海拉细胞(HeLacell)；或者昆虫细胞(杆状病毒))中制得。所述融合蛋白可以使用本领域已知的标准技术从宿主细胞中纯化。
各种例示性的融合蛋白的序列提供在表1中。如果需要另外可选的序列，可以使用标准技术(例如参见Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，Wiley&Sons，NY(1997andupdates)；Sambrook等，Sambrook,等MolecularCloning：ALaboratoryManual.第二版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，1989或者它们的升级版)克隆这些序列的变体和类似物。例如可以从适当的生物体例如嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)通过提取mRNA然后根据mRNA模板(例如通过RT-PCR)合成cDNA或者从基因组DNA通过PCR扩增该基因直接获得核酸序列。作为选择，编码IL-4R结合部分或者所述促凋亡Bcl-2家族部分的核酸序列可以通过标准程序从适当的cDNA文库获得。然后将分离的cDNA插入到适当的载体例如克隆载体或者表达载体中。
可以在特异性的预定位置通过本领域已知的体外定点诱变技术引入突变(如果需要的话)。可以通过对构成编码序列的一个或者多个适当核苷酸的缺失、插入、取代、倒位或者它们的组合来引入突变。
所述表达载体可以进一步包括调控元件例如充分转录融合蛋白编码序列所需要的转录元件。能够引入到载体中的调控元件的示例包括但不限于启动子、增强子、终止子和多腺苷化信号序列。可以使用包括操作地连接至编码遗传改造的融合蛋白的核酸序列的调控元件的载体来生成所述融合蛋白。
所述表达载体还可以另外包括便于对表达的融合蛋白进行纯化的异源核酸序列，例如亲和标签(如金属亲和标签、组氨酸标签、抗生物素/链霉亲和素编码序列、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)编码序列、麦芽糖结合蛋白(MBP)编码序列或者生物素编码序列)。在一个实施例中，所述标签被结合至融合蛋白的N末端或者C末端，或者可以定位在所述融合蛋白中。所述标签可以在使用之前根据本领域已知的方法从表达的融合蛋白除去。可选的是，所述标签可以保留在所述融合蛋白上，前提是它们不干扰所述融合蛋白的所希望的活性的能力。
所述融合蛋白可以根据需要和/或如本文所讨论的那样包括一个或者多个接头以及其他部分。它们可以包括结合区域，例如抗生物素或者表位、或者可以用于纯化和加工所述融合蛋白的多组氨酸标签等标签以及本文所述的其他接头。另外，可以将可检测的标记物结合至所述融合蛋白，使得可以方便地监视所述融合蛋白通过身体或者细胞的运输。这些标记物包括放射性核素、酶、荧光团、发色团以及类似的标记物。
本领域技术人员应当理解的是，可以以很多种方式改变所述DNA而不影响编码蛋白的生物学活性。例如，可以使用PCR来在编码所述融合蛋白的DNA序列中产生变化。编码融合蛋白的DNA中的这些变化可以被用来对用于表达所述蛋白的宿主中的密码子偏好进行优化，或者可以包含能够便于表达的其他序列变化。
IL-4R结合蛋白与促凋亡Bcl-2家族成员的直接的共价连接或者通过接头的共价连接可以如本领域已知的那样采取各种形式。例如，共价连接可以为二硫键的形式。编码所述部分中的一个部分的所述DNA可以被改造成包含独特的半胱氨酸密码子。第二部分可以使用与第一部分的半胱氨酸具有反应性的巯基进行衍生。可选的是，可以使用固相多肽技术将巯基本身或者作为半胱氨酸的一部分引入。例如，根据Hiskey(Peptides3：137，1981)所述将巯基引入到肽中。
分析
可以使用本领域已知的或者本文描述的标准方法对融合蛋白进行分析。
例如，可以使用适当的细胞(通常为表达标靶的细胞系或者癌症细胞)对所述融合蛋白杀灭细胞或者抑制细胞的生长的能力进行体外分析。一般来说，使选用的测试细胞系的细胞生长至适当的密度，并且添加候选的融合蛋白。可以将融合蛋白以约至少1ng/mL、至少1ug/mL、或者至少1mg/mL，例如约0.01ug/mL至约1mg/mL、约0.10ug/mL至约0.5mg/mL、约1ug/mL至约0.4mg/mL添加至培养物中。在一些实施例中，测试了系列稀释液。经过适当的温浴时间(例如约48小时至72小时)之后，评价细胞存活或者生长。确定细胞存活的方法在本领域中是已知的，并且包括但不限于刃天青还原试验(参见Fields&LancasterAm.Biotechnol.Lab.，11：48-50，1993；O'Brien等，Eur.J.Biochem.，267：5421-5426，2000或者U.S.Pat.No.5,501,959)、磺基罗丹明分析(Rubinstein等，J.Natl.CancerInst.，82：113-118，1999)、或者中性红色染料测试(Kitano等，Euro.J.Clin.Investg.，21：53-58，1991；West等，J.InvestigativeDerm.，99：95-100，1992)、或者台盼蓝分析。可以使用很多可以商购获得的试剂盒，例如CellTiterAQueousOneSolution细胞增殖分析(Promega)。通过比较被处理的培养物中的细胞存活和一个或者多个对照例如未处理的培养物和/或使用对照化合物(通常是一种已知的治疗剂)预处理的培养物或者其他适当的对照的细胞存活来确定细胞毒性。
另外的分析法在例如Crouch等(J.Immunol.Meth.160，81-8)；Kangas等(Med.Biol.62，338-43，1984)；Lundin等,(Meth.Enzymol.133，27-42，1986)；Petty等(ComparisonofJ.Biolum.Chemilum.10，29-34，1995)；和Cree等(AnticancerDrugs6：398-404，1995)中有描述。细胞生活力可以使用各种方法，包括MTT(3-(4,5-二甲基噻唑基)-2,5二苯基四氮唑鎓溴化物)(Barltrop，Bioorg.&Med.Chem.Lett.1：611，1991；Cory等，CancerComm.3，207-12，1991；PaullJ.HeterocyclicChem.25，911，1988)进行分析。对细胞生活力的分析还可以商购获得。这些分析法包括但不限于发光细胞生活力分析(Promega)(其使用荧光素酶技术来检测ATP并且对培养物中的细胞的健康或者数量进行量化)和Luminescent细胞生活力分析，这是一种乳酸盐脱氢酶(LDH)细胞毒素分析(Promega)。
可以测试提供对特定类型的癌症具有的选择性的融合蛋白靶向该特定癌症细胞类型的能力。例如，可以通过比较包含靶向显示I型或者II型的IL-4R的细胞的特异性IL-4的融合蛋白杀灭癌症细胞的能力与杀灭正常细胞或者不同类型的癌症细胞(例如没有表达I型或者II型的IL-4R的细胞)的能力来评价所述融合蛋白选择性地靶向所述细胞的能力。作为选择，可以使用本领域已知的流式细胞计数法来确定包含I型或者II型受体特异性IL-4的融合蛋白是否能够选择性地靶向特定类型的细胞。被标记的抗体与被结合的融合蛋白的结合将指示融合蛋白与靶标的结合。
类似地，用于测量细胞凋亡的分析法在本领域中是已知的。凋亡细胞通过特征性的形态变化包括染色质凝聚、细胞收缩和膜起泡(这些可以使用光学显微镜清楚地看到)来表征。凋亡的生物学特征包括DNA片段化、特定位置的蛋白切割、增加的线粒体膜渗透性以及细胞膜表面上的磷脂酰丝氨酸的出现。用于凋亡的分析法在本领域中是已知的。例示性的分析法包括TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶生物素-dUTP缺口末端标记(TerminaldeoxynucleotidylTransferaseBiotin-dUTPNickEndLabeling))分析法、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性(特别是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3)分析法和用于fas-配体和膜联蛋白V的分析法。用于检测凋亡的可以商购获得的产品包括例如HomogeneousCaspase-3/7分析法、FragELTUNEL试剂盒(ONCOGENERESEARCHPRODUCTS，SanDiego，Calif)、ApoBrdUDNA片段化分析法(BIOVISION，MountainView，Calif)、和快速凋亡DNA梯度检测试剂盒(QuickApoptoticDNALadderDetectionKit，BIOVISION，MountainView，Calif)。
适合于检测候选融合蛋白的各种细胞系在本领域中是已知的并且很多都可以通过商购获得(例如，从美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)，Manassas，Va.商购获得)。类似地，动物模型在本领域中也是已知的并且很多动物模型都可以商购获得。
治疗适应症和应用
包含如本文所述的IL-4R结合蛋白和促凋亡Bcl-2家族成员的所述融合蛋白可以被用于各种治疗用途。一般来说，本文所述的融合蛋白可以被用于涉及表达IL-4R的细胞以及将受益于对细胞增殖的抑制或者细胞死亡的促进的任意疾病、紊乱或者病症的治疗或者预防。在一些实施方式中，本文所述的融合蛋白可以被用于涉及表达I型或者II型IL-4R的细胞、以及其中相对于其他受体而选择一种类型的受体是有用的、以及将受益于对细胞增殖的抑制或者细胞死亡的促进的任意疾病、紊乱或者病症的治疗或者预防。
在一些实施方式中，包括促凋亡Bcl-2家族成员的融合蛋白可以被用来诱导凋亡或者细胞死亡、或者用来治疗与异常凋亡或者细胞增殖相关联的紊乱例如癌症。本文使用的术语“癌症”、“癌”、“过度增生”或者“赘生物”是指具有自动生长的能力的细胞(例如，以正在增殖的细胞生长激增为特征的异常状态或者情况)。过度增生性或者赘生性疾病状态可以被分类为病理性类型(例如，因为偏离正常状态但是与疾病状态不相关)。因此，“癌症”或者“赘生性”是指细胞的没有生理学功能的任何不需要的生长。一般来说，具有赘生性的细胞已经脱离于其正常的细胞分离控制，即，在细胞环境中其生长没有受到常规生物化学和物理影响的控制的细胞。在大多数情况中，赘生性细胞增殖从而形成要么是良性的要么是恶性的细胞克隆。癌症或者赘生物的示例包括转化并且永生化细胞、肿瘤以及癌例如乳腺细胞癌和前列腺癌。术语癌症包括从技术上来说是良性的但是可能存在变成恶性的风险的细胞生长。“恶性”是指任何细胞类型或者组织的异常生长。术语恶性包括从技术上来说是良性的但是存在变成恶性的风险的细胞生长。该术语还包括任何癌症、癌、赘生物、肿瘤形成或者肿瘤。因此，这些术语是指包括所有类型的癌生长或者肿瘤发生过程、转移性组织或者恶性转化细胞、组织或者器官，不管是组织病理学类型或者侵袭阶段。在一些实施方式中，包括促凋亡Bcl-2家族成员的融合蛋白没有结合影响干细胞的癌症使用。
大多数癌症分为三个大的组织学类别：癌，其是占多数的癌症以及表皮细胞或者覆盖在器官、腺体、或者其他身体结构(例如，皮肤、子宫、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃、肠)的外部或者内部表面上的细胞的癌症，并且往往会发生转移；肉瘤，其衍生于结缔组织或者支撑组织(例如，骨、软骨、肌腱、韧带、脂肪，肌肉)；和血液肿瘤，其衍生自骨髓和淋巴组织。癌症的示例包括但不限于：癌、肉瘤和血液肿瘤形成紊乱例如白血病。
癌可以是腺癌(其一般在能够分泌的器官或腺体中，如乳腺、肺、结肠、前列腺或膀胱)，或者可以是鳞状细胞癌(其衍生自鳞状上皮并且一般在身体的大部分区域形成)。
肉瘤可以是骨肉瘤或骨源性肉瘤(骨)、软骨肉瘤(软骨)、平滑肌肉瘤(平滑肌)、横纹肌(骨骼肌)，间皮肉瘤或间皮瘤(体腔的膜质内层)、纤维肉瘤(纤维组织)、血管肉瘤或血管内皮瘤血管)、脂肪肉瘤(脂肪)、神经胶质瘤或星形细胞瘤(见于大脑的神经源性结缔组织)、粘液肉瘤(原始胚胎结缔组织)或间叶细胞肿瘤或中胚叶混合瘤(混合结缔组织类型)。
造血肿瘤形成性紊乱包括涉及造血起源的增生性/赘生性细胞，例如源自于髓系、淋巴系或红细胞系或其前体细胞。优选的是，所述疾病源自于分化不良的急性白血病(例如，成红细胞性白血病和急性成巨核细胞性白血病)。另外的例示性髓性紊乱包括但不是限于急性前髓细胞性白血病(APML)、急性骨髓性白血病(AML)和慢性骨髓性白血病(CML)；淋巴恶性疾病包括但不是限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，其包括B系急性成淋巴细胞性白血病和T系急性成淋巴细胞性白血病，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、前淋巴细胞性白血病(PLL)、毛细胞白血病和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia)。
其他形式的恶性淋巴瘤包括但不是限于非霍奇金淋巴瘤及其变体，外周T细胞淋巴瘤，成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)、霍奇金病和里-斯疾病。
还可以根据癌症所源自的器官即“原发位点”而对这些癌症进行命名，例如乳腺、大脑、肺、肝、皮肤、前列腺、睾丸、膀胱、结肠和直肠、子宫颈、子宫等。即使癌症转移到身体的另外部分即不同于原发位点也坚持这种命名。根据原发位点进行命名的癌症可以与组织学分类相关联。例如，肺癌一般是小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其可能是鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌；皮肤癌通常是基底细胞癌、鳞状细胞癌或黑色素瘤。淋巴瘤可能出现在与头部、颈部和胸部相关联的淋巴结中以及腹部淋巴结或腋窝淋巴结或腹股沟淋巴结中。癌症的类型和阶段的识别和分类可以通过使用监测、流行病学和例如国家癌症研究所的最终结果(SEER)项目所提供的信息进行。
在一些实施方式中，包含促凋亡Bcl-2蛋白家族成员或其片段的融合蛋白可用于治疗癌症，如胃癌、侵袭性垂体腺瘤、胆道癌、宫颈癌、淋巴瘤、黑色素瘤、慢性淋巴细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、胰腺癌、直肠癌、结肠癌、甲状腺癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、间皮瘤、横纹肌肉瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、头和颈部癌症或卡波西氏癌。
一些实施方式中，包含促凋亡Bcl-2家族蛋白成员或其片段的融合蛋白可用于治疗中枢神经系统的癌症，如神经胶质瘤、脑膜肿瘤、弥漫性内在脑桥神经胶质瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、间变性星形细胞瘤、多形性神经胶质母细胞瘤、脑转移癌或中枢神经系统淋巴瘤。
所述融合蛋白可用于治疗、稳定或预防癌症。融合蛋白也可以用于治疗惰性癌症；复发性癌症包括局部复发、远处复发和/或难治性癌症(即对其他抗癌症治疗没有反应的癌症)；转移性癌症；局部晚期癌症和侵袭性癌症。在这些情况下，所述融合蛋白可以施加细胞毒性或抑制细胞生长的影响，导致例如癌症细胞的数量的减少或生长的减缓、肿瘤尺寸的减小或者肿瘤尺寸增大的减缓或者防止、肿瘤消失或者切除及其再次出现之间的无病存活时间的增加、肿瘤的原发性或者继发性出现(例如转移)的预防、疾病进展前时间的增加，与肿瘤相关联的一个或者多个不利症状的减缓、或者患有癌症的受试者的总体存活时间的增加。
可以使用包含促凋亡Bcl-2家庭成员的融合蛋白治疗增殖性和分化性紊乱的其他示例包括增殖性非恶性疾病如肺纤维化或增生(如良性前列腺增生)、心肌纤维化或肝纤维化；炎性疾病，如前列腺炎、春季型角膜结膜炎、动脉粥样硬化、特发性肺炎；或自身免疫性疾病如格雷夫氏症。
在一些实施方式中，包含促凋亡Bcl-2家族蛋白成员的融合蛋白或其片段能够抑制细胞存活、抑制细胞增殖，或促进细胞死亡或凋亡。在一些实施方式中，所述IL-4R结合蛋白-促凋亡Bcl-2家族融合蛋白在与适当的对照如单独的IL-4、结合至非促凋亡Bcl-2家族蛋白的IL-4等相比时，能够抑制细胞存活、抑制细胞增殖、促进细胞死亡或凋亡。合适的对照还可以包括以前建立的标准。因此，用于确定IL-4R结合蛋白-促凋亡Bcl-2家族融合蛋白的疗效或活性的任何测试或者分析法都可以与既定标准进行比较，并且可能不需要每次都包括与对照进行的比较。“抑制细胞存活”指的是降低(例如，至少10％、20％、30％、或者高达50％、75％、85％或90％或更多)存在细胞死亡风险的细胞将存活的可能性。“抑制细胞增殖”指的是降低(例如，至少10％、20％、30％、或者50％、75％、85％或90％或更多)细胞生长或增殖。“促进细胞死亡或凋亡”指的是增加(例如，至少10％、20％、30％、或者50％、75％、85％或90％或更多)的存在细胞死亡风险的细胞将会经历凋亡、坏死或任何其他形式的细胞死亡的可能性。
在一些实施方式中，包含促凋亡Bcl-2家族蛋白成员或其片段的融合蛋白在与在类似条件下培养但是不与所述融合蛋白接触的细胞相比时，能够抑制细胞存活、抑制细胞增殖，促进细胞死亡或凋亡至少20％，30％、或者高达50％、75％、85％或90％或更多。适用于测量细胞存活的抑制作用、细胞增殖的抑制作用或者细胞死亡或凋亡的促进作用的分析法在本文中有描述或者在本领域中是已知的。
在一些实施方式中，包含促凋亡Bcl-2家族蛋白成员或者其片段的融合蛋白在抑制细胞存活、抑制细胞增殖、促进细胞死亡或凋亡中的IC50的范围可以为约0.1ng/mL至约10,000ng/mL，或者其间的任何数值，例如为约0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、75ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL、250ng/mL、300ng/mL、350ng/mL、400ng/mL、450ng/mL、500ng/mL、550ng/mL、600ng/mL、650ng/mL、700ng/mL、750ng/mL、800ng/mL、850ng/mL、900ng/mL、950ng/mL、或者1000ng/mL。
“靶细胞”包括但不限于：神经元、淋巴细胞、干细胞、上皮细胞、癌症细胞、赘生物细胞、免疫细胞，肿瘤微环境的非恶性细胞、增殖过度性细胞等。所选择的靶细胞将取决于拟用所述融合蛋白治疗的疾病或损伤或病症。
药物组合物，剂量和施用
根据本公开内容的药物组合物可以包含一种或多种融合蛋白和一种或多种非毒性的药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和佐剂。这些组合物可以适合在本文所述的治疗性适应症的治疗中使用。
如果需要，可以将其它活性成分包含在所述组合物中。因此，在一些实施方式中，包含促凋亡Bcl-2家庭成员的融合蛋白可以以治疗有效量结合一种或多种抗癌症或其他疗法施用。可以在使用抗肿瘤或者其他疗法进行治疗之前、期间或之后施用所述融合蛋白。“抗癌治疗”是预防或者延迟癌症细胞的生长和/或转移的化合物，组合物或处置(例如，手术)。这种抗癌治疗包括但并不仅限于手术(例如，切除所有或部分肿瘤)、化疗药物治疗、辐射、基因疗法、激素控制、免疫疗法(例如，治疗性抗体和癌症疫苗)和反义或RNAi寡核苷酸治疗。有用的化疗药物的例子包括但不是限于：羟基脲、白消安(busulphan)、顺铂、卡铂、苯丁酸氮芥、马法兰、环磷酰胺、异环磷酰胺，道诺霉素(danorubicin)、阿霉素、表阿霉素、米托蒽醌、长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇、多西紫杉醇、吉西他滨、胞嘧啶、阿糖胞苷、博莱霉素、新制癌菌素(neocarcinostatin)、苏拉明、泰素、丝裂霉素C、阿伐斯汀、氟尿嘧啶、替莫唑胺(temozolamide)等。融合蛋白还适合通过采用两种或更多种的化疗药物的标准组合疗法使用。应当理解的是，抗癌治疗包括未来开发的新化合物或治疗方法。
还可以与辐射敏化剂如放射性治疗敏化剂结合使用所述融合蛋白(参见例如Diehn等，J.Natl.CancerInst.98：1755-7，2006)。一般而言，敏化剂是能够增加所述融合蛋白的活性的任何试剂。例如，敏化剂将增加融合蛋白抑制癌细胞生长或杀死癌细胞的能力。例示性的敏化剂包括抗IL-10的抗体、骨形态发生蛋白和HDAC抑制剂(参见例如Sakariassen等，Neoplasia9(11)：882-92，2007)。这些敏化剂可以在使用所述融合蛋白进行的治疗之前或期间施用。这些敏化剂的例示性剂量包括至少1ug/mL，例如至少10ug/mL、至少100ug/mL，例如5-100ug/mL或者10-90ug/mL。所述敏化剂可以以每日一次、每周三次，每周两次、每周一次或每两周一次施用。还可以在使用所述融合蛋白进行的治疗结束后施用所述敏化剂。
所述融合蛋白可能用作新辅助治疗（到初级治疗)的一部分、作为辅助治疗方案的一部分，其中目的是为了治愈受试者中的癌症。所述融合蛋白也可以在肿瘤发生和发展的不同阶段施用，包括在晚期和/或侵袭性赘生物(例如受试者中通过局部治疗形式(例如手术或者放射性治疗)不能治愈的显性疾病)、转移性疾病、。局部晚期疾病和/或难治性肿瘤(例如，对治疗不反应的癌症或肿瘤)的治疗中的各个阶段施用。“初级疗法”是指受试者中癌症的初次诊断后的一线治疗。例示性的初级疗法可能涉及手术、大范围的化学治疗和放射性治疗。“辅助治疗”是指这样的一种疗法，其跟随一种初级疗法之后以及在存在复发风险时施用于受试者。辅助系统性治疗在初级疗法之后很快开始，例如在最后一次的初级疗法治疗之后2、3、4、5、或6周开始以延迟复发，延长存活时间或治愈所述受试者。如此处讨论的那样，考虑到了所述融合蛋白可以单独使用或作为辅助疗法的一部分与一种或多种其他化疗药物结合使用。所述融合蛋白与标准化疗试剂的组合可以起到提高化疗疗效的作用，因此，可以用来改善标准癌症疗法。这种应用对对标准治疗不反应的耐药性癌症的治疗尤为重要。
在癌症中，肿瘤的微环境包含恶性和非恶性的细胞。肿瘤微环境可以使用一种或多种下列标准鉴定：(a)包含共享相同的生理环境或直接毗邻恶性细胞的非恶性细胞的区域；(b)延展的肿瘤区域；(c)包围肿瘤或者邻近肿瘤的炎症区域；(d)其中调节性T细胞的增殖数量或速度增加的区域；和(e)与肿瘤相关联的巨噬细胞、树突状细胞、髓源性抑制细胞、Th2细胞或纤维细胞增加的区域。在非实体肿瘤类型的情况中，所述肿瘤微环境还可以通过恶性细胞之间和恶性细胞和任何邻近或者附近的非恶性细胞之间的局部相互作用进行确定。这种相互作用可以包括例如肿瘤微环境中的细胞粘附事件和/或由一种细胞(恶性或者非恶性)产生的可溶性调节子对另一种细胞(恶性或者非恶性)的旁分泌作用。
所述肿瘤微环境中的所述非恶性细胞对于肿瘤的发作和进展可能是重要的(Reynolds等，CancerRes.，1996，56(24)：5754-5757)。所述非恶性细胞，也称为基质细胞，占据或者累积在与恶性细胞相同的细胞空间或者毗邻或者邻近恶性细胞的细胞空间，这调节肿瘤细胞生长或者存活。例如，一般起到支撑炎性和免疫反应的作用的非恶性细胞可能能够对肿瘤的发作或者进展有贡献。因此，在一些另外可选的实施方式中，包括促凋亡Bcl-2家族成员的融合蛋白可以被用来抑制细胞存活、抑制细胞增殖或者促进在肿瘤微环境中表达I型或者II型IL-4R的非恶性细胞的细胞死亡或者凋亡。这些非恶性细胞可以是免疫调节性细胞或者炎性细胞，例如在肿瘤微环境中存在的抗原呈递细胞(例如巨噬细胞、树突状细胞、B细胞)或者髓系源性抑制细胞(例如髓系源性单核细胞和tie-2表达单核细胞)，以及用于抑制用于支撑肿瘤进展(例如调节T细胞和Th2辅助细胞)的T细胞亚组和/或用于抑制肿瘤微环境中的一种或者多种炎性细胞因子的生成。在肿瘤微环境中的非恶性细胞中有调节T细胞，其在很多肿瘤以较高的频率被观察到，所述肿瘤包括霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(Shi等，AiZheng.，2004，23(5)：597-601(只有摘要))、恶性黑色素瘤(Viguier等，J.Immunol.，2004，173(2)：1444-53；Javia等，J.Immunother.，2003，26(l)：85-93)、和卵巢癌(Woo等，CancerRes.，2001，61(12)：4766-72)、胃肠道癌(Ichihara等，ClinCancerRes.，2003，9(12)：4404-4408；Sasada等，Cancer，2003，98(5)：1089-1099)、乳腺癌(Liyanage等，JImmunol.，2002，169(5)：2756-2761)、肺癌(Woo等，CancerRes.，2001，61(12)：4766-72)和胰腺癌(Liyanage等，JImmunol.，2002，169(5)：2756-2761)。所述调节T细胞响应于由肿瘤细胞分泌的化学因子而被募集到肿瘤部位，参见例如，Curiel等，Nat.Med.，2004，10：942-949。调节T细胞的数量的增加还可能与不良预后相关联(Curiel等，Nat.Med.，2004，10：942-949；Sasada等，Cancer，2003，98：1089-1099)。相反，调节T细胞被观察到在化学治疗之后降低(Beyer等，Blood，2005，106：2018-2025)。当与Th1细胞比较时，肿瘤微环境还具有较高比例的Th2细胞，其与不良预后和存活相关联。在一些另外可选的实施方式中，根据本发明的包含促凋亡Bcl-2家族成员的融合蛋白例如cpIL-4-Bad例如通过消耗Th2细胞来恢复Thl>>Th2平衡是有用的。在一些实施方式中，根据本发明的包含促凋亡Bcl-2家族成员的融合蛋白例如cpIL-4-Bad可以在化学疗法、放射性疗法、免疫疗法等之前或者其间施用于受试者，以关闭或者调低肿瘤微环境。
非恶性细胞还可以是成纤维细胞、肌成纤维细胞、神经胶质细胞、上皮细胞、脂肪细胞、血管细胞(包括血液和淋巴血管内皮细胞与周皮细胞)、驻留和/或募集炎性及免疫细胞(例如，巨噬细胞、树突状细胞、骨髓抑制细胞、粒细胞、淋巴细胞等)、能够产生或分化成任何上述非恶性细胞和上述细胞的任何功能上不同的亚型的驻留和/或募集细胞，如本领域已知的那样。
“受试者”可以是需要治疗的哺乳动物，如人类或兽医学患者(例如，啮齿类动物，如小鼠或者大鼠、猫、狗、奶牛、马、绵羊、山羊，或其他牲畜)。在一些实施方式中，“受试者”可以是临床患者、临床试验志愿者、实验动物等等。所述受试者可能被怀疑患有以细胞增殖为特征的疾病或者具有患上以细胞增殖为特征的疾病、被诊断为患有以细胞增殖为特征的疾病、或者是被证实不患有以细胞增殖为特征的疾病的对照受试者，如本文所述。用于以细胞增殖为特征的疾病的诊断方法和这种诊断的临床划分对于本领域技术人员是已知的。
所述组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、缓释制剂或粉末，并且可以和药学上可接受的载体配制。所述组合物可以使用传统的粘合剂和载体例如甘油三酯配制成栓剂。“药学上可接受的载体”是指不会干扰活性成分的生物活性的有效性并且不对所述宿主或者受试者产生毒性的载体基质或者媒介物(vehicle)。
融合蛋白可以和药学上可接受的媒介物一起输送。在一个实施例中，媒介物可以增强稳定性和/或输送性质。因此，本公开内容还提供了所述融合蛋白与合适的媒介物，如人造膜囊泡(包括脂质体、非离子表面活性剂泡囊(noisome)、纳米微脂囊等)、微粒或者微胶囊、或者包含药学可接受的聚合物的胶体制剂。这种媒介物/聚合物的使用有利于实现所述融合蛋白的持续释放。作为替代方式或者另外的方式，所述融合蛋白制剂可以包括用于稳定体内蛋白的添加剂例如人类血清白蛋白，或者本领域已知的用于蛋白治疗剂的其他稳定剂。融合蛋白制剂还可以包括一种或者多种粘性增强试剂，所述粘性增强试剂可以在例如通过注射或者经由导管进行施用时防止所述制剂的反流。这种粘度增强试剂包括但不限于具有生物兼容性的甘油和蔗糖。
包含一种或者多种融合蛋白的药物组合物可以根据本领域已知的方法并且使用适当的一种或者多种分散试剂或润湿试剂和/或悬浮试剂配制成无菌可注射水性或者油质悬浮液。所述无菌可注射制剂可以是在非毒性的亲本可接受的稀释剂或者溶剂中的无菌可注射溶液或者悬浮液。例如，在1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的媒介物和溶剂包括但不限于水、林格氏溶液、乳酸林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。其他的例子包括一般被用作溶剂或者悬浮介质的无菌固定油、以及各种品牌的固定油，包括例如合成单甘油酯或二甘油酯。脂肪酸如油酸也可以用于可注射制剂的制备。
在一些实施方式中，融合蛋白被偶联至水溶性聚合物例如以增加稳定性或循环半衰期或者降低免疫原性。临床可接受的水溶性聚合物包括但不是限于：聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇丙醛、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙二醇均聚物(PPG)、聚氧乙烯化多元醇(polyoxyethylatedpolyols，POG)、(例如，丙三醇)和其他聚氧乙烯化多元醇、聚氧乙烯化山梨醇或者聚氧乙烯化葡萄糖和其他碳水化合物聚合物。用于将多肽偶联至水溶性聚合物如聚乙二醇的方法例如在美国专利No.20050106148以及本文所引用的参考文献中有描述。在一个实施例中，所述聚合物是设计用于增强药物从酸性体腔释放到细胞质的释放的pH敏感性聚合物(例如参见Henry等，Biomacromolecules7(8)：2407-14，2006)。
通常，疫苗被制备成可注射形式，或者作为液体溶液或者作为悬浮液。适用于注射的固体剂型也可以被制备成乳液，或者将多肽包封在脂质体中。可以在本领域已知的任何适当的载体中注射细胞。适当的载体一般包含代谢缓慢的大的大分子，例如蛋白质、多肽、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质集料以及无活性的病毒颗粒。这种载体对于本领域技术人员来说是已知的。这些载体还可以用作佐剂。
佐剂是增加疫苗的有效性的免疫刺激试剂。有效的佐剂包括但不限于铵盐例如氢氧化铵和磷酸铝、胞壁酰肽(muramylpeptide)、细菌细胞壁组分、皂素佐剂以及用作免疫刺激试剂以增强所述组合物的有效性的其他物质。
疫苗以与剂量配方兼容的方式施用。有效量是指有效治疗或者预防疾病或者紊乱的单剂量，或者是以多剂量安排施用的疫苗。优选的是，剂量可有效地抑制赘生物的生长。所施用的剂量药物将因被处理对受试者、受试者健康状况和身体条件、受试者的免疫系统产生抗体的能力、期望保护的程度以及其它有关因素而异。所需的活性成分的精确量将取决于医生的判断。
本文描述的药物组合物包括一种或多种融合蛋白，其量为有效地达到预期的目的。通常情况下，包含含有促凋亡Bcl-2家族成员的融合蛋白的组合物被施用于已经患有以细胞增殖为特征的疾病、紊乱或者病症的患者、或者具有患上这些疾病、紊乱或者病症的风险的患者，其量为足以治愈或者至少部分地抑制与细胞增殖有关的症状或者减缓细胞生长。
因此，本领域技术人员应当认识到的是，将施用的剂量不受特定的限制。在为治疗目的而施用之前，所述融合蛋白的剂量可能需要针对特定目的而进行修改或改变，例如，系统性地施用所需的融合蛋白的浓度可能不同于用于局部施用的浓度。类似的，治疗剂的毒性可能会因所使用的施用模式和总体组成(如缓冲剂、稀释剂、附加化学治疗剂等)而异。
根据本发明的药物组合物的“有效量”包括治疗有效量或者预防有效量。“治疗有效量”是指所述融合蛋白的在用必要的剂量和时间时有效地减轻待治疗的疾病、紊乱或者病症的量。化合物的治疗有效量可能因受试者的诸如疾病状态、年龄、性别和体重以及该化合物在所述受试者中引起所期望的反应的能力等因素而异。可以对剂量方案进行调整以提供最优的治疗反应。治疗有效量还是其中所述融合蛋白的任何有毒或者不利的效果被治疗有益效果所超过的量。确定化合物的治疗有效量完全处在本领域技术人员的能力范围内。例如，治疗有效剂量最初可以以细胞培养分析法进行确定、或者在动物模型例如本文所述的那些动物模型中确定。“预防有效量”是指所述融合蛋白的在用必要的剂量和时间时有效地实现了所期望的预防效果，例如延长神经紊乱的症状的发作或者癌症的持续缓解的量。可以使用动物模型来确定适当的施用浓度范围和途径。这些信息然后可以被用来利用本领域普通技术人员已知的标准方法来确定用于在其他动物例如人类中施用的有用的剂量和途径。
所述融合蛋白在最终的制剂中的浓度可以为至少0.1mg/mL，例如至少1ng/mL或者至少1ug/mL或者至少1mg/mL。例如，在最终制剂中的浓度可以为约0.01ug/mL至约1,000ug/mL。在一个实施例中，在最终制剂中的浓度为约0.01mg/mL至约100mg/mL。
在一些实施方式中，以如下浓度范围施用包含抗凋亡Bcl-2家族蛋白或者其片段的融合蛋白：约10ng/mL至约10,000ng/mL或者其间的任意值，例如约25ng/mL、50ng/mL、75ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL、250ng/mL、300ng/mL、350ng/mL、400ng/mL、450ng/mL、500ng/mL、550ng/mL、600ng/mL、650ng/mL、700ng/mL、750ng/mL、800ng/mL、850ng/mL、900ng/mL、950ng/mL、1000ng/mL、1500ng/mL、2000ng/mL、2500ng/mL、3000ng/mL、3500ng/mL、4000ng/mL、4500ng/mL、5000ng/mL、5500ng/mL、6000ng/mL、6500ng/mL、7000ng/mL、7500ng/mL、8000ng/mL、8500ng/mL、9000ng/mL、9500ng/mL、或者10000ng/mL。
在一些实施方式中，包含促凋亡Bcl-2家族蛋白或者其片段的融合蛋白以约0.1ng/mL至约10,000ng/mL的浓度范围施用。
然而，应当理解的是，准备施用的化合物的实际的量将由医生根据有关情况包括待治疗的病症、所选用的施用途径、所施用的实际化合物、个体患者的年龄、体重和反应以及患者症状的严重程度来决定。上述剂量范围仅以举例方式给出，并且根本没有限制范围的任何意图。在一些情况中，低于上述范围的下限的剂量水平可能更加适当，但是在其他一些情况中，可以采用较大的剂量而没有导致有害的副作用，例如，首先通过将较大的剂量分成若干较小的计量以用于整天施用。
本领域的普通技术人员将理解的是，剂量将取决于被施用的融合蛋白的类型和正在被治疗的紊乱或者病症类型等。
通常，根据本公开内容的所述融合蛋白含有大量的人类序列，因此比例如免疫毒素或者包含非人类序列的其他分子具有较低的抗原性。在一些实施方式中，根据本公开内容的所述融合蛋白包含至少80％，例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的人类序列。在一些实施方式中，根据本公开内容的所述融合蛋白可以以比例如免疫毒素或者天然IL-4R结合蛋白例如IL-4或者IL-13明显较低的剂量施用。
在一些实施方式中，所述融合蛋白可以在施用于受试者时引起一定水平的抗体应答，这在一些情况中可能导致不利的副作用。因此，如果需要，可以按照本领域已知的或者本文描述的那样评价所述融合蛋白的抗原性。例如，可以通过在治疗的过程中测量所述融合蛋白对动物体重的影响以及在杀死动物后通过进行血象(hematologicalprofile)和肝酶分析法来评价所述融合蛋白的体内毒性影响。可以根据本领域已知的方法测试所述融合蛋白的总体毒性。例如，可以通过在单次静脉内注射后确定杀死100％的小鼠(即，LD100)或者杀死50％的小鼠(即，LD50)的剂量来测试所述融合蛋白的总体系统毒性。可以选择比LD100或者LD50低至少约2、5或者10倍的剂量来施用于其他动物例如人类中。
可以例如在免疫活性小鼠中确定抗体对本文所述的融合蛋白反应的动力学和量级。并且可以将所述动力学和量级用于促进可以用于免疫活性人类的剂量方案的形成。对免疫活性小鼠例如C57-BL6株系施用静脉内剂量的融合蛋白。以不同的时间间隔杀死所述小鼠(例如，在单个剂量之后、在多个剂量之后)并获得血清。使用基于ELISA的分析法检测抗-融合蛋白抗体的存在。
如本领域已知的那样评价来自小鼠的血清样品中抗-融合蛋白抗体的存在。作为另一个实施例，还可以使用表位作图法来确定蛋白的抗原性，例如在Stickler等，J.Immunotherapy，23：654-660，2000中所述的那样。简而言之，从没有暴露于感兴趣的蛋白的社会供体分离称作树突状细胞的免疫细胞和CD4+T细胞。然后向培养的细胞中添加跨过所述蛋白的长度的小和合成肽。响应于特定肽的存在的增殖指示T细胞表位被涵盖在该序列中。然后在所述融合蛋白中删除或者修饰这个肽序列，由此降低它的抗原性。
还可以例如通过确定半数有效剂量或者ED50(即在50％的群体中治疗有效的剂量)和半数致死剂量或者LED50(对50％的群体而言是致死的剂量)等标准药学程序来确定治疗效果和毒性。治疗效果和毒性效果之间的剂量比被称为“治疗指数”，其可以表示为比例LD50/ED50。从细胞培养物分析和动物研究中获得的数据可以被用来制定用于人类或者动物使用的剂量的范围。包含在这种组合物中的剂量通常处于包括ED50的浓度的范围之内并且显示出几乎没有毒性或者没有毒性。剂量根据采用的剂型、受试者的敏感性和施用途径等而在这个范围内变化。
可以通过在病灶内施用所述融合蛋白，例如通过直接注射法直接注射到凋亡组织部位中；直接注射到需要细胞生长的部位中；直接注射到细胞、组织或者器官存在细胞死亡风险的部位中；或者直接注射到高度增殖的部位中或者直接注射到肿瘤中而施用所述融合蛋白。作为选择，可以系统性地施用所述融合蛋白。对于包括将融合蛋白与化学治疗试剂结合施用的联合治疗的方法，施用组合物的顺序可以相互交换。也可以考虑同时施用。
在癌症治疗中，一般来说，将融合蛋白系统性地施用于患者，例如通过弹丸注射法或者持续输注法而施用到患者的血流中。作为选择，可以在肿瘤部位局部施用(肿瘤内施用)所述融合蛋白。在肿瘤内施用融合蛋白的情况中，可以经由任意途径施用，例如通过局部施用、区域施用、局地施用、系统性地施用、对流增强输送或者它们的组合进行施用。
在与一种或者多种已知的化学治疗试剂结合使用时，可以在施用所述化学治疗试剂之前或者之后施用所述化合物，或者它们可以同时施用。所述一种或者多种化学治疗试剂可以进行系统施用，例如通过弹丸注射法或者持续输注法施用，或者它们可以通过口服施用。
对于对动物进行的施用，可以将所述药物组合物配制成用于通过各种途径施用。例如，可以将所述组合物配制成用于表面施用、直肠施用或者肠胃外施用或者用于通过吸入法或者喷雾施用。本文使用的术语“肠胃外”包括皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射、鞘内注射、胸骨内注射或者输注技术。也考虑了直接注射或者输注到肿瘤中。对流增强输送法也可以被用来施用所述融合蛋白。
在一个实施例中，使用类似于近距离放射疗法的多注射方法的施用方法将所述融合蛋白注射到患有癌症的受试者中。例如，可以使用针以适当的剂量单位以药物组合物或者制剂的形式注射纯化融合蛋白的多个等分试样。施用所述融合蛋白的另外可选的方法对于本领域普通技术人员来说是清楚的。这些方法包括例如使用导管或者可植入泵以将所述融合蛋白持续输注到需要治疗的受试者。
如本领域已知的那样，软件规划程序(softwareplanningprograms)可以与近距离发射疗法和超声疗法结合使用，以例如留置用于输注融合蛋白的导管，从而治疗例如脑肿瘤或者其他局部肿瘤。例如，一般可以在超声引导的情况下实现针的定位和留置。可以例如根据待治疗的器官的体积或者面积调节施用于患者的注射和放置的总体积因而可以调节注射和沉积的数量。适当的软件规划程序的示例是用于向脑部进行的对流增强输送的近距离放射疗法治疗规划程序Variseed7.1(VarianMedicalSystems，PaloAlto，Calif.)或者iPlan(BrainLab，Munich，德国)。这种方法已经被成功用于治疗前列腺癌和脑癌等。
融合蛋白可以用于在中枢神经系统(CNS)中抑制细胞存活或者抑制细胞增殖。当输送部位是脑部时，所述融合蛋白必须能够被输送到脑部。血脑屏障限制了很多治疗试剂从周身循环吸收到大脑和脊髓中。跨过血脑屏障的分子使用两种主要机制：自由扩散和促进运输。因为存在血脑屏障，所以可能需要使用特定的药物输送策略来实现给定融合蛋白在中枢神经系统中的有益浓度。可以通过若干种方法实现融合蛋白对中枢神经系统的输送。
一种方法依赖于神经外科技术。例如，融合蛋白可以通过直接物理引导而输送到中枢神经系统中，例如脑室内注射、病灶内注射或者鞘内注射。脑室内注射可以通过脑室内导管例如连接到储室例如Ommaya储室的导管来提供便利。还可以通过可以重新填充的或者生物可降解的装置来提供导入方法。另一种方法是通过增加血脑屏障的通透性的物质来突破血脑屏障。例子包括动脉内输注扩散性差的试剂例如甘露醇、增加脑血管通透性的药物例如依托泊苷或血管活性试剂如白三烯或利用导管通过对流增强输送法(CED)进行动脉内输送。另外，可能希望将所述组合物局部施用到需要治疗的区域；这可以例如通过在手术过程中通过注射、利用导管、或者利用植入物进行局部输注来实现，所述植入物是孔隙性的或者非孔隙性的，或者是胶状材料，包括膜，例如硅橡胶膜或者纤维。适当的膜有(EisaiInc.)。
非病毒方法也可以用于将治疗剂导入至需要调节细胞死亡的细胞(例如，患者的细胞)。例如，可以在存在脂质转染法(Feigner等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：7413，1987；Ono等，NeuroscienceLetters17：259，1990；Brigham等，Am.J.Med.Sci.298：278，1989；Staubinger等，MethodsinEnzymology101：512，1983)、缺乏唾液酸基的血清粘蛋白-多赖氨酸偶联法(asialoorosomucoid-polylysineconjugation)(Wu等，JournalofBiologicalChemistry263：14621，1988；Wu等，JournalofBiologicalChemistry264：16985，1989)、或者通过在手术条件下进行的微注射(Wolff等，Science247：1465，1990)的情况下通过施用核酸分子来将核酸分子导入到细胞中。优选的是，将所述核酸与脂质体和鱼精蛋白结合施用。
也可以使用涉及体外转染的非病毒方法实现基因转移。这些方法包括磷酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔和原生质体融合的使用。脂质体还可能潜在地有利于将DNA输送到细胞中。还可以通过将正常核酸转移到可离体培养的细胞类型(例如，自体或者异种原发细胞或者其子代细胞)来实现将融合蛋白移植到患者的受影响的组织中，然后将细胞(或者其后代细胞)注射到目标组织中。
用于多核苷酸治疗方法的cDNA表达可以由任何适当的启动子(例如，人类巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)或金属硫蛋白启动子)指导，而且可以受任何适当的哺乳动物调控元件调控。例如，如果需要，可以使用已知优先指导细胞在特定细胞类型中表达的增强子来指导核酸的表达。所使用的增强子可以包括但不限于，那些被定性为组织或细胞特异性的增强子的那些增强子。作为选择，如果基因组克隆被用作治疗构建体，调控可以由同源调控序列进行介导，或者如果需要的话，通过源自于异种来源的调控序列，包括上述的任意启动子或者调控元件进行介导。
本发明将在如下实施例中进行进一步的描述。
实施例
实施例1
这个实施例描述环状排列的IL-4蛋白的制备。
将IL-4的编码序列设计成将被重新组织，从而产生新的氨基末端和新的羧基末端。选择重新组织的位点并且通过合成方式形成或者使用自然序列作为模板形成编码区。PCR可以被用来扩增分离的序列编码区，并且分离的片段的5′和3′端被设计成重叠，从而允许形成新的编码序列的信息，其中新产生的肽可以例如编码在天然蛋白中可能曾经是第40个氨基酸的第一氨基酸。制备环状排列的配体的具体例子在美国专利No.6,011,002中有提供。
使用如下序列作为参比序列。
实施例2
使用标准技术制备cpIL-4-BAD并且使用cpIL4-PE作为参比在体外表达IL-4Rα的癌细胞和无胸腺裸小鼠模型中的IL-4Rα阳性异种移植肿瘤上进行测试。结果表明，cpIL-4-BAD有效杀死癌症细胞并且使肿瘤减退。
更具体地说，cpIL-4-BAD融合蛋白通过使用在pET24a表达载体(图1)中的嵌合质粒cpIL-4BAD转导BL21(DE3)pLysS细菌进行制备。将新鲜转换的细菌铺板在含有卡那霉素的LB上。挑取菌落并且将其转移到1升的富含葡萄糖、MgCl2和卡那霉素的超级肉汤中，并且使用1mMIPTG诱导细胞。监测细胞生长6小时。将IL-4-BAD融合蛋白重新折叠并且使用HiTrap柱纯化，然后经过两个循环的MonoS柱，此后通过SDS-PAGE电泳评价cpIL-4-BAD级分。这个策略在pH为6.5时获得了约0.980mg/L的cpIL-4BAD，并且在pH为6.8时获得了约2.930mg/L的cpIL-4BAD。
将IL-4Rα阳性肿瘤细胞(U251细胞和Daudi细胞)按一式四份铺板在6孔陪替氏培养皿的完全培养基中过夜。添加0.1至1000ng/mL的cpIL-4BAD，并且将平板在CO2培养箱中于37℃培养5天。在第5天，使用1XPBS洗涤平板，并且采用胰蛋白酶处理使细胞分离。经过胰蛋白酶失活后，使用台盼蓝排阻技术(trypanblueexclusiontechnique)对活细胞进行计数。
结果表明，cpIL-4BAD融合蛋白在体外以浓度依赖方式杀死了U251细胞，IC50值为约0.6ng/mL(图2)。100倍过量的IL-4阻断了cpIL-4BAD杀死U251细胞的能力，表明cpIL-4BAD活性具有特异性(图3)。而且，在5天的细胞活力分析中，IC50值从约0.3ng/mL增加至>1000ng/mL。
cpIL-4BAD融合蛋白在体外以浓度依赖方式杀死了Daudi细胞IC50值为约0.1ng/mL(图4)。100倍过量的IL-4也阻断了cpIL-4BAD杀死Daudi细胞的能力，表明cpIL-4BAD活性具有特异性(图5)。在5天的细胞活性分析中，IC50值从约0.3ng/mL增加至>1000ng/mL。
在菌落形成分析中还发现，cpIL-4BAD融合蛋白降低了IL-4Rα阳性肿瘤细胞的菌落数量。更具体地说，5000U251的细胞被铺板在10cm培养板(总共6板)上，添加cpIL-4BAD并将细胞培养10天。使用水晶蓝(CrystalBlue)对菌落进行染色并计数。结果表明，cpIL-4BAD在体外以浓度依赖方式降低了U251菌落数量，且IC50值为约5ng/mL(图6)。
在使用U251肿瘤细胞形成皮下神经胶质瘤肿瘤之后，在无胸腺小鼠中评价了cpIL-4BAD融合蛋白的有效性。更具体地说，以100μg/kg肿瘤内(IT)注射(注射6次)和以100μg/kg腹膜内(IP)注射(注射6次)cpIL-4BAD。使用0.2％HAS/PBS作为媒介物对照。所评价的端点是肿瘤尺寸和存活。结果表明，6次注射后，IT施用cpIL-4BAD与安慰剂对照处理动物相比显著地使肿瘤生长减退。IP施用与IT处理小鼠相比强烈地使肿瘤减退。两组小鼠的肿瘤都超过40天才复发，出于道德原因而对对照组的小鼠实施安乐死，因为肿瘤在36天时具有2000mm3(图7)。cpIL-4BAD-处理小鼠的存活也长于安慰剂处理小鼠(图8)。
实施例3
在相同的实验条件下测试了6个另外的IL-4Rα阳性细胞系对cpIL-4BAD融合蛋白和cpIL-4PE的敏感性。通过使用台盼蓝排阻技术对细胞进行计数来确定IC50值。
表3.IL-4Rα阳性细胞系的IC50值。
实施例4
表达并纯化IL-4BAD，cpIL-4BAD和cpS4-BAD融合蛋白。更具体地说，通过PCR将IL-4BAD，cpIL-4BAD和cpS4-BAD的cDNA克隆到pGW07大肠杆菌表达载体的BamFII/XhoI位点(图9)。通过DNA测序证实所得的载体(图10A-D)。
在大肠杆菌细胞中进行蛋白表达。将IL-4BAD，cpIL-4BAD和cpS4-BAD蛋白以非溶性形式表达在1L培养物中，使用IMAC在变性条件下对它们进行纯化，然后进行“快速稀释”蛋白重新折叠。通过“快速稀释”进行重新折叠产生没有凝聚物的完整蛋白，如通过非还原性SDS-PAGE所确定的那样。最终的样品量和浓度如下：IL-4BAD为约3.5mL，0.24mg/mL，根据UV280nm(UV280nmAbs，1mg/ml＝1.14)测定；cpIL-4BAD为约3.5mL，0.23mg/mL，根据UV280nm(UV280nmAbs，1mg/mL＝1.13)测定；并且cpS4-BAD为约3.5mL，0.23mg/mL，根据UV280nm(UV280nmAbs，1mg/ml＝1.25)测定。将蛋白保存在如下保存缓冲组合物中：500nMNaCL，l0mMNa-磷酸盐，pH7.0，1％甘油，1μΜEDTA，0.01％吐温20(Tween20)。
BL21(DE3)pLysS-RARE2细胞使用IL-4BAD、cpIL-4BAD和cpS4-BAD蛋白表达构建体进行转化，并且将它们铺板在补充有100μg/mL的Amp的LB板上并在37℃过夜。第二天，从培养板刮下菌落并且将它们重新悬浮在含有100μg/mL的Amp的液体LB培养基中。然后让培养物在37℃生长并通风，并且在细胞培养物的OD600达到约0.5时使用1mMIPTG诱导蛋白表达。诱导在30℃持续约4小时。然后收集细胞沉淀并且保存在-20℃。通过在95℃在50μL的还原性蛋白上样缓冲液中煮沸10分钟将10μl的非诱导和诱导的培养物样品裂解，并在SDS-PAGE凝胶上进行电泳。来自诱导后4小时时收集的1mL样品的细胞在低渗缓冲液中裂解，超声处理并在13,000rpm离心10分钟。在还原性蛋白上样缓冲液中煮沸来自可溶性和非溶性级分的等分试样并在SDS-PAGE凝胶上对它们进行分析。所估测的IL-4BAD、cpIL-4BAD蛋白的表达水平为大于50mg/L粗制材料。所估测的cpS4-BAD的表达水平为大于50mg/L。发现IL-4BAD几乎是完全不可溶的，带有一些可能可溶形式(小于5％)。cpS4-BAD主要在不可溶性级分中。
在室温裂解来自诱导培养物的细胞沉淀，并且收集内涵体级分(inclusionbodiesfraction)并使用PBS-T洗涤。将不可溶性物质溶解在8M尿素中并结合至3mL镍载树脂(Ni-chargedresin)。所述树脂使用15CV的洗涤缓冲液洗涤，并且将所结合的蛋白在洗涤缓冲液中的8CV步梯度咪唑洗脱液中进行洗脱。将7.5μl的各个级分在SDS-PAGE凝胶上进行分析。将含有最大量的IL-4BAD(约6mg)和cpIL-4BAD(约8mg)的级分合并并进行重新折叠。剩下的级分在-20℃保存。
合并IL-4BAD和cpIL-4BAD级分，通过添加1mMDTT进行还原，并且在保存缓冲液(150mMNaCl、10mMHEPES(pH7.4)、0.01％Tween20)中进行缓慢的逐步透析，且在每次改变透析缓冲液时补充浓度逐渐减小的尿素。在每次透析步骤之后通过紫外光分光光度计测量蛋白浓度：IL-4BAD为约0.8mg，而cpIL-4BAD为约0.45mg。然后将样品在SDS-PAGE凝胶上进行分析。
将25μL的每种蛋白(约0.6mg/mL、200mM咪唑级分)稀释在1mL的如下缓冲液中：20mMHEPES(pH7.4)、1％甘油、10μΜEDTA、0.01％Tween(缓冲液1)；10mMNa-磷酸盐(pH7.0)、1％甘油、10μΜEDTA、0.01％Tween(缓冲液2)；和PBS(pH7.2)(缓冲液3)。将样品在室温保存过夜。第二天，将样品在13,000rpm旋转10分钟，观测到每个样品中沉淀的存在并记录在表2中：(+++)表示丰富的沉淀；(-)表示没有可见沉淀。
表2：在缓冲液1、2、和3中的IL-4BAD和cpIL-4BAD沉淀。
还在非还原性SDS-PAGE凝胶上分析样品。使用Amicon10kDaMWCO将重新折叠的样品浓缩至100μL，旋转沉降，并且将每个样品的7.5μL的等分试样在SDS-PAGE凝胶上电泳。
使用快速稀释折叠重复纯化过程。将含有IL-4BAD、cpIL-4BAD或者cpS4-BAD的4ml的200mM咪唑级分快速稀释在200mL的重新折叠缓冲液(500mMNaCl、10mMNa-磷酸盐(pH7.0或者6.0或者7.8)、1％甘油、10μΜEDTA、0.01％Tween)中，在室温诱导过夜，在4,000rpm在4℃旋转沉降20分钟，使用Amicon10kDaMWCO浓缩至3mL，并且使用DG-10柱缓冲交换至保存缓冲液(500mMNaCl、10mMNa-磷酸盐(pH7.0或者6.0或者7.8)、1％甘油、1μΜEDTA、0.01％Tween)中。最终的样品浓度如下：3.5mL的IL-4BAD，约0.24mg/mL；3.5mL的cpIL-4BAD，约0.23mg/mL。将最终的样品在SDS-PAGE凝胶上电泳。
cpS4-BAD的最终浓度为约3.5mL，约0.23mg/mL。将最终的样品在SDS-PAGE凝胶上电泳。
实施例5
pKFR4-BAD-H6融合蛋白(图11A-B)制备如下：通过PCR将的pKFR4-BAD-H6的cDNA克隆到pET-21a(+)载体的Ndel/Xhol位点。然后将所述载体转化到HMS174(DE3)细胞中并使用0.1mMIPTG诱导3小时。在诱导之前和诱导之后将样品在SDS-PAGE凝胶上电泳。使细胞沉淀并且通过在含有20mMTris-HCl、300mMNaCl、20mM咪唑(pH8.0)的缓冲液中进行超声处理来裂解，并将样品在SDS-PAGE凝胶上电泳。
将内涵体(Inclusionbodies)溶解在溶解缓冲液(20mMTris-HCl、300mMNaCl、20mM咪唑、20mMβ-ME、7MGuaHCl、pH8.0)中。然后利用Ni2+亲和色谱法对上清液进行纯化。在还原和非还原条件下使用20mMTris-HCl、300mMNaCl、300mM咪唑、8M尿素(pH8.0)对pKFR4-BAD-H6进行洗脱。在整个纯化过程中获取样品。
纯化之后，将pKFR4-BAD-H6按如下方式在透析缓冲液中进行透析：0.1％TFA、30％乙腈，在还原性条件和非还原性条件下，获得约2.67mg/mL的浓度。
实施例6
为了评价融合蛋白对表达IL-4R的细胞系的效力，将表达I型IL-4R的HH悬浮细胞培养在含有10％FBS(来自LifeTechnologies)、2mML-谷氨酰胺(来自Gibco)和10mMHEPES(来自Gibco)的RPMI1640(来自Gibco)中。添加cpS4-BAD到细胞悬浮液中。以约1X104细胞/孔的量将所述细胞悬浮液倒入到96孔分离板中。将所述细胞悬浮液在5％CO2培养箱在37℃培养48小时。在48小时培养结束之前，制备在完全培养基中的100μCi/mL的[3H]-胸腺嘧啶，并且将10μL添加至每个孔的培养基中。使用[3H]-胸腺嘧啶培养6小时之后，将50μL的50％三氯乙酸缓慢添加至每个孔中并且在4℃培养2小时。然后使用去离子水(dH2O)将孔板洗涤5次并进行空气干燥。将100μL的闪烁液添加到每个孔中并将孔板于室温放置过夜。第二天，在MicroBetaTrilux上读取放射活性。收集数据并且使用来自对照孔(只有细胞)的读数进行标准化。从所有孔的读数减去背景读数(空白)并计算抑制作用(抑制％)。cpS4-BAD的IC50为约126.3ng/mL，比用作参比的MDNA55(cpIL4-PE；362.4ng/mL)的效力大约3倍。
在此通过参引方式将所有引用文献并入本文。
已经就一个或者多个实施方式对本发明进行了说明。但是，本领域技术人员应当理解的是，可以进行很多变化和改进而没有脱离根据权利要求书所限定的范围。

Claims (29)

1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含白介素-4(IL-4)受体结合蛋白和促凋亡Bcl-2家族多肽。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述IL-4受体结合蛋白是环状排列的(cp)。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中，所述促凋亡Bcl-2家族多肽包含BH3域。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中，包含BH3域的所述促凋亡Bcl-2家族多肽是Bad、Bik/Nbk、Bid、Bim/Bod、Hrk、Bak或者Bax。
5.根据权利要求3或4所述的融合蛋白，其中，包含BH3域的所述促凋亡Bcl-2家族多肽进一步包含降低磷酸化的突变。
6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，进一步包含降低磷酸化的突变的包含BH3域的所述促凋亡Bcl-2家族多肽是Bad多肽。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白能够促进表达IL-4受体(IL-4R)的靶细胞的细胞死亡或者凋亡、抑制细胞存活、或者抑制细胞增殖。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的融合蛋白，其中，所述IL-4受体结合蛋白是对与I型或II型IL-4R的结合具有选择性的突变型IL-4或者IL-13。
9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中，对与II型IL-4R的结合具有选择性的所述突变型IL-4包含KFR变体或者KF变体，或者对与I型IL-4R的结合具有选择性的所述突变型IL-4包含RGA变体。
10.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中，所述突变型IL-13包含Al1变体或者DN变体。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的融合蛋白，所述融合蛋白进一步包含接头。
12.根据权利要求11所述的融合蛋白，其中，所述接头具有序列GS或者是泛素或者泛素变体分子。
13.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQIDNO：24至27中任一个的氨基酸序列。
14.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白。
15.一种核酸分子，所述核酸分子包含SEQIDNO：35至38中任一个的核酸序列。
16.一种载体，所述载体包含权利要求14或15所述的核酸分子。
17.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求16所述的载体。
18.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白、权利要求14或15所述的核酸分子、权利要求16所述的载体、或者权利要求17所述的宿主细胞。
19.一种诱导细胞死亡的方法，所述方法包括向需要的受试者施用：权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白、权利要求14或15所述的核酸分子、权利要求16所述的载体、或者权利要求17所述的宿主细胞。
20.一种诱导细胞死亡的方法，所述方法包括使表达IL-4R的靶细胞与权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白、权利要求14或15所述的核酸分子、或者权利要求16所述的载体接触。
21.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向需要的受试者施用：权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白、权利要求14或15所述的核酸分子、权利要求16所述的载体、或者权利要求17所述的宿主细胞。
22.一种治疗癌症的方法，所述方法包括使表达IL-4R的赘生性细胞与权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白、权利要求14或15所述的核酸分子、或者权利要求16所述的载体接触。
23.一种治疗癌症的方法，所述方法包括使在需要的受试者中的肿瘤微环境中表达IL-4R的非恶性细胞与权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白、权利要求14或15所述的核酸分子、权利要求16所述的载体、或者权利要求17所述的宿主细胞接触。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述非恶性细胞在所述受试者开始治疗之前接触。
25.一种治疗过度增生性或者分化性紊乱的方法，所述方法包括向需要的受试者施用：权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白、权利要求14或15所述的核酸分子、权利要求16所述的载体、或者权利要求17所述的宿主细胞。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述过度增生性或者分化性紊乱是纤维化症或增生症、炎性疾病或自身免疫疾病。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述纤维化症或增生症是肺纤维化症或增生症(例如良性前列腺增生症)、心肌纤维化症、或者肝纤维化症；所述炎性疾病是前列腺炎、春季型角膜结膜炎、动脉粥样硬化症或特发性肺炎；所述自身免疫疾病是格雷夫氏症。
28.权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白、权利要求14或15所述的核酸分子、权利要求16所述的载体、或者权利要求17所述的宿主细胞用于在需要的患者中诱导细胞死亡、或者治疗癌症、或者治疗过度增生性或者分化性紊乱的应用。
29.根据权利要求19、21、23至27所述的方法或者权利要求28所述的应用，其中，所述受试者是人类。
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3049445A4 (en) * 2013-09-24 2017-10-25 Medicenna Therapeutics, Inc. Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
CA2925417C (en) * 2013-09-24 2023-10-24 Fahar Merchant Interleukin-4 receptor-binding fusion proteins and uses thereof
EA201692025A1 (ru) 2014-05-21 2017-05-31 Университет Базель Доставка белков, осуществляемая на основе бактерий
KR101741594B1 (ko) * 2015-06-30 2017-05-30 경북대학교 산학협력단 암세포 및 종양관련 대식세포를 동시에 표적하는 융합 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 및 암 전이 억제용 약학적 조성물
WO2017001568A1 (en) 2015-07-01 2017-01-05 Universitat De Lleida Treatment and prevention of amyotrophic lateral sclerosis
US20190119357A1 (en) * 2015-07-23 2019-04-25 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof
SI3377634T1 (sl) 2015-11-19 2021-01-29 Universitaet Basel Dostava na bakterijah osnovanih proteinov
US11166987B2 (en) 2015-11-19 2021-11-09 Universitaet Basel Virulence attenuated bacteria for treatment of malignant solid tumors
BR112019012338A2 (pt) 2016-12-20 2019-11-26 Univ Basel liberação de proteína à base de bactérias de virulência atenuada
CN109503715B (zh) * 2017-09-15 2023-12-15 科济生物医药（上海）有限公司 Il-4r的融合蛋白及其应用
CN114457024A (zh) * 2020-10-30 2022-05-10 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达IL-4Rα阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用
WO2023170475A2 (en) * 2022-03-08 2023-09-14 Medicenna Therapeutics, Inc. Uses and methods for il-2, il-13, and il-4 cytokine bifunctional molecules

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6011002A (en) * 1994-04-08 2000-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Circularly permuted ligands and circularly permuted chimeric molecules
US6737511B1 (en) * 1999-08-16 2004-05-18 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Receptor-mediated uptake of an extracellular BCL-xL fusion protein inhibits apoptosis
US20100183545A1 (en) * 2008-10-14 2010-07-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Targeted cargo protein combination therapy
WO2012139112A1 (en) * 2011-04-08 2012-10-11 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Ubiquitin fusions for improving the efficacy of cytosolic acting targeted toxins
WO2013112871A1 (en) * 2012-01-27 2013-08-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Therapeutic il-13 polypeptides

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5501959A (en) 1989-01-17 1996-03-26 Alamar Biosciences Laboratory, Inc. Antibiotic and cytotoxic drug susceptibility assays using resazurin and poising agents
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
AU5010793A (en) 1992-08-21 1994-03-15 Schering Corporation Human interleukin-13
DE4423131A1 (de) 1994-07-01 1996-01-04 Bayer Ag Neue hIL-4-Mutantenproteine als Antagonisten oder partielle Agonisten des humanen Interleukin 4
FR2742156A1 (fr) 1995-12-06 1997-06-13 Sanofi Sa Polypeptide recepteur de l'il-13
US6335426B1 (en) 1996-06-14 2002-01-01 Bayer Corporation T-cell selective interleukin-4 agonists
US6028176A (en) 1996-07-19 2000-02-22 Bayer Corporation High-affinity interleukin-4 muteins
US6410046B1 (en) 1996-11-19 2002-06-25 Intrabrain International Nv Administering pharmaceuticals to the mammalian central nervous system
JP4505166B2 (ja) * 1999-09-09 2010-07-21 シェーリング コーポレイション 哺乳動物インターロイキン−１２ｐ４０およびインターロイキンｂ３０、その組成物、抗体、薬学的組成物における使用
CA2386248A1 (en) 1999-10-06 2001-04-12 The Penn State Research Foundation Il13 mutants
CA2404763A1 (en) 1999-11-11 2001-05-17 Raj K. Puri Mutated il-13 molecules and their uses
GB0004016D0 (en) 2000-02-22 2000-04-12 Royal Brompton Hospital Biological material and uses thereof
DE60142479D1 (de) 2000-08-30 2010-08-12 Penn State Res Found Aminosäureaustauschmutanten von interleukin 13
US7087224B2 (en) 2000-10-31 2006-08-08 Amgen Inc. Method of treating anemia by administering IL-1ra
US20030091640A1 (en) 2001-02-08 2003-05-15 Srinivasan Ramanathan Enhanced oral and transcompartmental delivery of therapeutic or diagnostic agents
IL159215A0 (en) 2001-06-07 2004-06-01 Wyeth Corp A solution of interleukin-13 and methods utilizing the same
US20040248260A1 (en) 2001-10-26 2004-12-09 Heavner George A. IL-13 mutein proteins, antibodies, compositions, methods and uses
US20050027110A1 (en) 2003-07-24 2005-02-03 Michael Russell Drug delivery in the nervous system
JP2008526889A (ja) 2005-01-10 2008-07-24 リサーチ ディベロップメント ファウンデーション 癌治療のための標的化キメラ分子
AU2006347606B2 (en) * 2005-09-09 2012-10-11 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods and compositions for inhibiting cell death or enhancing cell proliferation
WO2007048019A2 (en) 2005-10-20 2007-04-26 The Penn State Research Foundation Delivery system for diagnostic and therapeutic agents
WO2008101671A2 (en) * 2007-02-19 2008-08-28 Apogenix Gmbh Il-4 fc fusion proteins
JP2010536386A (ja) * 2007-08-24 2010-12-02 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ 受容体標的化試薬
CN102112144A (zh) * 2008-05-16 2011-06-29 拜耳医药保健有限公司 靶向性凝固因子及其使用方法
US20110171219A1 (en) * 2008-09-19 2011-07-14 Fahar Merchant Treating cancer stem cells using targeted cargo proteins
SG171733A1 (en) * 2008-11-26 2011-07-28 Glaxo Group Ltd Ligands that bind il-13
US20110023680A1 (en) 2009-07-30 2011-02-03 Kuo-Chung Wang Pcb cutter module with detachable cutters
WO2011106779A1 (en) 2010-02-26 2011-09-01 Aerovance Inc. Use of modified il-4 mutien receptor antagonists to treat dermatitis
AU2011316786A1 (en) * 2010-10-22 2013-05-02 Protox Therapeutics Corp. Use of human serum albumin to decrease antigenicity of therapeutic proteins
CA2925417C (en) * 2013-09-24 2023-10-24 Fahar Merchant Interleukin-4 receptor-binding fusion proteins and uses thereof

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6011002A (en) * 1994-04-08 2000-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Circularly permuted ligands and circularly permuted chimeric molecules
US6737511B1 (en) * 1999-08-16 2004-05-18 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Receptor-mediated uptake of an extracellular BCL-xL fusion protein inhibits apoptosis
US20100183545A1 (en) * 2008-10-14 2010-07-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Targeted cargo protein combination therapy
WO2012139112A1 (en) * 2011-04-08 2012-10-11 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Ubiquitin fusions for improving the efficacy of cytosolic acting targeted toxins
WO2013112871A1 (en) * 2012-01-27 2013-08-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Therapeutic il-13 polypeptides

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BATES，D.L.等: "Chain A，Interleukin 4", 《GENBANK DATABASE》 *
JUNTTILA I S, CREUSOT R J, MORAGA I, ET AL.: "Redirecting cell-type specific cytokine responses with engineered interleukin-4 superkines", 《NATURE CHEMICAL BIOLOGY》 *
TONI Y.REYNOLDS等: "Genetic Instability Induced by the Tumor Microenvironment", 《CANCER REARCH》 *
刘新民: "《中华医学百科大辞海 内科学（第一卷）》", 31 July 2008, 军事医学科学出版社 *
潘建平，邵传森: "《医学免疫学》", 31 August 2006, 浙江大学出版社 *
胡杨: "《运动分子生物学》", 31 March 2013, 北京体育大学出版社 *

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