CN105699647B - 一种新型电泳缓冲液及其制备方法和应用 - Google Patents

一种新型电泳缓冲液及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型电泳缓冲液及其制备方法和应用，属于生物免疫学技术领域。本发明新型电泳缓冲液含有三羟甲基氨基甲烷10.0‑11.0g/L，乳酸钙0.15‑0.25g/L，叠氮钠0.10‑0.20g/L，三甲基甘氨酸5.00‑5.50g/L，剩余成分为灭菌双蒸水，pH值为8.6‑8.8。本发明新型电泳缓冲液的原料购买简便，配制简单，电泳结果确实可靠，阳性结果与传统电泳液的阳性结果相比较稳定、确实可信，长期使用不易形成结晶，不影响电流的泳动速度，完全可以替代巴比妥电泳液，并且可同时应用于对流免疫电泳和PCR核酸电泳。

Description

一种新型电泳缓冲液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种电泳缓冲液，具体涉及一种可同时应用于对流免疫电泳和PCR核酸电泳的新型电泳缓冲液及其制备方法和应用，属于生物免疫学技术领域。
背景技术
目前，对流免疫电泳中的缓冲液常用的是巴比妥缓冲液，这种缓冲液被大家一致认可，并得到了广泛的应用，包括实验室的科学研究到临床相关样品的检测。对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis,CIEP)是指在适宜缓冲液和电场条件下，抗原和相应抗体在琼脂凝胶中，由于电泳和电渗作用，抗原向正极移动，抗体向负极移动。将抗原放负极端，抗体放正极端，则抗原抗体相向运动，在两孔之间相遇，在比例合适时形成深沉线。在对流免疫电泳中最常用的电泳液为0.05M(pH8.6)巴比妥缓冲液，这种缓冲液被大家一致认可，并得到了广泛的应用，包括实验室的科学研究到临床相关样品的检测，但是，其中的巴比妥及巴比妥钠是一类作用于中枢神经系统的镇静剂，属于巴比妥酸的衍生物，其应用范围可以从轻度镇静到完全麻醉，还可以用作抗焦虑药、安眠药、抗痉挛药。因此该类药物为管制类化学药品，购买过程复杂，手续繁琐，样品质量良莠不一，购买量有所限制；另一方面此缓冲液在配制的过程也耗费时间，不易溶解；再者巴比妥电泳液在应用过程中容易在电极两端形成结晶，影响电流的泳动效率，导致阳性结果不易判断，最终导致实验结果或临床检测结果出现偏差。在认识到上述问题后，本发明经研究提出新型电泳缓冲液，经多次实验测试，可完全替代现在的巴比妥缓冲液。同时本发明缓冲液也可用于PCR核酸电泳中。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种新型电泳缓冲液，该缓冲液完全无巴比妥缓冲液原料购买的限制，容易购买，不形成结晶，多次对比实验证实，完全可以替代巴比妥电泳液；
本发明的第二个目的在于提供一种制备所述新型电泳缓冲液的方法；
本发明的第三个目的在于提供所述新型电泳缓冲液在流免疫电泳和PCR核酸电泳中的应用。
为达到上述目的本发明采用了以下技术手段：
一种新型电泳缓冲液，其特征在于，所述的电泳缓冲液含有三羟甲基氨基甲烷10.0-11.0g/L，乳酸钙0.15-0.25g/L，叠氮钠0.10-0.20g/L，三甲基甘氨酸5.00-5.50g/L，剩余成分为灭菌双蒸水，pH值为8.6-8.8。
在本发明中，优选的，所述的电泳缓冲液含有三羟甲基氨基甲烷10.8g/L，乳酸钙0.206g/L，叠氮钠0.20g/L，三甲基甘氨酸5.30g/L，剩余成分为灭菌双蒸水，pH值为8.6-8.8。
本发明采用白色结晶颗粒状，纯度≥99.5％的三羟甲基氨基甲烷(Tris)10.8g，加入乳酸钙0.206g，叠氮钠0.20g，三甲基甘氨酸5.30g，灭菌双蒸水1000mL，配制成新型的免疫电泳缓冲液，pH值在8.6-8.8之间。其特点是Tris为弱碱，在25℃下，它的pKa为8.1；根据缓冲理论，Tris缓冲液的有效缓冲范围在pH7.0到9.2之间。Tris碱的水溶液pH在10.5左右，一般加入盐酸以调节pH值至所需值，即可获得该pH值的缓冲液。Tris缓冲液的离子强度低，呈碱性缓冲液。三甲基甘氨酸极易溶于水，是一种季胺型生物碱，通过加入的乳酸钙形成稳定的弱碱性缓冲液，在电泳过程中不影响抗原的泳动速度，不干扰被检血清的电渗作用，从而使得带负电荷的蛋白质抗原，在电场中由阴极向阳极移动。抗体等电点较抗原高，在碱性缓冲液中带阴离子少，分子量大，泳动较慢，因电渗作用反而向阴极泳动，这样变使抗原、抗体在电场中相对移动，而形成对流，经过一定时间的泳动后，在最适处形成肉眼可见的白色沉淀线。最后添加的叠氮钠可增加该缓冲液的保质期，以防止细菌等无效成分的滋生，从而更增加缓冲液的稳定状态。结果确实可靠，阳性结果与传统电泳液的阳性结果相比较稳定、确实可信，长期使用不易形成结晶，不影响电流的泳动速度。
进一步，本发明还提供了所述的新型电泳缓冲液的方法，其特征在于，准确量取灭菌双蒸水1000mL放入三角瓶中，然后依次称取三羟甲基氨基甲烷10.0-11.0g，乳酸钙0.15-0.25g，叠氮钠0.10-0.20g，三甲基甘氨酸5.00-5.50g放入灭菌双蒸水中，在磁力搅拌器中搅拌30分钟至溶液完全澄清，调溶液pH值为8.6-8.8，即得。
在本发明中，优选的，称取三羟甲基氨基甲烷10.8g，乳酸钙0.206g，叠氮钠0.20g，三甲基甘氨酸5.30g。
更进一步的，本发明提供了所述的新型电泳缓冲液在流免疫电泳和PCR核酸电泳中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明新型电泳缓冲液的原料购买简便，配制简单，电泳结果确实可靠，阳性结果与传统电泳液的阳性结果相比较稳定、确实可信，长期使用不易形成结晶，不影响电流的泳动速度。
附图说明
图1为电泳缓冲液电泳结果图；其中，图1A为通用型缓冲液电泳结果图，图1B为本发明缓冲液电泳结果图；1-Mark，2-被检样品1，3-被检样品2，4-阳性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三甲基甘氨酸购自sigma公司，乳酸钙购自天津市致远化学试剂有限公司，叠氮钠购自天津市福晨化学试剂厂。
实施例1
准确量取灭菌双蒸水1000mL放入三角瓶中，依次称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)10.8克，乳酸钙0.206克，叠氮钠0.20克，三甲基甘氨酸5.30克放入灭菌双蒸水中，在磁力搅拌器中搅拌30分钟至溶液完全澄清，调溶液pH值在8.6-8.8之间。
实施例2
准确量取灭菌双蒸水1000mL放入三角瓶中，依次称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)10.0克，乳酸钙0.15克，叠氮钠0.10克，三甲基甘氨酸5.00克放入灭菌双蒸水中，在磁力搅拌器中搅拌30分钟至溶液完全澄清，调溶液pH值在8.6-8.8之间。
实施例3
准确量取灭菌双蒸水1000mL放入三角瓶中，依次称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)11.0克，乳酸钙0.25克，叠氮钠0.20克，三甲基甘氨酸5.50克放入灭菌双蒸水中，在磁力搅拌器中搅拌30分钟至溶液完全澄清，调溶液pH值在8.6-8.8之间。
试验例1
1.1样品材料
随机抽取送检貂血样品120份，分别以巴比妥缓冲液与本发明新型缓冲液进行对比实验。
1.2方法
先配制pH8.6离子强度0.05巴比妥缓冲液及本发明实施例3的缓冲液，再制琼脂板，以巴比妥缓冲液和本发明实施例3的缓冲液分别配成1％～1.5％琼脂凝胶板，厚度2mm～3mm。琼脂冷却后，打孔，打成对的小孔数列，孔径0.3cm～0.6cm，孔距0.4cm～1.0cm。挑去孔内琼脂，封底。加样一对孔中，一孔加已知(或待测)抗原，另一孔加待测(或已知)抗体。然后电泳，将抗原孔置于负极端。电压2.5V/cm～6V/cm，或电流强度3mA/cm～5mA/cm，电泳时间30min。
1.3结果
实验结果见表1。
表1 阿留申血清样品检测
结果显示两种缓冲液的符合率为100％，本发明缓冲液完全符合实验要求，可替代巴比妥缓冲液。
试验例2
2.1样品材料
临床送检疑似阿留申脾组织病料2份。
2.2方法
采用常规方法提取病料组织DNA。根据阿留申基因序列，设计特异性扩增引物，预计扩增产物大小401bp，如表2所示。PCR产物采用本发明实施例3的缓冲液进行电泳检测，同时采用通用缓冲液作对照。
表2 引物序列及其所对应的PCR扩增条件
2.3结果
结果显示两个送检测样品均为阳性，与通用缓冲液结果相一致，表明本发明缓冲液也可用于PCR的电泳检测中。结果见图1。

Claims (4)

1.一种新型电泳缓冲液替代巴比妥缓冲液在对流免疫电泳或PCR核酸电泳中的应用，其特征在于，所述的电泳缓冲液含有三羟甲基氨基甲烷10.0-11.0g/L，乳酸钙0.15-0.25g/L，叠氮钠0.10-0.20g/L，三甲基甘氨酸5.00-5.50g/L，剩余成分为灭菌双蒸水，pH值为8.6-8.8。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的电泳缓冲液含有三羟甲基氨基甲烷10.8g/L，乳酸钙0.206g/L，叠氮钠0.20g/L，三甲基甘氨酸5.30g/L，剩余成分为灭菌双蒸水，pH值为8.6-8.8。
3.制备权利要求1所述的新型电泳缓冲液的方法，其特征在于，准确量取灭菌双蒸水1000mL放入三角瓶中，然后依次称取三羟甲基氨基甲烷10.0-11.0g，乳酸钙0.15-0.25g，叠氮钠0.10-0.20g，三甲基甘氨酸5.00-5.50g放入灭菌双蒸水中，在磁力搅拌器中搅拌30分钟至溶液完全澄清，调溶液pH值为8.6-8.8，即得。
4.根据权利要求3所述的制备新型电泳缓冲液的方法，其特征在于，称取三羟甲基氨基甲烷10.8g，乳酸钙0.206g，叠氮钠0.20g，三甲基甘氨酸5.30g。
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