CN104307367B - 一种往复式自由流等电聚焦电泳装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种往复式自由流等电聚焦电泳装置及方法，主要由分离室、储液管、气液缓冲室、收集管以及位于收集管下方与收集管一一对应的回收管、介质驱动泵组成，其中，分离室的分离室出液口通过开关分别与收集管和回收管连接，储液管连接气液缓冲室出液口，气液缓冲室出液口又与分离室进液口连接，介质驱动泵驱动介质由气液缓冲室进液口流入或流出气液缓冲室。本发明装置及方法，采用一台单道驱动泵取代多道驱动泵，采用CA缓冲液和样品快速往复经过分离室替代现有技术中单向循环，达到了已有RFFIEF技术同样效果，且整个ReFFIEF的技术、设备和方法大大简化，降低了成本。

Description

一种往复式自由流等电聚焦电泳装置及方法

技术领域

本发明涉及的是生物化工技术领域的制备型电泳装置及方法，具体是一种往复式自由流等电聚焦电泳装置及方法。主要应用于蛋白质、多肽、细胞、细胞器、病毒等两性物质与颗粒的自由流等电聚焦电泳分离。

背景技术

自由流电泳(Freeflowelectrophoresis，FFE)是一种兼具制备和分析功能的纯液相电泳技术，具有分离条件温和、回收率高、可连续分离纯化等优点。自1961年Hanning发明自由流电泳以来(Hanning,K.,FreseniusJ.Anal.Chem.1961,181,244-254)，FFE已发展出多种电泳制备技术，如自由流区带电泳(Freeflowzoneelectrophoresis,FFZE)、自由流等电聚焦电泳(Freeflowisoelectricfocusingelectrophoresis,FFIEF)、自由流等速电泳(Freeflowisotachophoresiselectrophoresis,FFITP)和自由流场梯度电泳(Freeflowfieldstepelectrophoresis,FFFSE)等。其中FFIEF是目前FFE应用较广泛分离效率最高的FFE分离技术(Burggraf,D.,Weber,G.,Lottspeich,F.,Electrophoresis1995,16,1010–1015)。

FFIEF基本原理是利用载体两性电解质(Carrierampholytes,CA)在直流电场中形成pH梯度缓冲体系，当带电的蛋白质或多肽移动到其等电点pI位置时由于净电荷变为零而停止运动，从而实现蛋白质或多肽等两性物质的聚焦分离。整个FFIEF结束后，分离的样品将随CA缓冲液从不同组分收集检测。FFIEF技术可分为连续式自由流等电聚焦技术(Continuousfreeflowisoelectricfocusing,CFFIEF)和循环式自由流等电聚焦技术(Recyclingfreeflowisoelectricfocusing,RFFIEF)。CFFIEF为通用型连续式自由流聚焦电泳技术，相关研究较多(Weber,G.,US5275706,1994；Weber,G.,US6328868,1995；Weber,G.,WO2008025806,2008；Nissum,M.,Weber,G.,WO2009133153,2009)。在进行CFFIEF时，CA缓冲液和蛋白样品连续泵入分离室，在电场作用下进行聚焦分离，随即进行组分收集。但CFFIEF常常存在聚焦不完全的问题。

为克服上述问题，Bier等于1979年发展了RFFIEF(Bier,M.,Egen,N.,in:Haglund,H.,Westerfeld,J.G.,Ball,J.T.(Eds.),Electrofocusing,ElsevierNorthHolland,NewYork1979,pp.35-48.)。在进行RFFIEF时，多道驱动泵驱动CA缓冲液和蛋白样品流入分离室，CA和蛋白质在横向电场作用下实现部分等电聚焦，从分离室出口流出，经外部循环后再次流入分离室进行再聚焦，如此反复直到实现充分的聚焦分离。为减少对流，RFFIEF分离室是由孔径5-10μm多孔尼龙膜或聚酯膜隔成的多室结构，有效抑制了等点聚焦电泳过程中由于电场和重力引起的对流，提高了分辨率。

1990年Bier等(Bier,M.,Twitty,G.E.,USPatent4897169,1990.)发展了RF3型FFIEF装置。在该装置中，多道驱动泵驱动CA缓冲液和蛋白样品依次流经储液池、脉冲缓冲器、分离室、热量交换器，再循环到多道驱动泵。该装置的分离室是由两块间距0.5-1.5mm平行板构成的矩形薄层分离腔，长条形电极分布于分离室两侧，提供垂直于液流方向的分离电场。该装置的突出优点是分离室温度控制能力较强，液体在分离室快速流动，在电场中停留时间较短，温度升高有限，通过外循环过程中的热量交换器转移热量，达到控制分离室温度的目的。优异的温控能力为高电场创造了条件，该装置最高可使用150W分离功率，是CFFIEF所能承载功率的20倍。此外，CA缓冲液在分离室的快速流动有效抑制了因重力、浓度差异、电渗流等引起的对流，提高了分辨率。

但上述RFFIEF技术存在以下问题：第一，装置复杂且较为昂贵，需要昂贵的多道驱动泵；第二，多道驱动泵能驱动软管数量有限，限制了装置的设计；第三，操作复杂，溶液的引入和回收较为麻烦，分离室气体排出需要反复调整多道驱动泵转动方向来实现。

发明内容

针对上述现有技术中存在的技术问题，本发明提出一种往复式自由流等电聚焦技术(Reciprocatingfreeflowisoelectricfocusing,ReFFIEF)，采用一台单道驱动泵取代多道驱动泵，采用CA缓冲液和样品快速往复经过分离室替代现有技术中单向循环，达到了已有RFFIEF技术同样效果：有效抑制因重力、浓度差异、电渗流等引起的对流，提高了分离的分辨率。但整个ReFFIEFFFIEF的技术、设备和方法大大简化，降低了成本。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种往复式自由流等电聚焦电泳装置，主要由分离室、储液管、气液缓冲室、收集管以及位于收集管下方与收集管一一对应的回收管、介质驱动泵组成，其中，分离室的分离室出液口通过开关分别与收集管和回收管连接，储液管连接气液缓冲室出液口，气液缓冲室出液口又与分离室进液口连接，介质驱动泵驱动介质由气液缓冲室进液口流入或流出气液缓冲室。

所述分离室出液口与三通相连接，三通其他两管分别与收集管和回收管相连接，分离室出液口与三通之间，回收管与三通之间分别设置开关。

所述气液缓冲室为封闭式结构，储液管独立分布于气液缓冲室内部，储液管下端连接气液缓冲室出液口，气液缓冲室侧面分布有气液缓冲室进液口。

所述其中一个分离室进液口和其中一个分离室出液口各设有一个非接触式微型水位控制器，当分离室进液口或分离室出液口中水位低于微型水位控制器时，微型水位控制器发出信号，介质驱动泵反转运行方向，两个微型水位控制器均控制同一个介质驱动泵；水位上升至微型水位控制器时不做响应。

所述气液缓冲室内部容积是储液管总容积的两倍以上，保证介质液面不会超过储液管管口。

所述气液缓冲室由储液管支架、气液缓冲室壳体和气液缓冲室底板构成，储液管支架起到固定储液管作用，气液缓冲室壳体和气液缓冲室底板紧固，形成封闭结构。

还包括温度控制部件，位于分离室下方位置。

所述介质为冰水。

一种往复式自由流等电聚焦电泳方法，采用上述装置完成，包括步骤如下：载体两性电解质缓冲液和样品从储液管流出，流经分离室，进入收集管；再由收集管回流，流经分离室，流入储液管，如此往复循环流动，载体两性电解质缓冲液和样品多次流经分离室时，在横向电场作用下实现多次等电聚焦，直到聚焦充分完成，载体两性电解质缓冲液和样品在储液管和收集管之间的往复流动是由气液缓冲室中气压增大或减小驱动，介质驱动泵驱动介质流入或流出气液缓冲室使分离室内部气压增大或减小。

所述介质驱动泵驱动介质流入或流出气液缓冲室之间的切换由设置于分离室进液口和分离室出液口的微型水位控制器控制，当分离室进液口和分离室出液口水位低于微型水位控制器时，微型水位控制器发出信号，介质驱动泵反转运行方向。

与已有RFFIEF装置相比，本发明具有以下优点：

第一、装置简单，已有RFFIEF装置多采用多道驱动泵，由于采用气液缓冲室，本发明涉及装置中只需要一台单道驱动泵即可实现相似功能。

第二、易于拓展，已有RFFIEF装置受到多道驱动泵所能驱动软管数量的限制，增加循环管数困难，本发明中不存在上述限制，理论上可无限增加循环管数，为提高装置的分辨率提供了可能。

第三、多道驱动泵运行过程中，在卡盒位置容易产生气泡，气泡进入分离室后会破坏流型，影响等电聚焦分离效果，现有RFFIEF装置通过设置气泡俘获装置克服上述问题，本发明中不存在上述问题，无须设置气泡俘获装置。

第四、驱动泵运行过程中多存在脉冲现象，脉冲会影响CA缓冲液在分离室中的流型进而影响等电聚焦分离效果，现有RFFIEF装置通过设置脉冲缓冲装置克服上述问题，本发明中气液缓冲室本身具有脉冲缓冲功能，无须设置脉冲缓冲器即可得到稳定的液流。

第五、电泳过程中焦耳热的产生不可避免，控制CA缓冲液温度，降低焦耳热引起的对流是提高装置分辨率的重要途径，已有RFFIEF装置中通过在分离室外部的循环管上设置热量交换器，降低CA缓冲液温度。本发明中采用双制冷控温，其一，驱动介质采用冰水，即可充当驱动介质，亦可降低储液管中CA缓冲液温度，其二，分离室下方的半导体制冷系统直接控制分离室温度。

第六、操作简单，本发明涉及ReFFIEF技术中繁琐的手动操作只有样品注入一个步骤，其他步骤均易于操作。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1是本发明所提供的ReFFIEF装置原理示意图；

图2是气液缓冲室结构示意图；

图3是分离室结构示意图。

其中，1分离室，2储液管，3气液缓冲室，4收集管，5回收管，6介质驱动泵，7电极缓冲液驱动泵，8开关，9开关，10分离室出液口，11三通，12分离室进液口，13气液缓冲室出液口，14电极室，15气液缓冲室进液口，16进液口微型水位控制器，17出液口微型水位控制器，18分离室上板，19分离室下板，20隔垫，21气液缓冲室壳体，22储液管支架，23气液缓冲室底板。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

如图1，2，3所示，本发明所提供的ReFFIEF装置，包括分离室1、储液管2、气液缓冲室3、收集管4、回收管5、介质驱动泵6、电极缓冲液驱动泵7、多个开关8、9及温度控制部件。分离室出液口10与三通11相连接，三通11其他的两个管分别与收集管4和回收管5相连接；分离室出液口10与三通11之间，回收管5与三通11之间各设置开关8和开关9；收集管4下端位置高于分离室出液口10，回收管5位于收集管4正下方且与收集管4一一对应；气液缓冲室出液口13与分离室进液口12相连接；电极室缓冲溶液通过驱动泵7的驱动在电极室14内循环。

气液缓冲室3为封闭式结构，由气液缓冲室壳体21，储液管支架22和气液缓冲室底板23构成，气液缓冲室壳体21和气液缓冲室底板23通过紧固螺丝固定，达到密封效果；储液管2分布于气液缓冲室3内部，储液管支架22起到固定储液管2的作用，储液管2下端连接气液缓冲室出液口13，气液缓冲室出液口13又与分离室进液口12连接；气液缓冲室3侧面靠近气液缓冲室底板23位置分布有气液缓冲室进液口15，液体(或气体)介质通过介质驱动泵6的驱动由气液缓冲室进液口15流入(或流出)气液缓冲室3。

其中一个分离室进液口12和其中一个分离室出液口10底部各设置一个微型非接触式进液口微型水位控制器16和出液口微型水位控制器17，当分离室进液口12或分离室出液口10中水位低于进液口微型水位控制器16或出液口微型水位控制器17时，进液口微型水位控制器16或出液口微型水位控制器17发出信号，介质驱动泵6反转运行方向，进液口微型水位控制器16和出液口微型水位控制器17均控制同一个介质驱动泵6；水位上升至进液口微型水位控制器16和出液口微型水位控制器17时不做响应。

分离室上板18、分离室下板19将隔垫20夹在中间，隔垫20中间为挖空结构，在分离室上板18、分离室下板19中间形成矩形薄层分离腔；分离室进液口12和分离室出液口10分别位于分离室上板18前段和后端，分离室进液口12和分离室出液口10数量相同，均为两排交错分布且一一对应；电极室14平行分布于分离室上板18两侧，电极位于电极室14内。温度控制部件包括一个或多个半导体制冷片、温度传感器、散热风扇和控制电路，半导体制冷片制冷面紧贴于分离室下板19。

电泳过程中介质驱动泵6驱动介质流入气液缓冲室3，气液缓冲室3气压增大推动储液管2中CA缓冲液和样品流入分离室1，CA和样品在横向电场作用下实现部分等电聚焦，然后流入收集管4，当分离室进液口12中液面低于设于分离室进液口12处的进液口微型水位控制器16时，介质驱动泵6接受信号翻转运行方向，气液缓冲室3气压减小，储液管2中液面上升，CA缓冲液和样品从收集管4回流再次进入分离室1，在横向电场中再次等电聚焦，然后进入储液管2，当分离室出液口10中液面低于设于分离室出液口10的出液口微型水位控制器17时，介质驱动泵6再次接受信号反向运行方向，如此反复，CA缓冲液和样品在储液管2和收集管4间往复流动，反复快速流经分离室1，在横向电场作用下完成等电聚焦。

阴极缓冲溶液为0.1MNaOH缓冲溶液；阳极缓冲溶液为0.1MH₃PO₃缓冲溶液；CA缓冲液含2％的pH3-10载体两性电解质溶液；200mlCA缓冲液中加入10mg人血清蛋白；采用冰水做为介质。

操作步骤如下：步骤一：打开制冷部件电源，设置温度10℃，开启电极缓冲液驱动泵7驱动电极缓冲液在电极室14内流动。步骤二：打开分离室出液口10与三通11之间开关8，关闭回收管5与三通11之间开关9，CA缓冲液和样品注入收集管4；开启介质驱动泵6且以最大速度运行，直至CA缓冲液和样品充满分离室1且无任何气泡存在；步骤三：调整介质驱动泵6流速，打开分离电场，施加1000V电压，电泳过程中CA缓冲液电导逐步下降，待电导下降至平台期后，完成电泳过程；步骤四：待储液管2中液面降至底部时，关闭介质驱动泵6，关闭分离电场，关闭分离室出液口10与三通11之间开关8，打开回收管5与三通11之间开关9，收集管4中各组分在重力作用下流入回收管5，完成回收。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (10)

1.一种往复式自由流等电聚焦电泳装置，其特征在于，主要由分离室（1）、储液管（2）、气液缓冲室（3）、收集管（4）以及位于收集管（4）下方与收集管（4）一一对应的回收管（5）、介质驱动泵（6）组成，其中，分离室（1）的分离室出液口（10）通过开关分别与收集管（4）和回收管（5）连接，储液管（2）连接气液缓冲室出液口（13），气液缓冲室出液口（13）又与分离室进液口（12）连接，介质驱动泵（6）驱动介质由气液缓冲室进液口（15）流入或流出气液缓冲室（3）。

2.根据权利要求1所述的往复式自由流等电聚焦电泳装置，其特征在于，所述分离室出液口（10）与三通（11）相连接，三通（11）其他两管分别与收集管（4）和回收管（5）相连接，分离室出液口（10）与三通（11）之间，回收管（5）与三通（11）之间分别设置开关（8）和开关（9）。

3.根据权利要求1所述的往复式自由流等电聚焦电泳装置，其特征在于，所述气液缓冲室（3）为封闭式结构，储液管（2）独立分布于气液缓冲室（3）内部，储液管（2）下端连接气液缓冲室出液口（13），气液缓冲室（3）侧面分布有气液缓冲室进液口（15）。

4.根据权利要求1所述的往复式自由流等电聚焦电泳装置，其特征在于，其中一个分离室进液口（12）和其中一个分离室出液口（10）分别设有一个非接触式进液口微型水位控制器（16）和出液口微型水位控制器（17），当分离室进液口（12）水位低于进液口微型水位控制器（16）时，进液口微型水位控制器（16）发出信号，或者，分离室出液口（10）中水位低于出液口微型水位控制器（17）时，出液口微型水位控制器（17）发出信号，介质驱动泵（6）反转运行方向，进液口微型水位控制器（16）和出液口微型水位控制器（17）均控制同一个介质驱动泵（6）；水位上升至进液口微型水位控制器（16）和出液口微型水位控制器（17）时不做响应。

5.根据权利要求1所述的往复式自由流等电聚焦电泳装置，其特征在于，所述气液缓冲室（3）内部容积是储液管（2）总容积的两倍以上，保证介质液面不会超过储液管（2）管口。

6.根据权利要求1所述的往复式自由流等电聚焦电泳装置，其特征在于，所述气液缓冲室（3）由储液管支架（22）、气液缓冲室壳体（21）和气液缓冲室底板（23）构成，储液管支架（22）起到固定储液管（2）作用，气液缓冲室壳体（21）和气液缓冲室底板（23）紧固，形成封闭结构。

7.根据权利要求1所述的往复式自由流等电聚焦电泳装置，其特征在于，还包括温度控制部件，位于分离室下方位置。

8.根据权利要求1所述的往复式自由流等电聚焦电泳装置，其特征在于，所述介质为冰水。

9.一种往复式自由流等电聚焦电泳方法，其特征在于，采用如权利要求1至8中任一装置完成，包括步骤如下：载体两性电解质缓冲液和样品从储液管（2）流出，流经分离室（1），进入收集管（4）；再由收集管（4）回流，流经分离室（1），流入储液管（2），如此往复循环流动，载体两性电解质缓冲液和样品多次流经分离室（1）时，在横向电场作用下实现多次等电聚焦，直到聚焦充分完成，载体两性电解质缓冲液和样品在储液管（2）和收集管（4）之间的往复流动是由气液缓冲室（3）中气压增大或减小驱动，介质驱动泵（6）驱动介质流入或流出气液缓冲室（3）使分离室（1）内部气压增大或减小。

10.根据权利要求9所述的往复式自由流等电聚焦电泳方法，其特征在于，所述介质驱动泵（6）驱动介质流入或流出气液缓冲室（3）之间的切换由设置于分离室进液口（12）的进液口微型水位控制器（16）和设置于分离室出液口（10）的出液口微型水位控制器（17）控制，当分离室进液口（12）水位低于进液口微型水位控制器（16）时，进液口微型水位控制器（16）发出信号，或者，分离室出液口（10）中水位低于出液口微型水位控制器（17）时，出液口微型水位控制器（17）发出信号，介质驱动泵（6）反转运行方向。