CN105713829B - 一种基于多孔金属富集探针的单细胞取样装置及取样方法 - Google Patents

Abstract

一种基于多孔金属富集探针的单细胞取样装置及取样方法，属于单细胞取样技术领域。解决了现有技术中基于毛细管探针的单细胞取样装置及方法，成本高、重复性差、过程繁琐的问题。该取样装置，包括线性控制器、多孔金属富集探针和显微镜；其中，线性控制器由底座、支杆、夹持装置、微分头和固定座组成，多孔金属富集探针具有三维连续的多孔结构且一端为尖端，另一端固定在固定座上，多孔金属富集探针随微分头的测杆沿微分头轴线方向移动，显微镜用于观察待取样组织中的细胞。该单细胞取样装置操作简单方便、重复性好、成本低、效率高，能够实现动植物组织单细胞取样，进而实现单细胞代谢物的快速分析，发现不同细胞间代谢物的差异。

Description

一种基于多孔金属富集探针的单细胞取样装置及取样方法

技术领域

本发明涉及一种基于多孔金属富集探针的单细胞取样装置及取样方法，属于单细胞取样技术领域。

背景技术

单细胞分析技术是通过高灵敏度和高专一性的方法检测单个细胞内痕量代谢物的技术。对于新鲜动植物组织而言，同一块组织中的不同细胞往往具有类似的基因和生长环境。然而，近年来科学家发现，同一块组织的不同细胞，对同一信号的应激反应也可能显著不同，导致细胞内代谢物也可能存在明显的差异。这种单细胞水平的变化与生长、分化、异质性、应激反应、衰老、凋亡、癌变等多种生物学现象相关。因此，研究新鲜动植物组织中单细胞水平的代谢物种类和含量的变化，对于在细胞水平了解多种生物学现象的机制有重要意义。应用于新鲜动植物组织的单细胞分析技术，通常包含单细胞取样技术和单细胞检测技术。单细胞取样技术是指通过特殊的方法从微米级直径的单个细胞内获取微量细胞溶液或目标代谢物的技术。

现有的应用于新鲜动植物组织的单细胞取样方法主要通过将极细的毛细管探针插入单个细胞内的方法来吸取细胞溶液。这不光需要高超的毛细管探针制备技术，还需要可以三维移动的控制器来控制毛细管探针插入细胞内。并使用皮升级的气泵来控制细胞溶液的吸入及排出。复杂的取样过程和探针制备技术增加了单细胞取样的成本和难度。且毛细管探针取样过程中容易发生堵塞。探针重复利用时清洗不便。

综上所述，开发更加方便、快速、廉价、易行的单细胞取样装置和取样方法，是目前本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中基于毛细管探针的单细胞取样装置，成本高、探针不易清洗，基于毛细管探针的单细胞取样方法，过程繁琐的技术问题，提供一种基于多孔金属富集探针的单细胞取样装置及取样方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下。

基于多孔金属富集探针的单细胞取样装置，包括线性控制器、多孔金属富集探针和显微镜；

所述线性控制器由底座、支杆、夹持装置、微分头和固定座组成，所述支杆固定在底座上，所述夹持装置的一端固定在支杆上，另一端夹持微分头，夹持装置用于调整多孔金属富集探针与载玻片的角度，所述微分头用于控制多孔金属富集探针插入目标细胞的深度和时间，所述固定座与微分头的测杆连接；

所述多孔金属富集探针具有三维连续的多孔结构且一端为尖端，另一端固定在固定座上，多孔金属富集探针随微分头的测杆沿微分头轴线方向移动，多孔金属富集探针的直径为30-3000μm，尖端的直径为1-20μm；

所述显微镜用于观察待取样组织中的细胞，待取样组织置于显微镜的载玻片上。

进一步的，所述夹持装置夹持微分头的安装套。

进一步的，所述多孔金属富集探针通过以下方法制备：

步骤一、取由活泼金属和不活泼金属组成的合金金属丝，所述合金金属丝中不活泼金属的质量百分数为20-60％，直径为30-3000μm；

步骤二、在合金金属丝的一端切割出直径为1-20μm的尖端；

步骤三、采用化学腐蚀的方法腐蚀掉合金金属丝中的活泼金属，不活泼金属自发形成三维连续的多孔结构，得到多孔金属富集探针。

进一步的，所述步骤三采用化学腐蚀的方法腐蚀掉合金金属丝中的活泼金属时，同时在合金金属丝上施加电压，进行电化学辅助腐蚀。

进一步的，所述不活泼金属为铂、金、钯中的一种，活泼金属为银、铜、锌、镍、锰、铝中的一种或多种按任意比例混合；

或者，所述不活泼金属为钛，活泼金属为铜、锌、镍、锰、铝中的一种或多种按任意比例混合；

或者，所述不活泼金属为铜，活泼金属为锌、镍、锰、铝中的一种或多种按任意比例混合。

上述基于多孔金属富集探针的单细胞取样装置的取样方法，包括以下步骤：

步骤一、调整夹持装置使多孔金属富集探针与显微镜的载玻片成30-60度夹角；

步骤二、将待取样组织置于显微镜的载玻片上，通过显微镜物镜观察待取样组织的细胞，选取一个目标细胞；

步骤三、旋转微分头使多孔金属富集探针插入目标细胞，停留至多孔金属富集探针达到富集平衡，再次旋转微分头拔出多孔金属富集探针，完成单细胞取样。

进一步的，所述取样方法还包括对单细胞取样的分析过程，是将固定座从微分头的测杆上取下，使用体积为0.1-2μL的基质溶液清洗多孔金属富集探针的尖端后，采用MALDI-MS或者nano ESI对洗涤液进行分析。

进一步的，在步骤三之前，还包括，在显微镜的视野范围内，保证多孔金属富集探针与显微镜的载玻片成30-60度夹角下，移动显微镜的载物台，使多孔金属富集探针的尖端靠近待取样组织。

进一步的，所述步骤三中，停留时间为20s以上；更进一步的，停留时间为20-180s。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明的单细胞取样装置可以直接对新鲜动植物组织取样，操作简单方便、重复性好，且成本低，仅需数百元即可完成装置的搭建，远低于三维控制器和皮升泵万元以上的价格，效率高，完成一次单细胞分析仅需数分钟。其中，多孔金属富集探针可通过腐蚀廉价的合金金属丝制备，相比于微米级别尖端的毛细管探针具备制备工艺简单，造价低廉的优点，成本远低于现有装置；多孔金属富集探针表面具有三维连续多孔结构，可增强探针对代谢物的富集作用，多孔金属富集探针比处理前富集能力增加25-60倍，大幅度提高了单细胞分析的灵敏度，解决了实心探针(金属丝探针)在单细胞分析时取样量不足的问题，且不存在毛细管探针的堵塞问题；多孔金属富集探针在使用后，可以依次在稀 硫酸、甲醇、水中洗涤后，真空干燥，重复使用，相比于毛细管探针需要依靠皮升泵泵入和泵出洗涤液的方式来清洗，简便快捷。夹具控制微分头与载玻片的夹角，微分头控制探针插入目标细胞的深度和时间，两者配合既能够控制探针插入目标细胞，又不需要毛细管探针的三维控制器，进一步节省了装置成本。

2、本发明的单细胞取样方法简单，快速，廉价，重复性强，灵敏度高，大大降低了动植物组织单细胞分析的门槛，能够实现动植物组织单细胞取样，进而实现单细胞代谢物的快速分析，发现不同细胞间代谢物的差异。

附图说明

图1为本发明多孔金属富集探针的制备流程图；

图2中，(a)为本发明的单细胞取样装置的结构示意图，(b)为(a)的局部放大图；

图3中，(a)-(c)分别为实施例1的锌铜合金金属丝未腐蚀前的不同倍率的电镜图，(d)-(f)分别为实施例1的锌铜合金金属丝在腐蚀液中腐蚀15h后的不同倍率的电镜图；

图4中，(a)为实施例1的锌铜合金金属丝插入寡糖溶液后的洗涤液的质谱图，(b)为实施例1的多孔金属富集探针插入浓度为锌铜合金金属丝插入的寡糖溶液的浓度的1/25后的洗涤液的质谱图；

图5为本发明实施例2的洋葱内表皮取样的质谱图；

图6为本发明实施例3的洋葱外表皮取样的质谱图；

图中，1、线性控制器，2、多孔金属富集探针，11、底座，12、支杆，13、夹持装置，14、微分头，15、固定座，3、显微镜，31、载玻片，32、物镜。

具体实施方式

为了进一步了解本发明，下面结合具体实施方式对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。

如图1-3所示，本发明的基于多孔金属富集探针的单细胞取样装置，包括线 性控制器1、多孔金属富集探针2和显微镜3。其中，线性控制器1主要由底座11、支杆12、夹持装置13、微分头14和固定座15组成；底座11放置在取样台上，结构没有特殊限制；支杆12的底端固定在底座11上；夹持装置13一端固定在支杆12上，另一端夹持微分头14的安装套，夹持装置13控制多孔金属富集探针2插入目标细胞(待取样组织的单细胞)的角度，为操作简便，夹持装置13可以为普通夹具；微分头14没有特殊限制，现有技术中的微分头14都能使用，微分头14控制多孔金属富集探针2插入目标细胞的深度和时间，固定座15用于固定多孔金属富集探针2，固定座15与微分头14的测杆连接，能够安装在测杆上，也能够从测杆上拆下。多孔金属富集探针2具有为三维连续的多孔结构且一端为尖端，另一端固定在固定座15上，多孔金属富集探针2随测杆沿微分头14轴线方向移动，多孔金属富集探针2的直径为30-3000μm，尖端的直径为1-20μm，长度没有特殊限制，依据实际使用需要设置即可，一般可以为1-3cm，具备机械强度，保证在取样过程中不会弯曲。显微镜3用于观察待取样组织中的细胞。待取样组织置于显微镜3的载玻片31上。

上述多孔金属富集探针2可以通过以下方法制备：

步骤一、取由活泼金属和不活泼金属组成且直径为30-3000μm的合金金属丝；

其中，活泼金属与不活泼金属是相对而言的，待腐蚀掉的金属即为活泼金属，形成多孔金属富集探针2的金属为不活泼金属，没有特殊限制，本领域技术人员能够根据需要进行选择。活泼金属与不活泼金属都可以为一种也可以为多种，通常，不活泼金属采用单一种类，如不活泼金属选择铂、金、钯中的一种，活泼金属选择银、铜、锌、镍、锰、铝中的一种或多种按任意比例混合；或者，不活泼金属选择钛，活泼金属选择铜、锌、镍、锰、铝中的一种或多种按任意比例混合；或者，不活泼金属选择铜，活泼金属选择锌、镍、锰、铝中的一种或多种按任意比例混合。不活泼金属的质量百分数需要达到20-60％。

步骤二、在合金金属丝的一端切割出直径为1-20μm尖端。

步骤三、采用化学腐蚀的方法腐蚀掉合金金属丝中的活泼金属，剩余的不活泼金属会自发形成三维连续的多孔结构，得到多孔金属富集探针2；

本领域技术人员能够根据需要腐蚀的活泼金属选择化学腐蚀的腐蚀液；如当活泼金属为银或铜时，腐蚀可以选择在氧化性酸中进行；当活泼金属为锌、镍、锰时，腐蚀可以选择在强酸溶液中进行；当活泼金属为铝时，腐蚀可一选择在强酸或强碱中进行；

优选在腐蚀过程中，在合金金属丝上施加电压，进行电化学辅助腐蚀，既能保护不活泼金属，又能够辅助活泼金属组分分解使探针获得更佳的富集能力。

以多孔铜富集探针的制备为例，

述探针的制备过程。先取铜合金金属丝，铜合金金属丝中，铜元素含20-60％，活泼金属为锌、铝、镁、锰、银等活泼金属，可以是一种也可以是多种的混合，将直径约30-3000μm的铜合金金属丝切割成数厘米的小段，再在每小段金属丝的一端切割出一个直径1-20μm的尖端。将切割好的金属丝在强酸溶液中腐蚀，活泼金属会选择性分解，剩余的铜元素可自发形成三维连续的多孔结构，再用超纯水和/或甲醇冲洗后真空干燥，即得多孔铜探针。

上述基于多孔金属富集探针的单细胞取样装置的取样方法，包括以下步骤：

步骤一、调整夹持装置12使多孔金属富集探针2与载玻片31成30-60度夹角，如果角度小于30度，取样时探针会与多个细胞接触，影响检测的准确性，如果角度过大，探针在空间上受显微镜阻碍，无法在微分头14的控制下插入细胞，通常角度越小，探针的比表面积越大，富集能力越好；

步骤二、将待取样组织置于显微镜3的载玻片上，通过显微镜3的物镜32观察待取样组织的细胞，选取一个目标细胞，即确定待取样的单细胞；

其中，待取样的组织来源于具有细胞结构的生物，尤其是多细胞生物，如动物，植物等，待取样的组织一般为薄片，具体厚度没有限制，能够通过显微镜3观察到其细胞就可以；

如果多孔金属富集探针2距离待取样组织的距离较远，可以在显微镜3物镜32的视野范围内，保证多孔金属富集探针2与载玻片31成30-60度夹角下，移动显微镜3的载物台，使多孔金属富集探针2靠近待取样组织；

步骤三、旋转微分头14使多孔金属富集探针2插入待取样的单细胞，停留至多孔金属富集探针2达到富集平衡，一般时间为20s以上，优选20-180s，再 次旋转微分头14拔出多孔金属富集探针2，完成单细胞取样。

还可以继续对上述取样方法得到的单细胞样品进行分析，分析过程是将固定座15从微分头14的侧杆上取下，使用体积为0.1-2μL，优选0.5-1μL的基质溶液清洗多孔金属富集探针2的尖端后，采用MALDI-MS或者nano ESI对洗涤液进行分析，具体分析过程为现有技术，本发明不再赘述。其中，基质溶液为本领域常用试剂，一般可采用浓度为10mg/ml的2,5-二羟基苯甲酸(DHB)。

本发明中评价多孔金属富集探针2的富集效率时，使用腐蚀前、后的探针在相同的条件下分别对一份寡糖溶液的m和n倍稀释液进行取样，获得相似质谱图时的n/m值即为富集倍数。探针孔隙率越高，则富集倍数越大，富集能力越强。

以下结合实施例进一步说明本发明。

实施例1

基于多孔金属富集探针的单细胞取样装置，由线性控制器1、多孔金属富集探针2和显微镜3组成；线性控制器1由底座11、支杆12、夹持装置13、微分头14和固定座15组成，支杆12固定在底座11上，夹持装置13的一端固定在支杆12上，另一端夹持微分头14的安装套，固定座15与微分头14的测杆连接，夹持装置12用于调整多孔金属富集探针2与载玻片31的角度，微分头14用于多孔金属富集探针2插入目标细胞的深度和时间；

多孔金属富集探针2为三维连续的多孔结构且一端为尖端，另一端固定在固定座上，多孔金属富集探针随微分头的测杆沿微分头轴线方向移动，多孔金属富集探针2通过以下方法制备：将直径为0.1mm的锌铜合金金属丝(含质量分数60％的铜和40％的锌)切成3cm的小段，取其中一段并在该段的尖端切割出一个直径约为20μm的尖端；将切割好的金属丝置于腐蚀液(含有0.95M盐酸和0.05M硝酸)中，在37℃的条件下腐蚀15h；

显微镜3用于观察待取样组织中的细胞，待取样组织置于显微镜3的载玻片31上。

图3中，(a)-(c)分别为不同倍率的锌铜合金金属丝未腐蚀前的电镜图，(d)-(f)分别为不同倍率的锌铜合金金属丝在腐蚀液中腐蚀15h后的电镜图。 从图3可以看出，在腐蚀前锌铜合金金属丝表面光滑，在腐蚀后，锌铜合金金属丝表面形成了大量三维连续的孔隙。

将锌铜合金金属丝和多孔金属富集探针插入不同浓度寡糖溶液中，停留120s后取出探针，用0.5μL，10mg/ml的DHB基质溶液清洗探针尖端，将洗涤液进行质谱分析。结果如图4所示，当多孔金属富集探针2插入的寡糖溶液的浓度是锌铜合金金属丝插入的寡糖溶液的浓度的1/25时，两种探针获得了相似的质谱图，说明多孔金属富集探针2富集的样品量是锌铜合金金属富集的样品量的25倍。

实施例2

采用实施例1的单细胞取样装置对洋葱内表皮取样的方法：

步骤一、调整夹持装置13使多孔金属富集探针2与载玻片31成30度夹角；

步骤二、将洋葱内表皮切片置于载玻片31上，通过显微镜3的物镜32观察洋葱内表皮细胞，选取一个细胞作为目标细胞；

步骤三、旋转微分头14使多孔金属富集探针2插入目标细胞，停留120s，再次旋转微分头14拔出多孔金属富集探针2，完成单细胞取样；

将富集了样品的多孔金属富集探针2尖端在1μL 10mg/ml DHB溶液中洗涤后，然后将洗涤液点板后用MALDI-TOF-MS进行分析，结果如图5所示。从图5可以看出，洋葱内表皮细胞中则主要含有寡糖类化合物。

实施例3

采用实施例1的单细胞取样装置对洋葱外表皮取样的方法：

步骤一、调整夹持装置13使多孔金属富集探针2与载玻片31成60度夹角；

步骤二、将洋葱外表皮切片置于载玻片31上，通过显微镜3的物镜32观察洋葱外表皮细胞，选取一个细胞；

步骤三、旋转微分头14使多孔金属富集探针2插入选取的细胞，停留120s，再次旋转微分头14拔出多孔金属富集探针2，完成单细胞取样。

将富集了样品的多孔金属富集探针2尖端在1μL 10mg/ml DHB溶液中洗涤后，然后将洗涤液点板后用MALDI-TOF-MS进行分析，结果如图6所示。从图6可以看出，洋葱外表皮细胞中寡糖类化合物含量较低，但花青素衍生物含量较 高。综合图5和图6，说明本方法可以有效用于单细胞取样和分析，并可发现不同细胞间代谢物的差异。

实施例4

基于多孔金属富集探针的单细胞取样装置，结构与实施例1相同，只是其多孔金属富集探针2通过以下方法制备：将直径为0.03mm的铂铜合金金属丝(含质量分数20％的铂和80％的铜)切成3cm的小段，取其中一段并在该段的尖端切割出一个直径约为1μm的尖端；将切割好的金属丝置于1M硫酸中并在探针上施加1.2V的电压，在室温件下腐蚀2.4h。

将实施例2的铂铜合金金属丝和多孔金属富集探针插入不同浓度寡糖溶液中，停留60s后取出探针，用0.2μL，10mg/ml的DHB基质溶液清洗探针尖端，将洗涤液进行质谱分析。结果发现，当多孔金属富集探针2插入的寡糖溶液的浓度是铂铜合金金属丝插入的寡糖溶液的浓度的1/60时，两种探针获得了相似的质谱图，说明多孔金属富集探针2富集的样品量是锌铜合金金属富集的样品量的60倍。

实施例5

采用实施例4的单细胞取样装置对洋葱外表皮取样的方法：

步骤一、将多孔金属富集探针2安装在固定座15上，调整夹持装置13使多孔金属富集探针2与载玻片31成45度夹角；

步骤二、将洋葱外表皮切片置于载玻片31上，通过显微镜3的物镜32观察洋葱外表皮细胞，选取一个细胞；

步骤三、旋转微分头14使多孔金属富集探针2插入选取的细胞，停留20s，再次旋转微分头14拔出多孔金属富集探针2，完成单细胞取样。

显然，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于所述技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.基于多孔金属富集探针的单细胞取样装置，其特征在于，包括线性控制器、多孔金属富集探针和显微镜；

所述线性控制器由底座、支杆、夹持装置、微分头和固定座组成，所述支杆固定在底座上，所述夹持装置的一端固定在支杆上，另一端夹持微分头，夹持装置用于调整多孔金属富集探针与载玻片的角度，所述微分头用于控制多孔金属富集探针插入目标细胞的深度和时间，所述固定座与微分头的测杆连接；

所述多孔金属富集探针具有三维连续的多孔结构且一端为尖端，另一端固定在固定座上，多孔金属富集探针随微分头的测杆沿微分头轴线方向移动，多孔金属富集探针的直径为30-3000μm，尖端的直径为1-20μm；

所述显微镜用于观察待取样组织中的细胞，待取样组织置于显微镜的载玻片上。

2.根据权利要求1所述的基于多孔金属富集探针的单细胞取样装置，其特征在于，所述夹持装置夹持微分头的安装套。

3.根据权利要求1所述的基于多孔金属富集探针的单细胞取样装置，其特征在于，所述多孔金属富集探针通过以下方法制备：

步骤一、取由活泼金属和不活泼金属组成的合金金属丝，所述合金金属丝中不活泼金属的质量百分数为20-60％，合金金属丝的直径为30-3000μm；

步骤二、在合金金属丝的一端切割出直径为1-20μm的尖端；

步骤三、采用化学腐蚀的方法腐蚀掉合金金属丝中的活泼金属，不活泼金属自发形成三维连续的多孔结构，得到多孔金属富集探针。

4.根据权利要求3所述的基于多孔金属富集探针的单细胞取样装置，其特征在于，所述步骤三采用化学腐蚀的方法腐蚀掉合金金属丝中的活泼金属时，同时在合金金属丝上施加电压，进行电化学辅助腐蚀。

5.根据权利要求3所述的基于多孔金属富集探针的单细胞取样装置，其特征在于，所述不活泼金属为铂、金、钯中的一种，活泼金属为银、铜、锌、镍、锰、铝中的一种或多种按任意比例混合；

或者，所述不活泼金属为钛，活泼金属为铜、锌、镍、锰、铝中的一种或多种按任意比例混合；

或者，所述不活泼金属为铜，活泼金属为锌、镍、锰、铝中的一种或多种按任意比例混合。

6.权利要求1-5任何一项所述的基于多孔金属富集探针的单细胞取样装置的取样方法，包括以下步骤：

步骤一、调整夹持装置使多孔金属富集探针与显微镜的载玻片成30-60度夹角；

步骤二、将待取样组织置于显微镜的载玻片上，通过显微镜观察待取样组织的细胞，选取一个目标细胞；

步骤三、旋转微分头使多孔金属富集探针插入目标细胞，停留至多孔金属富集探针达到富集平衡，再次旋转微分头拔出多孔金属富集探针，完成单细胞取样。

7.根据权利要求6所述的基于多孔金属富集探针的单细胞取样装置的取样方法，其特征在于，所述取样方法还包括对单细胞取样的分析过程，是将固定座从微分头的测杆上取下，使用体积为0.1-2μL的基质溶液清洗多孔金属富集探针的尖端后，采用MALDI-MS或者nano ESI对洗涤液进行分析。

8.根据权利要求6或7所述的基于多孔金属富集探针的单细胞取样装置的取样方法，其特征在于，所述步骤三中，停留时间为20s以上。

9.根据权利要求8所述的基于多孔金属富集探针的单细胞取样装置的取样方法，其特征在于，所述停留时间为20-180s。

10.根据权利要求6或7所述的基于多孔金属富集探针的单细胞取样装置的取样方法，其特征在于，在步骤三之前，还包括，在显微镜的视野范围内，保证多孔金属富集探针与显微镜的载玻片成30-60度夹角下，移动显微镜的载物台，使多孔金属富集探针的尖端靠近待取样组织。