JP2012032402A - パラフィン包埋標本の解析法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】生体試料がパラフィンに包埋された標本を、加熱条件下で、パラフィンと互いに相溶性がある有機溶剤に晒し、前記パラフィンを融解及び前記有機溶剤へ溶解させることによって、前記生体試料を露出させる工程と、前記パラフィンが溶解した有機溶剤と、前記露出した生体試料とを分離することによって、前記標本から前記パラフィンを除去する工程とを含む。
【選択図】図7
Description
今日、病理診断などで用いた数多くのパラフィン包埋生体組織が保存されている。それらから、生体分子の情報を取得することが可能になることは、過去の症例を用いて、診断法、治療法、病理所見、予後などをレトロスペクティブ(retrospective)に検討することを可能にすることであり、疾患の発生病理の研究や新薬の開発などにおいて大きな利点となると認識されている。
近年、生体内での生命現象を視覚的に捉えるために、細胞や生体組織を直接観測するバイオイメージング技術が開発され、発展している。バイオイメージング技術は、生体分子を、生体内での位置情報を保ったまま検出することを可能にする。バイオイメージング技術においては、生体組織標本の薄切片(例えば凍結切片やパラフィン包埋切片など)が試料として用いられる。
顕微鏡法によるイメージングの例として、例えばタンパク質分子などの生体分子を見る場合は、一般的に免疫組織化学的手法が用いられる。この手法においては、例えば、組織切片に含まれる標的の生体分子を、特異抗体を介して標識し、その標識の発色、発光、蛍光等を検出することによってイメージングを行うことが出来る。
質量分析イメージングの例としては、例えば、組織切片に含まれるタンパク質分子を、適宜、消化などの処理を行った後、組織切片表面の複数の位置について質量分析し、組織切片表面の各位置について得られたマススペクトルから画像を構成する。
例えば、Stoeckli, M.; Chaurand, P.; Hallahan, E. D.; Caprioli, M. R. Nature Med. 7, 493-496 (2001)、Chaurand, P.; Schwartz, A. S.; Caprioli, M. R. Anal. Chem., 76, 86A-93A (2004)、及び、Chaurand, P.; Schwartz, A. S.; Billheimer, D.; Xu, J. B; Crecelius, A.; Caprioli, M. R. Anal. Chem., 76, 1145-1155 (2004)などにおいて、凍結生体組織切片をMALDI質量分析に供し、MSスペクトルを取得したことが報告されている。
パラフィン包埋切片を試料とするバイオイメージング技術は、凍結切片を試料とする場合よりも、レトロスペクティブ・スタディ(retrospective study)が可能で汎用性のある病理診断等でも有効であるという点で優れている。
従って、パラフィン包埋切片を用いて質量分析イメージングを行うことが可能になれば、大変有用な技術となる。
このことから、より情報量に優れたマススペクトルを得て、クオリティの高い質量分析イメージングを行うために、パラフィン除去後の生体試料の状態(例えば露出の程度)について、より厳格な条件が課されるべきである点に、本発明者らは着目した。
本発明は、以下の(1)〜(14)を含む。下記(1)〜(7)は、パラフィン包埋標本の脱パラフィン法に向けられ、下記(8)〜(14)は、パラフィン包埋標本の解析法に向けられる。
(1)生体試料がパラフィンに包埋された標本を、加熱条件下で、パラフィンと互いに相溶性がある有機溶剤に晒し、前記パラフィンを融解及び前記有機溶剤へ溶解させることによって、前記生体試料を露出させる工程と、
前記パラフィンが溶解した有機溶剤と、前記露出した生体試料とを分離することによって、前記標本から前記パラフィンを除去する工程と、
を含む、パラフィン包埋標本の脱パラフィン法。
上記(1)において、「相溶性がある」とは、物質同士(具体的には、パラフィンの液体と有機溶剤)が相分離することない程度の溶解性を示すことをいう。また、生体試料の「露出」とは、生体試料がパラフィンに包埋された標本から、パラフィンが溶出して、生体試料が露出することをいう。
(2)前記生体試料を露出させる工程において、前記生体試料がパラフィンに包埋された標本を、加熱された前記有機溶剤中に浸漬及び保持し、
前記パラフィンを除去する工程において、前記有機溶剤中に保持した前記標本を前記有機溶剤から引き上げる、(1)に記載のパラフィン包埋標本の脱パラフィン法。
上記(4)において、アルコール類には、メタノール、イソプロピルアルコールなどが含まれる。
上記(5)の方法は、特に、パラフィン包埋標本からの質量分析を行う場合に、有用な前処理法として用いることが可能になる。
上記(7)において、「薬物動態を解析するための標本」とは、体内動態(吸収、分布、代謝、及び排泄)の観点から薬剤としての可能性を検証・評価するための標本で、具体的には薬物を投与された生体に由来する標本である。
(8)上記(1)〜(7)のいずれかに記載の方法を用いて、生体試料がパラフィンに包埋された標本から前記パラフィンを除去する工程と、
前記生体試料を質量分析装置によって測定する工程と、
を含む、パラフィン包埋標本の解析法。
本発明は、上記(1)〜(7)のいずれかに記載の方法を用いた脱パラフィン処理において加熱を行うため、脱パラフィン後の生体試料に付着していた有機溶剤が、熱により気化する。このため、下記(9)に記載のように、従来、消化処理の前に行われてきた水和処理を行わなくとも、消化処理が可能になる。
(9)前記パラフィンを除去する工程の後、前記質量分析装置によって測定する工程の前に、前記生体試料を消化処理する工程をさらに含む、(8)に記載のパラフィン包埋標本の解析法。
上記(9)に記載の消化処理によって、生体試料中のタンパク質が分解され、より多くのマススペクトルピークを得ることが可能になる。
(10)前記パラフィンを除去する工程の後、前記質量分析装置によって測定する工程の前に、前記生体試料を水和処理する工程をさらに含む、(8)に記載のパラフィン包埋標本の解析法。
上記(10)に記載の水和処理によって、脱パラフィン後に微量に残存しうるパラフィンが効果的に洗い去られ、より多くのマススペクトルピークを得ることが可能になる。
(11)前記パラフィンを除去する工程の後、前記質量分析装置によって測定する工程の前に、前記生体試料を水和処理及び消化処理する工程をさらに含む、(8)に記載のパラフィン包埋標本の解析法。
(12)前記質量分析装置によって測定する工程において、前記質量分析装置として、マトリックス支援レーザー脱離イオン化型質量分析装置を用いる、(8)〜(11)のいずれかに記載のパラフィン包埋標本の解析方法。
上記(13)の方法によって、マトリックスの微小結晶を均一に堆積させることができるため、測定すべき生体分子を効果的にイオン化することが可能になる。
上記(14)の方法によって、生体試料上に、マトリックスの微小結晶を均一に堆積させることができるため、生体試料上における測定すべき生体分子を、安定且つ効率的にイオン化することができ、緻密な位置情報と共にその局在を知ることが可能になる。(また、均一な結晶ができていることの目視確認が不要になるため測定条件の制約が不要になる。)
また、本発明によれば、パラフィン包埋された標本からの質量分析、とりわけ質量分析イメージングを、クオリティ良く行うことが可能な方法を提供することができる。さらに、過去から長期間保存されている病理検体から本発明の方法を用いてデータをとることで、発現タンパク質についてプロファイリングができ、タンパク質の発現パターンと病気との関連付けを行うことが可能になる。
[1−1.パラフィン]
本発明におけるパラフィン包埋標本としては、形態学的、免疫組織化学的および酵素組織化学的解析を含むあらゆる解析において研究ターゲットとなる標本であって、通常パラフィン切片としての形態のものが対象となる。本発明におけるパラフィンは、そのようなあらゆる解析において包埋媒体として用いられるものが含まれる。
上述したように、本発明におけるパラフィン包埋標本としては、形態学的、免疫組織化学的および酵素組織化学的解析を含むあらゆる解析において研究ターゲットとなる標本が対象となる。多くは、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)された生体試料の薄切標本である。従って、当該標本は、いかなる生物に由来するものであっても良い。動物であれば、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類など幅広く許容され、特に哺乳類に由来する標本であることが好ましい。この中でも、マウスやヒトに由来する標本であることがさらに好ましい。また、当該生体の全身標本、臓器標本、組織標本、胚子標本及び細胞標本を問わない。さらに、当該標本が病理検体である場合、当該生体が罹患している疾病としては、癌、アルツハイマー病、パーキンソン病、虚血性脳疾患、虚血性心疾患を問わない。
前記標本は、ガラス製支持体、樹脂製支持体、金属製支持体等の支持体の表面に保持させるか、又は電気的に、樹脂製支持体、例えばメンブレンに転写させておくと良い。メンブレンとしては、ポリビニリデンジフルオリド(PVDF)、ニトロセルロース、ポリアミド、ポリエチレン等の有機合成高分子及びその誘導体を挙げることができる。ポリアミドとしては、ナイロン等が挙げられる。標本を保持或いは転写するためのこれら支持体は、標本を本発明の方法によって脱パラフィン処理した後にどのような解析に供するかによって、当業者が適宜決定することができる。
本発明においては、標本が、電気伝導性支持体の表面に保持されていることが特に好ましい。
[2−1.脱パラフィン操作]
本発明の脱パラフィン法は、生体試料がパラフィンに包埋された標本を、加熱条件下、パラフィンに相溶性がある有機溶剤に晒し、前記パラフィンを融解及び前記有機溶剤へ溶解させることによって、前記生体試料を露出させる工程と;前記パラフィンが溶解した有機溶剤と、前記露出した生体試料とを分離することによって、前記標本から前記パラフィンを除去する工程とを含む。上記の2つの工程は、ステップワイズに行われてもよいし、いちどきに行われても良い。具体的操作の例としては、以下が挙げられる。
この例においては、パラフィン包埋標本を加熱された有機溶剤中に浸漬する前に、あらかじめパラフィン包埋標本を熱してパラフィンを融解させておいても良い。また、加熱された有機溶剤は、温水浴を用いて有機溶剤を加熱することにより用意すると良い。
上記操作を複数回行うことも許容される。
この例においては、パラフィン包埋標本に加熱した有機溶剤をかける前に、あらかじめパラフィン包埋標本を熱してパラフィンを融解させておいても良い。また、加熱された有機溶剤は、温水浴を用いて有機溶剤を加熱することにより用意すると良い。
本発明では、加熱条件ないし温度制御条件としては、パラフィンの融点近辺の温度条件とする。このような温度に設定することにより、パラフィン自体の溶融現象を生じさせることができるため、溶融パラフィンを有機溶剤へ溶解(相溶)させることができる。このため、固体パラフィンを有機溶剤へ溶解させる従来法に比べ、生体試料内に浸透していたパラフィンを効率よく除去することができると考えられる。すなわち、パラフィンに包埋されていた生体試料が、従来に比べてより好ましく露出する。このために、後に生体試料を解析する際に、残存パラフィンの影響が従来に比べて少なくなる。このことは、引き続く生体試料の解析において質量分析法を用いる場合に特に良い結果として現れる。
有機溶剤としては、パラフィンに相溶性がある有機溶剤、より具体的には、パラフィンの液体(すなわち溶融パラフィン)と相分離することない程度の溶解性を示す有機溶剤であれば、特に限定されない。例えば、パラフィン包埋作業において、生体試料中の水分を脱水剤と交換した後、生体試料にパラフィンを浸透させる前に、生体試料内の脱水剤と交換するための中間剤として用いられる有機溶剤を用いることができる。本発明における有機溶剤の例としては、キシレン、クロロホルム、ジエチルエーテル、レモゾール、及びアルコール類(例えばメタノールやイソプロピルアルコールなど)などから選ぶことができる。これらの有機溶剤は、単独で用いてもよいし、2種以上を混合して用いても良い。
上記の本発明の脱パラフィン法によって、パラフィン包埋標本からパラフィンが効果的に除去されるため、それによって得られた生体試料はよく露出している。本発明における脱パラフィン処理時の加熱条件は、当該処理によって得られた生体試料において、生体試料の露出という物理的に好ましい効果だけでなく、それ以外のたとえば生化学的に好ましい効果をもたらしている可能性もある。
本発明の脱パラフィン法が行われて得られた生体試料を解析に供する場合は、必要に応じ、さらに解析のための前処理が当業者によって適宜行われる。そのような処理としては、例えば、消化処理や水和処理などが挙げられる。
本発明の解析法においては、脱パラフィン工程及び質量分析工程の間に、適宜、水和工程及び/又は消化工程がさらに行われて良い。水和工程と消化工程との両方がさらに行われる場合は、水和工程の後に消化工程が行われる。
消化処理を行う場合、その具体的操作及び諸条件は、当業者が適宜決定することができる。例えば、トリプシンなどのタンパク質消化酵素溶液を添加し、湿潤条件下にてインキュベートすることができる。
水和処理を行う場合、その具体的操作及び諸条件は、当業者が適宜決定することができる。通常、上記脱パラフィンに用いた有機溶剤(すなわちパラフィンに相溶性の有機溶剤)と水との両方に相溶性の有機溶剤を用いる。そのような水和処理用の有機溶剤としては、多くは、アルコールが用いられる。具体的には、水和処理用の有機溶剤及びそれに引き続き当該有機溶剤を段階希釈した水溶液を用い、生体試料を水和していくことができる。
本発明の解析法においては、上記脱パラフィン処理を行って得られた生体試料或いは、さらに適宜上記消化処理及び/又は水和処理が行われた生体試料は、質量分析工程に供される。この工程において用いられる質量分析装置としては、マトリックス支援レーザー脱離イオン化型(MALDI)質量分析装置が好ましい。例えば、MSの二乗以上の多段階MSが可能などの点で好ましい装置としては、AXIMA−QIT(島津製作所製)等が挙げられる。MSの二乗以上の多段階MSが可能な質量分析装置を用いることで、測定分子の同定が可能になる。
しかしながら、DHBをマトリックスとして用いる場合は、従来から当業者によって広く用いられていた濃度よりも高濃度で用いることが特に好ましい。例えば、40mg/ml〜飽和濃度、より好ましくは50mg/ml程度とすると良い。当該範囲を下回ると、均一に堆積した結晶ができにくくなる傾向にある。 なお、上記飽和濃度は、作業環境の温度における飽和濃度である。作業環境としては、通常室温といわれる温度であり、具体的には15〜30℃、好ましくは20〜25℃である。
上記の分注操作を、生体試料の一定の範囲にわたって2次元的に行うことによって、標的とする生体分子の質量分布に基づいたイメージング、すなわち質量分析イメージングが可能になる。
マウス脳のパラフィンブロックよりミクロトームで10μm厚の切片を作製し、インヂウムチンオキサイドコーテッドスライドグラス8-12ohms(Aldrich)に張り付け、伸展器(50℃、1時間)で伸展乾燥をした。従来からの脱パラフィン処理として、100%キシレン処理を5分間3回行った。次いで水和処理として、100%エタノール処理を5分間2回、90%エタノール処理を5分間、80%エタノール処理を5分間、70%エタノール処理を5分間、室温で行った後、デシケータ内で乾燥させた。
マウス脳のパラフィンブロックよりミクロトームで10μm厚の切片を作製し、インヂウムチンオキサイドコーテッドスライドグラス8-12ohms(Aldrich)に張り付け、伸展器(50℃、1時間)で伸展乾燥をした。あらかじめ、キシレン入り染色壺をウォーターバスで暖めておき、キシレンの温度が、検討条件として定めた温度になったところで、乾燥したパラフィン切片を染色壺に入れて、10分間静置した。キシレンの温度としては、55℃、60℃、及び65℃の条件を検討した。次いで、水和処理として、100%エタノール処理を5分間2回、90%エタノール処理を5分間、80%エタノール処理を5分間、70%エタノール処理を5分間、室温で行った後、デシケータ内で乾燥させた。
図1に、上記比較例1及び上記実施例1の結果を示す。具体的には、図1は、従来の脱パラフィン法を用いた、パラフィン切片からの質量分析(比較例1)の結果と、本発明の脱パラフィン法(加熱時間:10分)を用いた、パラフィン切片からの質量分析(実施例1)によって得られた結果とを、脱パラフィン時の温度とマススペクトルのピーク数との関係にして示したグラフである。図1においては、横軸に脱パラフィン時の温度(℃)を、縦軸にピーク数(Number of Peaks)を示す。この結果により、加熱を行うことによって、より多数のピーク数が検出されたことが示された。
マウス脳のパラフィンブロックよりミクロトームで10μm厚の切片を作製し、インヂウムチンオキサイドコーテッドスライドグラス8-12ohms(Aldrich)に張り付け、伸展器(50℃、1時間)で伸展乾燥をした。あらかじめ、キシレン入り染色壺をウォーターバスで暖めておき、キシレンの温度が60℃になったところで、乾燥したパラフィン切片を染色壺に入れて、静置した。静置時間としては、5分、10分、15分の条件を検討した。次いで、水和処理として、100%エタノール処理を5分間2回、90%エタノール処理を5分間、80%エタノール処理を5分間、70%エタノール処理を5分間、室温で行った後、デシケータ内で乾燥させた。
図2に、上記実施例2の結果を示す。具体的には、本発明の脱パラフィン法(加熱温度:60℃)を用いた、パラフィン切片からの質量分析(実施例2)の結果を、脱パラフィン時の加熱時間とマススペクトルのピーク数との関係にして示したグラフである。図2においては、横軸に脱パラフィン時の加熱時間(分)を、縦軸にピーク数(Number of Peaks)を示す。
マウス脳のパラフィンブロックよりミクロトームで10μm厚の切片を作製し、インヂウムチンオキサイドコーテッドスライドグラス8-12ohms(Aldrich)に張り付け、伸展器(50℃、1時間)で伸展乾燥をした。あらかじめ、キシレン入り染色壺をウォーターバスで暖めておき、キシレンの温度が60℃になったところで、乾燥したパラフィン切片を染色壺に入れて、10分間静置した。水和処理として、100%エタノール処理を5分間2回、90%エタノール処理を5分間、80%エタノール処理を5分間、70%エタノール処理を5分間、室温で行った後、デシケータ内で乾燥させた。
図3に、上記実施例3の結果を示す。具体的には、図3は、本発明の脱パラフィン法(加熱条件:60℃−10分)を用いた、パラフィン切片からの質量分析(実施例3)の結果を、マトリックス溶液の分注ピッチとマススペクトルのピーク数との関係にして示したグラフである。図3においては、横軸に分注ピッチ(μm)を、縦軸にピーク数(Number of Peaks)を示す。
マウス脳のパラフィンブロックよりミクロトームで10μm厚の切片を作製し、インヂウムチンオキサイドコーテッドスライドグラス8-12ohms(Aldrich)に張り付け、伸展器(50℃、1時間)で伸展乾燥をした。あらかじめ、キシレン入り染色壺をウォーターバスで暖めておき、キシレンの温度が60℃になったところで、乾燥したパラフィン切片を染色壺に入れて、10分間静置した。壺から取り出し、キシレンを気化させた。
図4に、上記実施例4の結果を、実施例3に相当する結果(すなわち、実施例3と同じ操作を、別途行って得られた結果)とともに示した結果を示す。水和処理を行った本発明の解析法(脱パラフィン条件:60℃−10分)による、パラフィン切片からの質量分析(実施例3)の結果と、水和処理を行わなかった本発明の解析法(脱パラフィン条件:60℃−10分)による、パラフィン切片からの質量分析の結果(実施例4)とを、マトリックス溶液の分注ピッチとマススペクトルのピーク数との関係にして示したグラフである。図4においては、横軸に分注ピッチ(μm)を、縦軸にピーク数(Number of Peaks)を示す。
マウス脳の凍結ブロックよりクリオスタットで10μm厚の切片を作製し、インヂウムチンオキサイドコーテッドスライドグラス8-12ohms(Aldrich)に張り付け、風乾させた。70%エタノール処理を5分間、室温で行った後、デシケータ内で乾燥させた。
図5に、(a)本発明の解析法による、パラフィン切片からの質量分析(実施例3:脱パラフィン条件は60℃、10分)の結果得られたマススペクトルと;(b)従来の解析法による、凍結切片からの質量分析(比較例2)の結果得られたマススペクトルとを示す。図5(a)及び図5(b)においては、横軸に質量/電荷(Mass/Charge)を、縦軸にイオン強度を示す。図5が示すように、本発明の方法によって、パラフィン切片からの試料でも、凍結切片の場合と同レベルの質、或いは情報量においては凍結切片以上の質のマススペクトルを得ることが可能になる。
図6に、(a)本発明で解析を行ったパラフィン切片の実画像と、(b)マトリックス分注後のパラフィン切片の実画像を示す。
実施例3に記載の脱パラフィン法によって、マウス脳パラフィン切片を脱パラフィンして得られた切片に、以下のようにしてマトリックスの結晶を調製した。
50%アセトニトリル−0.1%トリフルオロ酢酸水溶液を溶媒として、50mg/mlの2,5−ジヒドロキシ安息香酸溶液を調製した。調製された高濃度マトリックス溶液を、マイクロピペットを用いて、脱パラフィン切片上へ滴下した。これにより生成した結晶の写真を図9(a)に示す。また、調製された高濃度マトリックス溶液を、ケミカルプリンタChIP-1000(島津製作所) を用い、脱パラフィン切片上へ滴下した。これにより生成した結晶の写真を図9(b)に示す。
図10(b)は、上記50mg/mlの高濃度マトリックス溶液をChIP-1000を用い、脱パラフィン切片上へ滴下して得られた結晶で、上記図9(b)の一部を図10(a)と同じスケールに引き伸ばしたものである。
これらの写真が示すように、高濃度のマトリックス溶液をインクジェット機構によって滴下すると、均一な結晶が、まんべんなくできることがわかる。
Claims (13)
- 生体試料がパラフィンに包埋された標本を、加熱条件下で、前記パラフィンと互いに相溶性がある有機溶剤に晒し、前記パラフィンを融解及び前記有機溶剤へ溶解させることによって、前記生体試料を露出させる工程と、
前記パラフィンが溶解した有機溶剤と、前記露出した生体試料とを分離することによって、前記標本から前記パラフィンを除去する工程と、
前記生体試料を質量分析装置によって測定する工程と、
を含む、パラフィン包埋標本の解析法。 - 前記生体試料を露出させる工程において、前記生体試料がパラフィンに包埋された標本を、加熱された前記有機溶剤中に浸漬及び保持し、
前記パラフィンを除去する工程において、前記有機溶剤中に保持した前記標本を前記有機溶剤から引き上げる、請求項1に記載のパラフィン包埋標本の解析法。 - 前記加熱条件は、45〜70℃の温度条件である、請求項1又は2に記載のパラフィン包埋標本の解析法。
- 前記有機溶剤は、キシレン、クロロホルム、ジエチルエーテル、レモゾール、及びアルコール類からなる群から選ばれる、請求項1又は2に記載のパラフィン包埋標本の解析法。
- 前記標本は、電気伝導性支持体の表面上に保持されている、請求項1〜4のいずれか1項に記載のパラフィン包埋標本の解析法。
- 前記標本は、癌、アルツハイマー病、パーキンソン病、虚血性脳疾患、及び虚血性心疾患からなる群から選ばれる疾病を罹患した生体に由来するものである、請求項1〜5のいずれか1項に記載のパラフィン包埋標本の解析法。
- 前記標本は、薬物動態を解析するための標本である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のパラフィン包埋標本の解析法。
- 前記パラフィンを除去する工程の後、前記質量分析装置によって測定する工程の前に、前記生体試料を消化処理する工程をさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載のパラフィン包埋標本の解析法。
- 前記パラフィンを除去する工程の後、前記質量分析装置によって測定する工程の前に、前記生体試料を水和処理する工程をさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載のパラフィン包埋標本の解析法。
- 前記パラフィンを除去する工程の後、前記質量分析装置によって測定する工程の前に、前記生体試料を水和処理及び消化処理する工程をさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載のパラフィン包埋標本の解析法。
- 前記質量分析装置によって測定する工程において、前記質量分析装置として、マトリックス支援レーザー脱離イオン化型質量分析装置を用いる、請求項1〜10のいずれか1項に記載のパラフィン包埋標本の解析方法。
- マトリックスとして2,5−ジヒドロキシ安息香酸を用い、前記マトリックスの40mg/ml〜飽和濃度溶液を、インクジェット機構を用いて前記生体試料に滴下し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化型質量分析装置を用いて測定を行う、請求項11に記載のパラフィン包埋標本の解析法。
- 前記マトリックスの溶液を、100〜200μmの間隔で滴下する、請求項12に記載のパラフィン包埋標本の解析法。
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