CN105695608A - 一种筛查dna甲基化修饰相关基因的方法 - Google Patents

一种筛查dna甲基化修饰相关基因的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种筛查DNA甲基化修饰相关基因的方法，属于DNA检测技术领域。本发明利用单基因缺失型突变体生物材料，采用化学发光酶联免疫法检测基因组DNA链中的碱基甲基化水平，通过比较基因缺失型突变体与其同源正常对照组细胞中基因组DNA的甲基化水平，分析突变体中缺失基因与DNA碱基甲基化修饰的关系，筛选出与DNA甲基化修饰相关的基因。该方法既具有对DNA中甲基化碱基的检测特异性，又具有极高的检测灵敏度。本发明操作步骤简便，成本较低，稳定性强，无需大型昂贵设备，可同时检测多个样本。

Description

一种筛查DNA甲基化修饰相关基因的方法
技术领域：
本发明涉及DNA检测技术领域，具体是一种筛查DNA甲基化修饰相关基因的方法。
技术背景:
生物体在有氧活动过程中会产生氧化性DNA损伤，并能激活体内修复系统及时修复DNA损伤，维持机体遗传结构稳定、功能正常。当机体相关基因功能缺失或异常时，机体对损伤的修复能力下降。由于生物体内存在基因互补作用，使很多单基因缺失型突变体在一般条件下能维持生理状态，但遭遇环境刺激时，因突变体维持机体稳态的功能低下，与正常对照组产生差异。
DNA分子中碱基的甲基化修饰与DNA氧化损伤有关，还涉及目前最新的表观遗传学控制理论，是近年来生物学和医学领域研究的热点。DNA分子中胞嘧啶和鸟嘌呤的甲基化参与机体中DNA分子结构的稳定及转录调节，与环境暴露和肿瘤发生有直接关系。研究发现，人类组织中DNA胞嘧啶甲基化(M5C)和鸟嘌呤甲基化(M1G)状态与多种疾病和癌症的发生有关，真核生物基因组DNA甲基化特征的改变会影响基因转录和一系列生理过程。但是关于甲基化修饰在机体生理中的作用及机制研究还处于起步阶段，很多过程有待发现。目前对DNA甲基化的研究很大程度上依赖于基因缺失型突变体材料，筛选甲基化修饰相关基因是研究DNA甲基化作用及机制的关键之一。
目前，对DNA甲基化修饰相关基因的筛选，可采用芯片技术、高通量测序技术、高压液相色谱、高压液相-质谱(LC-MS)联用技术。其中，高压液相色谱、高压液相-质谱联用技术可分析DNA样品中碱基的总甲基化水平，芯片技术可以检测DNA中特定序列中的胞嘧啶甲基化水平，高通量测序能对基因组DNA序列中胞嘧啶的甲基化特征进行检测。通过这些技术可获得组织细胞中DNA的甲基化水平和特征，经过对不同基因缺失型材料与正常对照组材料中DNA甲基化特征的比对分析，可筛选出甲基化修饰相关的功能基因，但均需昂贵设备和专门技术人员，费用较高，一般实验室难以开展。因此，发明一种简便快速、高效、稳定的筛查方法非常必要。
随着技术的进步，我们能够获得越来越多的突变体材料，为基因功能研究提供了便利，但很多基因的功能尚属未知。为快速筛查DNA甲基化修饰相关基因，我们研究建立了以基因缺失型突变体为材料，化学发光酶联免疫法检测为基础，氧化剂处理辅助筛选为特点，快速筛查DNA甲基化修饰相关基因的方法。
发明内容：
本发明的目的是建立一种简便、易行、效果良好的筛查DNA甲基化修饰相关基因的方法，以解决用大型昂贵设备检测所带来的不便。
本发明提供了一种筛查DNA甲基化修饰相关基因的方法，包括如下步骤：
(1)取单基因缺失的突变体生物材料及其相应的对照组材料；设药物处理组和对照组，药物处理组用过氧亚硝酸盐(peroxynitrite)处理，对照组不加过氧亚硝酸盐；取药物处理组和对照组材料的组织或细胞，提取基因组DNA，加灭菌双蒸水或TE缓冲液(含10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)溶解；
(2)取步骤(1)得到的纯度和质量合格的DNA样品，于4℃超声波断裂为长度450-1500nt的片段，100℃保温5-8分钟后迅速制冷，加入等体积预冷2mol/L乙酸铵溶液，混匀；
(3)取DNA标准品和步骤(2)处理的DNA样品各1-10μg，分别加入到装有硝酸纤维素膜的Bio-Dot的狭缝或小孔底部，各点位加载等质量的DNA样品，接通低真空泵抽真空30-60分钟；
(4)取甲基胞嘧啶(M5C)或甲基鸟嘌呤(M1G)的特异性单克隆抗体，采用化学发光酶联免疫法检测DNA样品中的碱基甲基化水平；
(5)比较基因缺失型突变体材料与对照组材料中基因组DNA的甲基化水平，分析突变体材料与对照组材料甲基化水平的差异，筛选与对照材料基因组DNA甲基化水平明显不同的突变体作为甲基化修饰功能缺陷的突变体，突变体所缺失的基因为甲基化修饰相关基因。
所述的突变体生物材料，是具有单基因缺失突变的动物、植物或微生物，或者是具有单基因缺失突变的体外培养的组织或细胞。
所述的用过氧亚硝酸盐处理，是用浓度为10-200μmol/L的过氧亚硝酸盐处理3-6h。
所述的DNA标准品为博来霉素处理的小牛胸腺DNA。
所述的DNA甲基化修饰相关基因是鸟嘌呤甲基化(M1G)修饰相关基因或胞嘧啶甲基化(M5C)修饰相关基因。
所述的对照组材料，是指与突变体材料种属特性相同且不含有已知的基因变异的正常生物个体或细胞，如野生型酵母菌株或野生型拟南芥材料，可以分别作为酵母菌突变体和拟南芥突变体研究的对照组材料。
与现有技术相比，本发明的有益效果和特点：
本发明采用超声波处理来断裂DNA分子，快速简便，可使DNA链断裂为450-1500nt的片段，易于DNA链中甲基化碱基的暴露。加热使DNA双螺旋变性成为单链后加入乙酸铵可防止DNA复性，保障了点加于硝酸纤维素膜上的DNA分子为短的单链分子，便于一级抗体的识别结合。
用氧化剂过氧亚硝酸盐处理生物材料，可使基因缺失突变体与对照组材料间的DNA甲基化水平差异增大，易于检出甲基化功能缺陷的突变体，进而筛选甲基化修饰相关的基因。
检测过程使用甲基胞嘧啶或甲基鸟嘌呤特异性单克隆抗体，能特异性识别结合DNA链中的甲基化碱基，二级抗体携带了化学发光催化酶-过氧化物酶，以鲁米诺-过氧化氢为发光底物进行化学发光酶联免疫检测，因此既保障了检测的特异性，又提高了检测的灵敏度。
选用Bio-Dot或Bio-DotSF仪进行检测，能同时对16--48个DNA样品进行测试，提高了筛选的效率。
本发明的方法高效、经济，适用于从基因缺失型突变体库中筛选DNA甲基化修饰相关的功能基因。
附图说明：
图1化学发光酶联免疫法检测酵母菌M1G的图片，每个样品2个重复点位
图2CT-DNA检测结果及标准曲线
图3酵母菌突变体rad2与野生型(wild)菌株基因组DNA中M1G含量
图4酵母菌突变体apn1与野生型(wild)菌株基因组DNA中M1G含量
具体实施方式：
实施例1：酵母菌中与DNA甲基鸟嘌呤(M1G)修饰相关基因的筛选
取酿酒酵母野生型和基因缺失型突变体rad2菌株的细胞，分别接入YPD液体培养基中活化过夜，之后，于30℃、200-250r/min培养，每隔2小时取少量培养液，检测OD600值，绘制野生型和突变体菌的生长曲线，并用血球计数板计数细胞浓度，找出特定菌株细胞生长过程中细胞浓度与OD600值呈线性对应的区间；
取生长对数期细胞，药物处理组采用终浓度为50μmol/L的过氧亚硝酸盐处理，对照组不加过氧亚硝酸盐；30℃、200r/min作用3小时；
用QIAGEN基因组DNA提取试剂盒，按照QIAGENGenomicDNAHandbook操作，提取酵母基因组DNA，溶于无菌双蒸水中；
检测DNA样品的OD260和OD280值，计算DNA浓度和纯度，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子完整性；取质量合格的DNA样品适量于1.5ml离心管中，于4℃超声波处理20-60秒；
选博来霉素修饰的小牛胸腺DNA(CT-DNA)作为标品，稀释成系列浓度梯度溶液，用于制备标准曲线；
DNA标品管和待测样品管于恒温金属浴中100℃保温6-10分钟左右，迅速插入碎冰中，加入等体积2mol/L预冷乙酸酸铵溶液，上下颠倒混匀；
取硝酸纤维素膜1张，用去离子水浸湿后，加6×SSC溶液(氯化钠105.18g，柠檬酸钠52.92g，溶于1000ml蒸馏水中，pH7.0)浸泡。垫衬滤纸用6×SSC溶液浸湿，置于Bio-Dot仪底座上，将硝酸纤维素膜平铺于滤纸上，固定Bio-Dot仪盖子；
用移液器取DNA样品1-6μg，全部加入狭缝或小孔底部，各点位加载的DNA质量相同，每个DNA样品点加于2个点位，用1mol/L的乙酸铵400-500μl冲洗狭缝或小孔，接通低真空泵抽至膜表面无湿气；
打开Bio-Dot仪盖子，用镊子取出硝酸纤维素膜，置于洁净玻璃管内，于80℃旋转烘干；
取出硝酸纤维素膜，用2％脱脂牛奶粉-TBS(含20mMTris-HCl，500mMNaCl，pH7.5)封闭60-90分钟，TBST(含20mMTris-HCl，500mMNaCl，0.1％Tween20，pH7.5)洗脱30-60分钟；
将硝酸纤维素膜转入洁净塑料袋内，加入M1G特异性单克隆抗体，赶走袋内空气，袋口加热塑封，置于4℃震荡孵育过夜；
剪开塑封袋一侧，小心取出硝酸纤维素膜，用TBST洗脱30分钟，将硝酸纤维素膜转入新的塑料盒内，加入带有辣根过氧化物酶的二级抗体，孵育30-60分钟，倒掉二抗，加TBST洗脱30-60分钟；
取出硝酸纤维素膜，置于洁净塑料盒内，加入新鲜配制的化学发光液(含发光底物鲁米诺和起动剂过氧化氢)，浸泡30秒-2分钟，取出硝酸纤维素膜，置于凝胶成像分析仪中，用ChemiDocTM的CCD收集信号；
测量每个点位的化学发光(见图1)信号值，计算各DNA样品的平均信号值；用CT-DNA标品绘制标准曲线(见图2)，并依据标准曲线计算各测试DNA样品中的甲基鸟嘌呤含量。
检测发现，酿酒酵母菌野生型菌株细胞中M1G含量基础值为0.20fmol，经50μmol/L的过氧亚硝酸盐处理后M1G含量提高至0.61fmol；突变体rad2细胞中M1G含量基础值为0.23fmol，50μmol/L的过氧亚硝酸盐处理后M1G含量提高至1.10fmol；过氧亚硝酸盐处理后突变体rad2基因组DNA中M1G含量显著高于野生型(见图3)。说明酿酒酵母菌中基因RAD2功能缺失可导致基因组DNA稳定性降低，使突变体中碱基甲基化水平高于对照组，即RAD2基因为DNA甲基化修饰相关基因。
实施例2：酵母菌中与DNA甲基鸟嘌呤(M1G)修饰相关基因的筛选
取酿酒酵母野生型和基因缺失型突变体apn1菌株的细胞，分别接入YPD液体培养基中活化过夜，之后，于30℃、200-250r/min培养，每隔2小时取少量培养液，检测OD600值，绘制野生型和突变体菌的生长曲线，并用血球计数板计数细胞浓度，找出特定菌株细胞生长过程中细胞浓度与OD600值呈线性对应的区间；
取生长对数期细胞，药物处理组采用终浓度为50μmol/L的过氧亚硝酸盐处理，对照组不加过氧亚硝酸盐；30℃、200r/min作用3小时；
用QIAGEN基因组DNA提取试剂盒，按照QIAGENGenomicDNAHandbook操作，提取酵母基因组DNA，溶于无菌双蒸水中；
检测DNA样品的OD260和OD280值，计算DNA浓度和纯度，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子完整性；取质量合格的DNA样品适量于1.5ml离心管中，于4℃超声处理20-60秒；
选博来霉素修饰的小牛胸腺DNA(CT-DNA)作为标品，稀释成系列浓度梯度溶液，用于制备标准曲线；
DNA标品管和待测样品管于100℃保温6-10分钟，迅速插入碎冰中，加入等体积2mol/L预冷乙酸铵溶液，上下颠倒混匀；
取硝酸纤维素膜1张，用去离子水浸湿后，加6×SSC溶液(氯化钠105.18g，柠檬酸钠52.92g，溶于1000ml蒸馏水中，pH7.0)浸泡。垫衬滤纸用6×SSC溶液浸湿，置于Bio-Dot仪底座上，将硝酸纤维素膜平铺于滤纸上，固定Bio-Dot仪盖子；
用移液器取DNA样品1-6μg，全部加入狭缝或小孔底部，各点位加载的DNA质量相同，每个DNA样品点加于2个位点，用1mol/L的乙酸铵400-500μl冲洗狭缝或小孔，接通低真空泵抽至膜表面无湿气；
打开Bio-Dot仪盖子，用镊子取出硝酸纤维素膜，置于洁净玻璃管内，于80℃旋转烘干；
取出硝酸纤维素膜，用2％脱脂牛奶粉-TBS(含20mMTris-HCl，500mMNaCl，pH7.5)封闭60-90分钟，TBST(含20mMTris-HCl，500mMNaCl，0.1％Tween20，pH7.5)洗脱30-60分钟；
将硝酸纤维素膜转入洁净塑料袋内，加入M1G特异性单克隆抗体，赶走袋内空气，袋口加热塑封，置于4℃震荡孵育过夜；
剪开塑封袋一侧，小心取出硝酸纤维素膜，用TBST洗脱30分钟，将硝酸纤维素膜转入新的塑料盒内，加入带有辣根过氧化物酶的二级抗体，孵育30-60分钟，倒掉二抗，加TBST洗脱30-60分钟；
取出硝酸纤维素膜，置于洁净塑料盒内，加入新鲜配制的化学发光液(含发光底物鲁米诺和起动剂过氧化氢)，浸泡30秒-2分钟，取出硝酸纤维素膜，置于凝胶成像分析仪中，用ChemiDocTM的CCD收集信号；
测量每个点位的化学发光信号值，计算各DNA样品的平均信号值；用CT-DNA标品绘制标准曲线，并依据标准曲线计算各测试DNA样品中的甲基鸟嘌呤含量。
检测发现，酿酒酵母菌野生型菌株细胞中M1G含量基础值为0.20fmol，经50μmol/L的过氧亚硝酸盐处理后M1G含量提高至0.61fmol；突变体apn1细胞中M1G含量基础值为0.23fmol，50μmol/L的过氧亚硝酸盐处理后M1G含量提高至1.05fmol；过氧亚硝酸盐处理后突变体apn1基因组DNA中M1G含量显著高于野生型(见图4)。说明酿酒酵母菌中基因APN1功能缺失可导致基因组DNA稳定性降低，使突变体中碱基甲基化水平高于对照组，基因APN1为DNA甲基化修饰相关基因。

Claims (4)

1.一种筛查DNA甲基化修饰相关基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取单基因缺失的突变体生物材料及其相应的对照组材料；设药物处理组和对照组，药物处理组用过氧亚硝酸盐处理，对照组不加过氧亚硝酸盐；取药物处理组和对照组材料的组织或细胞，提取基因组DNA；
(2)取步骤(1)得到的纯度和质量合格的DNA样品，于4℃超声波断裂为长度450-1500nt的片段，100℃保温5-8分钟后迅速制冷，加入等体积预冷2mol/L乙酸铵溶液，混匀；
(3)取DNA标准品和步骤(2)处理的DNA样品各1-10μg，分别加入到装有硝酸纤维素膜的Bio-Dot的狭缝或小孔底部，各点位加载等质量的DNA样品，接通低真空泵抽真空30-60分钟；
(4)取甲基胞嘧啶或甲基鸟嘌呤的特异性单克隆抗体，采用化学发光酶联免疫法检测DNA样品中的碱基甲基化水平；
(5)比较基因缺失型突变体材料与对照组材料中基因组DNA的甲基化水平，分析突变体材料与对照组材料甲基化水平的差异，筛选与对照材料基因组DNA甲基化水平明显不同的突变体作为甲基化修饰功能缺陷的突变体，突变体所缺失的基因为甲基化修饰相关基因。
2.如权利要求1所述的筛查DNA甲基化修饰相关基因的方法，其特征在于，所述的突变体生物材料，是具有单基因缺失突变的动物、植物或微生物，或者是具有单基因缺失突变的体外培养的组织或细胞。
3.如权利要求1所述的筛查DNA甲基化修饰相关基因的方法，其特征在于，所述的用过氧亚硝酸盐处理，是用浓度为10-200μmol/L的过氧亚硝酸盐处理3-6h。
4.如权利要求1所述的筛查DNA甲基化修饰相关基因的方法，其特征在于，所述的DNA标准品为博来霉素处理的小牛胸腺DNA。
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