CN105713837B - 一种高产多糖小球藻种的分离方法 - Google Patents

一种高产多糖小球藻种的分离方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105713837B
CN105713837B CN201510084371.7A CN201510084371A CN105713837B CN 105713837 B CN105713837 B CN 105713837B CN 201510084371 A CN201510084371 A CN 201510084371A CN 105713837 B CN105713837 B CN 105713837B
Authority
CN
China
Prior art keywords
algae
chlorella
hpsc
culture
chlorella vulgaris
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510084371.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105713837A (zh
Inventor
汪凡越
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201510084371.7A priority Critical patent/CN105713837B/zh
Publication of CN105713837A publication Critical patent/CN105713837A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105713837B publication Critical patent/CN105713837B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明涉及经济微藻研究与开发应用，旨在提供一种分离高产多糖小球藻种的方法。该方法是在Basal培养液中加入甘油、鼠李糖和维生素C配制成高产多糖小球藻种的培养液HPSC‑M；从野生铁皮石斛茎上分离附生藻，并经高温干燥环境下进行压力筛选，获得高产多糖的小球藻。本发明方法与传统选育方法相比，具有操作简便、成本低、对操作人员的专业技术无特殊要求、应用性强等优点，可为小球藻育种等提供必要的技术方法。

Description

一种高产多糖小球藻种的分离方法
技术领域
本发明涉及经济微藻研究与开发应用的技术，特别涉及高产多糖小球藻种的分离方法。
背景技术
小球藻(Chlorella)是一类分布广、生长快，其在全球培植与应用规模最大的经济微藻之一。多糖是小球藻的重要生物活性成分之一，具有调节机体免疫能力、抗肿瘤、抗病毒和抗衰老等显著功效。但生物活性多糖一般都属次生代谢产物，在生物体内的含量普遍较低、生产成本偏高，严重制约着其深入研究和进一步的推广应用。邵斌等[高产多糖小球藻新品系选育及其对南美白对虾的促生长和免疫调节作用.核农学报.2013，27(2)：167～172]利用诱发突变等技术育成了多糖含量达25.3％、比其亲本高70.9％的高产多糖小球藻新品系Chl-ZN5-M2，并已实现规模化应用。为进一步降低小球藻多糖的生产成本、推进其商业化进程，迫切需要建立多糖含量更高的小球藻种的选育方法。
发明内容
本发明要解决的问题是，克服现有技术中的不足，目的是提供一种高产多糖小球藻种的分离方法。所述的高产多糖小球藻种，是指多糖含量比目前多糖含量最高达25.3％的小球藻种Chl-ZN5-M2[邵斌等.高产多糖小球藻新品系选育及其对南美白对虾的促生长和免疫调节作用.核农学报.2013，27(2)：167～172]的至少高30％的小球藻种。
为解决技术问题，本发明的方案是：
提供一种高产多糖小球藻种的分离方法，包括以下步骤：
(1)在1L的Basal培养液[陈峰，姜悦 主编.微藻生物技术.中国轻工业出版社，1999，P 61]中，依次加入1.5ml甘油、2g鼠李糖、0.5g维生素C，充分搅拌溶解，配制成高产多糖小球藻种的培养液，记为HPSC-M；
(2)用浸蘸HPSC-M的棉签轻拭野生新鲜铁皮石斛茎上的藻斑，尔后将棉球放入盛有5ml HPSC-M的50ml烧杯中润洗，重复轻拭-润洗10次，直至烧杯中的藻液呈淡绿色，并用100目的尼龙筛绢过滤；
(3)将滤得的藻液置恒温光照培养箱中培养，温度30℃，光照60μmol·m-2·s-1，待藻液在分光光度计波长560nm处的光密度OD560达0.8时，用HPSC-M稀释使OD560至0.2，在上述条件下继续放大培养，如此反复，直至OD560达0.8的藻液达100ml；
(4)将上述OD560达0.8的藻液转入高速离心机的离心管中以8000～12000rpm的转速离心10-15min，小心倾去上清液后即得藻泥；
(5)将上述藻泥均匀涂于直径为7cm的玻璃培养皿中，置于温度为45℃、相对湿度RH为20％、光照强度60μmol·m-2·s-1的人工光照气候箱中处理12d后，取出并用100ml的HPSC-M润洗后转入250ml的三角瓶中置于温度30℃、光照60μmol·m-2·s-1的恒温光照培养箱，过10d后发现变绿，取样于显微镜下观察发现野生铁皮石斛附生藻中的部分藻能恢复生长；
(6)取5ml步骤(5)中恢复生长的藻液，用100目的尼龙筛绢过滤，滤液用HPSC-M稀释至OD560约为0.1；
(7)在超净工作台中，将经115℃高压灭菌25min后的含1％琼脂粉的HPSC-M倒入培养皿中制成固体平板，取30μl步骤(6)中稀释后的藻液均匀涂布于平板上，正面放置10min后倒置培养于温度30℃、光照60μmol·m-2·s-1的恒温光照培养箱中，观察平板上藻的生长情况；
(8)约一周后可见平板上有藻落长出，在超净工作台中用接种针挑取圆形的单藻落转接至装有0.5mL HPSC-M的1.5mL离心管中，置于温度30℃、光强60μmol·m-2·s-1的恒温光照培养箱中培养，观察离心管中藻的生长情况；
(9)当藻液较绿时，取少许于载玻片上作显微观察，并依据培养物的形状学特征鉴别是否为小球藻的纯培养物；若未获得小球藻的纯培养物，可挑较纯的藻落再涂布平板分离，直至获得小球藻纯培养物；
(10)对获得的小球藻纯培养物在温度30℃、光强60μmol·m-2·s-1下培养，当OD560达0.8时加入HPSC-M稀释至OD560为0.2，逐级进行扩大培养；
(11)将获得的纯小球藻种按步骤(10)培养OD560达0.8的藻液约1L，转入高速离心机的离心管中以8000～12000rpm的转速离心10-15min，小心倾去上清液，藻泥用100ml重蒸水润洗后，再离心，反复3次；
(12)将步骤(11)中洗净的藻泥置于80℃恒温箱中烘至恒重，用硫酸-苯酚法[何照范等编著.保健食品化学及其检测技术.中国轻工业出版社.1999，P：70-71]测定所分离小球藻种的多糖含量。
作为一种改进，所述在高速离心机上的离心速率为10000rpm，离心时间为10min。
本发明的有益效果在于：
本发明研制高产多糖小球藻培养液HPSC-M含甘油、鼠李糖和维生素C，其渗透压、抗氧化性和营养价值均高于仅以无机元素配制的Basal培养液，以适应高多糖小球藻种离体液体培养的需要；以将初步分离的野生铁皮石斛附生藻置于高温干燥环境下进行压力筛选，可获得高多糖含量的附生藻。这种方法具有操作简便、成本低、对操作人员的专业技术无特殊要求、应用性强等优点。
具体实施方式
本发明的技术方案可以通过以下步骤实现。
实例1：
选用样本材料：野生新鲜铁皮石斛(Dendrobium candid Wall.Ex Lindl.)采自云南思茅，可到云南思茅采集，也可于每年5-10月份在杭州凤起花鸟市场、杭州吴山广场花鸟市场等市场购买。
试剂和仪器：本发明中所用的培养液成分均为国产分析纯。CH-30光学显微镜为日本OLYMPUS生产；Ultrospec 2000型紫外-可见分光光度计为美国Pharmacia公司生产；TE214S型电子天平为北京赛多利斯生产；TGL-16A高速离心机为长沙平凡仪器仪表公司生产。
高产多糖小球藻种的分离方法，包括以下步骤：
(1)在1L的Basal培养液中，依次加入1.5ml甘油、2g鼠李糖、0.5g维生素C，充分搅拌溶解，配制成高产多糖小球藻种的培养液，记为HPSC-M；
(2)用浸蘸HPSC-M的棉签轻拭采自云南思茅野生新鲜铁皮石斛茎上的藻斑，尔后将棉球放入盛有5ml HPSC-M的50ml烧杯中润洗，重复轻拭-润洗10次，直至烧杯中的藻液呈淡绿色，并用100目的尼龙筛绢过滤；
(3)将滤得的藻液置恒温光照培养箱中培养，温度30℃，光照60μmol·m-2·s-1，待藻液在分光光度计波长560nm处的光密度OD560达0.8时，用HPSC-M稀释使OD560至0.2，在上述条件下继续放大培养，如此反复，直至OD560达0.8的藻液达100ml；
(4)将上述OD560达0.8的藻液转入高速离心机的离心管中以10000rpm的转速离心10min，小心倾去上清液后即得藻泥；
(5)将上述藻泥均匀涂于直径为7cm的玻璃培养皿中，置于温度为45℃、相对湿度RH为20％、光照强度60μmol·m-2·s-1的人工光照气候箱中处理12d后，取出并用100ml的HPSC-M润洗后转入250ml的三角瓶中置于温度30℃、光照60μmol·m-2·s-1的恒温光照培养箱，过10d后发现变绿，取样于显微镜下观察发现野生铁皮石斛附生藻中的部分藻能恢复生长；
(6)取5ml步骤(5)中恢复生长的藻液，用100目的尼龙筛绢过滤，滤液用HPSC-M稀释至OD560约为0.1；
(7)在超净工作台中，将经115℃高压灭菌25min后的含1％琼脂粉的HPSC-M倒入培养皿中制成固体平板，取30μl步骤(6)中稀释后的藻液均匀涂布于平板上，正面放置10min后倒置培养于温度30℃、光照60μmol·m-2·s-1的恒温光照培养箱中，观察平板上藻的生长情况；
(8)约一周后可见平板上有藻落长出，在超净工作台中用接种针挑取圆形的单藻落转接至装有0.5mL HPSC-M的1.5mL离心管中，置于温度30℃、光强60μmol·m-2·s-1的恒温光照培养箱中培养，观察离心管中藻的生长情况；
(9)当藻液较绿时，取少许于载玻片上作显微观察，并依据培养物的形状学特征鉴别是否为小球藻的纯培养物；若未获得小球藻的纯培养物，可挑较纯的藻落再涂布平板分离，直至获得小球藻纯培养物；
(10)对获得的小球藻纯培养物在温度30℃、光强60μmol·m-2·s-1下培养，当OD560达0.8时加入HPSC-M稀释至OD560为0.2，逐级进行扩大培养；
(11)将获得的纯小球藻种按步骤(10)培养OD560达0.8的藻液约1L，转入高速离心机的离心管中以10000rpm的转速离心10min，小心倾去上清液，藻泥用100ml重蒸水润洗后，再离心，反复3次；
(12)将步骤(11)中洗净的藻泥置于80℃恒温箱中烘至恒重，用硫酸-苯酚法测得所分离到的3个小球藻纯种的多糖含量依次为36.4％、37.1％和36.9％，比目前多糖含量最高达25.3％的小球藻种Chl-ZN5-M2的至少高43.9％。
实例2：选取采自浙江雁荡山的野生铁皮石斛(Dendrobium candid Wall.ExLindl.)为样本，利用本发明的方法从其茎上分离到的2个小球藻纯种的多糖含量分别为35.7％和36.3％，比目前多糖含量最高达25.3％的小球藻种Chl-ZN5-M2的至少高41.1％。
实例3：选取采自福建武夷山的野生铁皮石斛(Dendrobium candid Wall.ExLindl.)为样本，利用本发明的方法从其茎上分离到的4个小球藻纯种的多糖含量依次为38.1％、37.4％、38.9％和36.8％，比目前多糖含量最高达25.3％的小球藻种Chl-ZN5-M2的至少高45.5％。

Claims (2)

1.一种高产多糖小球藻种的分离方法，包括以下步骤：
(1)在1L的Basal培养液中，依次加入1.5ml甘油、2g鼠李糖、0.5g维生素C，充分搅拌溶解，配制成高产多糖小球藻种的培养液，记为HPSC-M；
(2)用浸蘸HPSC-M的棉签轻拭野生新鲜铁皮石斛茎上的藻斑，尔后将棉球放入盛有5mlHPSC-M的50ml烧杯中润洗，重复轻拭-润洗10次，直至烧杯中的藻液呈淡绿色，并用100目的尼龙筛绢过滤；
(3)将滤得的藻液置恒温光照培养箱中培养，温度30℃，光照60μmol·m-2·s-1，待藻液在分光光度计波长560nm处的光密度OD560达0.8时，用HPSC-M稀释使OD560至0.2，在上述条件下继续放大培养，如此反复，直至OD560达0.8的藻液达100ml；
(4)将上述OD560达0.8的藻液转入高速离心机的离心管中以8000～12000rpm的转速离心10-15min，小心倾去上清液后即得藻泥；
(5)将上述藻泥均匀涂于直径为7cm的玻璃培养皿中，置于温度为45℃、相对湿度RH为20％、光照强度60μmol·m-2·s-1的人工光照气候箱中处理12d后，取出并用100ml的HPSC-M润洗后转入250ml的三角瓶中置于温度30℃、光照60μmol·m-2·s-1的恒温光照培养箱，过10d后发现变绿，取样于显微镜下观察发现野生铁皮石斛附生藻中的部分藻能恢复生长；
(6)取5ml步骤(5)中恢复生长的藻液，用100目的尼龙筛绢过滤，滤液用HPSC-M稀释至OD560约为0.1；
(7)在超净工作台中，将经115℃高压灭菌25min后的含1％琼脂粉的HPSC-M倒入培养皿中制成固体平板，取30μl步骤(6)中稀释后的藻液均匀涂布于平板上，正面放置10min后倒置培养于温度30℃、光照60μmol·m-2·s-1的恒温光照培养箱中，观察平板上藻的生长情况；
(8)约一周后可见平板上有藻落长出，在超净工作台中用接种针挑取圆形的单藻落转接至装有0.5mL HPSC-M的1.5mL离心管中，置于温度30℃、光强60μmol·m-2·s-1的恒温光照培养箱中培养，观察离心管中藻的生长情况；
(9)当藻液较绿时，取少许于载玻片上作显微观察，并依据培养物的形状学特征鉴别是否为小球藻的纯培养物；若未获得小球藻的纯培养物，可挑较纯的藻落再涂布平板分离，直至获得小球藻纯培养物；
(10)对获得的小球藻纯培养物在温度30℃、光强60μmol·m-2·s-1下培养，当OD560达0.8时加入HPSC-M稀释至OD560为0.2，逐级进行扩大培养；
(11)将获得的纯小球藻种按步骤(10)培养OD560达0.8的藻液约1L，转入高速离心机的离心管中以8000～12000rpm的转速离心10-15min，小心倾去上清液，藻泥用100ml重蒸水润洗后，再离心，反复3次；
(12)将步骤(11)中洗净的藻泥置于80℃恒温箱中烘至恒重，用硫酸-苯酚法检验所分离小球藻种的高产多糖特性，所述的高产多糖小球藻种，是指多糖含量比目前多糖含量最高达25.3％的小球藻种Chl-ZN5-M2的至少高30％的小球藻种。
2.根据权利要求1所述高产多糖小球藻种的分离方法，其特征在于，所述在高速离心机上的离心速率为10000rpm，离心时间为10min。
CN201510084371.7A 2015-02-15 2015-02-15 一种高产多糖小球藻种的分离方法 Active CN105713837B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510084371.7A CN105713837B (zh) 2015-02-15 2015-02-15 一种高产多糖小球藻种的分离方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510084371.7A CN105713837B (zh) 2015-02-15 2015-02-15 一种高产多糖小球藻种的分离方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105713837A CN105713837A (zh) 2016-06-29
CN105713837B true CN105713837B (zh) 2019-02-15

Family

ID=56144715

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510084371.7A Active CN105713837B (zh) 2015-02-15 2015-02-15 一种高产多糖小球藻种的分离方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105713837B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111675772B (zh) * 2020-07-28 2020-12-18 广东梵蜜琳生物科技有限公司 一种抑制黑色素合成的天然成分及在化妆品中的应用
CN112680359B (zh) * 2020-12-25 2023-03-31 暨南大学 一种微藻培养基及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009060807A (ja) * 2007-09-04 2009-03-26 Kurorera Kogyo Kk 新規クロレラ及びその製造方法並びにそのクロレラを含有する健康食品
CN102229889A (zh) * 2011-05-31 2011-11-02 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一株小球藻及其培养方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009060807A (ja) * 2007-09-04 2009-03-26 Kurorera Kogyo Kk 新規クロレラ及びその製造方法並びにそのクロレラを含有する健康食品
CN102229889A (zh) * 2011-05-31 2011-11-02 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一株小球藻及其培养方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
高产多糖小球藻新品系选育及其对南美白对虾的促生长和免疫调节作用;邵斌等;《核农学报》;20131231;第27卷(第2期);第0168-0172页

Also Published As

Publication number Publication date
CN105713837A (zh) 2016-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104472342B (zh) 一种用于猕猴桃喷雾授粉法的授粉液及其制备方法
CN104381122B (zh) 一种猕猴桃授粉液及其制备方法
CN102599046A (zh) 一种梨的授粉溶液及其制备方法和应用
CN103392588A (zh) 一种猕猴桃悬浮液喷雾人工授粉方法
CN105340724A (zh) 一种吊瓜种植人工授粉的方法
CN105713837B (zh) 一种高产多糖小球藻种的分离方法
CN110249997A (zh) 适合于猕猴桃液体授粉的花粉悬浮液及其制备方法与应用
CN109164212A (zh) 一种利用离体叶片鉴定月季种质耐热性的测定方法
CN103454229B (zh) 一种宣木瓜适宜采收期的判别方法
CN104542309B (zh) 一种铁皮石斛生根壮苗专用培养基
CN104357532A (zh) 一种快速有效测定甜瓜花粉活力的方法
CN105994266A (zh) 一种猕猴桃喷雾授粉液及其制备方法
CN101569255B (zh) 检测兰科植物种子生活力的方法
CN108834908B (zh) 一种桃花药愈伤组织的诱导和继代保存方法
CN107581061B (zh) 一种油菜种子灌浆期高温耐受性高效筛选鉴定方法
CN110172494A (zh) 一种香水莲花花粉活力的检测方法
CN105533012A (zh) 一种蓝莓保健茶及其制备工艺
CN102703332B (zh) 一株产花生四烯酸油脂的菌株及其应用
CN102217542B (zh) 一种红叶金银木快速繁殖方法
CN108541921A (zh) 一种低温酶解工艺制备脱胶亚麻籽芽粉的方法
CN104351004A (zh) 一种同时提高梨果实中锌和硒含量的方法
CN105706868B (zh) 一种促进人工栽培铁皮石斛生长的方法
CN109287482B (zh) 一种黄栀子组培快繁专用培养基
CN111690708A (zh) 一种猕猴桃离体花粉活力测定方法
CN101946713B (zh) 甜(辣)椒未成熟小孢子直接诱导萌发成植株的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant