CN101918825A - 自由流动电泳中的ms-兼容性非离子或两性离子表面活性剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及自由流动电泳方法中MS-兼容性表面活性剂的使用，其允许具有不同电泳迁移率的分析物的分离。所述表面活性剂优选可切割表面活性剂，如PPS。

Description

自由流动电泳中的MS-兼容性非离子或两性离子表面活性剂
技术领域
本发明涉及用于进行分析物(尤其是包含微溶性蛋白或一般的疏水性物质的样品)的有效、选择性和可重复的自由流动电泳(FFE)分离的方法、试剂盒和介质。本发明所述的FFE分离涉及MS-兼容性非离子或两性离子表面活性剂的使用。
背景技术
为了分析无机或有机分子，特别是生物分子，如肽、蛋白质、DNA、例如作为药物有用的天然产物、代谢中间物、脂质等，通常需要在下游分析之前从混合物中单离目的化合物以获得有用的分析数据。
通过将质谱(MS)之类的现有鉴定方法与应用于复合蛋白混合物的高分辨率分离技术相组合尝试例如蛋白的单离和随后的分析/表征。通常认为现有的分离和鉴定方法本身不能给出蛋白组合物和复合混合物中蛋白表达(例如生物基质、生物流体(如血清、血浆、滑液、脑脊液、尿液、全细胞、细胞级分、细胞裂解物或组织提取物))的全面解释。然而所述限制未阻止现有方法(或许多现有技术的结合)的使用以给广泛的蛋白提供有价值的信息，尤其当其有无或其表达水平与病情相关联时。
广泛使用例如MS(质谱)分析、NMR(核磁共振)分析、圆二色谱分析、生物样品的结晶或UV-光谱分析后X射线衍射谱的确定的主要障碍之一为目的分子的成功纯化或至少基本富集以使其适于随后的分析。在蛋白或其他化合物的发现阶段要克服的障碍为在过程链的最后使用的分析工具(如MS)有对蛋白(或它们的衍生肽)的有限量的确定的检测限。需要从蛋白混合物或其他的生物有机混合物中分离和/或富集目的蛋白以充分开发例如通过MS的肽鉴定的灵敏检测限和纯化需要。
基于在直流电的作用下带电颗粒的迁移，电泳为广为采用的用于分离颗粒的技术。已开发了许多不同的操作模式(如等电聚焦(IEF)、区带电泳(ZE)和等速电泳(ITP))作为上述分离原理的变体并通常为本领域技术人员所知。
自由流动电泳(FFE)为在无固定相(或固体支持材料)下在液体介质中发生分析物分离的技术。FFE通常也称作无载波偏转电泳或无矩阵偏转电泳。
在蛋白组学领域中，FFE是就它们的不同等电点(pI)值而为复合蛋白样品的确切分离所选择的技术。可使用FFE基于其电泳迁移率分离有机和无机分子、生物颗粒、生物聚合物和生物分子。已描述了相应的原理。[例如Bondy B.et al.(1995)，″Sodium chloride inseparation medium enhances cell compatibility of free-flowelectrophoresis″，Electrophoresis 16：92-97]
近年来例如通过稳定化介质和逆流介质的方式改进了FFE的过程。这反映在例如美国专利5,275,706，其公开内容通过引用整体并入本文。依据所述专利，将逆流介质导入到与电极间移动的大量分离介质和样品的连续流动方向相反的分离空间。将两种介质(分离介质和逆流介质)经分级分离出口排出或洗脱至适合的收集装置(如微孔板)导致了低空隙体积(void volume)的分级分离过程。此外，在分级分离出口的区域中保持介质的层流(即具有非常低或无湍流)。
例如在美国专利6,328,868中公开了称作间隔FFE的特定FFE技术。在所述专利中，将样品和分离介质都导入到电泳室并使用电泳模式(如区带电泳(ZE)、等电聚焦(IEF)和等速电泳(ITP))分离样品中的分析物，最后经分级分离出口从室中排出。′868专利的实施方式描述，与本领域中的常用技术相比，当样品和介质被不流通地从入口端驱使至出口端时，分离介质和样品的运动为单向的，其从所述室的入口端移动至出口端，并施加有效电压导致电泳迁移发生，其中当在电场中分离时，样品和介质时其流经设备(通常称作连续FFE)。
在国际申请PCT/EP2007/059010(要求美国临时申请USSN60/823,833和USSN 60/883,260的优先权)中已描述了在FFE中本文所用的所谓循环模式或循环间隔模式，其通过引用整体并入本文。总之，所述循环间隔模式的特征在于，当在狭长电极间的电场中保持所述样品时，至少一个和可能的多个整体流动方向的反转。与静态间隔模式相比，样品始终在运动中，从而允许更高的电场强度和因此更好(或更快)的分离。另外，可通过反转狭长电极间样品的整体流动大大增加电场中分析物的滞留时间，从而提供增加的分离时间和/或更高的分离效率和更好的分辨率。尽管实际原因和短时间获得分离的需要通常限制以所述模式进行的循环数，但可以具体情况所需的来经常重复平行于狭长电极的任一方向内的整体流动的反转(称为一个循环)。
用于分析物(如生物颗粒和生物聚合物)分离的许多分离介质为本领域所知。例如，由K.Hannig和K.H.Heidrich所出版的书“自由流动电泳”(ISBN 3-921956-88-9)报道了适于FFE和尤其适于自由流动ZE(FF-ZE)的分离介质列表。
美国专利5,447,612公开了另一分离介质，其为通过等点聚焦通过在自由溶液中形成功能稳定的预制的狭窄pH区梯度来分离分析物的pH缓冲系统。其以互补的缓冲对使用缓冲组分。
美国在审临时登记号60/945,246涉及适于FFE的挥发性缓冲系统。所述挥发性缓冲系统提供了优势即在FFE步骤之后和在下游分析(如MS)之前可轻易将其去除，或不干扰下游分析。
不幸的是，最近成为当今研究重点的各种蛋白在水溶液中为不溶的或几乎不溶的。在所述方法中，其中通常使用表面活性剂(例如十二烷基硫酸钠(SDS)、尿素或Triton X-100)防止蛋白析出(例如在电泳期间)，因为所述表面活性剂干扰质谱检测的灵敏性，在随后的分析(如MS)之前必需去除所述表面活性剂。在成功电泳之后和在例如下游的MS分析之前通常使用传统方法来去除所述干扰物质以解决所述问题。所述大量和通常困难的净化和/或纯化方案造成分析时间总长度的增加且通常导致了样品的损失。此外，所述繁琐的方案表现出自动化的障碍。因此，在当今成功的生物分子分析工程中样品制备是一个关键且通常是在技术上具有挑战性的一个任务。对不需要在分离步骤之后耗费大量时间和样品的纯化步骤来去除所述表面活性剂而允许从分析物混合物中分离目的分析物的表面活性剂有需要。有本领域已知的基本适合于质谱分析的表面活性剂。已将非离子表面活性剂(如辛基-β-吡喃葡萄糖苷)用于质谱使用(例如Hatt，P et al.，1997)。然而，所述电泳分离仍需要SDS且需要耗费时间的表面活性剂交换步骤。
Norris等(Anal Chem.75(23)，6642-7，2003)描述了名为3-[3-(双烷氧基乙基)吡啶-1-基]丙烷-1-磺酸盐(PPS)的酸敏性“可切割洗涤剂”的特性和在蛋白提取期间和MS分析中所述化合物的使用，但用不使用分离方法以提供分离的或至少部分基本上的目的分析物的粗提取物进行所述分析。
在2005年Norris等(J.Mass Spectrom.，1319-1326，2005)还描述了提高了蛋白溶解度和用光敏性或氟切割代替酸敏性的“可切割洗涤剂”。在洗涤剂切割后，所述部分可析出，且其不再干扰MS分析或在MS分析之前可轻易将其去除。
涉及Norris等的美国专利申请US 2006/0292607描述了分析来自切除肿瘤手术切缘的组织的方法并描述了提取包含在细胞内部的蛋白的可切割洗涤剂3-[3-(双烷氧基乙基)吡啶-1-基]丙烷-1-磺酸盐(PPS)的使用及其随后的MS分析。
在2005年Norris等(Anal.Chem.，77，5036-5040，2005)的第二个出版物还涉及在质谱中可切割洗涤剂的使用，其中所述洗涤剂包含在所述洗涤剂切割后可作为MS基质的部分。
在US 2006/0240562和WO 02/097393中描述了尤其在疏水蛋白的MALDI-MS分析中的可切割组合物和使用所述组合物的方法。
WO 2006/047614描述了MS-兼容性增溶剂，其可提高分析物的溶解度和它们的使用。增溶剂被描述为适合于LC/MS。
WO 00/70334和WO 03/102536描述了可破坏的表面活性剂和使用其的方法。所述表面活性剂包含二氧戊环或二氧杂环乙烷官能团，其可使所述表面活性剂在酸性条件下被切割。该文所述表面活性剂是阴离子的，鉴于为待分离样品中的颗粒所添加的电荷，这使其对FFE方法，尤其对于自由流动等点聚焦(IEF)无吸引力。
Ying-Qing Yu等(Anal.Chem.，75，6023-6028，2003)描述了用于蛋白的溶液中酶消化的酸敏性阴离子表面活性剂。所述表面活性剂适合于HPLC-MS。由于所述表面活性剂的阴离子特征，其不适于FFE方法。
发明概述
现在，在本领域中需要有不需要在分离步骤之后和在下游分析之前耗费大量时间和样品的纯化步骤来去除所述表面活性剂而允许从分析物混合物中分离目的分析物的可用方法。
本发明旨在提供适于分离在水溶液中不溶或仅有限溶解的分析物的方法和试剂盒，但其避免了用于去除那些会干扰随后分析的表面活性剂的、传统的耗费时间和样品的纯化过程。本发明的实施方式通过使用表面活性剂的FFE为分离分析物提供了有利的方法，其不需要耗时和导致样品损失的净化步骤来去除干扰的表面活性剂而允许随后的分离出的分析物的MS分析。
因此，本发明的实施方式涉及通过自由流动电泳分离样品中分析物的方法，其包括至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂的使用。
在另一实施方式中，本发明提供用于分析分析物的方法，其包括本发明的自由流动电泳分离和从所述的自由流动电泳分离获得的至少一部分样品的随后分析。
本发明另一方面涉及包含适于本发明的自由流动电泳方法的至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂的分离介质。
本发明另一方面涉及用于进行本发明的样品中分析物的自由流动电泳分离的试剂盒，其含至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂。
另一方面还涉及本发明的MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂、或者本发明的MS-兼容性两性离子或非离子可切割表面活性剂用于自由流动电泳的用途。
附图简述
图1：由通过使用来自非洲岩蟒(python sebae)血清样品的挥发性缓冲系统的等点聚集的自由流动电泳分离得到的级分的银染SDS-PAGE，其中在存在3-[3-(1，1-双烷氧基乙基)吡啶-1-基]丙烷-1-磺酸盐(PPS)(第一块胶)和不存在PPS(第二块胶)下进行所述分离。
图2：含有PPS的样品的级分26的MALDI TOF质谱。
图3：可显示分离区内包含0.1％PPS的缓冲系统的各pI标记物的分布的在λ＝420nm、515nm和595nm处的FFE级分的吸光度。
图4：可代表分离区内无0.1％PPS的缓冲系统的各pI标记物的分布的在λ＝420nm、515nm和595nm处的FFE级分的吸光度。
图5：含有来自HELA细胞的总细胞提取物(在有PPS的HBS缓冲液中提取)的样品的自由流动区带电泳级分的银染SDS-PAGE。
图6：含有用PPS提取的膜蛋白的样品的自由流动电泳级分的银染SDS-PAGE。
图7：由可显示分离区内包含0.1％PPS的缓冲系统的各pI标记物分布的在λ＝420nm、515nm和595nm处的FFE级分的吸光度所表示的FFE分离洗脱分布。
图8：由可显示分离区内无PPS的缓冲系统的各pI标记物分布的在λ＝420nm、515nm和595nm处的FFE级分的吸光度所表示的FFE分离洗脱分布。
图9：用于进行本发明方法的合适的FFE设备的示意图。
发明详述
本发明的实施方式涉及用于进行水溶性、微水溶性或基本非水溶性分析物的有效、选择性和可重复的自由流动电泳分离的方法、分离介质和试剂盒，其包含可辅助例如疏水性、仅微水溶性或非水溶性分析物在基本上水介质中溶解的非离子或两性离子MS-兼容性表面活性剂。此外，因为在某些条件下所述表面活性剂是必需的以防止例如所述分析物的析出，其在包含水溶性分析物的样品中也有用。
本发明的实施方式包含具有许多优势的方法，所述优势包含但不限于下面的一个或更多：
a)不要求用于在电泳分离和随后的分析或其中所述MS-兼容性表面活性剂必不干扰所述分析方法的分析之间去除干扰的表面活性剂的、耗费时间和/或导致样品损失的纯化步骤；
b)与凝胶电泳，尤其2D-凝胶电泳相比，自由流动电泳具有更短的分离时间，其允许因更长的滞留时间不稳定的表面活性剂会被切割的期间的分离条件的使用；
c)例如通过逆流介质在自由流动电泳分离期间或之后立即修饰缓冲组合物的能力允许不稳定的表面活性剂的即刻稳定或切割；和
d)快速分离和随后分析的组合允许从分析物混合物更快速的、更好的和自动化的分离和鉴定分析物。
尤其对由于在水裂解液中它们的低溶解度和浓度而难以检测的蛋白或分析物而言，可使用本发明的实施方式例如来改进膜结合蛋白的分离。
因此，本发明一主要方面涉及通过自由流动电泳分离样品中分析物的方法、包括：进行包括至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂的自由流动电泳分离。
在一优选的实施方式中，在电泳分离后的一个或多于一个的级分中收集至少部分样品。
本发明的有利方法不仅允许蛋白或其他化合物的分离，而且其不需要耗时和导致样品损失的净化步骤来去除干扰许多下游分析的表面活性剂而允许进行例如通过质谱的随后分析。可选择地，如果目的分析物为蛋白，可在自由流动电泳之前或之后进行将所述蛋白切成更小的肽的消化步骤。也不需要去除在自由流动电泳中使用的MS-兼容性表面活性剂以进行所述消化步骤，所述表面活性剂的存在甚至可改善所述消化，但在所述的消化步骤之前不得不部分降低或甚至完全去除例如常用的表面活性剂尿素的浓度。
因此，本发明另一方面涉及用于分析分析物的方法，包括：本发明的自由流动电泳分离和从自由流动电泳所获得的至少一部分样品的随后分析。
在本发明中，希望术语“进行分离”和“分离”指基于其在电场中不同行为的两种或更多分析物的混合物的任何空间划分。因此分离包括但不限于包含在样品中的某些级分或分析物的分级分离以及特异性和选择性的富集或除尽、浓缩和/或单离。然而，应了解无论在电泳步骤期间是否还分离所述的其他分析物，通常认为分离分离指来自分析物剩余物的样品内的某些分析物的划分或富集。在术语分级分离和分离间无明显区别是显而易见的，尽管后者指样品中各种分析物的更好或更细的空间划分。因此，无论本申请在什么时候涉及术语“进行分离”或“分离”，希望其包括上述含义中的至少一个，其包括：分离、分级分离、单离、富集或除尽。
主要以制备的方法进行所述分离以便在随后收集某些级分，或当只可通过适合的方法检测、但不收集某级分中的目的分析物或其存在以例如用于进一步使用。
本文所用术语“样品”指其中至少一部分经受了自由流动电泳分离和/或分析的任何组合物。通常而言，样品包含或疑似包含至少一种目的分析物。
在本发明中“分级分离的样品”指其中在FFE步骤期间分离样品中各种分析物和其中在FFE分离步骤后可将样品划分成许多级分的样品。本领域技术人员理解如何收集经多个收集出口出适于FFE的设备的分离室并通常经单独的管道被引至任何类型的单独收集容器(例如96孔板、和有时不同尺寸的平板，例如96、384、1536或甚至更多的孔)的单独级分。应理解在电泳分离后的一个或多于一个的级分中收集经受自由流动电泳分离方法的至少部分样品。
本文互换使用术语“分析物”、“目的分析物”和“目的分子”来指人们希望分离、单离、检测、定量，或者检查、研究或分析的分子。因此，本文术语“分析物”的使用不限于仅确定目的分子的类型；其更包括涉及例如配体间互作、所述目的分子的3D结构或构象变化等的其他观察。可通过本发明的实施方式的FFE方法分离的典型分析物包括：无机和有机分子、生物颗粒、生物聚合物和生物分子或它们的任意组合。目的分析物，尤其是生物颗粒、生物聚合物和生物分子的非限制性例子为：蛋白(尤其是膜结合蛋白、内在膜蛋白和亲脂性蛋白)、蛋白聚集体、蛋白复合物、肽、疏水肽、DNA-蛋白复合物(例如染色质)、DNA、膜、膜碎片、脂质、糖及其衍生物、多糖及其衍生物、激素、脂质体、病毒颗粒、抗体、抗体复合物、纳米颗粒或上述任何之混合物。可依据本发明的某些实施方式分离的无机或有机分子包括疏水性聚合物，例如塑料的某些成分、乳胶漆颗粒、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、右旋糖苷、纤维素衍生物、多元酸、药用药物、药物前体、药物爆裂物(a drug explosives)的代谢物、毒素、致癌物、毒物、过敏原、传染剂、纳米颗粒等。
本文所用术语“蛋白”指任何蛋白，包括但不限于具有约20或更多氨基酸的肽、酶、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、生长因子、蛋白复合物、蛋白聚集体等。蛋白包括由多于约20个氨基酸、多于约50个氨基酸残基、多于约100个氨基酸残基或多于约200个氨基酸残基组成及可选通过例如糖基化、硫酸化或磷酸化修饰的多肽。
本文所用术语“亲脂性蛋白”指具有至少一个亲脂性区域的蛋白。能通过范德华力与膜体内互作的膜结合蛋白为亲脂性蛋白的一个非限制性例子。可选择地，亲脂性蛋白包含例如与膜的极性首基互作的极性或离子基团。非限制性例子为包含K区段或受体的脱水蛋白。在本领域中可识别受体分子且通常有胞外结构域、胞内结构域和/或跨膜结构域。
本文所用术语“内在膜蛋白”指体内永久附着到生物膜上的蛋白分子(或蛋白组集)。内在膜蛋白的最常见类型为跨越整个生物膜的跨膜蛋白类。在结构上，内在膜蛋白区穿过膜磷脂双层的疏水区。由于所述互作，通常仅通过使用干扰双分子层的疏水相互作用的表面活性剂从膜上移出内在膜蛋白。
本文所用术语“肽”或“多肽”指包含至少一个肽键的任何实体，且其可包含D型和/或L型氨基酸。肽可具有约2～约150，优选约2～约100，更优选约2～约50，及最优选约2～约20个氨基酸。
本文可互换使用术语“疏脂”和“亲水”且其指倾向于溶于水、与水混合或者被水湿润的分析物、化合物和物质。亲水性或疏脂性分析物、化合物和物质倾向于带电荷和有极性，并因此偏好其他带电荷和极性的溶剂或分子环境。
本文可互换使用术语“亲脂”和“疏水”且其指倾向于不溶于水、不与水混合或者不被水湿润的分析物、化合物和物质。疏水性或亲脂性分析物、化合物和物质倾向于电中性和非极性，并因此偏好其他中性和非极性的溶剂或分子环境。
应将本文所用术语“一种/一个(a)”理解为“一种/一个”、“至少一种/一个”或“一种/一个或更多”。
本文可互换使用术语“表面活性剂”、“洗涤剂”、“润湿剂”和“乳化剂”且其指能减小在水中的表面张力的分子或组合物。表面活性剂通常为两亲性有机化合物，其指它们兼含疏水性基团(它们的“尾”)和亲水性基团(它们的“头”)。因此，其在有机溶剂和水中都可溶。例如，表面活性剂促进在水溶液中保留疏水性肽或蛋白。
本文所用术语“MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂”指可为两性离子或非离子的MS-兼容性表面活性剂。在一些实施方式中，两性离子或非离子表面活性剂总体上带负电荷或正电荷，取决于两电极间不同区的pH；但非离子MS-兼容性表面活性剂在目的分析物被插入适于自由流动电泳的设备并从其洗脱的pH范围内的任何情况下不带电。此外，认为本发明所用的两性离子MS-兼容性表面活性剂的等电点通常在分离区的pH范围内。由于在分离区的pH范围内适于FFE的表面活性剂必为两性离子或非离子的，可互换使用本文所用术语“MS-兼容性表面活性剂”和“MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂”。
本文所用术语“两性离子”在表面活性剂中指为电中性但在不同的原子上携带形式上的正电荷和负电荷的化合物。不被认为是限制的例子是例如甜菜碱衍生物，优选磺基甜菜碱(如3-(三甲铵)-丙磺酸脂)或磷酸甜菜碱。通常而言，本发明所用两性离子表面活性剂的等电点(pI)在分离区的pH范围内，两性离子表面活性剂的pI优选在设备的样品导入点的pH值和目的分析物洗脱点的pH值间的pH范围内。在一些实施方式中，两性离子表面活性剂的pI远离目的分析物的洗脱pH值1.5或更少、1或更少、0.75或更少、0.5或更少或者0.25或更少的pH单位。
本文所用术语“非离子”在表面活性剂中指(双)极性化合物。例子包括但不限于具有至少一个疏水性取代基(如C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12～30-烷基、-烯基、-炔基、-芳烷基或-芳香基)的糖类衍生物。值得注意的是，仅具有亲水性取代基的乙酰吡喃糖苷和其他糖类衍生物不属于非离子表面活性剂组。通常而言，非离子表面活性剂在目的分析物被插入适于自由流动电泳的设备并从其洗脱的pH范围内不带电，非离子表面活性剂优选在分离区的pH范围内不带电。然而，取决于所述区的pH范围，非离子化合物在pH范围外的某pH仍然可带电荷以用于分离目的分析物。
本文所用术语“MS-兼容性”指可在MS分析中使用的表面活性剂。术语“MS-兼容性表面活性剂”包含本身适于MS分析的，即无需修饰的表面活性剂，且也包含在其非切割状态为非MS-兼容性的但可在至少一个位置将其切割成至少两个部分的“可切割”表面活性剂。所述部分可为MS-兼容性的或非MS-兼容性的。可通过例如离心、过滤或蒸发轻易去除本发明的可切割表面活性剂的非MS-兼容性部分，而MS-兼容性部分可留在溶液中并可在下游分析期间存在或在某些条件下同样可通过离心、过滤或蒸发将其去除。在一优选的实施方式中，多于一个所得的部分为MS-兼容性的。所述MS-兼容性可切割表面活性剂在例如包含蛋白消化步骤的方法中是合适的。蛋白在水中可为不溶的，但其由所述消化物所得的片段或部分片段是可溶的且可通过例如MS分析。
作为由本发明的可切割表面活性剂提供的优势的非限制性例子，在合适的MS-兼容性表面活性剂存在下分析物质谱检测的灵敏性比在例如SDS存在下分析物质谱检测的灵敏性大许多。在大多数情况下，包含SDS的样品的质谱由于SDS处理分析物或所述分析物的切割产物而表现出无信号或仅微弱信号。相反，包含所述分析物和在用MS-兼容性表面活性剂代替SDS存在下经受质谱分析的样品显示涉及所述分析物和所述分析物的切割产物的信号。
因此，可认为MS-兼容性表面活性剂为与包含规定浓度的所述对照分析物、但无表面活性剂(C(对照)样品)的样品相比，包含具有相同规定浓度的可溶性对照分析物的、经受质谱分析的样品(S样品)中其存在导致包含基本至少相同的质量峰(相似或甚至更高的强度)的质谱，即所述质谱基本相同。在一些实施方式中，例如当在质谱分析之前消化对照分析物且在质谱分析之前C样品中切割产物为疏水性并析出时，与源自C样品的MS谱相比，由于对照分析物的切割产物源自S样品的MS谱可甚至包含更多的质量峰。
例如在WO 2006/047614中描述鉴定MS-兼容性表面活性剂的合适方案。可使用通常使用的测试蛋白BSA作为例示完整蛋白并可使用β-半乳糖苷酶(t-β-gal)的胰蛋白酶消化物作为例示肽混合物。所述β-半乳糖苷酶的胰蛋白酶片段具有从亲水到疏水的溶解度范围。此外，许多其他物质也可起对照分析物的作用，只要其充分溶于水以产生MS谱。
作为非限制性例子，可将β-半乳糖苷酶S样品的MALDI-TOF分析与相当的C样品的MALDI-TOF分析相比较。可通过比较S样品中和C样品中鉴定的质量-离子的匹配确定在900～3700m/z范围中的电离抑制。本领域技术人员已知如何进行有用的MALDI-TOF分析。
与所述C样品的同一质量峰的强度相比，优选所述S样品的各列式质量峰的强度不低于25％，更优选其与C样品相同峰的强度是基本相同的，或最优选其比C样品相同峰的强度甚至更高。
就仅微溶或不溶的分析物或(对照)分析物的消化产物而言，优选包含所述仅微溶或不溶的分析物/消化产物和MS-兼容性表面活性剂的样品的质谱内质量峰的强度为比从根本不包含表面活性剂的样品获得的质谱的同一质量峰的强度高至少1、1.5、35、10、100或1000倍。
由于在所述S样品的波谱中也存在所述C样品的对照分析物的切割产物，本文所用“基本同一的”指质量峰的至少60％、至少70％、优选至少80％、更优选至少90％且最优选约100％。可使用搜索引擎(如
Figure BPA00001162648200131
)以将t-β-gal的消化物的理论MS谱或BSA的理论MS谱与例如消化的t-β-gal或BSA的MS谱相比较。对本发明的目的而言，主要应考虑从900至2600m/z的范围。
换言之，由于C样品的对照分析物的切割产物，在本发明的MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂的存在下获得的质谱包含质量峰的至少60％、至少70％、优选至少80％、更优选至少90％且最优选100％。
C样品的质量信号和S样品的同一质量信号间的质量差异可在取决于使用的方法或设备的测量误差内变化。本领域技术人员理解如何确定所述测量误差。例如，通常计算离子阱质谱仪的质量测量精度在0.5～2.5道尔顿之间，而可通过MALDI-TOF的应用测量约900道尔顿～3700道尔顿的范围的质量信号达到具有少于50ppm或甚至少于25ppm的误差的质量测量精度。
无论本发明表面活性剂的兼容性，认为在自由流动电泳和随后分析(如MS)中的表面活性剂的浓度仍应尽可能的低，优选其临界胶束浓度(CMC)附近。本领域技术人员已知本领域确定表面活性剂CMC的合适方法。此外，对于许多表面活性剂，所述CMC已知。
通常在低于100mM的浓度下使用所述MS-兼容性表面活性剂。取决于所述表面活性剂，低于50mM、低于30nM、低于15mM、低于5、低于1且甚至低于0.1mM的浓度是适合的。例如，经受本发明所用的自由流动电泳的样品内的可切割表面活性剂PPS的量为0.1％(w/v)。所述量相当于2～10mM间的浓度(取决于PPS的烷基链组合)。
通过比较各包含具有不同浓度的对照分析物的C样品和S样品的质谱，本领域技术人员可轻易鉴定出本发明典型的MS-兼容性表面活性剂。所述方法允许本领域技术人员来确定表面活性剂是否为MS-兼容性的。值得注意的是，希望当所述样品制备不包括表面活性剂的使用时，在水中几乎不溶或不溶的(无表面活性剂)分析物几乎根本不能给出可分析的质谱。因此，在MS-兼容性表面活性剂存在下通过自由流动电泳的目的分析物的分离产生了适于在下游分析中鉴定和表征所述分析物的样品。所述下游分析为质谱或本领域已知的合适的其他任何方法。
在一优选实施方式中，本发明的方法包括进行包括至少一种本发明的MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂(含于样品介质中和/或在至少一种分离介质中)的自由流动电泳分离。另一优选的实施方式涉及适于进行本发明的自由流动电泳分离的、包含MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂的分离介质。此外，另一优选的实施方式还涉及通过自由流动电泳分离样品中分析物的方法，其包括：进行包括至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂的自由流动电泳分离，其中所述表面活性剂存在于样品介质中和/或至少一种分离介质中。尽管优选在样品介质或分离介质中仅存在一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂，在样品介质和/或分离介质中多种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂的任意组合是可能的。在一优选的实施方式中，在本发明的方法中使用的两性离子或非离子表面活性剂为MS-兼容性表面活性剂。各所述表面活性剂都可包含在样品介质和/或至少一种分离介质中。
此外，在自由流动电泳分离期间，本文所用的MS-兼容性表面活性剂本身可为MS-兼容性的，或经所述表面活性剂的切割其可成为MS-兼容性的。在后一种情况中，MS-兼容性表面活性剂为MS-兼容性可切割表面活性剂。本发明一优选的实施方式为其中至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂为可切割表面活性剂的方法，尽管认为更多的MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂是可选存在的。在另一优选的实施方式中，样品介质和/或分离介质中的所有MS-兼容性表面活性剂都是可切割的。
本文互换使用术语“MS-兼容性两性离子或非离子可切割表面活性剂”、“MS-兼容性可切割表面活性剂”或“可切割表面活性剂”且其指在特定条件下可被切割成至少两部分的表面活性剂。在一实施方式中，可切割表面活性剂的切割部分中的至少一个为如上所述的MS-兼容性部分。所述MS-兼容性部分可在质谱分析期间存在或不存在，例如在MS分析之前被蒸发。无MS-兼容性部分在切割后析出或可在MS分析之前被蒸发。
如下所解释，认为由切割步骤可得到多于两个部分。作为认为非限制的适于本发明方法的可切割表面活性剂的例子，可将MS-兼容性可切割表面活性剂切割成MS-兼容性的并在溶液中保留的亲水性首基和可通过离心或过滤轻易从样品中去除的疏水性、非MS-兼容性的尾。因此，在一本发明优选的实施方式中，可通过过滤、离心和/或通过蒸发从样品或从至少部分经分级分离的样品中去除切割的MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂的部分中的至少一个。
包含在优选其中目的分析物基本稳定且其中可通过离心、过滤或蒸发轻易去除所得的所有非MS-兼容性部分的条件下，可通过切割剂将结合亲水部分(首基)和疏水部分(尾)的键切开的任何表面活性剂适合作为MS-兼容性可切割表面活性剂。依据本发明，所述键将被称为可切割键。优选在其中目的分析物基本稳定的条件下切割所述键。认为适于切割可切割表面活性剂的条件下基本稳定的分析物为目的分析物，切割步骤期间存在的所述分析物量的至少约80％、约90％、优选约97％、更优选约99％且最优选约100％在切割步骤后未被修饰，即在切割步骤期间在特定条件下所述分析物主要，优选完全对化学反应是惰性的。此述对化学反应为惰性的指在表面活性剂的切割步骤期间分无析物内的共价键断开或建立。
本文所用的“切割剂”涉及适于在可切割表面活性剂内选择性切割键的任何仪器或化合物或任何形式的化合物的混合物。适于选择性的切割可切割表面活性剂的化合物的非限制性例子为酸或碱或它们的溶液/混合物以选择性的切割可切割表面活性剂内的酸敏键或碱敏键。下文更详细的描述所述和进一步的例子。此外，术语“切割剂”包含适于在可切割表面活性剂内选择性切割键的仪器。所述仪器可为例如发光仪器，其可发出离散波长的光以切割光敏的可切割表面活性剂。
本文所用术语“用于切割可切割表面活性剂的溶液”指包含适于选择性切割可切割表面活性剂内接头和部分间的一个或更多键而产生至少两个部分(其中非MS-兼容性部分可通过离心、过滤或蒸发轻易的从样品中被去除，且MS-兼容性部分留在溶液中或同样可通过离心、过滤或蒸发被去除)的制剂或组合物的任何溶液。
MS-兼容性可切割表面活性剂可包含多于一个的可切割键，例如可产生由一个或更多的切割步骤所致的三个部分的两个可切割键。各可切割键可单独选自：共价键、离子键、氢键或配位键。在本发明中优选一个或更多的共价键。
在一本发明优选的实施方式中，在电泳分离后切割通过本发明的自由流动电泳分离来分离的样品的至少一个级分中的至少一种可切割MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂，即可将至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂切割成至少一个MS-兼容性部分和可通过过滤、蒸发或离心轻易去除的部分。此外，应注意也可通过在随后分析之前的蒸发去除MS-兼容性部分，即由可切割步骤所致的非MS-兼容性部分不经受所述下游分析，而MS-兼容性部分在下游分析中可存在或可选不存在。
MS-兼容性可切割表面活性剂可包含至少一个酸敏键(即所述表面活性剂为酸敏的)或至少一个碱敏键(即所述表面活性剂为碱敏的)或至少一个光敏键(即所述表面活性剂为光敏的)或至少一个化学活性键(即所述表面活性剂为化学活性的)。
可通过改变至少部分分级分离样品/级分的pH(例如通过在包含酸敏或碱敏可切割表面活性剂的本发明的FFE分离后的至少部分分级分离样品/至少一个级分的酸化或碱化)来切割酸敏或碱敏可切割表面活性剂。可通过照射切割光敏可切割表面活性剂，即可通过使在包含至少一种光敏可切割表面活性剂的FFE分离后的至少部分分级分离样品/至少一个级分经受用包含适于选择性的切开所述表面活性剂的接头和部分间的键的规定波长的光或由适于选择性的切开所述表面活性剂的接头和部分间的键的规定波长组成的光的照射进行可切割表面活性剂的切割。可通过添加的活性剂切割化学活性可切割表面活性剂，即通过将试剂添加到能切开在化学活性表面活性剂内的键的FFE分离后的至少部分分级分离样品/至少一个级分来进行可切割表面活性剂的切割。例如，可切割二硫键等的合适反应物为DTT(二硫苏糖醇)，或切割硅烷化合物的合适反应物的通式为：
其中R1选自C7～C20烷基或C7～C30的烷基、芳香基
R2、R3、R4、R5和R6为独立地为C1～C5烷基
A为N或P
X-为卤素
n为1～5
在一优选的实施方式中，在自由流动电泳中使用的化学活性可切割表面活性剂为{2-[(二甲基-辛基-硅烷基)-乙氧基]-2-羟基-乙基}-三甲基溴化铵。
例示光敏表面活性剂为例如肉桂酸酯(如3-(2，4，6-三羟基苯基)丙烯酸辛基酯)。
在另一优选的实施方式中，酸敏的可切割表面活性剂为3-[3-(1，1-双烷氧基乙基)吡啶-1-基]丙烷-1-磺酸盐(PPS)。
对于化学活性的可切割表面活性剂且尤其对于酸敏或碱敏的可切割表面活性剂而言，本发明的FFE方法提供了超过其他电泳方法/技术的独特优势。实际上，FFE允许使用广泛范围的可切割表面活性剂，其对其他的电泳技术是不可能的。例如，酸敏可切割表面活性剂(如PPS)是极易吸湿的，且其可由水在中性pH缓慢被切割，并在酸性或碱性pH以更快的速度被切割。据PPS的制造商Protein Discovery建议，一旦打开包装接触空气，应将内容物立即在水缓冲液(pH7～8)中复原，使其免受高温并在12小时内使用。这表示尤其只有当实验的持续时间相对短时可将pH敏感的可切割表面活性剂用于电泳。当pH降低或升高时，所述实验的最大持续时间甚至更短。因此，在非中性pH时必需在甚至更短的时间段内进行所述电泳实验。FFE的优势为在所需的短时间段内进行电泳分离(例如自由流动IEF)以确保表面活性剂的稳定性。相反，在2D-凝胶电泳的第一维中(或在离胶(off-gel)仪器中)进行的IEF通常需要5小时以上，或甚至更长(达到7～9小时或更久)的实验时间。因此，尤其在非常低或非常高pH，可更大程度的降解可切割表面活性剂。
此外，在其中所述表面活性剂在足够长的时间中稳定的恒定pH进行用于分离分析物的自由流动(间隔)区带电泳。
另外，如本发明所述的逆流介质的使用可在分离发生后的即刻稳定可切割表面活性剂。这允许在高的酸或碱pH以非常短的时间段(例如，低至约5分钟)分离分析物，并随后经逆流介质将pH调回其中可切割表面活性剂基本稳定以提高用于进一步处理的所述可切割表面活性剂的稳定性的pH值。
因此，本发明的一个实施方式涉及FFE方法，其中例如通过在自由流动电泳分离之后调整不同级分的pH，使用逆流介质来调整所述介质条件以在自由流动电泳后稳定包含在其中的可切割表面活性剂。
认为可将上文非限制性例子所述的原理扩大至在某些分离条件下的仅有限时间中稳定的其他类型可切割表面活性剂。
也可以不同的方式使用逆流介质例如以为FFE级分的即刻进一步处理引入可切割表面活性剂的切割剂。
因此，本发明的另一实施方式涉及自由流动电泳方法，其中包含与包含可切割表面活性剂的自由流动电泳分离后的至少部分样品级分接触和/或混合的切割剂以切割所述可切割表面活性剂的逆流介质。
认为MS-兼容性表面活性剂的使用不限于MS应用，但MS-兼容性表面活性剂也可在本发明的任何自由流动电泳方法之后的其他分析应用中存在。因此，本发明也提供了用于分析分析物的方法，其包括本文所述的自由流动电泳分离和由自由流动电泳获得的至少一个级分的随后分析，所述自由流动电泳包括选自但不限于下列的技术：自由流动电泳、凝胶电泳、1D-和2D-PAGE、MS、MALDI MS、ESI MS、SELDI MS、LC-MS(/MS)、MALDI-TOF-MS(/MS)、ELISA、IR-光谱法、UV-光谱法、HPLC、Edman测序、NMR谱、表面等离子体共振、X射线衍射、核酸测序、电印迹、氨基酸测序、流式细胞术、圆二色和它们的任意组合。一优选的实施方式涉及用于分析分析物的方法，其包括：包含至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂的使用的自由流动电泳分离，其中所述表面活性剂包含在样品介质和/或至少一种分离介质中；及由自由流动电泳获得的至少一个级分的随后分析，其中所述随后分析选自：自由流动电泳、凝胶电泳、1D-和2D-PAGE、MS、MALDI MS、ESI MS、SELDI MS、LC-MS(/MS)、MALDI-TOF-MS(/MS)、ELISA、IR-光谱法、UV-光谱法、HPLC、Edman测序、NMR谱、表面等离子体共振、X射线衍射、核酸测序、电印迹、氨基酸测序、流式细胞术、圆二色和它们的任意组合。
当目的分析物为蛋白或多肽，可在自由流动电泳步骤之前或之后进行所述蛋白或多肽的消化步骤。本领域技术人员已知如何进行蛋白消化步骤，例如使用胰蛋白酶。也不需要去除在自由流动电泳中使用的MS-兼容性表面活性剂以进行所述消化步骤。与之相反，所述表面活性剂的存在甚至可提高所述消化，而例如应在所述消化步骤前至少去除部分尿素。
在一本发明优选的实施方式中，使至少部分级分或至少部分样品经受蛋白消化步骤。可在通过本发明的自由流动电泳分离的所述分离之前或之后进行所述蛋白消化步骤。
在某些实施方式中，在本发明的可切割表面活性剂的切割步骤之前或之后，从自由流动电泳步骤收集的至少一个级分中进行的蛋白消化步骤。
通常而言，可通过导致无或基本无样品损失的方法轻易实现非MS-兼容性部分的去除。本发明的纯化步骤通常选自蒸发、过滤和离心，以去除可切割表明活性剂的析出部分。本文所用的术语“基本无样品损失”指目的分析物的少于5％、优选少于1％、更优选少于0.2％且最优选少于0.1％可例如粘附在用于去除可切割表面活性剂的析出部分的滤器上，或可留在可通过离心去除的可切割表面活性剂析出部分的压缩物中，或可与可切割表面活性剂的部分或挥发性缓冲化合物一起蒸发。
因为不需要耗时和/或导致样品损失的纯化步骤，本身为MS-兼容性或可被切割而产生至少一个MS-兼容性部分和可选可轻易去除的非MS-兼容性部分的MS-兼容性表面活性剂的存在是有利的。因此，本发明的一优选实施方式涉及不需要纯化步骤以去除表面活性剂的方法，所述用于除去表面活性剂的纯化步骤选自：透析、层析、反相层析、离子交换层析、表面活性剂交换、蛋白沉淀、亲和层析、电印迹、液-液相萃取和固-液相萃取。换言之，不需使由本发明FFE分离获得的级分在随后下游分析之前经受所述纯化步骤。
设备和它们的元件
适于进行自由流动电泳分离的设备包含至少分离室和两个电极(阳极和阴极)。可将待分离的样品添加到在FFE设备的阳极和阴极间的分离空间中存在的分离介质中，或优选通常经在FFE设备中提供的专用样品入口分别导入FFE设备的分离空间。在图9中图示显示适于FFE的设备。使在图中被称作S1～S4的样品入口的适合位置例如位于流动方向中的电极和分离介质入口(12～16)间和垂直于流动方向的稳定化缓冲液入口(11和17)间。适于进行FFE分离的设备可还包含逆流入口(C1～C3)。
当将样品中的各种分析物流通驱动至FFE设备的出口端时，通过使用电场分离导入分离介质中的样品中的各种分析物。单独的分析物经多个收集出口/样品出口出分离室，并通常经单独的管道被引至任何类型的单独收集容器。在收集容器中，与分离介质和可选的逆流介质一起收集分析物。收集出口阵列的单独收集出口间的距离通常应尽量的小以提供合适的分级分离/分离。从所述收集出口的中心测量的单独分离出口间的距离可为约0.1mm～约2mm，更通常为约0.3mm～约1.5mm。
在各种实施方式中，分离介质入口数受设备设计的限制，且实践上可在例如1～7、1～9、1～15、1～40或甚至更高的范围内。样品入口数可在例如1～36、1～11、1～5、1～4或甚至1～3的范围内，而收集出口数可在例如3～384或3～96的范围内，但可依分离装置选择方便的数量。逆流介质入口数通常在例如2～9、或3～7的范围内。提供的入口和出口数通常取决于分离装置和分离空间的形状和尺寸。因此，应了解分离介质入口和出口的不同数量也是可能的。
在图9中，分离介质在两个电极(大箭头)间和沿着两个电极的长度以层流的方式流动(优选在倾斜或平的分离室内从下至上)。在一些实施方式中，通过出口附近的逆流(小箭头)使所述分离介质减速，而因此经出口以级分出分离室，即在一些实施方式中，将逆流介质导入到与电极间移动的总体分离介质和样品的连续流动方向相反的分离空间。将两种介质(分离介质和逆流介质)经分级分离出口排出或洗脱。
经样品入口将例如待分离的蛋白样品导入分离介质中并通过分离介质的层流运输。当在连续操作的条件下运作时，将蛋白混合物进行连续的电泳分离，并依据分离介质的特性和由分离介质中电极间产生的电场所致的样品中分析物的空间分离在不同的级分中收集。当在批量或不连续的操作模式(例如静态间隔模式)下运作时，可将样品收集进具有可依电泳过程的特征和需要调整的可变室尺寸的不同级分中。
在本领域已知合适的FFE装置，并以BDTM自由流动电泳系统(BD GmbH，德国)的名称销售。另外，在包括美国专利5,275,706、美国专利6,328,868、在审已公开的美国申请US 2004/050697、US2004/050698、US 2004/045826和US 2004/026251、及国际申请PCT/EP2007/059010(其要求美国临时申请USSN 60/823,833和USSN60/883,260的优先权)的大量专利申请中已描述了可与本发明的分离和稳定化介质一起使用的合适的FFE装置，上述全部文献通过引用整体并入本文。
FFE方法和模式
本领域技术人员已知许多FFE操作方法且其在本发明中涉及。例如，可依据包含在样品中的分析物的pI(等电聚焦(IEF))、分析物的净电荷密度(区带电泳(ZE))或分析物的电泳迁移率(等速电泳(ITP))分离样品。
此外，本领域技术人员已知许多FFE操作方法且其在本发明中涉及。例如，当在FFE设备的阳极和阴极间施加电场(“连续模式”)时，可连续驱使样品和分离介质至出口端。认为在FFE中的连续模式指注入步骤和分离步骤可连续和同时的发生。当介质和分析物流经不同种类正在被分离(依据其pI(IEF)、净电荷密度(ZE)或电泳迁移率(ITP))的电泳室时发生电泳分离。连续模式的FFE允许分析物的连续注入和回收，而不需要进行许多独立的“运行”(可将一次运行理解为一系列的样品注入、分离和随后的收集和/或检测)。应认为连续模式的FFE包括分离技术，其中当分析物流经电极间的分离空间时与初始总体流速相比，总体流速降低(但未停止)以增加分离的时间。在后一种情况中，然而因为总体流速的降低仅对有限数量的样品有意义，不再能谈及真正的连续模式。
在本领域也已描述了与FFE应用有关的称作“间隔模式”或“静态间隔模式”的另一FFE操作模式。例如，在美国专利6,328,868显示了非连续(即间隔)偏转电泳的过程，其公开内容通过引用并入本文。在所述专利中，将样品和分离介质都导入到电泳室中，然后使用电泳模式(如区带电泳、等速电泳或等电聚焦)将其分离，最后经分级分离出口将其从所述室排出。′868专利的实施方式描述了单向的、从所述室的入口端向出口端移动的分离介质和样品运动。不同于传统的毛细管电泳，所述方向也被狭长电极的取向所共享。在所述静态间隔模式中，例如在′868发明中，仅当电场关闭或至少当电压对电泳迁移无效时(即当无部分样品经受有效的电场时)，由泵或其他一些射流位移元件所致的电极间样品的加速发生。
换言之，当施加电场以实现分离时，所述间隔过程的特征为将样品和介质导入电泳设备的分离室的装载阶段、并随之包含样品的介质的总体流动暂停的分离过程。在样品的分离/分级分离后，电场被关闭或降低至无效，总体流动再次启动以便将分级分离样品驱使至出口端且随后在合适的容器(例如，在微孔板中)中收集/检测。
在国际申请PCT/EP2007/059010(其要求美国临时专利USSN60/823,833和USSN 60/883,260的优先权)中已描述了本文所用的在FFE中的所谓循环或循环间隔模式，其通过引用整体并入本文。总而言之，循环间隔模式的特征为，当样品保持在狭长电极间的电场中时，总体流动方向的至少一次和可能的多次反转。相比于静态间隔模式，样品始终在运动从而允许更高的场强和因此更好(或更快)的分离。此外，通过反转狭长电极间样品的总体流动，可大大增加电场中分析物的滞留时间，从而提供了增加的分离时间和/或更高的分离效率和更好的分辨率。尽管实际原因和在短时间内获得分离的需求通常限制了以所述模式进行的循环数，可依特定环境下所需的经常重复反转成平行于狭长电极任一方向的总体流动(称为一个循环)。
因此，在一优选的实施方式中，通过等电聚焦、区带电泳或等速电泳实现本发明的自由流动电泳分离，且所述操作模式优选自连续模式、静态间隔模式或循环间隔模式。换言之，本文特别涉及了各组合(IEF、ZE、ITP和连续模式、静态间隔模式或循环间隔模式)。
在施加电场期间的典型的分离时间(介质中分析物的渡越时间)在几分钟～约1小时/FFE分离运行的范围内，但在某些条件下达到两小时的更长分离也是可能的。样品中分析物的渡越时间取决于FFE室的设计和流经FFE设备的总体分离介质流速，且通常为至少10分钟。概括而言，以ZE模式进行的分离通常比以IEF模式进行的更短，尤其当以可基本上将渡越时间延长如所需久的循环间隔模式运作时，且只有在分离空间中的条件在分离期间保持充分恒定。
在已经实现样品中分析物的所需分离或分级分离后，通常关闭电场并随后从FFE装置、通常以合适的级分数收集分离/分级分离的目的分析物(制备应用)或至少通过合适的方法在合适的容器(例如在微孔板中)检测(分析应用)。正如显而易见的，尤其对于制备应用(本文中其指包括需要有分析物的下游分析应用(如MS))，所述MS-兼容性两性离子或极性表面活性剂提供了优势即可为随后分析方便和快速制备收集的样品。
本发明另一方面也涉及MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂用于自由流动电泳的用途。在一些实施方式中，所述MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂为MS-兼容性可切割两性离子或非离子表面活性剂。
本发明另一方面还涉及适于本发明的包含至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂的自由流动电泳分离的分离介质的用途。在优选的实施方式中，所述分离介质选自但不限于：A/B分离介质、挥发性介质和互补多配对缓冲介质。
用于自由流动电泳(FFE)的合适的缓冲系统
依据本发明的实施方式各种缓冲系统对形成pH功能分布是有用的。所述缓冲系统可选自但不限于可商购的两性电解质(例如由ServaElectrophoresis GmbH，德国以名称为
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出售)、互补多配对缓冲系统(例如由BD GmbH、德国出售的BD FFE分离介质1和2)、挥发性缓冲系统和称作A/B介质的二元缓冲系统。
在本发明优选的实施方式中，包含至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂的分离介质的缓冲系统选自下文更详细描述的A/B介质、挥发性介质和互补多配对介质。
包含在美国在审临时申请60/945,246中描述的挥发性分离介质和MS-兼容性表面活性剂的方法尤其提供了优势，即可直接将从自由流动电泳步骤分离的样品用于随后的分析(如MS)而不需要除切割的MS-兼容性表面活性剂的非MS-兼容性部分的可选的轻易去除和/或缓冲化合物的蒸发之外的任何纯化步骤。
因此，本发明一优选的实施方式为包含挥发性缓冲系统和MS-兼容性两性离子或非离子极性表面活性剂的方法。包含所述组合的级分可通过经简单的方法(如蒸发)去除挥发性缓冲化合物而轻易的进一步浓缩，或为除(如果需要)切割的MS-兼容性表面活性剂的非MS-兼容性部分的去除之外无需进一步的纯化步骤的例如MS分析中的随后使用而直接制备。
本文所用术语“缓冲系统”指单-、双-或三-质子/碱性化合物的混合物，其能通过少量酸或碱的添加或通过稀释来维持处于基本恒定的pH值的溶液。
本文所用的“缓冲化合物”指单独或与第二或额外的化合物一起形成缓冲系统的化合物。
各介质组分优选包含具有小于或等于约40×10-9m2/V/sec，和更优选甚至小于30、25或甚至20×10-9m2/V/sec的电泳迁移率的阴离子和阳离子。
本文所用术语“分离介质“指适于在适于进行自由流动电泳方法的设备内形成分离区的缓冲介质。本文描述了许多有用的分离介质。
认为本文所用“分离区“位于适于进行自由流动电泳分离的设备的两个电极之间。通过至少一种分离介质形成分离区。典型的分离区在每一边上可由稳定化介质、聚焦介质或电极介质所包围。
本文所用术语“逆流介质”通常为水介质(如分离介质或它们的一部分)(例如仅水)，但还可包含添加剂(如表面活性剂)。此外，所述添加剂可为切割本发明表面活性剂的物质，例如，如碱或酸、氟或含氟化物的化合物或能切割可切割表面活性剂的任何其他化合物。在另一实施方式中，与分离介质相比，逆流介质可具有不同的pH。例如可通过与在分离介质中也使用的所述缓冲化合物的浓度相比而改变逆流介质中至少一种缓冲化合物的浓度来达到不同的pH。此外，可通过添加强酸或强碱改变pH。在一优选的实施方式中，用于逆流介质的缓冲系统选自A/B介质、挥发性介质和互补多配对介质。不同的pH可造成可切割表面活性剂的切割或可改变分离介质的pH至其中酸敏或碱敏表面活性剂为更稳定，即与分离介质的pH相比其基本不切割或更慢切割的pH。
所谓“稳定化介质”通过防止不良作用或假象起到稳定分离室中的电化学条件的作用，否则可在电泳分离过程期间尤其在自由流动电泳中可观察到的所述不良作用或假象。所述稳定化介质通常位于电极的附近，即分别在阳极/阴极和分离区之间。本文所公开的稳定化介质通常比与所述稳定化介质协同使用的分离介质有更高的电导率。更高的电导率防止在分离区和电泳装置的电极区室间的交叉污染，且也起到避免电极处分离的颗粒或分析物的有害积累。此外，可从分别在阳极和阴极附近存在的稳定化介质补充或补足在分离介质中需要的所有化合物(如离子、添加剂等)。
稳定化介质的特征通常为具有比邻近所述稳定化介质的分离介质中的电导率更高的电导率。所述电导率可被提高2倍、优选3倍并最优选大于3倍。通过各种途径，例如通过添加更多的导电性离子到稳定化介质或通过与在上文进一步详述的分离介质中所述缓冲化合物的浓度相比而提高稳定化介质中缓冲化合物的浓度、或通过添加强酸或强碱达到分离介质和稳定化介质间在电导率上的不同。例如，可通过添加强碱实现阴极稳定化介质的电导率的提高，或通过添加强酸实现阳极稳定化介质的电导率的提高。所述强酸或强碱可选自但不限于：NaOH、KOH、H2SO4或H3PO4。
尽管稳定化介质的电导率比相邻分离介质的电导率更高，但取决于分离问题的情况，稳定化介质的pH可比相邻分离介质的pH更高、几乎相等或甚至更低。例如，阳极稳定化介质具有与邻近所述阳极稳定化介质的分离介质的pH相等或较之更低的pH，或阴极稳定化介质具有与邻近所述阴极稳定化介质的分离介质的pH相等或较之更高的pH。稳定化介质的缓冲化合物与分离介质的缓冲化合物可相同或不同。
在本发明的某些实施方式中，可以平行模式进行至少一种分析物的分离，即可在适于进行自由流动电泳的设备的分离室内同时分离两种样品。对于后者，需要在适于进行自由流动电泳的设备内通过电极间稳定化介质的优点物理分离分离区。本文所用的术语“电极间稳定化介质”指由两种必备组分(一种阴极电极间稳定化介质和一种阳极电极间稳定化介质)组成的介质。术语阳极和阴极的使用涉及分别在分离区和阳极及阴极间相应的命名为电极间稳定化介质的相对位置是显而易见的。例如，典型的顺序(从FFE设备的阳极到阴极)为稳定化介质、分离区和然后阴极电极间稳定化介质、随之为阳极电极间稳定化介质、第二分离区和最后为(阴极)稳定化介质。在上述的例示设备中，阴极电极间稳定化介质比阳极电极间稳定化介质更接近FFE设备的物理阳极。例如在国际申请PCT/EP2007/056167(要求US临时申请USSN60/805,248和USSN 60/821,491的优先权)中公开了所述平行模式。
当实施本发明的上述实施方式时，在多个分离区间中可通过将电极间稳定化介质的两种组分导入FFE设备来便利地建立电极间稳定化区。
通常而言，所述电极间稳定化介质具有比邻近所述电极间稳定化介质的第一和第二分离区更高的电导率，从而防止了分离区间离子种类的交换及邻近分离区内的阳极和阴极电极间稳定化介质的阴离子和阳离子种类的交换。
本文所用术语“聚焦介质”指包含阳极聚焦介质的酸或阴极聚焦介质的碱(其形成关于邻近pH函数、pH梯度或pH分离坪的电导步骤)的、形成聚焦区(其中由于电导步骤，分析物向阳极或阴极的运动基本被降低至零)的介质。选择酸或碱的浓度以优选至少2倍和更优选至少3倍、至少5倍或甚至更多倍的充分提高涉及邻近pH分离坪、pH梯度或pH函数的所述聚焦介质的电导率。因分别移动至阳极或阴极的分析物的迁移基本被降低至零，在介质电导率上的陡然提高对积累具有与在有不同电导率值的两种介质的边界处的pH分离坪上分离的分析物pI相比的不同pI的分析物是有用的。
互补多配对缓冲系统
在本发明的某些实施方式中，用于产生pH梯度的缓冲混合物可由仔细匹配的酸和碱组成，以便当电流流经缓冲系统时所述混合物可提供平稳的pH梯度。选择低分子量有机酸和碱的混合物，而与可商购的高分子量两性电解质相比，其能提高缓冲的能力。可从分子量、pI、纯度和毒性方面极好的表征所述仔细配对的酸和碱的混合物。通常而言，酸和碱有比可商购的两性电解质更小的分子量。本领域已知合适的互补多配对缓冲系统。具体而言，BD GmbH Germany以BDFFE分离介质1出售具有3～5的pH范围的混合物而以BD FFE分离介质2出售具有5～8的pH范围的混合物。已在例如美国专利申请US 2004/0101973和在EP-A-1 320 747中以一般形式描述了所述缓冲系统，其通过引用整体并入本文。上文所述的互补多配对缓冲系统在本文被称为“CMPBS”或“CMPBS介质”。
挥发性缓冲系统
在本发明的其他实施方式中，可使用挥发性缓冲系统以进行样品的自由流动电泳分离。在美国在审临时申请60/945,246公开了所述缓冲系统并提供了具体的优势，即在FFE分离步骤后其可从回收的分级分离样品中无残余物的去除或其本身为MS-兼容性的且可在样品中保留。
认为本发明实施方式的挥发性分离介质代表即用形式的组合物，优选水性组合物，其包括：包含至少一种缓冲酸和至少一种缓冲碱的缓冲系统，其中所有缓冲化合物为挥发性的。可选地，尤其在MALDI应用中，所述缓冲化合物中的至少一种能起作为质谱(挥发性)基质的作用。
认为本文所用与缓冲化合物有关的术语“挥发性”指在合适的条件下可从水样品中完全去除缓冲化合物的能力，即可蒸发所述缓冲化合物而不留下任何残余的化合物(例如盐)，即无残余物。以其最广泛的含义，可在选自但不限于降低大气压、升高温度、通过照射(例如UV光或通过使用激光)供应能量或它们的任何组合的条件下无残余物地去除本发明实施方式的挥发性缓冲化合物，但应了解在FFE工作条件下挥发性缓冲化合物必需为基本非挥发的(即如上文所解释的大气压和通常在0℃和40℃之间的温度范围)。
在本文中，本领域技术人员应了解在本发明的一实施方式中，在上文提及的条件下在包含挥发性缓冲化合物的样品中存在的分析物应为非挥发性的，即分析物基本未经修饰(例如通过片段化或氧化)并保留在溶液中或以其固态保留。在某些实施方式中，尤其在质谱工作条件下，所述分析物也为挥发性的且可电离(需要通过MS的检测)。
本文所用术语“在FFE工作条件下的非挥发性”指在工作条件下和在FFE分离阶段期间，导致分离介质中各缓冲化合物少于5％w/v或优选少于2％w/v的浓度降低的缓冲化合物的挥发能力。最优选，在工作条件下和在FFE的分离阶段根本观察不到浓度降低。
认为本发明含义下的术语“无残余物”为挥发性化合物本身完全蒸发，但例如由所使用物质的杂质造成的残余物可为非挥发性的。然而，本领域技术人员熟知仅将具有可用的最高纯度级的化合物用于分析的目的，尤其用于质谱分析。
认为本文所用的通过“蒸发”进行溶剂和缓冲化合物的去除指经通过适当方法将所述化合物转变成气相并随后将所述气相排出而在目的分析物中进行的去除。因此，本文所定义的蒸发不同于通过包括柱层析、透析或截止过滤方法的通常被称为缓冲液交换(有时也被称为“脱盐”)的技术或已知的固相萃取或分析物析出技术去除所述缓冲化合物。另外，在术语蒸发下不包括的某些申请中，仅用水即可将以盐形式存在的所述缓冲化合物洗走，但这显然造成了样品材料不需要的损失和此外缓冲化合物的非定量去除。本领域技术人员应了解通过所述缓冲液交换或固相萃取技术也可至少基本上去除本文所定义的挥发性缓冲化合物，但其当然忽视了由所述缓冲物的挥发能力提供的明显优势(和鉴于与缓冲液交换技术相关的潜在问题，例如困难的处理和低的样品回收，其没有意义)。
通过蒸发从由FFE分离步骤收集的样品中去除溶剂和挥发性缓冲化合物的适当例示技术包括，但不限于使用适当的装置(如离心式蒸发器或已知的真空离心机(例如名为
Figure BPA00001162648200301
的))进行的真空离心、通过冷冻干燥或通过水样品的(温和)加热。蒸发溶剂和缓冲化合物的其他可能性包括通过使样品经受降低的压力条件的蒸发，例如对在质谱分析中使用的靶板上放置的样品施加真空。本领域技术人员应了解大多数质谱方法在真空条件下(例如真空MALDI)操作以便在将样品导入MS仪器之后，但在电离之前便利的去除挥发性缓冲化合物。
优选在降低压力和/或升高温度的条件下去除挥发性缓冲化合物。此外，在其他实施方式中，甚至可在环境温度和大气压条件下蒸发所述挥发性缓冲化合物，尤其如果所述含挥发性缓冲物的样品以少量存在(例如对于质谱分析)。然而，在大多数情况下，至少一些缓冲溶液在所述条件下不会轻易的蒸发。在另一实施方式中，只能在更苛刻的条件下(例如在真空和/或高温、可选的使用照射(例如在质谱工作条件下))去除挥发性缓冲化合物。
在本发明的某些实施方式中，所述FFE分离介质包含挥发性缓冲化合物，其中所述挥发性缓冲化合物中的至少一种可起到质谱分析的(挥发性)基质的作用，即只可在质谱工作条件下去除所述化合物。认为本文所用的在质谱(MS)中的术语基质不同于在电泳中所用的术语“基质”(例如聚丙烯酰胺或琼脂糖)。因此，在其中下游分析为例如MALDI应用的一些实施方式中，在质谱分析之前将用于MALDI分析的基质组分添加到分析物的缓冲溶液中。
挥发性缓冲系统的例子包括但不限于下列之组合：TRIS/乙酸、二乙醇胺/吡啶酸、二甲氨基丙腈/乙酸、二吡啶乙醇/吡啶酸、苄胺/2-羟基吡啶、三正丙胺/三氟乙醇等。
二元缓冲系统(A/B介质)
下文所定义的二元缓冲系统在本文指“A/B介质”且在共同在审的美国临时申请USSN 60/885,792中更详细的公开。所述分离介质包含至少一种缓冲酸和至少一种缓冲碱，但条件是缓冲酸的pKa值必需比分离介质的pH更高且缓冲碱的pKa比分离介质的pH更低。换言之，缓冲酸的pKa值比缓冲碱的pKa更高。
由分离介质显示的pH分布基本为线性(即在电泳分离期间无任何主要的pH梯级)。取决于使用的稳定化介质及缓冲酸和缓冲碱间的pKa差异，本发明所述方面的A/B分离介质在分离室内提供了基本恒定的(即平坦的)pH分布，或相当温和/平坦的pH梯度。应了解在电极间的分离室中提供了具有基本恒定pH的区域的所述分离介质对依据本文所述方法的pH分离坪的建立特别有用。然而，因所述A/B介质也可形成平坦或超平坦的pH梯度，其可被用于本文所定义的pH函数或pH梯度的建立。
优选使用在本发明上述一方面中的至少一种缓冲酸和一种缓冲碱的A/B介质的特征为约0.5～4个pH单位之间的至少一种缓冲酸和至少一种缓冲碱间的pKa差异，其中所述酸的pKa必需比上文所解释的碱的pKa高。在优选的实施方式中，ΔpKa在1.2和1.8之间，其对在FFE设备的分离室内具有恒定pH的pH分离坪特别有用。在其他实施方式中，ΔpKa在约2.5和3.3之间，而后者特别适于平坦的pH梯度。
所述A/B介质的一个特征为所述介质的电导率相对低，但应了解所述电导率必需足够高以在合理的时间量内完成分析物可接受的分离。因此，所述A/B介质的电导率通常在50和1000μS/cm之间，且更优选在50和500μS/cm之间，但本领域技术人员应知道在分离介质中的精确电导率当然取决于分离/分级分离问题的细节、介质中其他带电荷物种的存在(例如，样品/分析物稳定性所需的离子)和分析物的电化学特性。
优选所述A/B介质仅包含一种缓冲酸和一种缓冲碱。换言之，所述分离介质代表了二元介质，其中化合物的一种酸功能和同一或另一化合物的一种碱功能基本起到制定具有所需pH和电导率分布的分离介质的作用。当也可在分离介质中用两种或更多的缓冲酸和缓冲碱达到好的结果时，使用尽可能少的组分通常是有利的，这不仅因为其更易于制备且可能更廉价的使用，并且因为如果增加了在分离室中存在的带电荷物种数，介质的电化学特性将更复杂。
在共同在审的美国临时申请USSN 60/885,792中更详细的描述了A/B介质的概念，其通过引用整体并入本文。在本文中适合的缓冲碱为例如：牛磺酸、甘氨酸、2-氨基丁酸、甘氨酰甘氨酸、β-丙氨酸、GABA、EACA、肌酸酐、吡啶乙醇、吡啶丙醇、组氨酸、BISTRIS、吗啉乙醇、三乙醇胺、TRIS、3-丙二醇、苄胺、二乙氨基乙醇、三烷基胺等。合适的缓冲酸为例如：HIBA、乙酸、吡啶酸、PES、MES、ACES、MOPS、HEPES、EPPS、TAPS、AMPSO、CAPSO、α-丙氨酸、GABA、EACA、4-羟基吡啶、2-羟基吡啶等，其要满足如上所述的缓冲酸和缓冲碱间的pKa关系。
此外，在本发明的方法中也可使用在例如美国专利5,447,612中所公开的用于通过FFE分离分析物的二元缓冲系统。所述二元介质适合于形成0.4～1.25个pH单位之间的相对平坦的pH梯度。
添加剂
适于本发明的方法的分离介质还包含一种或多种添加剂。本发明实施方式的添加剂为对由缓冲酸和缓冲碱所提供的缓冲能力无(或至少无显著)贡献的化合物或离子。通常而言，应保持添加剂的数量和浓度最小，但应了解某些分析物或分离问题需要有额外的化合物以维持分析物的完整或达到介质所需的特性(例如在各种分离介质间的粘度适应性等)。
可能的添加剂优选选自其它的酸和/或碱、所谓“必需的”单价和二价阴离子和阳离子、粘度增强剂、亲和配体等。
本申请含义中必需的单价和二价阴离子和阳离子为维持样品中分析物的结构和/或功能完整所需的离子。所述必需的阴离子和阳离子的例子包括，但不限于：镁离子、钙离子、锌离子、Fe(II)离子、氯离子、硫酸根离子，磷酸盐离子或络合剂(如EDTA或EGTA)、或叠氮根离子(如用于避免细菌污染)等。
可能的酸和碱的例子包括少量在溶液中完全离解的强酸或强碱(例如NaOH、HCl等)、或在介质中以基本非离解的种类存在的非常弱的酸或碱(即具有远离介质pH多于约4个单位的pKa)。
在分离介质中常用的粘度增强剂可包括多元醇(如甘油或各种PEG)、亲水性聚合物(如HPMC等)、碳水化合物(如蔗糖)、透明质酸等。需要粘度增强剂来将分离介质的粘度调整至导入到分离空间内的样品的粘度或至在分离室内其他分离和/或稳定化介质的粘度以避免由样品和介质间或不同相邻介质间的密度或粘度差异引起的湍流。
可存在的额外添加物包括手性选择剂(如包括环糊精的某些糊精)、或亲和配体(如凝集素)等。
在某些情况中，需要添加还原剂以防止溶液中分析物的氧化。可添加到样品和/或分离介质中的适当还原剂包括：巯基乙醇、巯基丙醇、二硫苏糖醇(DTT)、抗坏血酸、偏亚硫酸钠或偏亚硫酸钾等。
在任何情况下，因为许多上文提及的添加剂是带电荷的，应维持其如所需高的浓度，但同时尽可能的低以维持在所需(低)范围内的分离介质的电导率。
应注意无论如何应避免在挥发性缓冲液部分中所述的任何条件下为不挥发或潜在干扰随后分析(例如MS分析)的添加剂。
试剂盒
可使用在本文涉及的方法中所用的表面活性剂作为样品介质的一部分和/或至少一种分离介质的一部分，这对本领域技术人员而言是显而易见的。
因此，本发明一方面还涉及用于进行本发明实施方式的样品中分析物的FFE分离(如IEF、ZE和ITP)的试剂盒，其中所述试剂盒包含至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂。在一实施方式中，至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂为可切割表面活性剂。
认为递送所述表面活性剂作为介质的一部分或分别进入一个或多个容器中
除了至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂之外，试剂盒可还包含一种或多种分离介质。可将所述介质递送进一个或分别递送进多个容器中。如果提供了多于一个的容器，至少两个容器中可含有相同的介质或所有批可分别含有不同的介质。分离介质数在1和15之间，或3和12之间，或4和9之间。
在一本发明优选的实施方式中，在试剂盒中的分离介质选自但不限于：A/B缓冲介质、挥发性缓冲介质和互补缓冲配对介质。试剂盒可包含许多不同的介质组合，例如挥发性缓冲介质和多配对缓冲介质。此外，分离介质还包含添加剂，例如：表面活性剂、粘度增强剂、“必需的”阴离子和阳离子等。
当试剂盒包含包含A/B介质的分离介质时，在一实施方式中优选所述A/B介质能形成分离区，其中在电泳期间FFE设备的分离室内最小pH和最大pH间的差异小于约0.2，并优选小于0.1个pH单位。此外，优选在电泳期间所述pH应基本恒定。包含所述A/B介质的试剂盒尤其是进行自由流动区带电泳的佐剂，即所述试剂盒将在自由流动区带电泳中使用。
在本发明的另一实施方式中，优选所述A/B介质能形成分离区，其中在电泳期间在分离室内的电极间所述pH形成基本线性的梯度，且在另一实施方式中，优选所述A/B介质能形成分离区，其中在电泳期间在分离室内所述pH基本上是非线性的。所述试剂盒将适于在自由流动等电聚焦中使用。
当试剂盒包含含有挥发性缓冲介质的分离介质时，优选在减压下至少一种缓冲化合物是挥发性的、在温度升高时是挥发性的、当经受照射时是挥发性的、或在质谱工作条件下是挥发性的。
除了本发明的一种或多种分离介质和至少一种表面活性剂外，本发明实施方式的用于进行FFE方法的试剂盒还包含至少一种上文所定义的稳定化介质。所述稳定化介质可为阴极稳定化介质和/或阳极稳定化介质。它们通常分别位于阳极/阴极和分离介质之间。
因为阳极和阴极的稳定化对于成功的电泳应用，尤其在FFE中都尤其有用，除所述分离介质以外，所述试剂盒优选包含本文所定义的一种阳极和一种阴极稳定化介质。
在本发明的一些实施方式中，稳定化介质位于两个pH函数分布之间，其能在包含两个电极的FFE设备内同时进行不同样品的平行分离。
在进一步的实施方式中，试剂盒还包含本文所定义的至少一种聚焦介质。
在其他的实施方式中，试剂盒还包含对选择性切割一种或至少一种可切割MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂有用的制剂。所述制剂可为固体化合物或固体化合物的混合物或溶液以例如改变在包含样品或部分样品的溶液或包含适于切割本发明的可切割表面活性剂的化合物的溶液中的pH。
应认为在本发明的某些实施方式中，所述试剂盒优选包括给定的电泳分离所需的所有介质或化合物，例如阳极和阴极稳定化介质、及分离介质(其由上文所解释的许多亚级分组成)和/或切割可切割表面活性剂的制剂。在所述实施方式中，当然选择所述分离介质和稳定化介质以用于预期的规程。
所述试剂盒包含作为预备在本发明的自由流动电泳中使用的一种或更多种水溶液的各种介质(即所有的组分以电泳分离问题所需的浓度存在)，或其可包含在其使用前待用预定量的溶剂稀释的浓缩溶液形式的一种或多种介质。所述储存溶液优选具有比在本发明自由流动电泳中使用的浓度高1.5×、2×、2.5×、3×、4×、5×、6×、10×、20×、25×、50×、75×、100×、150×、200×和1000×的浓度。
另外，所述试剂盒可包含干燥形式或冷冻干燥形式的一种或多种介质和/或组分，其待用溶剂(优选水)溶解至在本发明的自由流动电泳方法中使用的合适浓度。
本发明的试剂盒包含在许多，但优选在一个容器中的介质的各种成分，然后在用于电泳分离过程用前用预定量的溶剂将其复原。
认为在本发明的试剂盒中包括本文所述的所有优选的分离介质及优选的阴极和/或阳极稳定化介质和聚焦介质。
通常各介质(分离介质、阴极稳定化介质、阳极稳定化介质、逆流介质等)优选存在于分开的容器中，即所述试剂盒的各组分、各干燥组分和/或各储存溶液分别放置在密封的容器中，但在某些情况下其他的组合和包装选择是可能和有用的，这对本领域技术人员而言是明显的。例如用于IEF应用的分离介质可由不同量的具有不同浓度成分(及因此而不同的pH)的“亚级分”组成以在电泳设备内产生预形成的pH梯度。在一实施方式中，用于形成梯度的各分离介质的pH是不同的。在IEF应用中使用的亚级分数取决于分离问题、用用于分离的所述分离介质和电泳设备达到的所需pH跨度。在FFE应用中，所述设备通常包含许多介质入口(例如N＝7、8或9个入口)，以便将在设备内产生分离空间的亚介质导入到至少一个至最大N-2个入口(如果存在，通常为稳定化介质在各边上预留至少一个入口)。因此被插入到适于FFE的设备中的分离介质数通常为2～15之间，或3～12之间，或4～9之间。
在特别优选的实施方式中，由包含一种缓冲酸和一种缓冲碱的二元缓冲系统形成试剂盒中的分离介质。希望无论是否优选，在本发明的试剂盒中可包括上文所述的所有分离介质。
为了对各种数量和递送形式的合适介质和/或其他化合物作进一步的说明，试剂盒可包含描述一个或更多个实验规程的产品手册及可选的所述组分的储存条件。
通常而言，本发明的试剂盒在本文所述的自由流动电泳分离规程中是有用的。
只要不背离本发明的精神和范围，本文所述实施方式的许多修饰和变化是可能的，这对本领域技术人员而言是显而易见的。在下面的非限制性实施例中进一步描述本发明和其优势。
实施例
实施例1：用和不用PPS进行非洲岩蟒血清的分离
从非洲岩蟒中抽取血清。在分离介质中以1∶10的比例稀释血清样品。所述分离介质仅包含熟知与MALDI-TOF兼容的缓冲组分。此外，使用PPS(一种MALDI-TOF兼容性可切割表面活性剂)对样品及分离介质进行一次实验。
在BDTM自由流动电泳系统上以自由流动等电聚焦(FF-IEF)模式进行所述样品的分离。将设备设置成包含9个介质入口(E1～E9)和4个样品入口(S1～S4)。将阳极稳定化介质导入到入口E1中。将阴极稳定化介质导入到入口E9中并经样品入口S2导入样品。施加的电压为550V和电流为105mA。分别以2ml/h和150ml/h的流速导入样品和介质。
在FFE设备内的分离和稳定化介质：
Figure BPA00001162648200371
阳极稳定化介质：1567mM HAc/450mM Tris(pH＝4.11；电导率：6610μS/cm) (E1)
阴极稳定化介质：450mM HAc，900mM TRIS(pH＝8.23；电导率：6220μS/cm) (E9)
逆流介质：水(CF1～CF3)
上文所述分离介质为挥发性分离介质，即所述缓冲化合物为MS-兼容性的或可在MS分析之前通过蒸发去除。
在所述两个实验的每个中收集96种级分。从各级分取出0.2mL用于SDS-PAGE。在图1中示分离样品(有PPS的一种样品、无PPS的一种样品)的各第二级分的SDS-PAGE胶图像(银染)。
尽管分离图案看起来相当相似，在分离介质中无表面活性剂的分离室中观察到一些沉淀。在分离介质中使用0.1％PPS时其较不显著。
所述分离介质完全无甘油和已知干扰MALDI-TOF测量的其他组分。因此可将级分直接使用到MALDI靶。在图2中示级分26的25kDa蛋白的质谱。
实施例2：用和不用PPS进行从HELA细胞产生的肽的分离
将含有PPS的样品(和FFE方法)的分离模式与无PPS的样品(和FFE方法)的分离模式相比较以确定用于FFE的两性离子表面活性剂(如PPS)的适用性。在一实施例中，在HBS缓冲液(10mMHEPES pH7.9、1.5mM MgCl2、10mM KCl+蛋白酶抑制剂完全迷你片剂(1片用于10ml；Roche#11836153001))中超声处理两个108HeLa细胞样品。通过超速离心从不溶性细胞碎片(如膜和膜蛋白)中分离可溶性蛋白。
添加100mM碳酸氢铵缓冲液到上清中(可溶性蛋白3mg/ml)并添加TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)至5mM的最终浓度(温育60分钟)，然后添加IAA(碘乙酰胺)至15mM的最终浓度(温育60分钟)，添加胰蛋白酶(修饰的测序级，Promega)至1∶37.5的酶∶蛋白的最终比例，并在37℃最少温育4小时。通过用0.1％TFA(三氟乙酸)酸化溶液终止所述消化。
使用
Figure BPA00001162648200381
Vac 1 cct C18盒(水)纯化所述肽。所述方案包括用乙腈和0.1％TFA洗涤所述盒、装载样品、用0.1％TFA洗涤所述样品、用乙腈洗脱肽，并通过真空离心蒸发至干燥。在1ml分离介质中将第一种样品复原成3～8梯度，将第二种样品用1ml分离介质复原成3～8梯度和0.1％PPS。
本文所用3～8梯度为上文所述的互补多配对缓冲系统。
在BDTM自由流动电泳系统上以FF-IEF模式进行所述等电聚焦电泳。将设备装置成包含7个介质入口(E1～E7)和4个样品入口(S1～S4)。将阳极稳定化介质导入到入口E1和E2中。将阴极稳定化介质导入到入口E5至E7中，并经样品入口S2导入样品。施加的电压为400V和电流为29mA。分别以2ml/h和50ml/h的流速导入样品和介质。
在FFE设备内的分离和稳定化介质：
分离介质(E3～E4)：250mM甘露醇，35g/200ml Pro3～8
Pro3～8通常为如下的组合物：
  pH3～8   储存溶液(mM)   MW   250ml储存溶液(mg)
  HIBA   30   104.11   780.825
  异丁酸IBA   35   88.11   770.9625
  2-4-(吡啶基)-乙磺酸PES   40   187.21   1872.1
  MES   45   195.20   2196
  ACES   20   182.2   911
  MOPSO   50   225.27   2815.875
  MOPS   50   209.27   2615.875
  HEPES   50   238.31   2978.875
  EPPS   80   252.33   5046.6
  TAPS   100   243.28   6082
  无水甜菜碱   100   117.15   2928.75
  2-A-丁酸   80   103.10   2062
  尼克酰胺   60   122.13   1831.95
  甘氨酰甘氨酸   60   132.12   1981.8
  哌啶-4-碳酸   50   129.16   1614.5
  GABA   40   103.12   1031.2
  EACA(6-氨基己酸)   30   131.18   983.85
  3-(羟甲基)吡啶(4℃)   40   109.13   1091.3
  2-(2-羟乙基)吡啶   40   123.16   1231.6
  4-吡啶丙醇   35   137.18   1200.325
  BISTRIS   30   209.24   1569.3
  葡萄糖酸   25   196.16   1226
  N-乙酰甘氨酸   20   117.10   585.5
阳极稳定化介质：100mM H2SO4、30mM乙酰甘氨酸、200mM牛磺酸、50mM甜菜碱(pH＝1.2；电导率：24600μS/cm)(E1和E2)；
阴极稳定化介质：150mM NaOH、75mM乙醇胺、150mM AMPSO((N-(1，1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟丙基磺酸)、75mM TAPS((N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸)和30mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1--哌嗪乙磺酸)(pH＝9.2；电导率：7770μS/cm)(E5～E7)；
逆流介质：在水中的250mM甘露醇(CF1～CF3)
使用pH电极确定各FFE级分的pH，并在图3和图4中通过示意图显示。分离彩色的pI标记物以评估有和无额外PPS的互补多配对缓冲系统的缓冲系统的分离性能。在pH曲线间或在彩色pI标记物的分离模式中没有观察到显著的差异。在图3中报告了所述级分在λ＝420nm、515nm和595nm处的吸光度，其代表包含0.1％PPS的缓冲系统的各pI标记物的吸光度。表4示无PPS的缓冲系统的pI标记物吸光度分布。
消化含PPS的样品的级分，然后使其经受LC-MS/MS分析以证明在包含PPS和互补多配对缓冲系统的使用的自由流动电泳后蛋白的鉴定。
将TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)添加到150μl的各分离级分中以至5mM的最终浓度(温育60分钟)，然后添加IAA(碘乙酰胺)至15mM的最终浓度(温育60分钟)。添加5μg胰蛋白酶(修饰的，测序级，Promega)并在37℃过夜温育所述混合物。通过用200mM HCl酸化溶液终止所述消化。
取出不经纯化或样品浓缩的8μl各消化混合物以进行HPLC-MS/MS。
使用75μm×15cm融合的石英微毛细管反相柱(Agilent，美国)进行基于ESI的LC-MS/MS(HCTultra，Bruker，德国)分析。装载样品体积到前置柱(反相(C18)柱，Agilent，美国)上。在样品装载后，用2％B～40％B的梯度以200nl/min流速分析所述样品30分钟。直接将所述柱连接到喷雾针(New Objective，美国)。
流动相A为0.1％甲酸而流动相B为含有0.1％甲酸的100％乙腈。通过使用在一个MS扫描(300～1500m/z)和3个MS/MS扫描间更替的规程的质谱仪就CID选择从毛细管洗脱的肽。如果前体离子峰的强度超过了10000个离子量，就CID选择了在各检查扫描中的3种最丰富的前体离子。将电喷雾电压设定为1.8kV，并从2分钟的再分析中排除由CID片段化的肽的特定m/z值。通过HyStar(3.2版)数据系统(Bruker，德国)控制质谱扫描函数和HPLC溶剂梯度。
使用Mascot软件(Matrix Science Ltd.，U.K.)在发布号为3.18的IPI人数据库上搜索各MS/MS波谱。使用通过软件计算的概率得分作为正确鉴定的标准。鉴定所需的预期值小于0.05。个别肽的离子得分需高于15。此外，肽需要具有一内部漏失的允许切割位点而为可充分胰蛋白酶解的。包含甲硫氨酸氧化作为可变的修饰且MS的质量公差为1.5Da而MS/MS的质量公差为0.5Da。接受具有通过所述标准的至少一种肽的蛋白作为可能的鉴定。
如表1所示，在PPS存在下蛋白的鉴定和使用LC-MS/MS的互补多配对缓冲系统是成功的。
表1：使用与自由流动电泳组合的LC-MS/MS在级分28、30、40和48中鉴定的蛋白。
  级分   肽   Mascot得分   MS范围   蛋白分子量
  28   微管蛋白α-6链   423   16   50548.00
  膜联蛋白A1   234   12   38787
  假定蛋白DKFZp761K0511   219   7   85189
  热休克蛋白HSP 90-α2   203   4   98622
  烯醇酶1   194   9   47481
  14-3-3蛋白ζ/δ   162   14   27899
  过氧化氧化还原蛋白-5的线粒体亚型，线粒体   145   18   22298
  L-乳酸脱氢酶A链的亚型2   124   10   36953
  L-乳酸脱氢酶B链   119   4   36769
  膜联蛋白A2亚型1   91   4   40671
  过氧化氧化还原蛋白-6   82   5   25002
  酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单氧   80   8   28179
  14-3-3蛋白ε   77   7   29326
  NEDD8-缀合酶Ubc12   74   8   21172
  应力-70蛋白，线粒体前体   73   2   73920
  预测的：类似于平滑肌、α2、肌动蛋白   72   6   21340
  前胸腺素α   71   12   12196
  14-3-3蛋白γ   66   8   28325
  氯离子胞内通道蛋白1   59   20   27117
  醛酮还原酶家族1成员C3   58   6   37220
  内质网素前体   57   1   92696
  磷酸丙糖异构酶的亚型2   54   8   27320
  延伸因子2   52   2   96115
  预测的：类似于蛋白二硫异构酶   52   28   5539
  内质网蛋白ERp29前体   47   5   29032
  增殖相关蛋白2G4   47   4   43970
  Fascin   46   2   54992
  Transgelin-2   45   7   22417
  ACTA2蛋白(片段)   43   3   37125
  30   热休克70kDa蛋白1A   369   11   70280.00
  微管蛋白β-2链   323   9   50095
  微管蛋白β-2C链   305   9   50255
  氨甲酰磷酸合成酶的亚型1   260   3   165975
  热休克蛋白60   247   9   61346
  烯醇酶1   231   11   47481
  肌动蛋白，细胞质1   210   16   42052
  丙酮酸激酶3亚型1   198   13   58470
  乳酸脱氢酶A   184   16   36950
  热休克蛋白β-1   184   30   22826
  14-3-3蛋白σ   170   20   27871
  热休克同源71kDa蛋白的亚型1   161   6   71082
  蛋白S100-A11   140   23   11847
  输入蛋白β-1亚基   138   2   98420
  29kDa蛋白   136   9   29346
  延伸因子2   133   3   96115
  脂肪酸合成酶   132   2   275850
  异质核核糖核蛋白F   126   8   45985
  氯离子胞内通道蛋白1   120   20   27117
  转酮酶   105   4   68519
  Stathmin-2   101   10   20929
  结蛋白   99   4   53429
  磷酸激酶1   95   4   44854
  14-3-3蛋白θ   93   8   28032
  T型复合蛋白1亚基ε   88   3   60089
  假定蛋白DKFZp761K0511   87   3   85189
  10kDa热休克蛋白，线粒体   87   11   10794
  膜联蛋白A1   86   4   38787
  Cofilin-1   86   8   18588
  真核翻译起始因子4B   85   2   69167
  异质核核糖核蛋白H1   84   7   49484
  甘油醛-3-磷酸脱氢酶   83   4   36070
  55kDa蛋白   80   5   55328
  蛋白酶体激活复合物亚基2   76   5   27384
  酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单氧   76   5   28179
  原肌球蛋白4  72   9   28619
  Tu翻译延伸因子，线粒体  69   4   50185
  肽基脯氨酰顺反异构酶A  66   9   18098
  超氧化物歧化酶  65   8   16340
  14-3-3蛋白ζ/δ  63   4   27899
  磷酸甘油酸酯变位酶2  62   5   28788
  程序性细胞死亡5的短亚型  61   32   4472
  踝蛋白-1  60   0   273171
  超氧化物歧化酶[Mn]，线粒体前体  58   6   24878
  预测的：类似于异质核核糖核蛋白  57   3   26578
  三官能团嘌呤生物合成的长亚型  55   1   108953
  蛋白S100-A6  53   8   10230
  过氧化氧化还原蛋白-5的线粒体亚型，线粒体  53   12   22298
  Transgelin-2  52   11   22417
  L-乳酸脱氢酶B链  51   5   36769
  乙酰CoA羧化酶1  51   0   266469
  烟酰胺磷酸核糖转移酶的亚型1  46   5   55772
  蛋白SET的亚型1  46   4   33469
  蛋白二硫异构酶前体  45   2   57480
  果糖二磷酸醛缩酶C  43   7   39699
  果糖二磷酸醛缩酶C  42   3   0
  胸腺素β-10  41   18   4892
  核苷二磷酸激酶B  41   12   17401
  40   γ-烯醇酶  109   4   47450.00
  转酮酶  99   7   68519
  过渡内质网ATP酶  95   2   89819
  微管蛋白β-2C链  94   11   50255
  丙酮酸激酶3亚型1  88   8   58470
  异质核核糖核蛋白亚型1  78   3   51230
  含硫氧还蛋白域的蛋白5前体  76   4   48283
  钙网蛋白前体  75   8   48283
  脂肪酸合成酶  73   1   275850
  原肌球蛋白4  73   4   28619
 T型复合蛋白1亚基δ   68   2   58270
 预测的：类似于Ran特异性GTP活化酶   64   7   35344
 T型复合蛋白1亚基η   61   4   59842
 胸腺素-样3   51   29   5060
 胸腺素β-10   51   30   4892
 肌动蛋白，主动脉平滑肌   46   3   42381
 乙酰CoA乙酰转移酶，细胞质   45   6   41838
 葡萄糖苷酶2β亚基前体   45   2   60228
 磷酸甘油酸酯激酶1   44   5   44854
 Semaphorin-3A前体   41   1   89916
 Transgelin-2   41   11   22417
  48  磷酸丙糖异构酶   250   15   30802.00
 含硫氧还蛋白域的蛋白5前体   145   7   48283
 应力-70蛋白，线粒体前体   132   4   73920
 热休克70kDa蛋白1   119   3   70294
 假定蛋白   108   2   72492
 磷酸甘油酸酯激酶1   106   6   44854
 细胞质1肌动蛋白   95   9   42052
 程序性细胞死亡蛋白5   93   10   14145
 膜联蛋白A1   90   4   38787
 Stathmin   87   16   17161
 T型复合蛋白1亚基δ   82   2   58270
 TUBA6蛋白   80   11   37681
 色氨酰-tRNA合成酶   79   3   53474
 核迁移蛋白nudC   76   3   38276
 动力蛋白-1-样蛋白的亚型5   76   3   79587
 脂肪酸合成酶   73   0   275850
 膜联蛋白A5   70   3   35840
 内质网素前体   70   1   92696
 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2的亚型1   70   7   16579
 延伸因子2   66   1   96115
 氨甲酰磷酸合成酶的亚型1[铵   66   0   165975
 异柠檬酸脱氢酶[NADP]细胞质   66   3   46915
  苹果酸脱氢酶，线粒体前体   65   6   35965
  Rab GDP解离抑制因子α   65   4   51177
  黄素还原酶   62   4   22751
  α-辅肌动蛋白-4   62   1   105245
  14-3-3蛋白γ   59   4   28325
  蛋白S100-A11   57   10   11847
  假定蛋白DKFZp761K0511   54   2   85189
  谷胱甘肽转移ω-1   54   4   27833
  中性α-葡萄糖苷酶AB前体的亚型2   50   1   109825
  14kDa蛋白   50   7   13781
  延伸因子1-γ   49   3   50298
  异质核核糖核蛋白的亚型1   49   2   51230
  网蛋白-1的亚型1   49   0   533408
  DNA片段化因子α的亚型DFF45   49   5   36899
  DNA-(无嘌呤或无嘧啶位点)裂解酶   49   5   35800
  增殖细胞核抗原   48   5   29092
  锌指蛋白313   48   5   26647
  T-复合物蛋白1θ亚基   47   1   60311
  蛋白S100-A9   45   11   13291
  丝束蛋白3   45   2   71279
  类肌动蛋白，细胞质1   44   7   22865
  热休克蛋白105kDa的β亚型   43   1   92970
  微管蛋白β-2C链   43   3   50255
  预测的：类mif2的SMT3抑制物   43   6   18200
  张力介导的磷蛋白1   42   2   63227
  F-肌动蛋白加帽蛋白α-1亚基   41   7   32942
  分选连接素-5   41   2   47072
  CDNA FLJ45525 fis，克隆BRTHA2026311，高si   41   2   54408
  转酮酶   40   1   68519
  60S酸性核糖体蛋白P0   40   3   34423
  组蛋白结合蛋白RBBP4   40   2   47780
实施例3：使用PPS对来自HELA细胞的膜蛋白进行的分离和鉴 定
在第一步中，在PPS存在下制备总细胞提取物和膜蛋白提取物的样品。
在1.5ml HBS缓冲液+4％ PPS(3-[3-(1，1-双烷氧基乙基)吡啶-1-基]丙烷-1-磺酸盐)+1μl benzonase中超声处理108 HeLa细胞以制备总细胞提取物的样品(包含可溶性蛋白和膜蛋白的溶液)。离心(6000g)所述样品并回收上清用于FFE分离。
在1.5ml HBS缓冲液+1μl benzonase中超声处理108 HeLa细胞以制备膜蛋白提取物的样品并将其离心(6000g)。收集上清，并将额外的1.5ml HBS缓冲液添加到超声处理及在600g离心的压缩物中。合并上清并进行超速离心(125000g)。在Na2CO3缓冲液中重悬所述压缩物(蛋白终浓度为1mg/ml)在冰上温育30分钟并再次进行超速离心(125000g)。用HBS缓冲液洗涤所述压缩物一次并再次进行超速离心。在含有4％PPS(3-[3-(1，1-双烷氧基乙基)吡啶-1-基]丙烷-1-磺酸盐)的HBS缓冲液中重悬所述压缩物，对其进行超声处理、在冰上温育20分钟并进行超速离心。收集所述上清并准备所述上清用于FFE分离。
在BDTM自由流动电泳系统上以循环间隔模式进行间隔区带自由流动电泳(IZE)。将设备设置成包含7个介质入口(E1～E7)和4个样品入口(S1～S4)。将阳极稳定化介质导入到入口E1中。将阴极稳定化介质导入到入口E7中并经样品入口S3导入样品。本文所用的缓冲系统为上文所述的A/B介质。施加的电压为950V和电流为50mA。分别以2.5ml/h和250ml/h的流速导入样品和介质。在间隔期间和在级分收集期间介质流速分别为90ml/h和300ml/h。
在FFE设备内的分离和稳定化介质：
Figure BPA00001162648200481
逆流介质：水
在图5中示使用IZE分离的包含HeLa细胞的总细胞提取物的样品的分离级分的银染胶。图6示使用IZE分离的包含HeLa细胞膜蛋白提取物的样品的分离级分的银染胶。
在分离级分经受LC-MS/MS前如实施例2所述的制备所述级分。
如实施例2所述的进行基于ESI的LC-MS/MS(HCTultra，Bruker，德国)。
如实施例2所述，使用Mascot软件(Matrix Science Ltd.，U.K.)在发布号为3.18的IPI人数据库上搜索各MS/MS波谱。
从粗的非分离HeLa膜蛋白样品完全鉴定的总共96种蛋白中的54种为膜蛋白。在表2总结鉴定的蛋白。作为一非限制性例子，所述FFE分离的级分22经受了质谱分析。在级分22中总共鉴定了15种膜蛋白和5种胞质蛋白。在表3中总结了所述结果。值得注意的是，在粗的非分离的样品中未鉴定出在FFE分离的级分22中鉴定的20种蛋白中的3种。用粗体标出了发现的所述3种额外蛋白。
表2：粗的非分离HeLa膜蛋白样品的96种鉴定的蛋白(54种膜蛋白)
肽   Mascot得分   质谱范围   蛋白MW pI值   发现的肽 类型
 溶质载体家族3(二元以及中性氨基酸转运激活物)，d型成员2 1042 44 65003 4.8 20 整合的(1TM)
 电压依赖型阴离子选择通道蛋白1   546   43   30737   9.27   10  通道蛋白
 纳/钾转运ATP酶α-1链前体长亚型   446   9   114135   5.21   6  膜蛋白(10TM)
 HLA I型组织相容性抗原，A-68α链前体 390 31 41168 6.24 7  I型一次穿膜膜蛋白(1TM)
 甘油醛-3-磷酸脱氢酶   373   29   36070   9.3   7  细胞质的
 I亚型电压依赖型阴离子选择通道蛋白2 323 22 38639 6.37 9 通道蛋白
 生糖蛋白-1的GN-1S亚型   315   27   29078   4.58   6  细胞质
干扰素诱导的跨膜蛋白3 292 31 14794 6.62 4  多次穿膜膜蛋白(3TM)
低密度脂蛋白受体前体 291 8 98906 4.72 5  I型单次穿膜膜蛋白(1TM)
2亚型生碱蛋白(basigin)前体 274 23 29431 5.32 4  I型单次穿膜膜蛋白(1TM)
 角蛋白，II型细胞骨架1   268   11   66018   8.82   5  细胞骨架
 脑酸可溶性蛋白1   258   35   22549   4.47   5  细胞质
 肌动蛋白，细胞质1   256   24   42052   5.18   5  细胞骨架
 HLA I型组织相容性抗原，Cw-12α链前体 244 21 41316 5.88 5  I型单次穿膜膜蛋白(1TM)
 抑制素   238   23   29843   5.47   4  整合的(1TM)
CD44 4亚型抗原前体 237 11 39904 5.09 3  多次穿膜膜蛋白(6TM)
粘蛋白-13前体 210 9 32971 10.27 3  I型单次穿膜膜蛋白(1TM)
 整联蛋白β1亚型1A前体   209   8   91664   5.14   4  整合的(1TM)
 烯醇酶1   207   10   47481   7.71   3  细胞质
 Ras相关蛋白Rab-7   202   22   23760   7.2   3  细胞质
 角蛋白，I型细胞骨架10   195   5   59711   4.99   2  细胞骨架
 粘蛋白-13前体   195   8   55710   4.77   3  整合的(1TM)
小泡相关膜蛋白3 192 33 11228 9.7 2  I型单次穿膜膜蛋白(1TM)
 CD81抗原   184   16   26476   4.95   2  多次穿膜膜蛋白
  (4TM)
  热休克蛋白同源71kDa蛋白I亚型   182   4   71082   5.24   2   细胞质
  角蛋白，I型细胞骨架9   178   10   62320   5.06   3   细胞骨架
小泡相关膜蛋白2 175 28 12567 9.17 3   IV型单次穿膜膜蛋白(1TM)
  阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸盐受体前体 163 11 31487 5.49 2 整合的(1TM)
  假定蛋白   161   4   72492   4.92   2
柯萨奇病毒和腺病毒受体前体I型 161 13 40575 8.63 4   I型单次穿膜膜蛋白(1TM)
  A型Ephrin受体2前体   156   3   109667   5.76   2   整合的(1TM)
D亚型质膜钙转运ATP酶1 150 3 139637 5.67 3   多次穿膜膜蛋白(10)
中性氨基酸转运蛋白B(0) 144 9 57018 5.22 3   多次穿膜膜蛋白(10)
  I亚型疑似线粒体转入受体TOM40亚基同源物 142 16 38211 6.97 3 多次穿膜膜蛋白
  TUBA6蛋白   137   16   37681   9.54   3   细胞质
  泛醌-细胞色素c还原酶复合物核心蛋白2，线粒体前体 134 8 48584 9.32 2   暂时的(transitorial)
含富含亮氨酸的重复的蛋白59 128 14 35308 10.36 3   II型单次穿膜膜蛋白(1TM)
  细胞色素c氧化酶多肽Va，线粒体前体 125 20 16935 6.38 2   暂时的(transitorial)
  I亚型电压依赖性阴离子选择通道蛋白3 122 20 30981 9.55 4 通道蛋白
  磷酸甘油酸酯激酶1   118   8   44854   9.21   2   细胞质
  δ15亚型血小板内皮细胞粘附分子前体   113   7   82239   6.93   3
桥粒芯糖蛋白2前原蛋白 109 1 123016 5 1   I型单次穿膜膜蛋白(1TM)
  L-乳酸脱氢酶A样6B   106   4   42408   9.74   1   细胞质
  突出结合蛋白23的SNAP-23a亚型   102   14   23682   4.74   2   外周的
骨骼肌生长期间上调的蛋白5 101 25 6510 10.25 1   单次穿膜膜蛋白(1TM)
ADP核糖基化因子样蛋白8B 99 21 21753 9.58 2
  Ras相关蛋白Ral-A   98   14   23723   7.48   2   外周的
tetraspanin-8 96 5 26711 5.36 1   多次穿膜膜蛋白(4TM)
  蛋白S100-A14   88   14   11826   5.04   1   细胞质
蛋白脂蛋白2 87 9 17022 7.75 1   多次穿膜膜蛋白(4TM)
锌转运蛋白1 87 7 56318 6.02 2   多次穿膜膜蛋白(8TM)
高亲和阳离子氨基酸转运蛋白1 82 2 68449 5.16 1   多次穿膜膜蛋白(14TM)
I型神经细胞黏着分子L1前体 81 3 140885 5.81 2   单次穿膜膜蛋白(1TM)
大的中性氨基酸转运蛋白小亚基1 80 3 55659 8.96 1   多次穿膜膜蛋白(12)
  细胞色素c氧化酶多肽Vb，线粒体前体 78 24 13915 10.19 2   暂时的(transitorial)
钠/钾运输ATP酶亚基β-3 76 5 31834 9.31 1   II型单次穿膜膜蛋白(1TM)
I亚型网状蛋白-4 76 4 130420 4.28 2   多次穿膜膜蛋白(2TM)
  推定的S100钙结合蛋白H NH0456N16.1 76 15 11673 9.75 2
钙联蛋白前体 72 2 67982 4.31 1   I型单次穿膜膜蛋白(1TM)
小泡膜内在蛋白VIP36前体 71 10 40545 6.51 2   I型单次穿膜膜蛋白(1TM)
  促激活剂多肽前体Sap-mu-0亚型   70   2   59899   4.93   1
  Ras相关蛋白Rab-2A   69   6   23702   6.09   1   外周的
  热休克蛋白HSP 90-α2   69   1   98622   4.95   1   细胞质
  果糖二磷酸醛缩酶A   68   8   39720   9.24   2   细胞质
  微管蛋白β2链   68   6   50095   4.64   2   细胞骨架
  转甲状腺素蛋白前体   68   15   15991   5.43   1   分泌型(seceted)
SMARCA4亚型2 67 0 188658 8.9 1   暂时的(transitorial)
  泛醌-细胞色素c还原酶复合物14kDa蛋白 67 11 13391 9.32 1 整合的(1TM)
溶酶体膜蛋白2 67 8 54581 4.86 2   多次穿膜膜蛋白(2TM)
髓磷脂蛋白0-样I亚型a 67 5 29235 9.48 1   I型单次穿膜膜蛋白(1TM)
  21kDa蛋白   66   7   21711   9.81   2
  ATP合酶e链，线粒体   63   20   7797   9.55   1   F0肽
  热休克70kDa蛋白1   63   4   70294   5.36   2
滋养细胞糖蛋白前体 63 4 46573 6.39 1   I型单次穿膜膜蛋白(1TM)
 I亚型丙酮酸激酶3   61   4   58470   8.97  1   细胞质
A亚型磷酸载体蛋白，线粒体前体 59 3 40525 10.1 1   多次穿膜膜蛋白(6TM)
内皮因子前体长亚型 58 4 71559 6.15 2   I型单次穿膜膜蛋白(1TM)
转铁蛋白受体蛋白1 58 2 85274 6.18 1   II型单次穿膜膜蛋白(1TM)
 半乳凝集素-3   56   6   26098   9.2  1   核仁
 垂体瘤-转化基因1蛋白-互作蛋白前体   54   10   21109   10.68  1   整合的(1TM)
 延伸因子2   53   1   96115   6.42  1   细胞质
 2亚型鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)，α2亚基 52 8 39075 5.16 1 外周的
 假定蛋白FLJ20455   52   7   27780   7.76  1
 异质核核糖核蛋白U的长亚型   51   1   91033   5.68  2
前列腺素F2受体负调节蛋白前体 47 1 99464 6.16 1   I型单次穿膜膜蛋白(1TM)
易位子相关蛋白α亚基前体1亚型 47 5 32215 4.22 2   I型单次穿膜膜蛋白(1TM)
 UDP-Gal：βGlcNAc β1，4-半乳糖基转移酶1，膜结合型 47 3 44291 9.6 1   II型单次穿膜膜蛋白(1TM)
高尔基体磷蛋白4 46 1 81888 4.58 1   II型单次穿膜膜蛋白(1TM)
 细胞色素b5还原酶亚型1   43   6   34441   7.9  2   外周的
 Ras相关蛋白Rab-35   43   7   23296   9.42  1   外周的
 线粒体前体蛋白输入受体   43   2   68096   6.91  1   整合的(1TM)
 组蛋白H4   42   11   11229   11.85  1   细胞核
1亚型胆碱转运蛋白样蛋白2 42 2 81638 9.8 1   多次穿膜膜蛋白(10TM)
 钙调蛋白   40   11   16696   3.93  1   细胞质
小突触囊泡蛋白样1 40 8 25261 9.73 1   IV型单次穿膜膜蛋白(1TM)
 细胞色素b5外线粒体膜前体   40   22   16798   4.73  1   外周的
表3：分离的HeLa膜蛋白的级分22的20种鉴定的蛋白(15种膜蛋白)
标题   Mascot得分   MS范围   蛋白MW pI值   发现的肽 类型
  角蛋白，II型细胞骨架1   349   9   66018   8.8   6   细胞骨架
  脑酸可溶性蛋白1   312   35   22549   4.47   6   细胞质
  角蛋白，I型细胞骨架10   205   7   59711   4.99   3   细胞骨架
4F2细胞表面抗原重链 201 13 58023 5.07 5   II型单次穿膜膜蛋白(1TM)
  甘油醛-3-磷酸脱氢酶   161   17   36070   9.3   4   细胞质
低密度脂蛋白受体前体 158 3 98906 4.72 2   I型单次穿膜膜蛋白(1TM)
  电压依赖型阴离子选择通道蛋白1   130   15   30737   9.27   3   通道蛋白
  1亚型电压依赖型阴离子选择通道蛋白2   125   12   38639   6.37   4   通道蛋白
  角蛋白，外皮的II型细胞骨架2   91   3   66111   8.85   2   细胞骨架
  角蛋白，I型细胞骨架9   88   2   62320   5.06   1   细胞骨架
小泡相关膜蛋白3 81 17 11228 9.7 1   IV型单次穿膜膜蛋白(1TM)
CD44抗原4亚型前体 76 3 39904 5.09 2   I型单次穿膜膜蛋白(1TM)
2亚型Basigin前体 75 11 29431 5.32 2   I型单次穿膜膜蛋白(1TM)
骨骼肌生长期间上调的蛋白5 62 25 6510 10.25 1   I型单次穿膜膜蛋白(1TM)
中性氨基酸转运蛋白B(0) 60 3 57018 5.22 1   多次穿膜膜蛋白(10TM)
阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体前体 55 5 31487 5.49 2   IV型单次穿膜膜蛋白(1TM)
  含亮氨酸拉链EF-手的跨膜蛋白1，线粒体前体 55 1 83986 6.29 1 整合的(1TM)
钙联蛋白前体 52 2 67982 4.31 1   I型单次穿膜膜蛋白(1TM)
整联蛋白α-5前体 45 1 115605 5.42 1   I型单次穿膜膜蛋白(1TM)
干扰素诱导的跨膜蛋白3 43 18 14794 6.62 2   多次穿膜膜蛋白(3TM)
粘蛋白-13前体 41 2 55710 4.77 1   I型单次穿膜膜蛋白(1TM)
如本文所证明，本发明的FFE分离产生了具有较低复杂性的质谱。因此，具有降低的复杂性的波谱允许更容易的分析，且此外使额外信号的检测成为可能，由于例如造成所述信号的分析物的低浓度其在更复杂的波谱中否则将被抑制。
实施例4：用和不用PPS制备的HELA细胞蛋白的鉴定和肽的分 离
在HBS缓冲液(10mM HEPES pH7.9、1.5mM MgCl2、10mMKCl+蛋白酶抑制剂(1个完全迷你片剂，Roche # 11836153001，10ml))中超声处理108个HeLa细胞的样品并平行地以100000g进行超速离心。所述上清包含可溶性蛋白。
将所述上清分成两部分，其经过如下相同的处理：添加100mM碳酸氢铵缓冲液。添加TCEP至5mM的最终浓度(温育60分钟)，然后添加IAA(碘乙酰胺)至15mM的最终浓度(温育60分钟)。添加胰蛋白酶(修饰的测序级，Promega)至1∶37.5的酶∶蛋白的最终比例，并在37℃过夜温育所述混合物。通过用0.1％TFA(三氟乙酸)酸化溶液来终止所述消化。
平行地，使用
Figure BPA00001162648200541
Vac 1 cct C18盒(水)纯化所述两种样品的肽。所述方案包括用乙腈和0.1％TFA洗涤所述盒、装载样品、用0.1％TFA洗涤所述样品、用乙腈洗脱肽，并通过真空离心蒸发样品至干燥，并在导入到入口S2的1ml分离介质中复原。
在BDTM自由流动电泳系统上以FF-IEF静态间隔模式进行所述等电聚焦。将设备设置成包含9个介质入口(E1～E9)和4个样品入口(S1～S4)。将阳极稳定化介质导入到入口E1中。将阴极稳定化介质导入到入口E9中，并经样品入口S3导入样品。施加的电压为500V和电流为130mA。分别以3ml/h和150ml/h的流速导入样品和介质。
在FFE设备内的分离和稳定化介质：
Figure BPA00001162648200551
逆流介质：水
使用如上所述的装置和介质进行所述两种样品的FFE分离。
在PPS实验中，将PPS添加到0.1％浓度的介质(E1～E9)中。
在图7和图8中分别显示有和无PPS的FFE分离洗脱分布。
使用SpeedVac将100μl FFE分离的各级分蒸发至干燥，用25μl0.1％TFA溶解并将它们的5μl用于LC-MS/MS实验。如实施例2所述的鉴定蛋白。值得注意的是，当分离介质包含PPS时在样品的级分中可鉴定出更多的蛋白。作为一个例子，在无PPS的样品的级分32中，通过LC MS/MS鉴定了48种不同的蛋白，而在包含有PPS的分离介质的实验的级分32中，可鉴定出70种不同的蛋白。分别在表4和表5中总结了随后LC MS/MS分析的结果。
表4：在无PPS的自由流动等电聚焦后通过LC-MS/MS进行蛋白的鉴定
  级分   肽   Mascot得分   MS范围   pI值   蛋白MW
  32   肌动蛋白，主动脉平滑肌   176   9   5.1   42381
  丙酮酸激酶同工酶M1/M2的亚型M1   159   5   8.64   58407
  TUBA6蛋白   150   8   9.54   37681
  热休克蛋白60   149   4   5.59   61346
  假定蛋白DKFZp761K0511   146   3   5.13   85189
  FK506-结合蛋白4   139   9   5.22   51926
  Hsc70-互作蛋白   101   3   5.04   41477
  热休克70kDa蛋白4亚型b   98   16   4.46   15851
  新生多肽相关复合物α亚基   91   6   4.36   23370
  延伸因子2   89   1   6.42   96115
  细丝蛋白A，α   88   0   5.64   282581
  14-3-3蛋白γ   86   5   4.65   28325
  29kDa蛋白   85   8   4.6   29346
  46kDa蛋白   82   3   4.63   46713
  T复合蛋白1亚基β   82   2   6   57663
  膜联蛋白A1   82   3   6.68   38787
  D-3-磷酸甘油酸脱氢酶   79   2   6.31   57225
  硫氧还蛋白   79   12   4.67   11884
  14-3-3蛋白σ   78   5   4.53   27871
  α-辅肌动蛋白-1   77   1   5.13   103563
  输出蛋白-2的亚型1   74   1   5.43   111145
  热休克70kDa蛋白7(片断)   70   6   7.77   27004
  假定蛋白   69   1   4.92   72492
  真核翻译起始因子f的亚型1   69   1   4.74   92833
  乳酸脱氢酶A   66   3   9.26   36950
  转酮酶   65   3   8.54   68519
  中性α-葡萄糖苷酶AB前体的亚型1   65   3   5.7   107263
  热休克同源71kDa蛋白的亚型1   64   2   5.24   71082
  钙网蛋白前体   64   5   4.14   48283
  狼疮La蛋白   63   2   6.8   46979
  角蛋白，II型细胞骨架8   63   4   5.38   53540
  异质核核糖核蛋白的亚型1   61   3   8.52   38581
  真核翻译起始因子2亚基   61   3   9.57   51516
  磷酸甘油酸酯激酶1   60   2   9.21   44854
  核小体装配蛋白1-样4   60   2   4.45   43155
  脂肪酸合成酶   59   0   5.98   275850
  内质网素前体   59   1   4.61   92696
  羟酰基-CoA脱氢酶，II型   58   6   9.06   27134
  蛋白SET的亚型1   58   3   4.07   33469
  核糖核酸酶抑制因子   56   3   4.56   51635
  DNA复制许可因子MCM6   51   1   5.16   93801
  GARS蛋白   50   1   8.75   85336
  GARS蛋白   48   1   5.5   0
  染色盒蛋白同源物3   45   7   5.08   20981
  膜联蛋白A5   45   3   4.78   35840
  DnaJ同源物亚家族C成员7   43   2   6.62   57203
  核小体装配蛋白1-样1   42   4   4.21   45631
  132kDa蛋白   39   1   4.73   132516
  42   热休克同源71kDa蛋白的亚型1   306   9   5.2   71082
  热休克70kDa蛋白1A   253   5   5.35   70280
  假定蛋白   230   6   4.92   72492
  应力-70蛋白，线粒体前体   188   4   5.81   73920
  细丝蛋白A，α   165   1   5.64   282581
  肌动蛋白，细胞质1   163   11   5.18   42052
  Cofilin-1   144   15   9.19   18588
  氨甲酰磷酸合成酶的亚型1[氨   122   1   6.3   165975
  真核翻译起始因子4B   114   5   5.41   69167
  葡萄糖-6-磷酸异构酶   102   2   9.14   63204
  泛素激活酶E1   97   2   5.8   57443
  丙酮酸激酶同工酶M1/M2的亚型M1   90   3   8.64   58407
  延伸因子1-δ   89   4   4.75   31086
  果糖二磷酸醛缩酶A   86   3   9.24   39720
  硫氧还蛋白-样蛋白5   86   11   5.27   14217
  乳酸脱氢酶A   86   8   9.26   36950
  Fascin   86   2   7.02   54992
  微管蛋白β-2链   85   5   4.64   50095
  氯胞内通道蛋白1   79   12   4.94   27117
  多功能蛋白ADE2   74   2   8.7   50389
  OTTHUMP00000021786   69   1   4.7   55459
  转酮酶   68   2   8.54   68519
  14-3-3蛋白ζ/δ   64   4   4.57   27899
  α-辅肌动蛋白-1   62   2   5.13   103563
  泛素和核糖体蛋白S27a前体   62   8   10.4   18296
  丙酮酸脱氢酶E1组分α亚基   62   3   9.26   43952
  聚(rC)结合蛋白2亚型b   60   3   6.37   38597
延伸因子1-γ 60 3 6.26 50298
  预测的：类似于肽基脯氨酰异构酶A   55   4   9.87   24693
  转运蛋白-1   55   1   4.69   103771
  核苷二磷酸激酶A   55   9   5.78   17309
  6-磷酸葡萄糖脱氢酶，脱羧   54   3   6.98   53488
  热休克70kDa蛋白4   52   2   5.03   95096
  含富含小谷氨酰胺的tetratrico肽重复的   52   4   4.64   34270
  α-辅肌动蛋白-4   51   2   5.16   105245
  异质核核糖核蛋白A1亚型   50   2   9.58   38837
  脑酸可溶性蛋白1   50   15   4.47   22549
  输入蛋白β-1亚基   49   1   4.53   98420
  核自身抗原精子蛋白的亚型1   48   1   4.11   85471
  热休克蛋白60   48   2   5.59   61346
  丝氨酸蛋白酶抑制蛋白B13的亚型1   45   3   5.39   44305
  116kDa的U5小核核糖核蛋白组分   45   1   4.7   110336
  T-复合蛋白1亚基β   43   1   6   57663
  假定蛋白LOC64423亚型1   42   2   5.61   78284
  蛋白S100-A11   42   8   7.52   11847
  UV切割修复蛋白RAD23同源物B   41   2   4.63   43202
  血液和神经系统表达的1亚型   41   9   5.35   16005
  预测的：类似于核糖体蛋白S3a亚型   41   5   9.87   25033
  55   热休克同源71kDa蛋白的亚型1   168   6   5.2   71082
  假定蛋白DKFZp761K0511   135   3   5.13   85189
  过氧化氧化还原蛋白-1   106   10   9.22   22324
  热休克70kDa蛋白1   81   2   5.36   70294
  氨甲酰磷酸合成酶的亚型1[氨   75   1   6.3   165975
  14-3-3蛋白θ   64   4   4.53   28032
  T型复合蛋白1亚基δ   60   2   9.08   58270
  Methylosome蛋白50   56   4   4.88   37442
  热休克蛋白60   55   2   5.59   61346
  酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单氧   54   4   4.61   28179
  延伸因子2   52   1   6.42   96115
  内质网素前体   51   1   4.61   92696
  乳酸脱氢酶A   51   3   9.26   36950
  GTP结合核蛋白Ran   51   4   7.84   24448
  丝束蛋白-1   50   2   5.21   70707
  三官能团嘌呤生物合成的长亚型   49   1   6.27   108953
  磷酸丙糖异构酶   48   4   5.4   30802
  14-3-3蛋白ζ/δ   47   4   4.57   27899
  烯醇酶1   46   2   7.71   47481
  应力-70蛋白，线粒体前体   44   2   5.81   73920
  预测的：类似于延伸因子1-γ   43   3   5.27   36636
  转录延伸因子A蛋白2   41   4   10.39   34206
  信号转导与激活的亚型1   39   1   5.9   89190
表5：在有PPS的自由流动等电聚焦后通过LC-MS/MS进行蛋白的鉴定
  级分  条目   Mascot得分   MS范围   pI值   蛋白MW
  32  丙酮酸激酶3亚型1   405   18   9   58470
 脂肪酸合成酶   325   3   5.98   275850
 波形蛋白   248   10   4.91   53545
 肌动蛋白，主动脉平滑肌   223   10   5.12   42381
 磷酸甘油酸酯激酶1   192   8   9.21   44854
 果糖二磷酸醛缩酶A   190   7   9.24   39720
 烯醇酶1   154   9   7.71   47481
 假定蛋白   146   3   4.92   72492
 脑酸可溶性蛋白1   131   29   4.47   22549
 微管蛋白β-2C链   126   4   4.65   50255
 天冬酰胺合成酶   123   5   6.41   64768
 氨甲酰磷酸合成酶的亚型1[氨   122   1   6.3   165975
 L-乳酸脱氢酶B链   115   7   5.66   36769
 T-复合蛋白1亚基β   114   5   6   57663
 CDNA FLJ45525 fis，克隆BRTHA2026311，高si   111   2   5.04   54408
 假定蛋白DKFZp761K0511   108   4   5.13   85189
 异质核核糖核蛋白的亚型2   102   7   6.58   36059
 Transgelin-2   101   13   9.41   22417
 Sequestosome-1的亚型1   100   12   5.12   48638
 转酮酶   97   4   8.54   68519
 过氧化氧化还原蛋白-6   95   8   5.98   25002
 磷脂酰乙醇胺结合蛋白1   94   9   7.84   21027
 异质核核糖核蛋白H1   89   3   5.87   49484
 T复合蛋白1亚基ε   86   1   5.34   60089
 Tu翻译延伸因子，线粒体   86   2   7.92   50185
 T复合蛋白1亚基δ   86   2   9.08   58270
 信号识别颗粒14kDa蛋白   85   10   10.64   14649
  热休克70kDa蛋白1   85   5   5.36   70294
  Rab GDP解离抑制因子β   84   2   6.08   51087
  酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单氧   81   5   4.61   28179
  过氧化氧化还原蛋白-2   80   8   5.59   21918
  泛素激活酶E1   76   1   5.41   118858
  预测的：类似于热休克蛋白HSP90-   75   5   5.37   22588
  14-3-3蛋白σ   74   5   4.53   27871
  T复合蛋白1亚基ζ   74   2   6.24   58313
  异质核核糖核蛋白R   71   2   8.8   71184
  内质网钙结合蛋白-1前体   70   3   4.72   38866
  羟甲基戊二酰CoA合成酶，细胞质   70   3   5.09   57828
  蛋白酶体激活剂复合物亚基的亚型1   69   5   5.61   29602
  乳酸脱氢酶A   64   3   9.26   36950
  14-3-3蛋白ε   63   4   4.48   29326
  60S酸性核糖体蛋白P2   62   10   4.22   11658
  程序性细胞死亡5短亚型   60   32   4.77   4472
  46kDa蛋白   60   4   4.63   46713
  蛋白S100-A6   59   8   5.21   10230
  细胞角蛋白II型   59   1   8.66   59753
  预测的：类似于磷酸甘油酸酯变位酶1   56   7   6.82   29003
  过渡期内质网ATP酶   56   1   5   89819
  应力-诱导的-磷蛋白1   54   2   6.42   63227
  核仁磷蛋白的亚型2   53   3   4.32   29617
  蛋白法尼基转移酶/牦牛儿基牦牛儿基转移酶   52   3   4.82   44495
  TALDO1蛋白   50   3   9.7   35535
  α-辅肌动蛋白-4   49   1   5.16   105245
  含硫氧还蛋白域的蛋白4前体   49   2   4.96   47341
  肽基脯氨酰顺反异构酶A   49   13   9.14   18098
  β-烯醇酶   48   6   8.68   47168
  烟酰胺磷酸核糖转移酶的亚型1   48   3   6.78   55772
 烟酰胺磷酸核糖转移酶的亚型1   46   0   5.66   0
 12kDa蛋白   45   7   5.22   12680
 转运蛋白-1   43   1   4.69   103771
 肌球蛋白，轻多肽6，碱，平滑肌的   42   9   4.41   17090
 类似于膜联蛋白A2亚型1   41   5   6.58   38806
 含TCP1的分子伴侣，亚基3亚型b   41   4   6.08   60994
 E(Y)2的同源物   41   16   10.16   11635
 异质核核糖核蛋白的亚型1   40   2   9.15   69788
 原肌球蛋白1α链亚型2   40   4   4.55   32715
 膜联蛋白A1   40   3   6.68   38787
 膜联蛋白A3   39   3   5.55   36393
 苹果酸脱氢酶，细胞质   39   5   7.66   36500
 过氧化氧化还原蛋白-1   38   3   9.22   22324
  39  热休克70kDa蛋白1A   357   10   5.4   70280
 假定蛋白DKFZp761K0511   261   10   5.13   85189
 应力-70蛋白，线粒体前体   254   7   5.81   73920
 假定蛋白   247   6   4.92   72492
 热休克同源71kDa蛋白的亚型1   240   7   5.24   71082
 细丝蛋白A，α   208   1   5.64   282581
 热休克蛋白60   202   7   5.59   61346
 热休克蛋白HSP 90-α2   179   3   4.95   98622
 热休克蛋白β-1   156   22   5.97   22826
 Cofilin-1   149   15   9.19   18588
 氯胞内通道蛋白1   147   12   4.94   27117
 肌动蛋白，细胞质1   147   11   5.18   42052
 真核翻译起始因子4B   134   5   5.41   69167
 烯醇酶1   126   5   7.71   47481
 果糖二磷酸醛缩酶A   120   11   9.24   39720
 蛋白质二硫异构酶A3前体   118   4   5.95   57146
 类似于膜联蛋白A2亚型1   117   6   6.58   38806
 波形蛋白   112   4   4.91   53545
 磷脂酰乙醇胺结合蛋白1   111   10   7.84   21027
 T-复合蛋白1亚基θ   108   4   5.31   60311
 脑酸可溶性蛋白1   100   15   4.47   22549
 膜联蛋白A1   99   4   6.68   38787
 乳酸脱氢酶A   98   8   9.26   36950
 40kDa蛋白   95   7   4.58   39893
 葡萄糖-6-磷酸异构酶   95   2   9.14   63204
 电子传递黄素蛋白α-亚基，mi   95   5   9.47   35400
 微管蛋白β-2链   91   5   4.64   50095
 甘油醛-3-磷酸脱氢酶   91   4   9.3   36070
 Fascin   90   2   7.02   54992
 脂肪酸合成酶   86   1   5.98   275850
 蛋白酶体β亚基6型前体   85   4   4.65   25570
 Stathmin-2   85   10   9.21   20929
 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，脱羧的   83   3   6.98   53488
 氨甲酰磷酸合成酶的亚型1[氨   80   0   6.3   165975
 130kDa富含亮氨酸的蛋白质   80   1   5.86   160023
 肌动蛋白，主动脉平滑肌   77   6   5.12   42381
 钙调蛋白   75   10   3.93   16696
 预测的：类似于肽基脯氨酰异构酶A   75   4   9.87   24693
 14-3-3蛋白ζ/δ   74   4   4.57   27899
 三官能团嘌呤生物合成的长亚型   74   2   6.27   108953
 微管蛋白β-2C链   73   5   4.65   50255
 α-辅肌动蛋白-4   72   1   5.16   105245
 蛋白S100-A11   72   8   7.52   11847
 RcTPI1(片段)   69   5   9.24   27211
 丙酮酸激酶同工酶M1/M2的亚型M1   69   3   8.64   58407
 磷酸甘油酸酯激酶1   69   4   9.21   44854
 延伸因子1-δ   68   4   4.75   31086
  硫氧还蛋白-样蛋白5   67   11   5.27   14217
  新生多肽相关复合物α亚基   66   6   4.36   23370
  泛素激活酶E1   65   2   5.8   57443
  丙酮酸脱氢酶E1组分α亚基   64   3   9.26   43952
  ATP柠檬酸合成酶   62   1   7.08   121660
  50kDa蛋白   60   5   4.61   50168
  色氨酰-tRNA合成酶   60   2   5.8   53474
  热休克70kDa蛋白4   59   2   5.03   95096
  延伸因子1-γ   59   3   6.26   50298
  转录中介因子1的亚型1   59   2   5.44   90261
  多功能蛋白ADE2   58   2   8.7   50389
  L-乳酸脱氢酶B链   57   3   5.66   36769
  血液和神经系统表达的1亚型   57   9   5.35   16005
  转酮酶   56   2   8.54   68519
  异质核核糖核蛋白的亚型1   55   2   5.26   51230
  GMP合成酶   54   1   6.44   77408
  酯酶D   53   4   6.62   31956
  输入蛋白β-1亚基   52   1   4.53   98420
  S-腺苷甲硫氨酸合成酶亚型2型   51   3   6.02   43975
  聚(rC)结合蛋白2亚型b   51   3   6.37   38597
  核自身抗原精子蛋白的亚型1   51   1   4.11   85471
  核苷二磷酸激酶A   51   9   5.78   17309
  CDNA FLJ45525 fis，克隆BRTHA2026311，高si   49   2   5.04   54408
  组蛋白H4   47   9   11.85   11229
  含富含小谷氨酰胺的tetratrico肽重复的   46   4   4.64   34270
  T复合蛋白1亚基β   46   1   6   57663
  肌球蛋白-11   45   0   5.29   228054
  40S核糖体蛋白S13   45   8   10.96   17081
  116kDa的U5小核核糖核蛋白compo   43   1   4.7   110336
  硫氧还蛋白-样蛋白2   42   3   5.19   37693
  转运蛋白-1   41   1   4.69   103771
  胸腺素β-10   41   18   5.16   4892
  蛋白酶体β亚基3型   40   7   6.17   23219
  47   磷酸甘油酸酯激酶1   261   10   9.2   44854
  热休克70kDa蛋白1   246   5   5.36   70294
  假定蛋白DKFZp761K0511   202   9   5.13   85189
  L-乳酸脱氢酶A链的亚型2   199   12   9.11   36953
  微管蛋白α-泛素链   195   12   4.81   50804
  热休克蛋白60   188   5   5.59   61346
  微管蛋白β-2链   182   10   4.64   50095
  微管蛋白β-2C链   176   10   4.65   50225
  甘油醛-3-磷酸脱氢酶   167   9   9.3   36070
  L-乳酸脱氢酶B链   155   7   5.66   36769
  磷酸丙糖异构酶   147   13   5.4   30802
  烯醇酶1   129   5   7.71   47481
  热休克同源71kDa蛋白的1亚型   128   4   5.24   71082
  过氧化氧化还原蛋白-1   126   15   9.22   22324
  肌动蛋白，细胞质1   114   7   5.18   42052
  氨甲酰磷酸合成酶的亚型1[氨   104   2   6.3   165975
  核苷二磷酸激酶B   95   12   9.35   17401
  热休克蛋白HSP 90-α2   94   3   4.95   98622
  预测的：类似于丙酮酸激酶，同工酶   80   6   6.56   39895
  蛋白S100-A11   78   19   7.52   11847
  预测的：类似于mif2的SMT3抑制蛋白   78   7   5.92   18200
  增殖细胞核抗原   77   4   4.42   29092
  热休克蛋白β1   70   4   5.97   22826
  蛋白S100-P   69   13   4.6   10450
  延伸因子2   69   2   6.42   96115
  膜联蛋白A1   66   4   6.68   38787
  脂肪酸合成酶   58   0   5.98   275850
  GTP-结合核蛋白Ran   57   10   7.84   24448
  真核起始因子4A-I   57   2   5.19   46353
  腺苷高半胱氨酸酶   54   4   5.91   48124
  profilin-1   53   11   9.45   15085
  肽基脯氨酰顺反异构酶A   48   7   9.14   18098
  T复合物蛋白1的θ亚基   45   2   5.31   60311
  蛋白质二硫化物异构酶A3前体   44   2   5.95   57146
  56   Hsp89-α-δ-N   186   4   4.9   63839
  假定蛋白DKFZp761K0511   153   3   5.13   85189
  异质核核糖核蛋白F   111   3   5.27   45985
  2型S-腺苷甲硫氨酸合成酶亚型   94   3   6.02   43975
  26S蛋白酶非ATP酶调节亚基3   93   2   9.01   61054
  蛋白二硫化物异构酶前体   75   3   4.61   57480
  预测的：类似于磷酸甘油酸酯变位酶1   71   4   6.82   29003
  异质核核糖核蛋白H1   66   3   5.87   49484
  ATP合酶α链，线粒体前体   66   1   9.61   59828
  过氧化氧化还原蛋白-5的线粒体亚型，线粒体   64   6   9.93   22298
  T复合物蛋白1θ亚基   63   2   5.31   60311
  网织钙结合蛋白1前体   62   4   4.72   38866
  钙网蛋白前体   48   3   4.14   48283
  增殖相关蛋白2G4   48   3   6.12   43970
  SHC(含Src同源2结构域)转换   42   2   5.99   63367
  L-氨基乙二酸半醛脱氢酶-磷酸   42   4   6.39   35981

Claims (94)

1.用于通过自由流动电泳分离样品中分析物的方法，包括：进行包括至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂的自由流动电泳分离。
2.权利要求1的方法，其中在电泳分离后在一个或多于一个级分中收集至少部分样品。
3.权利要求1或2的方法，其中在样品介质中包含至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂。
4.权利要求1～3中任一项的方法，其中在至少一种分离介质中包含至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂。
5.权利要求1～4中任一项的方法，其中所述自由流动电泳以连续模式运作。
6.权利要求1～4中任一项的方法，其中所述自由流动电泳以静态间隔模式运作。
7.权利要求1～4中任一项的方法，其中所述自由流动电泳以循环间隔模式运作。
8.权利要求1～7中任一项的方法，其中所述分离通过自由流动等电聚焦(FF-IEF)进行。
9.权利要求1～7中任一项的方法，其中所述分离通过自由流动区带电泳(FF-ZE)进行。
10.权利要求1～7中任一项的方法，其中所述分离通过自由流动等速电泳(FF-ITP)进行。
11.权利要求1～10中任一项的方法，其中所有的两性离子或非离子表面活性剂为MS-兼容性的。
12.权利要求1～11中任一项的方法，其中至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂为可切割表面活性剂。
13.权利要求12的方法，其中所述可切割表面活性剂为酸敏的、碱敏的、化学活性的或光敏的。
14.权利要求12或13的方法，其中所述可切割表面活性剂选自：{2-[(二甲基-辛基-硅烷基)-乙氧基]-2-羟基-乙基}-三甲基溴化铵、3-(2，4，6-三羟基苯基)丙烯酸辛基酯和3-[3-(1，1-双烷氧基乙基)吡啶-1-基]丙烷-1-磺酸盐。
15.权利要求12～14中任一项的方法，其中所述可切割两性离子或非离子表面活性剂的切割部分中的至少一个为MS-兼容性的。
16.权利要求12～15中任一项的方法，其中切割的两性离子或非离子表面活性剂的所述部分中的至少一个可通过离心、蒸发和/或过滤去除。
17.权利要求12～16中任一项的方法，其中所述至少一种可切割表面活性剂在自由流动电泳分离后在至少一个级分中切割。
18.权利要求12～17中任一项的方法，其中所述可切割表面活性剂的切割通过酸化包含酸敏可切割表面活性剂的FFE分离后的至少一个级分，或通过碱化包含碱敏可切割表面活性剂的FFE分离后的至少一个级分来进行。
19.权利要求12～17中任一项的方法，其中可切割表面活性剂的切割通过使包含至少一种光敏可切割表面活性剂的FFE分离后的至少一个级分经受照射来进行。
20.权利要求12～17中任一项的方法，其中可切割表面活性剂的切割通过添加试剂到能切断化学活性表面活性剂内的键的FFE分离后的至少一个级分来进行。
21.权利要求20的方法，其中所述试剂为氟化物。
22.权利要求1～21中任一项的方法，其中使至少部分样品经受蛋白消化步骤。
23.权利要求22的方法，其中所述蛋白消化步骤在通过自由流动电泳的分离之前进行。
24.权利要求22的方法，其中所述蛋白消化步骤在通过自由流动电泳的分离之后进行。
25.权利要求24的方法，其中蛋白消化步骤在从自由流动电泳分离收集的至少一个级分中及在权利要求17～21中任一项的切割之前或之后进行。
26.用于分析分析物的方法，包括：权利要求1～25中任一项所定义的自由流动电泳分离，及从自由流动电泳分离所获得的至少部分样品的随后分析。
27.权利要求26的方法，其中所述随后分析包括选自下列的技术：自由流动电泳、凝胶电泳、1D-和2D-PAGE、MS、MALDI MS、ESIMS、SELDI MS、LC-MS(/MS)、MALDI-TOF-MS(/MS)、IR-光谱法、UV-光谱法、ELISA、HPLC、Edman测序、NMR谱、表面等离子体共振、X射线衍射、核酸测序、电印迹、氨基酸测序、流式细胞术、圆二色或它们的任意组合。
28.权利要求1～27中任一项的方法，其中所述分析物选自：有机分子、无机分子、生物颗粒、生物聚合物或生物分子、及它们的任意组合。
29.权利要求28的方法，其中所述分析物选自：蛋白、蛋白聚集体、蛋白复合物、肽、疏水肽、DNA-蛋白复合物、DNA、膜、膜碎片、脂质、糖及其衍生物、多糖及其衍生物、激素、脂质体、病毒颗粒、抗体、抗体复合物、纳米颗粒、塑料的成分、乳胶漆颗粒、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、右旋糖苷、纤维素衍生物、多元酸、药用药物、药物前体、药物爆裂物的代谢物、毒素、致癌物、毒物、过敏原、传染剂或上述任何之混合物，其中所述蛋白尤其是膜结合蛋白、内在膜蛋白和亲脂性蛋白。
30.权利要求12～29中任一项的方法，其中将包含切割剂的逆流介质与包含可切割表面活性剂的自由流动电泳分离后的样品的至少部分级分相接触和/或相混合。
31.权利要求12～29中任一项的方法，其中逆流介质用于调整所述介质条件以在自由流动电泳分离后稳定包含在其中的可切割表面活性剂。
32.权利要求12～29中任一项的方法，其中进行纯化步骤以去除可切割表面活性剂的部分，所述纯化步骤选自：可切割表面活性剂的部分的过滤、离心和蒸发。
33.权利要求1～32中任一项的方法，其中所述方法不需要选自下列的纯化步骤来去除表面活性剂：透析、层析、反相层析、离子交换层析、表面活性剂交换、蛋白沉淀、亲和层析、电印迹、液-液相萃取和/或固-液相萃取。
34.分离介质，其包含至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂，其中所述分离介质适于权利要求1～33中任一项的自由流动电泳分离。
35.权利要求34的分离介质，其中所述包含至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂的介质选自：A/B分离介质、挥发性介质和互补多配对缓冲介质。
36.用于进行权利要求1～33中任一项的样品中分析物的自由流动电泳分离的试剂盒，其包含至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂。
37.权利要求36的试剂盒，其中所述至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂为权利要求12～16中任一项所定义的可切割表面活性剂。
38.权利要求36或37的试剂盒，其还包含一种分离介质或多种分离介质。
39.权利要求38的试剂盒，其中所述分离介质数在2～15之间，或3～12之间，或4～9之间。
40.权利要求38或39的试剂盒，其中所述分离介质选自：A/B缓冲介质、挥发性缓冲介质和互补多配对缓冲介质。
41.权利要求40的试剂盒，其中所述分离介质为能形成分离区的A/B介质，其中电泳期间在分离区内最小pH和最大pH间的差异小于约0.2，并优选小于0.1个pH单位。
42.权利要求41的试剂盒，其中所述分离区的pH在电泳期间基本恒定。
43.权利要求40～42中任一项的试剂盒，其在自由流动区带电泳中使用
44.权利要求40的试剂盒，其中所述分离介质为能形成分离区的A/B介质，其中电泳期间在分离室内的电极间所述pH形成基本线性的梯度。
45.权利要求40的试剂盒，其中所述分离介质为能形成分离区的A/B介质，其中电泳期间在分离室内的电极间所述pH基本上为非线性的。
46.权利要求40、44和45中任一项的试剂盒，其在自由流动等电聚焦中使用。
47.权利要求40的试剂盒，其中所述分离介质为包含至少一种缓冲化合物的挥发性缓冲介质。
48.权利要求47的试剂盒，其中所述挥发性缓冲介质包含在减压下为挥发性的至少一种缓冲化合物。
49.权利要求47的试剂盒，其中所述挥发性缓冲介质包含在提高温度时为挥发性的至少一种缓冲化合物。
50.权利要求47的试剂盒，其中所述挥发性缓冲介质包含在经受照射时为挥发性的至少一种缓冲化合物。
51.权利要求47的试剂盒，其中所述挥发性缓冲介质包含在质谱工作条件下为挥发性的至少一种缓冲化合物。
52.权利要求36～51中任一项的试剂盒，其还包含阳极和/或阴极稳定化介质。
53.权利要求52的试剂盒，其中所述稳定化介质具有比所述分离介质更高的电导率，优选其中与邻近稳定化介质的分离介质的电导率相比，所述电导率提高了至少2倍，且最优选至少3倍。
54.权利要求53的试剂盒，其中所述稳定化介质电导率的提高通过提高相比于分离介质的缓冲化合物的浓度来实现。
55.权利要求53或54的试剂盒，其中所述阴极稳定化介质电导率的提高通过添加强碱到所述阴极稳定化介质来实现，及其中所述阳极稳定化介质电导率的提高通过添加强酸到所述阳极稳定化介质来实现。
56.权利要求55的试剂盒，其中所述强碱为NaOH且所述强酸为H2SO4。
57.权利要求52～56中任一项的试剂盒，其中所述阳极稳定化介质具有与邻近所述阳极稳定化介质的分离介质的pH相等或较之更低的pH。
58.权利要求52～57中任一项的试剂盒，其中所述阴极稳定化介质具有与邻近所述阴极稳定化介质的分离介质的pH相等或较之更高的pH。
59.权利要求36～58中任一项的试剂盒，其还包含至少一种聚焦介质。
60.权利要求37～59中任一项的试剂盒，其还包含用于切割至少一种可切割表面活性剂的制剂。
61.权利要求36～60中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒的组分以即用于权利要求1～33中任一项的自由流动电泳方法的水溶液存在。
62.权利要求36～60中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒的组分以待稀释至适当浓度以在权利要求1～33中任一项的自由流动电泳方法中使用的浓缩的储存水溶液存在。
63.权利要求62的试剂盒，其中各储存溶液相互独立地具有选自下列的浓度：1.5×、2×、2.5×、3×、4×、5×、6×、10×、20×、25×、50×、75×、100×、150×、200×和1000×。
64.权利要求36～60中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒的组分以待用溶剂、优选水将其溶解至适当浓度以在权利要求1～33中任一项的自由流动电泳方法中使用的干燥或冷冻干燥形式存在。
65.权利要求36～64中任一项的试剂盒，其还包含：描述一个或更多个实验规程的产品手册及可选的所述组分的储存条件。
66.权利要求36～65中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒的各组分、各干燥组分和/或各储存溶液被分别放置在密封容器中。
67.权利要求12～16中任一项所定义的MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂，或者MS-兼容性两性离子或非离子可切割表面活性剂用于自由流动电泳的用途。
68.权利要求34或35所定义的分离介质用于自由流动电泳的用途。
69.权利要求36～66中任一项所定义的试剂盒用于自由流动电泳的用途。
70.用于通过自由流动电泳分离样品中分析物的方法，其包括：进行包括至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂的自由流动电泳分离，其中所述表面活性剂包含于样品介质和/或至少一种分离介质中。
71.权利要求70的方法，其中在电泳分离后在一个或多于一个级分中收集至少部分样品。
72.权利要求70的方法，其中所述分析物选自：有机分子、无机分子、生物颗粒、生物聚合物或生物分子，尤其是：蛋白、蛋白聚集体、蛋白复合物、肽、疏水肽、DNA-蛋白复合物、DNA、膜、膜碎片、脂质、糖及其衍生物、多糖及其衍生物、激素、脂质体、病毒颗粒、抗体、抗体复合物、纳米颗粒、塑料的成分、乳胶漆颗粒、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、右旋糖苷、纤维素衍生物、多元酸、药用药物、药物前体、药物爆裂物的代谢物、毒素、致癌物、毒物、过敏原、传染剂、和它们的混合物，其中所述蛋白尤其是膜结合蛋白、内在膜蛋白和亲脂性蛋白。
73.权利要求70的方法，其中所述自由流动电泳的操作模式选自：连续模式、间隔模式和循环间隔模式，且它们独立地，其中所述自由流动电泳分离通过选自下列的分离模式来实现：自由流动等电聚焦(FF-IEF)、自由流动区带电泳(FF-ZE)或自由流动等速电泳(FF-ITP)。
74.权利要求70的方法，其中所述MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂为未经修饰的MS-兼容性表面活性剂，或者为酸敏、碱敏、化学活性或光敏的且可切割成MS-兼容性部分和可通过离心或过滤去除的部分的可切割表面活性剂。
75.权利要求70的方法，其中所述MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂为可切割MS-兼容性表面活性剂，且所述可切割MS-兼容性表面活性剂选自：{2-[2-(二甲基-辛基-硅烷基)-乙氧基]-2-羟基-乙基}-三甲基溴化铵、3-(2，4，6-三羟基苯基)丙烯酸辛基酯和3-[3-(1，1-双烷氧基乙基)吡啶-1-基]丙烷-1-磺酸盐。
76.权利要求70的方法，其中至少部分级分或至少部分样品在通过自由流动电泳分离之前或之后经受蛋白消化步骤；且，当所述蛋白消化步骤在FFE分离后进行时，所述蛋白消化步骤在可选的表面活性剂切割步骤之前或之后进行。
77.权利要求70的方法，其中将包含切割剂的逆流介质与包含可切割表面活性剂的自由流动电泳分离后的样品的至少部分级分相接触和/或相混合。
78.权利要求70的方法，其中所述逆流介质用于调整所述介质条件以在自由流动电泳分离后稳定包含在其中的可切割表面活性剂。
79.用于分析分析物的方法，包括：
自由流动电泳步骤，其包括至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂的使用，其中所述表面活性剂包含于样品缓冲液和/或至少一种分离缓冲液中；及
从自由流动电泳获得的至少一个级分的随后分析，其中所述随后分析选自：自由流动电泳、凝胶电泳、1D-和2D-PAGE、MS、MALDIMS、ESI MS、SELDI MS、ELISA、LC-MS(/MS)、MALDI-TOF-MS(/MS)、IR光谱法、UV光谱法、HPLC、Edman测序、NMR谱、表面等离子体共振、X射线衍射、核酸测序、电印迹、氨基酸测序、流式细胞术、圆二色和它们的任意组合
80.权利要求79的方法，其中在电泳分离后的一个或多于一个级分中收集至少部分样品。
81.权利要求79的方法，其中所述分析物选自：有机分子、无机分子、生物颗粒、生物聚合物或生物分子，尤其是：蛋白、蛋白聚集体、蛋白复合物、肽、疏水肽、DNA-蛋白复合物、DNA、膜、膜碎片、脂质、糖及其衍生物、多糖及其衍生物、激素、脂质体、病毒颗粒、抗体、抗体复合物、纳米颗粒、塑料的成分、乳胶漆颗粒、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、右旋糖苷、纤维素衍生物、多元酸、药用药物、药物前体、药物爆裂物的代谢物、毒素、致癌物、毒物、过敏原、传染剂、和它们的混合物，其中所述蛋白尤其是膜结合蛋白、内在膜蛋白和亲脂性蛋白。
82.权利要求79的方法，其中所述自由流动电泳的操作模式选自：连续模式、间隔模式和循环间隔模式，且它们独立地，其中所述自由流动电泳分离通过选自下列的分离模式实现：自由流动等电聚焦(FF-IEF)、自由流动区带电泳(FF-ZE)或自由流动等速电泳(FF-ITP)。
83.权利要求79的方法，其中所述MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂为未经修饰的MS-兼容性表面活性剂，或为酸敏、碱敏、化学活性或光敏的且可切割成MS-兼容性部分和可通过离心、过滤和蒸发去除的部分的可切割表面活性剂。
84.权利要求79的方法，其中所述MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂为可切割MS-兼容性表面活性剂，且所述可切割MS-兼容性表面活性剂选自：{2-[2-(二甲基-辛基-硅烷基)-乙氧基]-2-羟基-乙基}-三甲基溴化铵、3-(2，4，6-三羟基苯基)丙烯酸辛基酯和3-[3-(1，1-双烷氧基乙基)吡啶-1-基]丙烷-1-磺酸盐。
85.权利要求79的方法，其中至少部分级分或至少部分样品在通过自由流动电泳的分离之前或之后经受蛋白消化步骤；且，当所述蛋白消化步骤在FFE分离后进行时，所述蛋白消化步骤在可选的表面活性剂切割步骤之前或之后进行。
86.权利要求79的方法，其中使用包含切割剂的逆流介质以使包含可切割表面活性剂和至少部分样品的自由流动电泳级分与所述切割剂相接触。
87.权利要求79的方法，其中将包含切割剂的逆流介质与包含可切割表面活性剂的自由流动电泳分离后的样品的至少部分级分相接触和/或相混合。
88.适于通过自由流动电泳分离样品中分析物的分离介质，其包含至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂。
89.权利要求88的分离介质，其中所述包含至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂的介质选自：A/B分离介质、挥发性介质和互补多配对缓冲介质。
90.用于通过自由流动电泳分离样品中分析物的试剂盒，其包含至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂。
91.权利要求90的试剂盒，其中所述至少一种MS-兼容性两性离子或非离子表面活性剂可切割成至少一个MS-兼容性部分和至少一个可通过离心、过滤或蒸发去除的部分。
92.权利要求90的试剂盒，其还包含选自一种分离介质和多种分离介质的至少一种组分，其中所述分离介质选自：A/B缓冲介质、挥发性缓冲介质和互补多配对缓冲介质；及可选择地，其还包含阳极和/或阴极稳定化介质、聚焦介质、可切割表面活性剂、描述一个或更多个实验规程的产品手册、所述组分的储存条件和/或逆流介质。
93.权利要求90的试剂盒，其中以选自下列的形式或下列之任意组合提供所述试剂盒的组分：
即用于自由流动电泳方法的水溶液、
待稀释至适当浓度以在自由流动电泳方法中使用的浓缩的储存水溶液、和
待用溶剂、优选水将其溶解至适当浓度以在自由流动电泳方法中使用的干燥或冷冻干燥形式。
94.权利要求90的试剂盒，其中所述试剂盒的各即用组分、各干燥的组分和/或各储存溶液分别放置在密封容器中。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104560636A (zh) * 2014-12-30 2015-04-29 北京理工大学 一种细胞预处理装置和方法
CN104991027A (zh) * 2015-07-31 2015-10-21 北京市药品检验所 降低lc-ms测试物中不挥发性缓冲盐含量的方法
CN105699647A (zh) * 2015-09-11 2016-06-22 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种新型电泳缓冲液及其制备方法和应用
CN109900774A (zh) * 2018-12-13 2019-06-18 中国科学院生态环境研究中心 通过高温处理提高maldi-tof-ms对聚苯乙烯微/纳米颗粒检测灵敏度的方法
CN114728213A (zh) * 2019-10-09 2022-07-08 普诺森公司 用于具有顺序pH调整的单通道自由流电泳的方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8865401B2 (en) * 2007-12-14 2014-10-21 The Johns Hopkins University Purification and concentration of proteins and DNA from a complex sample using isotachophoresis and a device to perform the purification
JP5977269B2 (ja) 2013-01-22 2016-08-24 アークレイ株式会社 試料の分析方法及びそれに用いる溶液
EP2821781A1 (en) 2013-07-04 2015-01-07 FFE Service GmbH Free-flow electrophoresis method for separating analytes
CN104307367B (zh) * 2014-10-27 2016-06-01 上海交通大学 一种往复式自由流等电聚焦电泳装置及方法
EP4012395A1 (en) * 2020-12-11 2022-06-15 Gerhard Weber Free-flow electrophoresis method for separating analytes
CN114216951A (zh) * 2021-12-08 2022-03-22 中国石油大学(北京) 污水中磺酸盐类化合物的分离方法和溶解性有机质分子组成分析方法
CN116804630B (zh) * 2023-08-03 2024-03-05 中拓生物有限公司 一种血清同型半胱氨酸测定试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001153841A (ja) * 1999-11-26 2001-06-08 Olympus Optical Co Ltd 電気泳動装置
US20040010126A1 (en) * 2000-02-08 2004-01-15 The Regents Of The University Of Michigan Protein mapping
CN1469120A (zh) * 2002-07-18 2004-01-21 中国科学院大连化学物理研究所 一种聚合物芯片微通道内表面予处理的方法
CN1477391A (zh) * 2002-08-21 2004-02-25 中国科学院大连化学物理研究所 二维或多维毛细管电泳分离生物大分子的方法及所用接口

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4139472C1 (zh) 1991-11-29 1993-03-11 Gerhard Dr. 8011 Kirchheim De Weber
US5447612A (en) 1993-02-01 1995-09-05 Protein Technologies, Inc. Buffering system and its use in electrophoretic processes
DE19711898A1 (de) 1997-03-21 1998-09-24 Gerhard Dr Weber Verfahren und Vorrichtung zur trägerfreien Ablenkungs-Elektrophorese im Intervall-Betrieb
DE10047088C2 (de) 2000-09-21 2002-10-17 Gerhard Weber Medium für analytische und präparative Elektrophorese
DE10063097B4 (de) 2000-12-18 2007-04-19 Becton, Dickinson And Co. Elektrophoresevorrichtung
DE10063096C1 (de) 2000-12-18 2002-09-12 Gerhard Weber Elektrophoresevorrichtung, Elektrophoreseverfahren unter Verwendung einer Elektrophoresevorrichtung und Verwendung der Elektrophoresevorrichtung
WO2002097393A2 (en) 2001-05-29 2002-12-05 Vanderbilt University Cleavable surfactants and methods of use thereof
US7169275B2 (en) 2002-01-21 2007-01-30 Tecan Trading Ag Method for separating particles in free flow electrophoresis
US7169278B2 (en) 2002-01-21 2007-01-30 Tecan Trading Ag Apparatus and separation media for separating particles in free-flow electrophoresis
WO2006047614A2 (en) 2004-10-26 2006-05-04 Invitrogen Corporation Compositions and methods for analyzing biomolecules using mass spectroscopy
WO2006133325A2 (en) 2005-06-08 2006-12-14 Vanderbilt University Analysis of tissue samples surrounding malignancies
US20100252435A1 (en) 2006-06-20 2010-10-07 Gerhard Weber Method and device for separation and depletion of certain proteins and particles using electrophoresis
ES2635255T3 (es) 2006-08-29 2017-10-03 Becton Dickinson And Company Método y aparato para electroforesis de desviación libre de portador

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001153841A (ja) * 1999-11-26 2001-06-08 Olympus Optical Co Ltd 電気泳動装置
US20040010126A1 (en) * 2000-02-08 2004-01-15 The Regents Of The University Of Michigan Protein mapping
CN1469120A (zh) * 2002-07-18 2004-01-21 中国科学院大连化学物理研究所 一种聚合物芯片微通道内表面予处理的方法
CN1477391A (zh) * 2002-08-21 2004-02-25 中国科学院大连化学物理研究所 二维或多维毛细管电泳分离生物大分子的方法及所用接口

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JEREMY L. NORRIS, MATTHEW J. HANGAUER ET AL.: "Nonacid cleavable detergents applied to MALDI mass spectrometry profiling of whole cells"", 《JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY》 *
JEREMY L. NORRIS, NED A. PORTER, RICHARD M. CAPRIOLI: "Mass Spectrometry of Intracellular and Membrane Proteins Using Cleavable Detergents", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
YONGHUI WANG, WILLIAM S., ET AL.: "Free flow electrophoresis coupled with liquid chromatography-mass spectrometry for a proteomic study of the human cell line(K562/CR3)", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104560636A (zh) * 2014-12-30 2015-04-29 北京理工大学 一种细胞预处理装置和方法
CN104991027A (zh) * 2015-07-31 2015-10-21 北京市药品检验所 降低lc-ms测试物中不挥发性缓冲盐含量的方法
CN105699647A (zh) * 2015-09-11 2016-06-22 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种新型电泳缓冲液及其制备方法和应用
CN105699647B (zh) * 2015-09-11 2018-10-12 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一种新型电泳缓冲液及其制备方法和应用
CN109900774A (zh) * 2018-12-13 2019-06-18 中国科学院生态环境研究中心 通过高温处理提高maldi-tof-ms对聚苯乙烯微/纳米颗粒检测灵敏度的方法
CN114728213A (zh) * 2019-10-09 2022-07-08 普诺森公司 用于具有顺序pH调整的单通道自由流电泳的方法

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