CN105713937B - 一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法 - Google Patents
一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，该方法包括以下步骤：⑴将西兰花毛状根接种于液体培养基，经增殖培养后冷冻干燥并研磨成粉末，得到冻干的毛状根粉末；⑵将新收获的芥籽粉碎后经超声波振荡提取、抽滤除杂，得到粗酶液；⑶冻干的毛状根粉末中加入粗酶液，经酶解、超声波振荡提取后真空抽滤除杂，得到萝卜硫素粗提液；⑷将萝卜硫素粗提液浓缩后萃取，得到乙酸乙酯相A；⑸将液体培养基萃取，得到乙酸乙酯相B；⑹合并乙酸乙酯相A与乙酸乙酯相B后经真空浓缩、溶解，得到萝卜硫素甲醇溶液；⑺萝卜硫素甲醇溶液真空浓缩，即得萝卜硫素粗提物；⑻萝卜硫素膏状粗提物干燥，即得纯度为5~30%的萝卜硫素粗品。本发明简单，高效。
Description
技术领域
本发明涉及一种萝卜硫素的获取方法，尤其涉及一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法。
背景技术
西兰花中含有丰富的抗癌物质萝卜硫素，被美国《时代周刊》评为十大最佳营养蔬菜之一。西兰花可以增强机体免疫力、促进生长、增强血管韧性等功效，可以预防患乳腺癌、胃癌等癌症的风险。西兰花种子与幼苗中的萝卜硫素含量低，但毛状根培养体系中萝卜硫素的产量高。
目前，萝卜硫素制备方法主要有化学合成法和酶法。化学合成法工艺复杂，中间产物难以控制；酶法是目前常用的萝卜硫素制备方法。但西兰花毛状根培养体系中萝卜硫素的提取鲜有报道，对萝卜硫素的提取大多数都集中在西兰花幼苗、花蕾、种子中，且未有西兰花毛状根中萝卜硫素外分泌的研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简单、高效的从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，包括以下步骤：
⑴将西兰花毛状根按接种量为鲜重0.1g接种于300mL的液体培养基进行培养，15d后得到增殖培养的西兰花毛状根；然后于超净工作台上，用灭菌后的镊子取出所述液体培养基中所述培养后的西兰花毛状根，置于滤纸上，吸附根表面水分，经冷冻干燥至恒重后研磨成粉末，得到冻干的毛状根粉末；同时，所述液体培养基封口置于4℃条件下保存；
⑵将新收获的芥籽粉碎至55~65目，得到芥籽粉；该芥籽粉用蒸馏水经超声波振荡提取后真空抽滤除杂，得到粗酶液；
⑶将所述冻干的毛状根粉末按照1g：10mL~1g：30mL加入粗酶液，搅拌均匀，于35℃下静置酶解0.5~1.5h，然后用体积浓度为70~95%的乙醇经超声波振荡提取后真空抽滤除杂，得到萝卜硫素粗提液；
⑷将所述萝卜硫素粗提液先于45~55℃真空浓缩，再于65℃浓缩，得到膏状物A；所述膏状物A用其质量3~5倍的乙酸乙酯溶解后经蒸馏水萃取2~3次，得到乙酸乙酯相A；
⑸将所述步骤⑴中的液体培养基与乙酸乙酯按1：1~3的体积比萃取2~3次，得到乙酸乙酯相B；
⑹将所述乙酸乙酯相A与所述乙酸乙酯相B合并后，在50~60℃下真空浓缩，得到膏状物B，该膏状物用其质量5~10倍的甲醇溶解，得到萝卜硫素甲醇溶液，该萝卜硫素甲醇溶液于-10℃下避光保存备用；
⑺将所述萝卜硫素甲醇溶液于40~50℃真空浓缩至膏状，即得萝卜硫素粗提物；
⑻所述萝卜硫素膏状粗提物经冷冻干燥至恒重，即得纯度为5~30%的萝卜硫素粗品。
所述液体培养基均指MS基本培养基。
所述步骤⑴与所述步骤⑻中冷冻干燥的条件均是指先对材料进行预冷冻，待温度达到-35~-45℃时抽真空，待压力达到25~35Pa开始加热；从-35至0℃，每5℃为一个阶段，每阶段控温加热0.5~1.5h，最后在5℃控温加热1~3h即可。
所述步骤⑵中超声波振荡提取的条件是指料液比为1g：55~65mL，温度为30~40℃，超声波功率为700~900W，提取时间为8~12min。
所述步骤⑶中超声波振荡提取的条件是指冻干的毛状根粉末与乙醇的料液比为1g：15~30mL，温度为30~40℃，超声波功率为700~900W，提取时间为15~45min。
所述步骤⑷和所述步骤⑹及所述步骤⑺中真空浓缩的条件均是指真空度为-0.06~-0.08MPa。
所述步骤⑷中乙酸乙酯与蒸馏水的体积比为1：1~3。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明合并提取毛状根及其液体培养基中的萝卜硫素，且毛状根培养基中含有大量的萝卜硫素，填补了萝卜硫素的分泌性研究空白。
2、本发明接种量为鲜重0.1g接种于300mL的液体MS培养基中培养一个周期（15d）的西兰花毛状根培养体系中萝卜硫素收获量可达3~6.25mg，毛状根生物量可达4.5~5g。
3、本发明投资少，工艺简单，适合工厂化生产。
具体实施方式
实施例1 一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，包括以下步骤：
⑴将西兰花毛状根按接种量为鲜重0.1g接种于300mL的液体培养基进行培养，15d后得到增殖培养后的西兰花毛状根；然后于超净工作台上，用灭菌后的镊子取出液体培养基中培养后的西兰花毛状根，置于滤纸上，吸附根表面水分，经冷冻干燥至恒重后研磨成粉末，得到冻干的毛状根粉末；同时，液体培养基封口置于4℃条件下保存。
其中：冷冻干燥的条件是指先对材料进行预冻，待温度达到-35℃时抽真空，待压力达到25Pa开始加热；从-35至0℃，每5℃为一个阶段，每阶段控温加热0.5h，最后在5℃控温加热1h即可。
⑵将新收获的芥籽粉碎至55目，得到芥籽粉；该芥籽粉用蒸馏水以1g：55mL的料液比在温度为30℃、超声波功率为700W的条件下经超声波振荡提取8min后真空抽滤除杂，得到粗酶液。
⑶将冻干的毛状根粉末按照1g：10mL加入粗酶液，搅拌均匀，于35℃下静置酶解0.5h，然后用体积浓度为70%的乙醇经超声波振荡提取后真空抽滤除杂，得到萝卜硫素粗提液。
其中：超声波振荡提取的条件是指冻干的毛状根粉末与乙醇的料液比为1g：15mL，温度为30℃，超声波功率为700W，提取时间为15min。
⑷将萝卜硫素粗提液先于45℃、真空度为-0.06MPa条件下真空浓缩（除去大部分乙醇），再于65℃浓缩，得到膏状物A（完全除去乙醇）；膏状物A用其质量3倍的乙酸乙酯溶解后经蒸馏水萃取2次，得到乙酸乙酯相A。
其中：乙酸乙酯与蒸馏水的体积比为1 mL：1 mL。
⑸将步骤⑴中的液体培养基与乙酸乙酯按1 mL：1 mL的体积比萃取2次，得到乙酸乙酯相B。
⑹将乙酸乙酯相A与乙酸乙酯相B合并后，在50℃、真空度为-0.06MPa条件下真空浓缩，得到膏状物B，该膏状物用其质量5倍的甲醇溶解，得到萝卜硫素甲醇溶液，该萝卜硫素甲醇溶液于-10℃下避光保存备用。
⑺将萝卜硫素甲醇溶液于40℃、真空度为-0.06MPa条件下真空浓缩至膏状，即得萝卜硫素粗提物。
⑻萝卜硫素膏状粗提物经冷冻干燥至恒重，即得纯度为5%的萝卜硫素粗品。
其中：冷冻干燥的条件同步骤⑴。
实施例2 一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，包括以下步骤：
⑴将西兰花毛状根按接种量为鲜重0.1g接种于300mL的液体培养基进行培养，15d后得到增殖培养后的西兰花毛状根；然后于超净工作台上，用灭菌后的镊子取出液体培养基中培养后的西兰花毛状根，置于滤纸上，吸附根表面水分，经冷冻干燥至恒重后研磨成粉末，得到冻干的毛状根粉末；同时，液体培养基封口置于4℃条件下保存。
其中：冷冻干燥的条件是指先对材料进行预冻，待温度达到-40℃时抽真空，待压力达到30Pa开始加热；从-35至0℃，每5℃为一个阶段，每阶段控温加热1h，最后在5℃控温加热2h即可。
⑵将新收获的芥籽粉碎至65目，得到芥籽粉；该芥籽粉用蒸馏水以1g： 65mL的料液比在温度为40℃、超声波功率为900W的条件下经超声波振荡提取12min后真空抽滤除杂，得到粗酶液。
⑶将冻干的毛状根粉末按照1g：30mL加入粗酶液，搅拌均匀，于35℃下静置酶解1.5h，然后用体积浓度为95%的乙醇经超声波振荡提取后真空抽滤除杂，得到萝卜硫素粗提液。
其中：超声波振荡提取的条件是指冻干的毛状根粉末与乙醇的料液比为1g：30mL，温度为40℃，超声波功率为900W，提取时间为45min。
⑷将萝卜硫素粗提液先于55℃、真空度为-0.08MPa条件下真空浓缩（除去大部分乙醇），再于65℃浓缩，得到膏状物A（完全除去乙醇）；膏状物A用其质量5倍的乙酸乙酯溶解后经蒸馏水萃取3次，得到乙酸乙酯相A。
其中：乙酸乙酯与蒸馏水的体积比为1 mL：3 mL。
⑸将步骤⑴中的液体培养基与乙酸乙酯按1 mL：3 mL的体积比萃取2次，得到乙酸乙酯相B。
⑹将乙酸乙酯相A与乙酸乙酯相B合并后，在60℃、真空度为-0.08MPa条件下真空浓缩，得到膏状物B，该膏状物用其质量10倍的甲醇溶解，得到萝卜硫素甲醇溶液，该萝卜硫素甲醇溶液于-10℃下避光保存备用。
⑺将萝卜硫素甲醇溶液于50℃、真空度为-0.08MPa条件下真空浓缩至膏状，即得萝卜硫素粗提物。
⑻萝卜硫素膏状粗提物经冷冻干燥至恒重，即得纯度为20%的萝卜硫素粗品。
其中：冷冻干燥的条件同步骤⑴。
实施例3 一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，包括以下步骤：
⑴将西兰花毛状根按接种量为鲜重0.1g接种于300mL的液体培养基进行培养，15d后得到增殖培养后的西兰花毛状根；然后于超净工作台上，用灭菌后的镊子取出液体培养基中培养后的西兰花毛状根，置于滤纸上，吸附根表面水分，经冷冻干燥至恒重后研磨成粉末，得到冻干的毛状根粉末；同时，液体培养基封口置于4℃条件下保存。
其中：冷冻干燥的条件是指先对材料进行预冻，待温度达到-45℃时抽真空，待压力达到35Pa开始加热；从-35至0℃，每5℃为一个阶段，每阶段控温加热1.5h，最后在5℃控温加热3h即可。
⑵将新收获的芥籽粉碎至60目，得到芥籽粉；该芥籽粉用蒸馏水以1g：60mL的料液比在温度为35℃、超声波功率为800W的条件下经超声波振荡提取10min后真空抽滤除杂，得到粗酶液。
⑶将冻干的毛状根粉末按照1g：20mL加入粗酶液，搅拌均匀，于35℃下静置酶解1h，然后用体积浓度为85%的乙醇经超声波振荡提取后真空抽滤除杂，得到萝卜硫素粗提液。
其中：超声波振荡提取的条件是指冻干的毛状根粉末与乙醇的料液比为1g：25mL，温度为35℃，超声波功率为800W，提取时间为30min。
⑷将萝卜硫素粗提液先于50℃、真空度为-0.07MPa条件下真空浓缩（除去大部分乙醇），再于65℃浓缩，得到膏状物A（完全除去乙醇）；膏状物A用其质量4倍的乙酸乙酯溶解后经蒸馏水萃取2次，得到乙酸乙酯相A。
其中：乙酸乙酯与蒸馏水的体积比为1 mL：2 mL。
⑸将步骤⑴中的液体培养基与乙酸乙酯按1 mL：2 mL的体积比萃取3次，得到乙酸乙酯相B。
⑹将乙酸乙酯相A与乙酸乙酯相B合并后，在55℃、真空度为-0.07MPa条件下真空浓缩，得到膏状物B，该膏状物用其质量8倍的甲醇溶解，得到萝卜硫素甲醇溶液，该萝卜硫素甲醇溶液于-10℃下避光保存备用。
⑺将萝卜硫素甲醇溶液于45℃、真空度为-0.07MPa条件下真空浓缩至膏状，即得萝卜硫素粗提物。
⑻萝卜硫素膏状粗提物经冷冻干燥至恒重，即得纯度为30%的萝卜硫素粗品。
其中：冷冻干燥的条件同步骤⑴。
上述实施例1~3中的液体培养基均指MS基本培养基。
Claims (6)
1.一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，包括以下步骤：
⑴将西兰花毛状根按接种量为鲜重0.1g接种于300mL的液体培养基进行培养，15d后得到增殖培养的西兰花毛状根；然后于超净工作台上，用灭菌后的镊子取出所述液体培养基中所述培养后的西兰花毛状根，置于滤纸上，吸附根表面水分，经冷冻干燥至恒重后研磨成粉末，得到冻干的毛状根粉末；同时，所述液体培养基封口置于4℃条件下保存；所述冷冻干燥的条件均是指先对材料进行预冷冻，待温度达到-35~-45℃时抽真空，待压力达到25~35Pa开始加热；从-35至0℃，每5℃为一个阶段，每阶段控温加热0.5~1.5h，最后在5℃控温加热1~3h即可；
⑵将新收获的芥籽粉碎至55~65目，得到芥籽粉；该芥籽粉用蒸馏水经超声波振荡提取后真空抽滤除杂，得到粗酶液；
⑶将所述冻干的毛状根粉末按照1g：10mL~1g：30mL加入粗酶液，搅拌均匀，于35℃下静置酶解0.5~1.5h，然后用体积浓度为70~95%的乙醇经超声波振荡提取后真空抽滤除杂，得到萝卜硫素粗提液；
⑷将所述萝卜硫素粗提液先于45~55℃真空浓缩，再于65℃浓缩，得到膏状物A；所述膏状物A用其质量3~5倍的乙酸乙酯溶解后经蒸馏水萃取2~3次，得到乙酸乙酯相A；
⑸将所述步骤⑴中的液体培养基与乙酸乙酯按1：1~3的体积比萃取2~3次，得到乙酸乙酯相B；
⑹将所述乙酸乙酯相A与所述乙酸乙酯相B合并后，在50~60℃下真空浓缩，得到膏状物B，该膏状物用其质量5~10倍的甲醇溶解，得到萝卜硫素甲醇溶液，该萝卜硫素甲醇溶液于-10℃下避光保存备用；
⑺将所述萝卜硫素甲醇溶液于40~50℃真空浓缩至膏状，即得萝卜硫素粗提物；
⑻所述萝卜硫素膏状粗提物经冷冻干燥至恒重，即得纯度为5~30%的萝卜硫素粗品；所述冷冻干燥的条件均是指先对材料进行预冷冻，待温度达到-35~-45℃时抽真空，待压力达到25~35Pa开始加热；从-35至0℃，每5℃为一个阶段，每阶段控温加热0.5~1.5h，最后在5℃控温加热1~3h即可。
2.如权利要求1所述的一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，其特征在于：所述液体培养基均指MS基本培养基。
3.如权利要求1所述的一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，其特征在于：所述步骤⑵中超声波振荡提取的条件是指料液比为1g：55~65mL，温度为30~40℃，超声波功率为700~900W，提取时间为8~12min。
4.如权利要求1所述的一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，其特征在于：所述步骤⑶中超声波振荡提取的条件是指冻干的毛状根粉末与乙醇的料液比为1g：15~30mL，温度为30~40℃，超声波功率为700~900W，提取时间为15~45min。
5.如权利要求1所述的一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，其特征在于：所述步骤⑷和所述步骤⑹及所述步骤⑺中真空浓缩的条件均是指真空度为-0.06~-0.08MPa。
6.如权利要求1所述的一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，其特征在于：所述步骤⑷中乙酸乙酯与蒸馏水的体积比为1：1~3。
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